Een gestroomlijnde en gestandaardiseerde procedure voor het genereren van adeno-geassocieerde virusvectoren met een hoge titer en hoge kwaliteit met behulp van een Cell Factory-platform

Samenvatting

Naarmate het gebied van gentherapie zich blijft ontwikkelen, is er een groeiende behoefte aan innovatieve methoden die deze uitdagingen kunnen aangaan. Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform, dat voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies.

Samenvatting

Preklinisch onderzoek naar gentherapie, met name in knaagdier- en grote diermodellen, vereist de productie van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en zuiverheid. Traditionele benaderingen in onderzoekslaboratoria omvatten vaak uitgebreid gebruik van celkweekschalen om HEK293T cellen te kweken, een proces dat zowel arbeidsintensief als problematisch kan zijn. Hier wordt een unieke in-house methode gepresenteerd, die dit proces vereenvoudigt met een specifiek cell factory (of cell stacks, CF10) platform. Een integratie van polyethyleenglycol/waterige tweefasige partitionering met jodixanolgradiënt ultracentrifugatie verbetert zowel het rendement als de zuiverheid van de gegenereerde AAV-vectoren. De zuiverheid van de AAV-vectoren wordt geverifieerd door SDS-PAGE en zilverkleuring, terwijl de verhouding tussen volle en lege deeltjes wordt bepaald met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Deze aanpak biedt een efficiënt celfabrieksplatform voor de productie van AAV-vectoren met hoge opbrengsten, gekoppeld aan een verbeterde zuiveringsmethode om te voldoen aan de kwaliteitseisen voor in vivo studies.

Inleiding

Adeno-geassocieerd virus (AAV) vectoren zijn een onmisbaar hulpmiddel geworden in onderzoek naar gentherapie en bieden een unieke combinatie van werkzaamheid en veiligheid voor^genafgifte. Traditionele methoden voor het genereren van AAV's in laboratoriumomgevingen zijn van cruciaal belang geweest voor het bevorderen van ons begrip en de toepassing van gentherapie². Hoewel deze methoden fundamenteel zijn, vertonen ze echter bepaalde beperkingen en uitdagingen, vooral op het gebied van opbrengst, tijdsefficiëntie en de kwaliteit van de geproduceerde vectoren, met name de verhouding tussen volle en lege deeltjes³.

De conventionele procedure voor de productie van AAV omvat voornamelijk de transfectie van HEK293-cellen⁴. Dit proces, dat meestal wordt uitgevoerd in celkweekschalen, vereist dat de cellen worden getransfecteerd met een plasmide dat het betreffende gen bevat, samen met helperplasmide en AAV-capsideplasmide ^5,6. Na transfectie produceren de cellen AAV-deeltjes, die vervolgens worden geoogst en gezuiverd ^5,6. Het zuiveringsproces omvat vaak ultracentrifugatie, een cruciale stap bij het verkrijgen van zeer zuivere AAV-vectoren⁷. Ultracentrifugatie, met name met behulp van cesiumchloride (CsCl) of jodixanolgradiënt, is een standaardmethode voor het scheiden van AAV-deeltjes van cellulair afval en andere onzuiverheden⁸. Deze stap is cruciaal voor het bereiken van de gewenste zuiverheid en concentratie van AAV-vectoren, wat een directe invloed heeft op hun werkzaamheid bij de afgifte van genen⁸. Ondanks het wijdverbreide gebruik heeft traditionele ultracentrifugatie zijn nadelen. De opbrengst van AAV-vectoren van deze methode kan bijvoorbeeld variabel en vaak laag zijn, wat aanzienlijke uitdagingen met zich meebrengt wanneer grote hoeveelheden vectoren met een hoge titer nodig zijn, met name voor in-vivostudies of grote diermodellen⁹.

Een ander cruciaal aspect van de kwaliteit van de AAV-vector is de verhouding tussen volle en lege deeltjes¹⁰. AAV-preparaten bevatten vaak een mengsel van deze deeltjes; Echter, alleen de volledige deeltjes bevatten het therapeutisch genetisch materiaal. De aanwezigheid van een hoog percentage lege deeltjes kan de efficiëntie van de genafgifte aanzienlijk verminderen¹⁰. Het beoordelen en optimaliseren van de verhouding tussen volle en lege deeltjes is dus een belangrijke parameter bij het evalueren van de werkzaamheid van AAV-vectoren. Traditionele methoden, hoewel in staat om AAV-vectoren te produceren, hebben vaak moeite om deze verhouding consistent te beheersen, wat leidt tot variaties in vectorpotentie¹⁰.

Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform dat vrij is van het gebruik van arbeidsintensieve HEK293T celculturen in celschalen, waarbij polyethyleenglycol/waterige tweefasige partitionering wordt geïntegreerd met jodixanolgradiënt ultracentrifugatie. De zuiverheid van de AAV-vector wordt bevestigd via SDS-PAGE en zilverkleuring, en de verhouding tussen vol-leeg deeltjes wordt bepaald met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), die voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies¹¹.

Protocol

De details van de reagentia, plasmiden en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. De samenstelling van de gebruikte buffers is opgenomen in aanvullend bestand 1.

1. Plasmide preparaat

1. Transformeer plasmiden (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) in E. coli.
   OPMERKING: Elke E.coli-stam kan worden gebruikt voor plasmide-amplificatie. Voor sommige plasmiden kunnen speciale competente cellen zoals NEB stable de plasmideopbrengst verbeteren. De drie plasmiden die in dit protocol worden gebruikt, zijn pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 en pAAV-Cap: pAAV-RC6.
2. Kweek bacteriën in LB-media die de juiste selectieve antibiotica bevatten in een optimaal volume bij 37 °C gedurende 16-18 uur.
   OPMERKING: Bij gebruik van NEB-stabiele cellen, kweek bij 30 °C gedurende 18-20 uur.
3. Oogst plasmide-DNA door de E. coli te centrifugeren. kweekmedium bij 4000 x g, 4 °C, gedurende 15 min.
4. Giet de overtollige vloeistof uit de centrifugefles voorzichtig in een afvalcontainer en zuiver het plasmide-DNA uit de pellet met een grootschalige endotoxinevrije plasmidezuiveringsset.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat u het langzaam giet en spatten voorkomt.
5. Meet de DNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.
   OPMERKING: Controleer de DNA-zuiverheid door de verhouding OD₂₆₀/OD₂₈₀ te controleren. De verhouding voor puur DNA is ongeveer 1,8. De DNA-concentratie moet hoger zijn dan 1 μg/μL voor de latere co-transfectiestap. Maak bacteriële glycerolvoorraden door 500 μL van de nachtcultuur toe te voegen aan 500 μL 50% glycerol in een cryovial en bewaar bij -80 °C.

2. Voorbereiding HEK293T cellen

1. Zaai HEK293T cellen met DMEM hoge glucosemedia die 10% FBS bevatten in een 10-laagse celfabriek (CF10) en laat de cellen een nacht in de incubator groeien.
   OPMERKING: Passages van de 293T-cellen moeten minder dan 10 zijn om de optimale conditie te hebben voor een robuuste AAV-productie. Voeg indien mogelijk op dit moment geen antibiotica toe aan de kweekmedia. CF10 heeft ongeveer 42 keer het groeioppervlak van een 150 mm celkweekschaaltje. Zaai dezelfde celdichtheid in een celkweekschaaltje van 150 mm, zodat de celgroei onder een microscoop kan worden gecontroleerd. Bereid 1075 ml celsuspensie, voeg 25 ml celsuspensie toe aan een schaal van 150 mm en voeg de rest toe aan de CF10.
2. Controleer de celconfluentie de volgende dag voor de transfectie.
   OPMERKING: Cellen moeten 80%-90% confluentie bereiken op het moment van transfectie door onder een microscoop te observeren.

3. Drievoudige transfectie van AAV-plasmiden

1. Bereken de hoeveelheid van elk plasmide die nodig is (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotype) om een molaire verhouding van 1,2: 1: 1 te hebben met 2,5-5 mg totaal DNA per CF10.
   OPMERKING: De molaire verhouding van de drie plasmiden kan variabel zijn voor de optimale transfectie-efficiëntie. Het is beter om het in een kleinschalige setting te testen voordat je overstapt op deze CF10-instelling. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 en pAAV-RC6 worden gebruikt om het AAV6-CMV-GFP-virus als voorbeeld te maken. De formule van de PEI-calculator staat vermeld in tabel 1.
2. Doe 350 ml OptiMEM in een steriele fles van 500 ml.
3. Voeg alle drie de plasmide-DNA toe aan het flesje met de Opti-MEM. Goed mengen.
4. Voeg 15 ml 1 mg/ml polyethylenimine (PEI)-oplossing toe (verhouding 1:3 μg DNA tot μg PEI). Schud het OptiMEM/DNA/PEI-mengsel krachtig op en neer gedurende 30 s.
   LET OP: Het is oké om bubbels te maken.
5. Incubeer het mengsel 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Langere incubatie kan de transfectie-efficiëntie verminderen.
6. Voeg de OptiMEM/DNA/PEI-oplossing toe aan de fles van 1 L met 700 ml DMEM lage glucose met 10 mM HEPES en 2% FBS. Goed mengen.
   OPMERKING: In deze studie vertoonde de lage glucose in de DMEM een betere AAV-vectorproductie na co-transfectie. De toevoeging van HEPES helpt om de cellen in een betere conditie te houden. Meng door de fles langzaam te draaien. Vermijd het creëren van te veel bubbels.
7. Haal de CF10 uit de incubator en zuig het media op in een afvalcontainer.
   NOTITIE: Leg de CF10 op het oppervlak in de kap en til geleidelijk één kant op, zuig de media langzaam op zonder de cellen los te maken.
8. Voeg het transfectantmengsel voorzichtig toe aan de CF10. Zorg ervoor dat alle tien de lagen bedekt zijn met media.
   OPMERKING: Voeg 25 ml transfectantmengsel toe aan de schaal van 150 mm. Bewaak de cellen dagelijks tot de oogst. Voeg het resterende transfectantmengsel toe aan de CF10 door langzaam te gieten. Draai de CF10 heel voorzichtig en zorg voor een gelijk volume voor elke laag.
9. Breng de CF10 terug naar de couveuse gedurende 72-96 uur.
   OPMERKING: Controleer de monitorschotel van 150 mm om te beslissen wanneer de AAV-vectoren moeten worden geoogst. Wanneer de cellen heel gemakkelijk loskomen met een volle lading AAV, is het tijd om te oogsten.

4. AAV-vectoren oogsten

1. Oogst het virus 3-4 dagen na transfectie door de CF10 krachtig te schudden. Giet de media in de conische buisjes van 250 ml en draai het virus gedurende 20 minuten bij 4 °C rond in een temperatuur van 4000 x g .
   OPMERKING: Voor het AAV6-serotype dat in dit protocol wordt gebruikt, blijft 80% AAV grotendeels gebonden aan cellulair materiaal in de pellet. En de 20% AAV werd uitgescheiden in de media. Deze verhoudingen kunnen verschillen voor andere AAV-serotypen.
2. Filter geklaard supernatans met 0,45 μm filtereenheid en bewaar het voor neerslag.
3. Spoel de CF10 af met 500 ml DPBS 1x buffer en centrifugeer op 4000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
4. Gooi het supernatans weg met behulp van een vacuümsysteem en een zuigpipet. Voeg 20 ml AAV-lysisbuffer per CF10 bij -80 °C toe tot zuivering.
   OPMERKING: Breng AAV-lysaat over in een conische buis van 50 ml voor latere AAV-extractie.
5. Haal het gefilterde supernatant eruit, voeg 40% PEG-2.5 M NaCl-oplossing toe voor een eindconcentratie van 8% PEG en incubeer in een koude kamer op een orbitale rotator gedurende ten minste 3 uur of een nacht.
   OPMERKING: Voeg voor 100 ml supernatant 25 ml 40% PEG-2.5 M NaCl-oplossing toe.
6. Precipiteer het virus neer door te centrifugeren bij 4000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   NOTITIE: Breng het mengsel over in conische buisjes van 250 ml voor centrifugatie.
7. Aspireer om het bovendrijvende middel te verwijderen en voeg 5-10 ml AAV HEPES-resuspensiebuffer toe om de pellets te suspenderen. Breng over in een conische buis van 50 ml om de stroomafwaartse zuivering voort te zetten, of bewaar deze bij -80 °C.

5. AAV-extractie

1. Ontdooi de viruskorrel in een waterbad van 37 °C gedurende 10-15 minuten met een shaker.
   OPMERKING: Draai het AAV-lysaat om volledig te smelten.
2. Vries in een bad van 100% ethanol bij -80 °C gedurende 20-30 minuten in.
   OPMERKING: Als alternatief kan de vriescyclus worden uitgevoerd met een koud bekerglas van 100% ethanol omgeven door droogijs.
3. Voer 3-4 keer bevriezing/dooi uit en draai indien nodig tussendoor.
   NOTITIE: Deze cyclus kan worden gepauzeerd bij de bevriezingsstap. Bewaar het AAV-lysaat bij -80 °C tot het stroomafwaartse werk.
4. Ontdooi AAV-lysaat (uit stap 5.3) en geresuspendeerde AAV (uit stap 4.7)" in een waterbad van 37 °C gedurende 10-15 minuten met een shaker en vortex.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat het volledig smelt en meng het.
5. Voeg benzonasenuclease (250 eenheden/μl) toe aan AAV-lysaat en geresuspendeerd AAV voor een eindconcentratie van 50 eenheden/ml. Vortex de oplossing.
6. Incubeer in een waterbad van 37 °C met schudden gedurende 30 min.
   OPMERKING: Haal 10% natriumdeoxycholaataliquots eruit in een waterbad om de tijd te geven om op te lossen, op te warmen en grondig te mengen.
7. Voeg 10% natriumdeoxycholaat toe voor een eindconcentratie van 0,5% en incubeer bij 37 °C met een shaker gedurende 30 min.
   OPMERKING: Natriumdeoxycholaat werd gebruikt om de AAV-afgifte uit de cellen te verbeteren.
8. Verdeel de ruwe AAV-oplossing in centrifugebuisjes van 2 ml en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
9. Breng het supernatans over in een conische buis van 50 ml.
   OPMERKING: Gebruik een pipet van 1 ml om het supernatant over te brengen. Gooi de pellets weg.
10. Voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe en extraheer AAV door 1-2 minuten te vortexen.
    OPMERKING: De oplossing moet ondoorzichtig, wit en melkachtig worden.
11. Breng de melkachtige oplossing over in centrifugebuisjes van 2 ml en verdeel gelijkmatig. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
12. Pipetteer voorzichtig de bovenste roze laag en breng deze over in een nieuwe conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Verstoor de chloroform/eiwitlagen niet.
13. Meet het uiteindelijke volume met behulp van een pipet. Meng volgens de ruwe AAV-PEG-sulfaatvolumegrafiek (tabel 2) de juiste volumes van 50% (NH₄)₂SO₄ en 40% PEG-oplossing. Draaikolk gedurende 2 min.
14. Breng het mengsel over in centrifugebuisjes van 2 ml om gelijkmatig te verdelen. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C
15. Verzamel de onderste laag met behulp van een naald van 22 G en een spuit van 3 ml. Verzamel de AAV in een conische buis van 50 ml en bewaar deze bij 4 °C voor latere ultracentrifugatie met jodixanolgradiënten.

6. AAV-zuivering door ultracentrifugatie met jodixanolgradiënt

1. Bereid de jodixanolgradiënten vers voor voordat u de AAV laadt volgens het aantal gebruikte ultracentrifugatiebuisjes (tabel 3).
   OPMERKING: Fenolrood werd gebruikt om de lagen te observeren.
2. Leg elke oplossing langzaam in een polypropyleen ultracentrifugebuis met ronde bovenkant met snelsluiting met behulp van een spuit van 10 ml die is bevestigd met een lange naald van 16 G. Vermijd bubbels.
3. Voeg voorzichtig tot 17 ml AAV-oplossing toe bovenop de gradiënt met een spuit van 22 G. Gebruik AAV-dialysebuffer om de buis bij te vullen.
   NOTITIE: Voeg de AAV-oplossing toe door druppels tegen de wand in de ultracentrifugebuis te laden. Verstoor de gradiëntlagen niet.
4. Sluit de ultracentrifugebuisjes af met een elektrische sealer.
   NOTITIE: Balanceer de buisjes voordat u ze naar de ultracentrifuge stuurt met ±0.2 g verschil.
5. Centrifugeer bij 350.000 x g gedurende 2 uur in een Ti70-rotor bij 4 °C.
6. Verwijder de buisjes voorzichtig van de rotor en plaats ze in het rek met ultracentrifugebuisjes.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de hellingen niet worden verstoord.
7. Verzamel AAV-breuken door de onderstaande stappen te volgen:
   1. Stabiliseer de buis op een standaardhouder.
   2. Prik de ultracentrifugebuisjes iets onder de 40%-60%-interface met een naald van 19 G die is bevestigd aan een spuit van 10 ml.
      NOTITIE: De opening van de naald moet naar boven wijzen, gericht op de helling van 40%.
   3. Prik met een naald van 16 G een gat in de bovenkant van de buis.
   4. Verzamel tot 5 ml per buis. Vermijd het verzamelen van de eiwitcontaminatie op de 25%-40%-interface.
   5. Herhaal dit voor elke ultracentrifugebuis.
      OPMERKING: Breng de AAV-fracties over in een conische buis van 50 ml.

7. Ultracentrifugatie van jodixanolgradiënten in de tweede ronde

OPMERKING: Deze stap is optioneel. Deze stap is om de lege AAV-ratio te verminderen voor een volledige AAV-capside van hogere kwaliteit.

1. Verdun AAV >1:1 met AAV-dialysebuffer.
   OPMERKING: AAV verzameld uit de eerste ronde van ultracentrifugatie was op 40% jodixanol laag. Het moet met ten minste 50% worden verdund om bovenop de 30% jodixanollaag te kunnen worden geladen.
2. Leg elke oplossing (tabel 4) in een ultracentrifugatiebuis met behulp van een naald van 16 G en bevestig langzaam een spuit van 10 ml. Vermijd bubbels.
3. Voeg voorzichtig 20 ml verdunde AAV-oplossing toe bovenop de gradiënt met een spuit van 22 G. Gebruik AAV-dialysebuffer om de buis bij te vullen.
4. Herhaal de stappen 6.4 t/m 6.7.

8. AAV-dialyse en concentratie

1. Breng het AAV-virus over in de dialysecassette met behulp van een nieuwe naald van 18 G en een spuit van 10 ml. Injecteer het virus langzaam in de cassette en verwijder er lucht uit.
2. Voeg een roerstaaf toe aan het bekerglas met AAV-dialysebuffer en leg deze op een roerplaat.
3. Zet de dialysecassette met een drijfboei in de dialysebuffer. Roer op 4 °C. Vervang 2-3 keer de AAV-dialysebuffer.
   OPMERKING: Gebruik voldoende buffer om de cassette te laten zweven en de bufferwissel uit te voeren. Dek het deksel af met aluminiumfolie.
4. Gebruik een spuit van 10 ml die is bevestigd met een naald van 18 G, verzamel het virus uit de cassette in een centrifugaalfiltereenheid.
5. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 15-30 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Spoel de AAV met AAV-dialysebuffer 2-3 keer. Concentreer de AAV totdat er nog ~200 μL restant op het filter ligt.
6. Verzamel de geconcentreerde AAV van de filtereenheid. Spoel het filter af met nog eens 300 μL AAV-dialysebuffer en breng deze over naar de geconcentreerde AAV.
7. Filtreer het virus door een spuitfilter van 0,22 μm met behulp van een tuberculine luer-slipspuit van 1 ml. Om zo min mogelijk volumeverlies te garanderen, gebruikt u de spuit van 10 ml om 2-3 keer lucht door het filter te duwen.
8. Bewaar het gezuiverde AAV-virus tijdelijk bij 4 °C voor titratie.
   OPMERKING: Titreer het virus, aliquot, en bewaar binnen 1 week bij -80 °C.

9. Titratie van het AAV-virus

OPMERKING: TaqMan kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) werd gebruikt om gezuiverde AAV te titreren.

1. Behandel AAV-vectoren met DNase I en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min, en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 °C.
   OPMERKING: Als voorbeeld van een reactie van 10 μL wordt een 2 μL AAV-virusmonster, 1 μL DNase, 1 μL DNasebuffer en 6 μL H₂O gebruikt. Het kan worden uitgevoerd in een thermocycler met PCR-buizen.
2. Bereid de primersets voor die gericht zijn op het AAV-insteekgebied.
   OPMERKING: Doelen kunnen de promotor, het transgen en de verslaggever zijn in de AAV-constructie. De primers zijn opgenomen in tabel 5.
3. Bereid DNA-plasmidestandaarden voor (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 en 0,0001 pg/μL) en een negatieve controle (H₂O).
4. Bereid de qPCR-mastermix, inclusief primers, voor volgens de instructies van de fabrikant.
5. Leg de standaarden en monsters in drievoud op een PCR-plaat. Voeg de qPCR-mix toe aan de standaarden en monsters. Verzegel de plaat en voer de qPCR-reactie uit volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: De reactieomstandigheden zijn afhankelijk van de materialen/reagentia en het instrument. Snelle en conventionele PCR-cycli zijn van toepassing.
6. Bereken de AAV-virustiter.
   OPMERKING: De monsterconcentratie in dit protocol is 1/10 verdunning van de originele monsters.
7. Aliquot het AAV-virus in buisjes van 1,5 ml en maximaal een maand bewaren bij 4 °C en langdurig bewaren bij -80 °C.
   NOTITIE: Vermijd vries-/dooicycli voor opslag. Bij gebruik voor in vivo experimenten, gebruik dooi niet meer dan tweemaal aliquots.

10. Kwaliteitscontrole van AAV

OPMERKING: AAV-virussen werden gekarakteriseerd op zuiverheid door SDS-PAGE-zilverkleuring met behulp van een SDS-PAGE-gel en gekleurd met een in de handel verkrijgbare kleuringsset.

1. Denatureer 3 x 10⁹ vg AAV-virusmonster met Laemmli-buffer.
   OPMERKING: Gebruik een referentie AAV-virus als controle. De AAV6-CMV-GFP referentie volledige capside wordt gebruikt.
2. Laad de gedenatureerde AAV op een SDS-PAGE-gel met een gradiënt van 4%-20% en laat deze gedurende 50 minuten op 180 V draaien.
3. Verwijder de gel van de elektroforeseplaat. Kleur de gel met een zilverkleuringsset volgens de instructies van de fabrikant.
4. Controleer de AAV-capside-eiwitten VP1, VP2 en VP3.
   OPMERKING: Het pure AAV-virus bevat alleen VP1-, VP2- en VP3-capside-eiwit. Als het niet zuiver is, zouden andere eiwitbanden zichtbaar zijn op de gel.
   OPMERKING: Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van negatief gekleurde recombinante AAV-virionen werd uitgevoerd om de morfologische integriteit en de vol/leeg-verhouding te beoordelen.
5. Pak met een pincet een EM-rooster op en ga op de bank liggen met de glanzende kant van het rooster naar boven.
6. Pipetteer 5 μL AAV-monster op het rooster en laat het drogen door verdamping.
   OPMERKING: Verdun de AAV indien nodig. 10¹² vg/ml is een gemiddelde titer. Het kan 30-60 minuten duren om het rooster te drogen.
7. Was het rooster door middel van pipetteren, druppel voor druppel, met ongeveer 200 μL H₂O op het rooster.
8. Verwijder het overtollige water door een chromatografiepapier langzaam verticaal naast het rooster te leggen.
9. Pipetteer 5 μL 2% Uranylacetaat-oplossing op het rooster. Incubeer gedurende 5 minuten en lont af zoals hierboven vermeld. Laat het rooster drogen.
10. Visualiseer de AAV-deeltjes onder een transmissie-elektronenmicroscoop (met een vergroting van 50.000 keer). Virale capsiden met een viraal genoom verschijnen als homogene witte zeshoeken, terwijl lege capsiden verschijnen als zeshoeken met een witte rand maar een donker centrum.
11. Tel willekeurig ten minste 100 deeltjes om het geschatte percentage van vol vs. lege AAV-deeltjes.

Resultaten

In dit gedetailleerde stap-voor-stap protocol wordt een gestandaardiseerd platform gedemonstreerd om met de CF10 een hoogtiter en hoogwaardig AAV-virus te maken in een grootschalig onderzoekslaboratorium. Vergeleken met conventionele celkweekschalen biedt de CF10 een handige manier om grote hoeveelheden cellen te kweken en het AAV-virus te produceren (Figuur 1). Er werden verschillende kweekomstandigheden getest om te bepalen of cellen in een optimale omgeving de virale productie kunnen bevorderen. Een lage glucose DMEM aangevuld met 10 mM HEPES en 2% FBS liet de beste AAV-productie zien.

Er werden verschillende protocollen getest om AAV's te zuiveren. De meeste procedures hebben een lage virusopbrengst en onzuiverheid van AAV-capsiden. Hier werd een herzien zuiveringsprotocol ontwikkeld, waarbij de AAV uit zowel celpellets als kweekmedia werden gecombineerd (Figuur 2). We hebben ontdekt dat 80% van de AAV zich in de cellen bevond en nog eens 20% van de AAV in de kweekmedia, die door de cellen werden uitgescheiden. Beide delen van AAV werden behandeld met DNase om het vrije DNA te verwijderen. Natriumdeoxycholaat werd gebruikt om AAV verder uit de cellen vrij te maken. AAV's werden vervolgens geëxtraheerd met chloroformextractie, gevolgd door een waterige tweefasige partitionering. Met deze stappen konden de meeste eiwitcontaminanten worden verwijderd. AAV blijft oplosbaar in de ammoniumsulfaatfase.

De overige verontreinigingen werden verwijderd met een discontinue jodixanolgradiënt ultracentrifugatie (figuur 3A). De gradiënt was ook nuttig bij het verwijderen van de lege AAV-capsiden, vooral bij de tweede ronde van jodixanol gradiënt ultracentrifugatie.

De zuiverheid van het AAV-virus werd bepaald door zilverkleuring. Toen drie belangrijke banden die overeenkomen met AAV-capside-eiwit, VP1, VP2 en VP3, met een zuiverheid van meer dan 90% werden verkregen, was het AAV-virus geschikt voor in vivo gebruik (Figuur 3B). De AAV-verhouding tussen volledige capside en lege capside werd benaderd door TEM (Figuur 3C). Alleen een volledige capside met een transgen-insertie zou de expressie van transgen in het beoogde weefsel mogelijk maken. Een groot deel van de lege capside kan ook een immuunrespons op de AAV-capside induceren. Deze kwaliteitscontroles zijn nodig voor elk AAV-virus dat voor gebruik wordt geproduceerd en gezuiverd.

Figuur 1: Schematische weergave van de AAV-productie door middel van HEK293T cellen triple-transfectie methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematische weergave van de AAV-zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: AAV-zuivering door middel van jodixanolgradiënt-ultracentrifugatie en verificatie van de zuiverheid van het AAV-virus. (A) Iodixanol-gradiëntlagen en de positie van de naald voor het oogsten. (B) Representatieve gel die het capsidegehalte en de zuiverheid beoordeelt. M: moleculaire marker; R: referentie AAV6 volledige capside; S1: in eigen huis gemaakte AAVDJ capside met één ronde ultracentrifugatie; S2: in eigen huis gemaakte AAVDJ capside met twee rondes ultracentrifugatie; S3: in eigen huis gemaakte AAV6 capside. (C) Elektronenmicroscopiebeeld van AAV. Virus verzameld na zuivering. Virale capsiden die een viraal genoom bevatten, verschijnen als homogene witte zeshoeken, terwijl lege capsiden verschijnen als zeshoeken met een witte rand maar een donker centrum. Schaal balk: 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: PEI-calculator voor AAV-verpakkingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Grafiek van het ruwe AAV-PEG-sulfaatvolume. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Bereiding van jodixanolgradiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Bereiding van de tweede ronde jodixanolgradiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: AAV-titratieprimers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Samenstelling van de buffers die voor het onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier wordt een technisch geavanceerd protocol geïntroduceerd voor grootschalige productie van hoogwaardige en hoogwaardige AAV-vectoren met behulp van een celfabrieksplatform (CF10), wat een aanzienlijke verbetering betekent ten opzichte van conventionele celkweekschaalmethoden. Het gebruik van celfabrieken vereenvoudigt het proces van het kweken van grote hoeveelheden cellen, waardoor de productie van AAV-virussen efficiënter wordt vergemakkelijkt¹. Door de kweekomstandigheden te optimaliseren, met name met lage glucose DMEM aangevuld met 10 mM HEPES en 2% FBS, werd ook een aanzienlijk verbeterde virale productie bevestigd, wat wijst op de cruciale rol van de cellulaire omgeving bij de virusopbrengst.

Het herziene zuiveringsprotocol, dat AAV van zowel celpellets als kweekmedia combineert, pakt het veelvoorkomende probleem van lage virusopbrengsten en onzuiverheid aan dat in veel bestaande protocollen wordt gezien. De stappen van chloroformextractie en waterige tweefasige partitionering verwijderen effectief de meeste eiwitverontreinigingen, waarbij AAV oplosbaar blijft in de ammoniumsulfaatfase. De verbetering van zowel het rendement als de zuiverheid van AAV-vectoren met behulp van de PEG/waterige tweefasige partitionering in combinatie met jodixanolgradiënt-ultracentrifugatie, in tegenstelling tot traditionele gradiënt-ultracentrifugatiemethoden, kan worden toegeschreven aan verbeterde initiële scheiding met PEG/waterige tweefasige partitionering, verfijnde zuiverheid met jodixanolgradiënt ultracentrifugatie en vermindering van de co-zuivering van verontreinigende stoffen¹². Ten eerste verbetert de introductie van PEG/waterige tweefasige partitionering vóór ultracentrifugatie de initiële scheiding van AAV-deeltjes uit cellulair afval en andere verontreinigingen aanzienlijk. PEG, een polymeer met een hoog moleculair gewicht, creëert bij vermenging met een waterige oplossing twee verschillende fasen¹³. AAV-vectoren hebben de neiging om bij voorkeur in een van deze fasen te verdelen (meestal de PEG-rijke fase), terwijl veel verontreinigingen en onzuiverheden worden verdeeld in de andere¹³. Deze selectieve partitionering concentreert de AAV-deeltjes effectief en verwijdert een aanzienlijk deel van de onzuiverheden zelfs vóór ultracentrifugatie, waardoor het rendement wordt verhoogd en de verontreinigingsbelasting die de ultracentrifugatiestap¹³ ingaat, wordt verminderd. Ten tweede verfijnt ultracentrifugatie met jodixanolgradiënt de zuiverheid van AAV-vectoren verder. Iodixanol, een niet-ionisch, iso-osmolair gradiëntmedium, zorgt voor een zachtere en gecontroleerde scheiding in vergelijking met traditionele CsCl-gradiënten¹⁴. In deze gradiënt migreren AAV-deeltjes naar een positie in de gradiënt die overeenkomt met hun opwaartse dichtheid¹⁴. Belangrijk is dat dit proces effectief is bij het scheiden van volledige AAV-capsiden (die de genetische lading bevatten) van lege capsiden (zonder genetisch materiaal), wat een cruciale bepalende factor is voor de vectorkwaliteit. De iso-osmolaire aard van jodixanol behoudt ook de integriteit van de AAV-capsiden beter dan hyperosmolaire middelen zoals CsCl, wat mogelijk leidt tot hogere opbrengsten van intacte, functionele vectoren¹⁴. Ten slotte kunnen traditionele ultracentrifugatiemethoden, vooral die waarbij gebruik wordt gemaakt van CsCl-gradiënten, soms verontreinigingen meezuiveren die een vergelijkbare drijfdichtheid hebben als AAV-vectoren¹⁵. Door gebruik te maken van PEG-partitionering als voorbereidende stap, wordt de belasting van dergelijke verontreinigingen sterk verminderd vóór ultracentrifugatie¹³. Deze vermindering van de verontreinigingsbelasting betekent dat de jodixanolgradiënt effectiever en selectiever kan werken bij het zuiveren van AAV-vectoren, wat leidt tot een hogere zuiverheid¹⁵.

De zuiverheid en kwaliteit van de AAV-vectoren worden streng beoordeeld door middel van zilverkleuring en TEM¹¹. De waarneming van drie hoofdbanden die overeenkomen met AAV-capside-eiwitten VP1, VP2 en VP3, met een zuiverheid van meer dan 90%, geeft aan dat deze AAV-vectoren geschikt zijn voor in vivo gebruik. De TEM-analyse voor het bepalen van de verhouding tussen vol en leeg capsiden is bijzonder cruciaal, aangezien een hoog percentage lege capsiden kan leiden tot een verminderde efficiëntie van de genafgifte en mogelijke immuunresponsen^. Deze kwaliteitscontrole is weliswaar essentieel, maar maakt de procedurele complexiteit nog complexer en kan aanvullende technische expertise vereisen.

Concluderend biedt het protocol aanzienlijke technische vooruitgang in de productie van AAV-vectoren, met name op het gebied van schaalbaarheid en zuiverheid. De complexiteit van het zuiveringsproces en de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur en expertise kunnen echter nog steeds een kleine beperking zijn voor de toepassing ervan in bepaalde onderzoeksomgevingen. Verdere verfijning en vereenvoudiging van deze technieken zou deze aanpak toegankelijker en breder toepasbaar kunnen maken in het veld van gentherapieonderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
293T/17 cellen	ATTC	CRL-11268
0,5 M EDTA	MilliporeSigma	324506-100ml
1 mL Henke-Ject spuit	Fisher Scientific	14-817-211
10% pluronic F68-oplossing	Fisher Scientific	24-040-032
10x Tris/Glycine/SDS-buffer	Biorad	1610732
1M HEPES	Fisher Scientific	15-630-080
2% Uranyl Acetaat-oplossing	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4%–20% voorgegoten eiwitgels	biorad	4561094
40% PEG-oplossing	Sigma	P1458-50ML
AAV6-referentievolle capsiden	Charles River Laboratories	RS-AAV6-FL
Accutase celdetacheringsoplossing	Fisher Scientific	A6964-100ML
Benzonase	Sigma	E1014-25KU
BioLite celkweekschalen behandeld 150 mm	Fisher Scientific	12-556-003
Centrifugeringsfilterunit	MilliporeSigma	UFC905024
Corning PES-slangfilters	Fisher Scientific	09-754-29
Dialyse cassettes, 10 K MWCO	Fisher Scientific	PI66810
Weggebruikbare PES-filtereenheden 1 L 0,2 µm	Fisher Scientific	FB12566506
Weggebruikbare PES-filtereenheden 1 L 0,45 µm	Fisher Scientific	FB12566507
Weggebruikbare PES-filtereenheden 500 mL 0,2 µm	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM hoge glucose	Fisher Scientific	10-569-044
DMEM lage glucose	Fisher Scientific	10567022
DNase	NEB	M0303S
DPBS 1x	Fisher Scientific	14-190-250
Fetaal bovien serum (FBS)	Biowest	S1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu-50
glycerol	Sigma	G5516-1L
KCl	Sigma	P9541-500G
LB-agar	Sigma	L2897-250G
LB-bouillon	Fisher Scientific	BP9732-500
MgCL2·6H2O	Sigma	M9272-100G
NEB stabiele competente cellen	NEB	C3040H
Nest Biofactory 10 kamer	MidSci	771302
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	740424
Opti-MEM	Fisher Scientific	31-985-088
OptiPrep-dichtheidsgradiëntmedium	Millipore Sigma	D1556-250ml
pAAV-CMV-GFP	Addgene	105530
pAAV-DJ	Cell BioLab	VPK-420-DJ
pAAV-RC6	Cell BioLab	VPK-426
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Promega	V3011
PEI Max	Polysciences, Inc	49553-93-7
Pen-Strep	Fisher Scientific	15-140-163
Fenolrood	Millipore Sigma	1.07242.0100
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	24612
QuickSeal-buis	Fisher Scientific	NC9144589
Natriumchloride	Sigma	1162245000
natriumdeoxycholaat	Millipore Sigma	D6750-100G
Taqman Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter	337922
Western Blotting-substraat	ThermoFisher	32209