Ontwikkeling van een goedkope epimysiale elektromyografie-elektrode: een vereenvoudigde workflow voor fabricage en testen

Samenvatting

Ons doel was om een bijgewerkte, gemakkelijk te volgen gids te bieden voor de fabricage en het testen van epimysiale elektromyografie-elektroden. Daartoe geven we instructies voor de inkoop van materialen en een gedetailleerde doorloop van het fabricage- en testproces.

Samenvatting

Elektromyografie (EMG) is een waardevol diagnostisch hulpmiddel voor het opsporen van neuromusculaire afwijkingen. Implanteerbare epimysiale elektroden worden vaak gebruikt om EMG-signalen te meten in preklinische modellen. Hoewel er klassieke bronnen bestaan die de principes van epimysiale elektrodefabricage beschrijven, is er een schaarste aan illustratieve informatie die de elektrodetheorie naar de praktijk vertaalt. Om dit te verhelpen, bieden we een bijgewerkte, gemakkelijk te volgen gids voor het vervaardigen en testen van een goedkope epimysiale elektrode.

Elektroden werden gemaakt door twee platina-iridiumfolies te vouwen en in een voorgesneden siliconenbasis te plaatsen om de contactoppervlakken te vormen. Vervolgens werden gecoate roestvrijstalen draden aan elk contactoppervlak gelast om de elektrodedraden te vormen. Ten slotte werd een siliconenmengsel gebruikt om de elektrode af te dichten. Ex vivo-tests werden uitgevoerd om onze op maat gemaakte elektrode te vergelijken met een industriestandaardelektrode in een zoutoplossingbad, waar hoge niveaus van signaalovereenkomst (sinus [intraclass correlatie - ICC = 0,993], vierkant [ICC = 0,995], driehoek [ICC = 0,958]) en temporale synchronie (sinus [r = 0,987], vierkant [r = 0,990], driehoek [r = 0,931]) werden gevonden in alle golfvormen. Lage niveaus van elektrode-impedantie werden ook gekwantificeerd via elektrochemische impedantiespectroscopie.

Er werd ook een in vivo prestatiebeoordeling uitgevoerd waarbij de vastus lateralis-spier van een rat chirurgisch werd geïnstrumenteerd met de op maat gemaakte elektrode en signalering werd verkregen tijdens het bergopwaarts en bergafwaarts lopen. Zoals verwacht was de piek-EMG-activiteit significant lager tijdens bergafwaarts wandelen (0,008 ± 0,005 mV) dan bergopwaarts (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), wat de geldigheid van het apparaat ondersteunt. De betrouwbaarheid en biocompatibiliteit van het apparaat werden ook ondersteund door consistente signalering tijdens niveaulopen 14 dagen en 56 dagen na implantatie (respectievelijk 0,01 ± 0,007 mV, 0,012 ± 0,007 mV; p > 0,05) en de afwezigheid van histologische ontsteking. Samen zorgen we voor een bijgewerkte workflow voor de fabricage en het testen van goedkope epimysiale elektroden.

Inleiding

Elektromyografie (EMG) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de elektrische activiteit van spieren. EMG-opnames kunnen vooral nuttig zijn in preklinische diermodellen om de effectiviteit van interventies voor de behandeling van neuromusculaire disfunctie te beoordelen. In deze modellen worden implanteerbare biocompatibele elektroden vaak gebruikt om de neurofysiologische interface tussen motorneuronen en spiervezels te beoordelen. Deze implanteerbare elektroden kunnen gelokaliseerde metingen van spierexcitatie leveren en kunnen divers zijn in termen van configuratie, vorm en materiaal, waarbij het optimale ontwerp uiteindelijk wordt bepaald door de locatie en het beoogde gebruik.

Ondanks hun geschiktheid voor het beoordelen van spierexcitatie in preklinische modellen, kan het gebruik van epimysiale elektroden worden beperkt door de kosten. Als gevolg hiervan gebruiken veel onderzoekers op maat gemaakte epimysiale elektroden die in eigen huis worden geproduceerd. Hoewel er bronnen bestaan waarin de fundamentele overwegingen van de fabricage, het testen en het gebruik van elektroden^{worden beschreven 1,2}, is er behoefte aan een bijgewerkte instructiegids waarin de inkoop, fabricage en validatie van epimysiale elektroden met behulp van moderne methoden worden beschreven. Geïnformeerd door de fundamentele werken van Loeb en Gans³ en anderen in de elektrodetheorie, presenteren we moderne instructies over de inkoop en fabricage van goedkope epimysiale elektroden en testen we hun prestaties in een reeks ex vivo en in vivo experimenten. Het doel is om een gebruiksvriendelijke gids te bieden voor anderen in de wetenschappelijke gemeenschap om in-house goedkope epimysiale elektroden voor dierlijk gebruik te vinden, te fabriceren en te testen, waardoor de bredere kwantificering van spierexcitatie in preklinische modellen mogelijk wordt.

In dit protocol bieden we een instructiegids voor het verkrijgen, vervaardigen en testen van epimysiale elektroden voor dierlijk gebruik in het moderne elektrofysiologische laboratorium. De elektrodeparameters die voor de fabricage werden gekozen, zoals de vorm, de afmetingen, het contactoppervlak, de afstand tussen de elektroden, de kabellengte, enz., werden geselecteerd om aan onze experimentele behoeften te voldoen en waren vergelijkbaar met een in de handel verkrijgbare epimysiale elektrode volgens de industriestandaard (zie de Tabel met materialen). We moedigen andere groepen aan om deze parameters aan te passen aan hun behoeften, naast het selecteren van een betrouwbare industriestandaard elektrode die past bij hun gebruikssituatie.

In een poging om lezers een relatief snel gevoel van elektrodeprestaties te geven, geven we ook een voorbeeld van een ex vivo testprotocol met de mogelijkheid om de elektrode-impedantie te meten. Daarnaast geven we een voorbeeld van een beoordeling van de elektrodeprestaties in vivo. Het ex vivo-experiment vergeleek de op maat gemaakte elektrode met een industriestandaard in een zoutbad om stabiele fysiologische omstandigheden na te bootsen. De impedantie werd ook ex vivo beoordeeld via elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS). Het in vivo experiment bestond uit de chirurgische implantatie van de op maat gemaakte elektrode in de vastus lateralis (VL) spier van een 16 weken oude vrouwelijke Long Evans-rat (HsdBlu: LE, Envigo) om het EMG-signaal te meten tijdens omstandigheden waarvan bekend is dat ze een hoog of laag signaal opwekken (bergopwaarts, bergafwaarts lopen). Om de betrouwbaarheid van de op maat gemaakte elektrode te beoordelen, werd EMG-signalering verkregen tijdens het lopen op niveau na volledig chirurgisch herstel en voorafgaand aan het offer (respectievelijk 14 dagen en 56 dagen na implantatie). Hematoxyline-eosine (H&E) kleuring werd uitgevoerd op de geïnstrumenteerde spier om de biocompatibiliteit van de op maat gemaakte elektrode te beoordelen.

Protocol

De in vivo procedure werd uitgevoerd onder goedkeuring van de Institutional Animal Care & Use Committee van de Universiteit van Michigan (IACUC approval #PRO00010765) en in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Inkoop en fabricage van elektroden

OPMERKING: Afbeelding 1 biedt een samenvatting op hoog niveau van alle belangrijke fabricagestappen met een QR-link die aanvullende visuele instructies geeft.

1. Koop biocompatibele elektrodematerialen rechtstreeks van de fabrikant in bulk voor fabricage. Zie de Materiaaltabel, die alle elektrodecomponenten en details over de herkomst bevat.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de siliconenbasis, siliconenkit en platina-iridium contactfolies biocompatibel zijn om een nadelige immuunrespons te voorkomen en chronische implantatie mogelijk te maken. Om de economische voordelen van interne fabricage te ondersteunen, presenteren we een gedetailleerde kostenanalyse van de op maat gemaakte epimysiale elektrode in vergelijking met de industriestandaard (Materiaaltabel).
2. Bereid de snij- en vouwmal voor (aanvullende vijl 1, aanvullende vijl 2). Gebruik geselecteerde 3D-printsoftware om snij- en vouwmallen te ontwerpen voor de batchproductie van identieke epimysiale elektroden.
   1. Ontwerp de snijmal zo dat de perforaties van de siliconenbasis consistent zijn en op afstand staan voor een gelijk contactoppervlak en een gelijke afstand tussen de elektroden en de afstand tussen de elektroden.
   2. Maak de inklapbare mal om de platina-iridium contactvlakken te vouwen en vereenvoudig de plaatsing van de folies in de siliconenbasis.
      OPMERKING: Gcode-bestanden worden meegeleverd; Wijzig de afmetingen en specificaties van de snij- en vouwmal om aan experimentele behoeften te voldoen.
3. Perforeer de siliconenbasis. Plaats de siliconen basis op de snijmal en plak deze vast. Perforeer de siliconen met behulp van de geleiders in de snijmal met behulp van een X-acto-mes voor het plaatsen van de contactfolies.
4. Steek de folies in de siliconenbasis om de contactvlakken te vormen. Vouw de biocompatibele, voorgesneden platina-iridium contactfolies (1,25 mm x 5 mm) met behulp van de inklapbare mal in een U-vorm. Leid vervolgens de armen van de gevouwen folies in de geperforeerde sleuven in de siliconenbasis om de contactvlakken van de elektrode te construeren. Plaats op deze manier alle 12 folies in de siliconenbasis; Laat een enkele kolom open tussen de elektroden om de juiste afstand te garanderen.
   OPMERKING: Deze configuratie maakt de fabricage van 6 bipolaire epimysiale elektroden mogelijk; Het bewerken van de snijmal kan de capaciteit indien nodig uitbreiden.
5. Verwijder de siliconenbasis van de snijmal. Plaats een stuk chirurgische tape over de contactvlakken om de folies op hun plaats te houden. Verwijder vervolgens de siliconenbasis van de snijmal, draai deze om zodat de armen van de U-vormige folie zichtbaar zijn en vouw een arm van de U-vormige folie gelijk met de siliconenbasis.
6. Sluit de elektrodekabels aan. Bereid een met perfluoralkoxy (PFA) gecoate roestvrijstalen draad voor door deze op de gewenste lengte te knippen. Verklein vervolgens het ene uiteinde van de roestvrijstalen draad ~ 1 cm met behulp van een in de handel verkrijgbare aansteker. Plaats het ontblote uiteinde van de roestvrijstalen draad aan de binnenkant van de uitgevouwen arm van de folie. Las de roestvrijstalen draad aan de arm van de folie met behulp van een Micro TIG-lasapparaat (pulsbreedte = 0, lasenergie = 25).
7. Inspecteer de lood-folie-interface. Test de draad-folieverbinding door spanning uit te oefenen op de roestvrijstalen draad. Als de verbinding standhoudt, vouwt u de arm van de folie gelijk met de siliconenbasis naar beneden en verwijdert u de tape die aan de siliconenplaat grenst.
   NOTITIE: Pas spanning toe die representatief is voor de spanning die wordt toegepast in de gespecificeerde gebruikssituatie.
8. Sluit de elektrode af. Om een dunnere consistentie te bereiken, mengt u 1 g biocompatibele vloeibare siliconen met 0,75 ml tolueen. Zuig het mengsel op met een injectiespuit met stompe punt van 18 G en breng deze aan op de gelaste zijde van elke elektrode om de achterkant van de elektroden af te dichten.
   LET OP: Tolueen is ontvlambaar, kan dodelijk zijn als het wordt ingeslikt of in de luchtwegen terechtkomt en huidirritatie veroorzaakt. Werk onder de zuurkast en blijf uit de buurt van open vuur.
9. Scheid de batch in afzonderlijke elektroden. Laat het silicone-tolueen 72 uur intrekken voordat u de elektrode aanraakt. Knip vervolgens met een schaar de siliconenbasis in afzonderlijke elektroden met een afmeting van 10 x 5 mm.
   NOTITIE: De grootte van de elektrode is afhankelijk van de afmetingen van de snijmal en het specifieke gebruik. Autoclaaf en/of reinig elektroden in een ultrasoon bad.

Figuur 1. Stappen voor de fabricage van elektroden. (A) Perforeer siliconenbasis. (B) Vorm U-vormige folies met behulp van de inklapbare mal. (C) Steek de U-vormige folies in de geperforeerde siliconenbasis. (D) Siliconenbasis bevat 12 folies om 6 bipolaire elektroden te vormen. (E) Breng chirurgische tape aan op de basis om de folies vast te zetten tijdens het verwijderen van de snijmal. (F) Verwijder de siliconenbasis van de snijmal. (G) Verwijder PFA-gecoate roestvrijstalen draad en las deze aan de rechtopstaande foliearm met behulp van een Micro TIG-lassapparaat. (H) Lijn de ontblote draden uit, breng siliconen-tolueenkit aan en laat uitharden. (I) Verdeel de siliconenbasis in afzonderlijke elektroden en reinig deze in een ultrasoon bad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Ex vivo testen

1. Sluit elektroden aan op een opnameapparaat. Draai elke elektrodedraad vast aan een kanaal op een elektrode-interfacekaart (EIB). Herhaal deze stap (met dezelfde EIB) voor een geselecteerde industriestandaardelektrode ter vergelijking. Sluit de EIB aan op een data-acquisitieplatform via een magnetisch kabelsysteem.
   OPMERKING: De industriestandaardelektrode kan elke elektrode zijn die als betrouwbaar wordt beschouwd en die past bij experimentele behoeften.
2. Aarding van de EIB. Maak het ene uiteinde van een PFA-gecoat roestvrij staal los en las het puntlassen aan een aardingsbron (bijv. een roestvrijstalen schroef). Draai de aardingsdraad vast aan dezelfde elektrode-interfacekaart in de daarvoor bestemde "aardings"-positie.
3. Zet het zoutbad op. Vul een glazen bekerglas (250 ml) met 180 ml fysiologische zoutoplossing (0,9% steriele zoutoplossing)⁴. Dompel de op maat gemaakte en industriestandaard epimysiale elektroden onder in het zoutbad en zet ze vast in een stabiele positie. Dompel vervolgens de aardingsbron onder in het zoutbad en zet deze vast. Dompel ten slotte twee stimulerende naaldelektroden onder in het zoutoplossingbad en sluit de stimulerende elektroden aan op de signaalgenerator.
4. Gebruik een signaalgenerator om signaalovereenkomst en temporele synchronie te beoordelen. Gebruik een signaalgenerator om herhaalde golfvormen met een geselecteerde spanning en frequentie (0.1 V en 5 Hz) in het zoutbad te leveren via de stimulerende elektroden (Figuur 2). Lever verschillende golfvormen (sinus, vierkant en driehoek) om opgenomen signalen te vergelijken tussen de op maat gemaakte epimysiale elektrode ten opzichte van de industriestandaard.
5. Beoordeel de prestaties informeel en visueel in realtime om te beoordelen in welke mate de signalen tussen elektroden variëren. Voer intra-class correlaties (ICC's) en Pearson-correlaties uit om respectievelijk signaalovereenkomst en temporele synchronie te beoordelen.
   OPMERKING: Voor onze analyse werden 8.000 monsters genomen bij 4.000 Hz en in realtime gefilterd met een hoog- en laagdoorlaatfilter Butterworth (hoogdoorlaat = 75 Hz; laagdoorlaat = 2 kHz).
6. Meet de impedantie van de elektrode. Om de impedantie van de elektrode te meten, verzamelt u EIS op de op maat gemaakte elektroden (bijv. 10 elektroden) over frequenties 10 Hz-31 kHz⁵ met een potentiostaat volgens de hieronder beschreven procedure door Richie et al.⁶. Zie Sarolic et al. voor aanvullende informatie over het meten van elektrode-impedantie op bipolaire elektroden⁷.
7. Dompel de epimysiale elektrode volgens de procedure van Richie et al. 1 mm onder in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik een zilver-zilverchloride (Ag|AgCl) referentie-elektrode en een roestvrijstalen staaf als tegenelektrode om het circuit te voltooien.
8. De Ag|AgCl-referentie-elektrode en de roestvrijstalen staaf in de 1x PBS met behulp van een bekerklem. Sluit de referentie-elektrode aan op de referentie van het gebruikte impedantiesysteem en sluit deze aan op de tegenelektrode-ingang van het gebruikte impedantiesysteem.
9. Gebruik een potentiostaat om een impedantiescan van 1 kHz uit te voeren. Stel in op een scanfrequentie van 1 kHz bij 0.01 V_rms in een enkele sinusgolfvorm. Stel tijdens de eerste 5 seconden van de scan de potentiostaat in op 0 V om het opgenomen signaal te stabiliseren. Gebruik de aan de potentiostaat gekoppelde software om de metingen vast te leggen.

Figuur 2: Ex vivo testen: Zoutbad met de op maat gemaakte elektrode, industriestandaard elektroden, twee stimulerende elektroden en een aardbron. Signaalovereenkomst en temporele synchronie werden beoordeeld door sinus-, vierkants- en driehoeksgolven vanuit de signaalgenerator in het zoutbad te brengen en de golfvormen die door de respectieve elektroden werden gedetecteerd op te nemen met behulp van een data-acquisitieplatform. OPMERKING: Elektrochemische impedantiespectroscopie is niet afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. In vivo testen

OPMERKING: De in vivo testprocedure beschrijft onze experimentele use case. Het wordt aanbevolen om op maat gemaakte epimysiale elektroden in vivo te testen op een manier die overeenkomt met de beoogde experimentele omstandigheden van de gebruiker.

1. Bekijk chirurgische informatie; Raadpleeg informatie voor chirurgen die het proces van het implanteren van chronische neurale opname-elektroden leren met behulp van de volgende bronnen: ^8,9.
   OPMERKING: Aangezien de focus van ons manuscript ligt op het vervaardigen en testen van elektroden, geven we hier slechts een kort overzicht van chirurgische technieken die in ons laboratorium worden gebruikt voor in vivo elektrodetesten.
2. Selecteer een rat die moet worden geïnstrumenteerd (bijv. een vrouwelijke Long Evans-rat op de leeftijd van 16 weken). Laat de rat een laboratoriumacclimatisatie van 1 week ondergaan voordat hij op de loopband acclimatiseert. Stel de rat na acclimatisatie in het laboratorium geleidelijk bloot aan een knaagdierloopband met toenemende snelheden tot 16 m/min.
3. Bereid de EIB voor door eerst een op maat gemaakte epimysiale elektrode op de EIB aan te sluiten door elke elektrodekabel op een kanaal op de EIB vast te pinnen. Om de EIB te aarden, verwijdert u het ene uiteinde van een PFA-gecoate roestvrijstalen draad en las u deze puntlassen op een geselecteerde aarding (bijv. roestvrijstalen schroef). Draai vervolgens de aardingsdraad vast aan dezelfde EIB in de daarvoor bestemde "massa" -positie.
   NOTITIE: Om de elektrode tijdens het instrumenteren te beschermen, wikkelt u deze in een beschermende bekleding (bijv. parafilm).
4. Desinfecteer alle chirurgische instrumenten en het operatiegebied voordat u begint. Gebruik verzegelde, aseptische chirurgische benodigdheden en autoclaaf alle chirurgische instrumenten die niet in een steriele verpakking zitten. Creëer een steriel operatieveld met behulp van een chirurgisch laken.
5. Verdoof het dier met behulp van een inductiekamer met 3-5% isofluraan en 1 l/min zuurstof en onderhoud via een neuskegel met 2% isofluraan en 500 ml zuurstof tijdens de voorbereiding van de rat. Na het bereiken van het chirurgische anesthesievlak, beoordeeld via teenknijpen, oogzalf aanbrengen, de ademhalingsfrequentie controleren (70-110 ademhalingen/min) en de kerntemperatuur beoordelen met behulp van een rectale sonde.
6. Scheer vervolgens de operatieplaats met een tondeuse voor dieren en verwijder vuil van de operatieplaats. Zodra het operatiegebied is geschoren, desinfecteert u de operatieplaats met chloorhexidine, isopropylalcohol en povidonjodium door vanuit het midden naar de buitenkant van het operatiegebied te schrobben. Dien pijnstillers toe zoals nodig en goedgekeurd en zorg voor warmte om de kerntemperatuur van het lichaam (37,5-38,5 °C) op peil te houden. Plaats de rat na de voorbereiding in een stereotactisch frame en stel het steriele veld in.
7. Voor een goede chirurgische voorbereiding van de chirurg moet u de handen grondig wassen met zeep en/of een ontsmettingsmiddel (chloorhexidine). Trek de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen aan: masker, steriele handschoenen en een wegwerpjas/scrubtop. Trek nieuwe steriele handschoenen aan als de aseptische techniek om welke reden dan ook wordt geschonden.
8. Om de rechter VL te instrumenteren, gebruikt u een scalpel om een incisie van 3-5 cm te maken op het anterolaterale deel van de rechterachterpoot en gebruikt u stompe dissectie om de VL-spier te identificeren.
9. Maak een incisie van 1 cm in het sagittale vlak langs de coronale hechting en leg de schedel bloot. Maak met een dunne tang een onderhuidse tunnel van de rechter achterpoot naar de basis van de schedel. Gebruik de tang om de elektrode vast te pakken en leid de elektrode naar de VL.
10. Gebruik een botboor om een gat in de calvaria te maken (zorg ervoor dat de specificaties van de boor overeenkomen met die van de grondschroef). Draai de grondschroef vast en bevestig de EIB met tandheelkundig cement aan de schedel.
    OPMERKING: Kleine hoeveelheden waterstofperoxide kunnen worden aangebracht om de poreusheid van de schedel te vergroten en de hechting van het tandcement te verbeteren.
11. Nadat u de VL-spier hebt geïdentificeerd, implanteert u de op maat gemaakte epimysiale elektrode die is geïmplanteerd in lijn met de spiervezels met behulp van 4-0 niet-resorbeerbaar monofilament. Sluit de incisie met behulp van wondklemmen of door te hechten.
12. Haal het dier na sluiting uit de narcose en plaats het afzonderlijk in een schone, droge dierenkooi. Laat de rat herstellen op een verwarmd kussen en controleer elke 15 minuten de temperatuur en ademhalingsfrequentie van de rat totdat het dier ambulant is. Behandel postoperatieve pijn door een goedgekeurde pijnstiller toe te dienen in de dagen na instrumentatie.
    OPMERKING: rat moet individueel worden gehuisvest totdat hij volledig hersteld is.
13. Voer na een periode van 14 dagen in vivo elektrodetesten uit om de geldigheid van de op maat gemaakte epimysiale elektrode te beoordelen om fysiologische veranderingen in spieractiviteit vast te leggen. Plaats de geïnstrumenteerde rat op een knaagdierloopband en stel hem willekeurig bloot aan bergopwaartse en bergafwaartse loopomstandigheden die een toename of vermindering van VL EMG-signalering veroorzaken (16° helling, 16° daling bij 16 meter/minuut). Verzamel longitudinale gegevens (bijv. 14 dagen en 56 dagen na instrumentatie) om de betrouwbaarheid in de loop van de tijd te garanderen.
    OPMERKING: Beoordelingen van 14 en 56 dagen zijn geselecteerd omdat een periode van 14 dagen volledig chirurgisch herstel mogelijk maakt en die van 56 dagen onze experimentele tijdlijn overschrijdt. We moedigen anderen aan om de prestaties en betrouwbaarheid van de elektrode te testen met behulp van een tijdsbestek dat hun experimentele tijdlijn vóór gebruik repliceert. Snelheid (16 m/min) en loopomstandigheden (16° helling, 16° daling) werden geselecteerd om te voldoen aan de vastgestelde omstandigheden van verhoogde en verlaagde VL-excitatie in dit model¹⁰.
14. Wijzig de acquisitieparameters om aan de experimentele behoeften te voldoen. Leg EMG-signalering vast tijdens het lopen met een snelheid van 2.000 Hz met behulp van het data-acquisitieplatform en synchroniseer met een motion capture-systeem.
    NOTITIE: Als u een ander acquisitieapparaat gebruikt, verzamel dan EMG en motion capture volgens de instructies van de fabrikant en om aan experimentele behoeften te voldoen.
15. Extraheer 25 s aan loopgegevens uit elke loopconditie en exporteer deze naar een aangepast Python-script voor verdere signaalverwerking en -analyse. Basislijn aanpassen (nul), corrigeren en gladstrijken met behulp van een wortelgemiddeld vierkant algoritme met een opslaglocatie van 50 ms. Pas een algoritme voor piekdetectie toe om RMS-EMG-pieken te selecteren die u kunt gebruiken voor daaropvolgende gegevensanalyses.
    OPMERKING: We hebben kort methoden beschreven om EMG-gegevens voor te verwerken en te analyseren, aangezien deze stap sterk varieert als gevolg van programmeertalen en EMG-acquisitiesoftware en -hardware. We raden auteurs aan om de volgende bronnen te raadplegen voor aanvullende informatie^: 3,11,12,13.

4. Biocompatibiliteit testen

1. Na het einde van longitudinale EMG-verzamelingen (of op een geselecteerd tijdstip), euthanaseert u de rat met behulp van geschikte en goedgekeurde methoden (bijv. verstikking met CO₂ gevolgd door bilaterale thoracotomie).
2. Extraheer na euthanasie bilaterale VL-spieren door een incisie te maken in de anterolaterale rechter- en linkerachterpoten. Diepvries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de elektrode tijdens de extractie op zijn plaats blijft op de geïnstrumenteerde spier (bijv. de rechter VL). U kunt ook het gebied van de sub-elektrode markeren of alleen de spier uit het gebied van de sub-elektrode halen. Dit geldt niet voor de contralaterale/controlespier.
3. Gebruik een cryostaat om seriële spierdoorsneden (7 μm) te snijden uit het gebied direct onder de elektrode-fasciale interface. Snijd secties uit de spierbuik van de contralaterale VL om als controle te dienen. Zie Kumar et al. voor details over cryosecties¹⁴.
4. Beitsen met Hematoxyline en Eosine (H&E); zie Wang et al. voor details over H&E-kleuring op dwarsdoorsneden van skeletspieren¹⁵.
5. Onderzoek de gekleurde delen (geïnstrumenteerd en controle) met behulp van een lichtmicroscoop met een vergroting van 20x. Analyseer histologische veranderingen blind voor de oorsprong van de monsters. Beoordeel de weefselgezondheid beoordeeld aan de hand van de volgende pathologische kenmerken: infiltratie van immuuncellen, interne myonucleaire accumulatie, fibrogenese en sarcolemmafragmentatie.

5. Voorgestelde statistische analyses

1. Om de prestaties van de op maat gemaakte epimyisal-elektrode te beoordelen in vergelijking met de industriestandaard, importeert u de ex vivo-gegevens in een geselecteerd statistisch pakket. Pas de volgende statistische tests toe op de ex vivo-gegevens die zijn verzameld van de op maat gemaakte en industriestandaard elektroden (bijv. 8.000 representatieve monsters van de sinus-, driehoeks- en vierkante golfvormen). Stel het alfaniveau a priori in op p ≤ 0,05.
   1. Om het niveau van signaalovereenkomst tussen elektroden te testen, gebruikt u intraclass-correlaties (ICC's) en Bland-Altman-plots. Bereken ICC-schattingen en hun 95%-betrouwbaarheidsintervallen op basis van een enkelvoudig (k = 2), absolute-overeenstemming, 2-weg willekeurige-effectenmodel.
   2. Om te testen in welke mate de registratie van de golfvormen in de loop van de tijd covarieerde, ook wel temporele synchronie genoemd, voert u een Pearson-correlatie uit op waarden die zijn verzameld met de op maat gemaakte en industriestandaard elektroden.
   3. Vergelijk de gemiddelde elektrode-impedantie voor beide contactvlakken (gemeten bij 1 kHz) van geselecteerde, op maat gemaakte elektroden (bijv. 10 elektroden) met de impedantie van de industriestandaard elektrode.
      OPMERKING: De impedantiewaarden van de elektrode verschillen afhankelijk van het gebruik en de materialen die worden gebruikt tijdens de fabricage van de elektrode.
2. Om de kwaliteit van de in vivo opnames te beoordelen, importeert u de gegevens die zijn verzameld tijdens het lopen op de loopband naar een geselecteerd statistisch pakket.
   1. Om de geldigheid van de op maat gemaakte elektrode te beoordelen tijdens in vivo tests (waarbij de gang van de rat werd verstoord door bergopwaarts en bergafwaarts te lopen om fysiologische veranderingen in spieractiviteit te induceren), voert u de t-test van Welch uit om de gemiddelde piekwaarden voor bergopwaarts en bergafwaarts lopen te vergelijken.
      OPMERKING: Lezers worden aangemoedigd om aanvullende tests en analyses uit te voeren (bijv. signaal-ruisverhouding (SNR)-beoordelingen; zie Delysys Fundamental Concepts in EMG Signal Acquisition) die hier kortheidshalve¹⁶ niet worden gepresenteerd.
   2. Om de betrouwbaarheid van de signalering van de elektrode in de loop van de tijd te beoordelen, evalueert u de longitudinale gegevens die zijn verzameld onder consistente omstandigheden (waterpas lopen met 16 m/min met tussenpozen van 14 en 56 dagen na implantatie) via gepaarde t-tests.

Resultaten

Ex vivo prestaties
ICC's toonden een hoge mate van overeenstemming aan tussen de op maat gemaakte en industriestandaard elektroden over alle golfvormen (sinus [ICC = 0,993], vierkant [ICC = 0,995], driehoek [ICC = 0,958]; p < 0,001). Bland-Altman-plots onthulden ook een hoge mate van signaalovereenkomst tussen elektroden. Flauwe Altman-plots en Pearson-correlaties zijn samengevat in figuur 3 met sterke positieve correlaties tussen de op maat gemaakte en industriestandaard elektroden. Pearson-correlaties onthulden hoge niveaus van temporele synchronie tussen de op maat gemaakte en industriestandaard elektrode over alle golfvormen (sinus [r = 0,987], vierkant [r = 0,990], driehoek [r = 0,931]).

Figuur 3: Ex vivo testresultaten. Onbewerkte gegevens van op maat gemaakte en industriestandaard elektroden voor een herhaalde (A) sinusgolf, (D) blokgolf en (G) driehoeksgolf bij 0,1 V en 5 Hz. (B,E,H) Correlatie tussen spanningsmetingen voor de aangepaste en MicroProbe-elektroden voor 8.000 monsters van de respectieve golfvormen. (C,F,I) Flauwe Altman-plot waarin het procentuele verschil tussen de aangepaste en MicroProbe-elektrode wordt beoordeeld over de gemiddelde waarden van de respectieve golfvormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een representatief impedantiespectrum voor een op maat gemaakte epimysiale elektrode wordt weergegeven in figuur 4. Hoewel impedantiemetingen werden verzameld van 10 Hz tot 31 kHz, worden de resultaten gerapporteerd bij 1 kHz, wat een relevante frequentie is voor EMG-acquisitie. De industriestandaard (referentie-elektrode) had een impedantie van 2 kΩ. Ter vergelijking: de gemiddelde impedantie van 10 op maat gemaakte epimysiale elektroden was 3,61 ± 7,95 kΩ en 1,63 ± 1,59 kΩ bij 1 kHz voor respectievelijk contactoppervlakken 1 en 2.

Figuur 4: Impedantie. Bode-magnitudegrafiek die de impedantiewaarde in Ohm (Ω) bij ~ 1 kHz weergeeft voor een representatieve, op maat gemaakte epimysiale elektrode. Kanalen 1 en 2 hebben betrekking op respectievelijk contactvlakken 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In vivo prestaties (Supplemental Video S1)
De op maat gemaakte elektrode legde effectief de fysiologische fluctuaties in VL EMG-activiteit vast die werden geïnduceerd tijdens verschillende loopomstandigheden op de loopband. Met name de gemiddelde piek EMG-activiteit bleek significant lager te zijn tijdens bergafwaarts lopen (0,008 ± 0,005 mV) dan bergopwaarts (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), in overeenstemming met eerdere bevindingen¹⁰. Bovendien bleek uit een gepaarde t-test dat de piek-EMG-amplitudewaarden na 14 dagen (0,01 ± 0,007 mV) geen significant verschil vertoonden met die op 56 dagen (0,012 ± 0,007 mV, p > 0,05), wat de betrouwbaarheid van het apparaat op lange termijn ondersteunt (Figuur 5). Aanzienlijk verschillende EMG-magnitudewaarden onder dezelfde opnameomstandigheden kunnen een indicatie zijn van schade aan of falen van de elektrode.

Figuur 5: Betrouwbaarheid van de in-vivo-elektroden . Tukey boxplot van piek EMG-amplitude (mV) van de vastus lateralis tijdens vlak lopen op de loopband (16 m/min) op 14 dagen (T14) en 56 dagen (T56) na instrumentatie. Afkortingen: EMG = elektromyografie; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Biocompatibiliteit
H&E toonde geen bewijs van ontsteking in de controlespier (Figuur 6, linkerpaneel) ten opzichte van de geïnstrumenteerde spier (Figuur 6, rechterpaneel). Dit omvatte geen duidelijk bewijs van infiltratie van immuuncellen, interne myonucleaire accumulatie, fibrogenese en/of sarcolemmafragmentatie tussen dwarsdoorsneden die uit de controle- of geïnstrumenteerde spier waren geëxtraheerd.

Figuur 6: Biocompatibiliteit. Histologische vergelijking van controle- (links) en geïnstrumenteerde (rechts) vastus lateralis-spieren gekleurd met hematoxyline en eosine (40x). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Catch_tray.gcode. 3D-printsjabloon van de opvangbak, ontworpen als onderdeel van de vouwmal om de gevouwen folies van de vouwmal op te vangen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Cutting_jig.gcode. 3D-printsjabloon van de snijmal, die gelijkmatig verdeelde sleuven bevat als richtlijn om de siliconenbasis consequent te perforeren. De snijmal is geconfigureerd voor de plaatsing van twintig folies om tien bipolaire epimysiale elektroden te vormen. We gebruiken momenteel echter de snijmal om een batch van zes bipolaire elektroden te produceren, omdat we voorstellen om een ruimte tussen de elektroden te laten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Folding_jig.gcode. 3D-printsjabloon van de vouwmal, waarmee de platina-iridiumfolies gemakkelijker kunnen worden gevouwen om de gewenste U-vorm te vormen. Het vouwen van de folies kan indien nodig ook handmatig worden uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S1: In vivo testen. EMG-signalering van de VL tijdens decline walking (-16°) op een gemotoriseerde loopband met 16 m/min met behulp van de op maat gemaakte epimysiale EMG-elektrode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Ons doel was om het EMG-fabricageproces te stroomlijnen, waardoor een bredere acceptatie en implementatie van epimysiale elektrodeontwerpen mogelijk zou worden, waardoor de toegankelijkheid zou worden bevorderd en neuromusculair onderzoek zou worden bevorderd. Daartoe presenteren we een gebruiksvriendelijke gids voor het in-house zoeken, fabriceren en testen van goedkope epimysiale elektroden. In de hoop andere onderzoeksgroepen te ondersteunen, bieden we ook aanvullende 3D-printsjablonen om de productie van interne epimysiale elektroden voor hun onderzoeksinspanningen te vergemakkelijken.

Onderzoekers die de toepassing van deze fabricagetechnieken overwegen, moeten het volgende in overweging nemen: 1) de elektrodeparameters die in deze workflow zijn gespecificeerd (vorm, afmetingen, contactoppervlak, afstand tussen de elektroden, kabellengte, enz.) zijn geselecteerd om bij ons experimentele model te passen en zullen moeten worden aangepast voor verschillende gebruiksscenario's, 2) het lassen van de geleidingsdraden aan de contactfolies is een cruciale stap die oefening vereist voor een succesvolle uitvoering; Het aanpassen van de pulsbreedte en lasenergie tijdens het lassen kan het succes vergroten, 3) het is essentieel om spanning op de geleidingsdraden uit te oefenen en de prestaties van de interface na het lassen te beoordelen om de verbinding tussen lood en contactoppervlak te testen, 4) De laatste fabricagestap omvat het coaten en afdichten van de elektrode met siliconen, een eenvoudig maar cruciaal proces voor optimale elektrodeprestaties. De siliconencoating moet dun en relatief glad zijn om irritatie van het huidweefsel tijdens implantatie te voorkomen, maar een te dunne coating kan de prestaties van de elektrode nadelig beïnvloeden. Onderzoekers wordt geadviseerd om de verhouding siliconen-tolueen aan te passen volgens hun specificaties om een robuuste maar toch dunne en gladde laag siliconenkit te verkrijgen.

Bij het beoordelen van de elektrodeprestaties moeten anderen het volgende opmerken: 1) we hebben een voorbeeld gegeven van een in vivo beoordeling, maar we moedigen de lezer aan om een in vivo testprocedure te gebruiken die het beoogde gebruik van hun op maat gemaakte epimysiale elektrode nabootst, 2) ons in vivo testprotocol stond ook niet ruimtelijk de gelijktijdige implantatie van de op maat gemaakte en industriestandaard elektroden toe. Als zodanig kon de signaalovereenkomst tussen elektroden niet in vivo worden gemeten en werd deze daarom niet geëvalueerd, 3) bovendien liet onze in vivo testconfiguratie de beoordeling van de elektrode-impedantie na implantatie niet toe, 4) het is belangrijk om te bedenken dat onze gegevens ex vivo zijn getest bij relatief lage spanningsniveaus (<1 V) vanwege onze experimentele behoeften. Onderzoekers die overwegen deze elektroden aan boord te nemen, willen dus misschien hun bruikbaarheid bij hogere spanningen testen. Dit zijn overwegingen waarmee anderen rekening kunnen houden bij het testen van hun eigen epimysiale elektroden.

Eerder werk heeft het potentieel van meerkanaals en high-density opname-elektroden benadrukt om de activiteit van motorneuronen nauwkeuriger te decoderen 17,18,19,20. We moedigen diegenen die geïnteresseerd zijn in het ontwikkelen en gebruiken van meerkanaals epimysiale elektroden aan om de instructiebronnen die we hier bieden te gebruiken en uit te breiden. Epimysiale elektroden dienen niet alleen als opname-elektroden, maar worden ook vaak gebruikt als stimulerende elektroden bij neurostimulatie 21,22,23 en prothesen controle-experimenten ^24,25. Voor degenen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van epimysiale elektroden voor deze doeleinden, moedigen we hen aan om voort te bouwen op ons werk en het stimulerende vermogen van hun eigen op maat gemaakte epimyisale elektroden te testen.

Over het algemeen is de kwantificering van de elektrische activiteit van spieren van fundamenteel belang voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van talrijke pathologieën en de effectiviteit van mogelijke behandelingen. Deze bijgewerkte workflow vertegenwoordigt een eenvoudige gids voor het produceren van in-house, kosteneffectieve epimysiale elektroden die kunnen worden gebruikt om deze belangrijke maatstaf voor de gezondheid van het bewegingsapparaat op betrouwbare wijze te kwantificeren. We hopen dat deze methodologie als sjabloon kan dienen voor andere groepen om hun eigen op maat gemaakte epimysiale elektroden te fabriceren en te testen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Elektrodematerialen
			Aantal & prijs per elektrode
Contactoppervlak	Prince and Izant PT90/IR10 1,25 mm x 5 mm folie	Catalogus #1040055	2 per elektrode $7,50 per folie $15,00 per elektrode
PFA-gecoate roestvrijstalen elektrodenleidingdraad	A-M Systems Multi-Stranded PFA-Coated Stainless Steel Wire 50,8 µm strengdiameter	Catalogus #793500	Afhankelijk van gewenste draadlengte (bijv. 9 inch draadleidingen x2) $128 per 25 voet spoel $5,12 per voet $0,42 per inch (x18) $7,68 per elektrode
Vouwende mal	3D-gedrukt (zie .gcode-bestand)	NA	NA
Dichtingsmiddel voor elektrodelichaam	Nusil Med-1137 vloeibaar siliconen	Catalogus #MED-1137	1 gram $344,66 per 2 oz. (59,15 mL) $5,83 per elektrode
Silicone basis	Implantech Alliedsil Silicone Sheeting-Reinforced, Long Term Implantable (8” x 6”).007 dik	Catalogus #701-07	10mm x 5mm vel $225,00 per 8 x 6 inch $0,36 per elektrode (10 mm x 5 mm)
Verdunner voor afdichtingsmengsel	Tolueen 99,5% ACS Reagent 500ML of Xyleen ACS 99,5%	Catalogus #179418-500 ML	0,75 mL $25,53 per 500 mL $0,38 per elektrode
Sjabloon voor het doorboren van de siliconen basis	Snijdmal – 3D-gedrukt (zie CAD-bestand)	NA	NA
Op maat gemaakte elektrode: $29,25
Branchestandaard elektrode (EP105 EMG Patch Electrode, 2 contacten, enkelzijdig, 7mm x 4mm, MicroProbe voor Life Science): $305,00
Aanvullende fabricagematerialen
			Aantal & prijs per elektrode
3D-printsoftware	Solidworks (Solidworks, 2022)
Micro-Tig lasser	Micro-Tig lasser (CD1000SPM, Single Pulse Research and Light Production Resistance Spot Welder, Sunstone)	SKU 301010	$3.500
Ultrasoon bad	Ultrasoon bad (CPX Series Ultrasonic Bath, Fisherbrand).	15-337-403	NA
Ex Vivo Testmaterialen
			Aantal & prijs per elektrode
Data-acquisitieplatform en software	DigitalLynx 4sX Base Cheetah versie 6.0 (Neuralynx Inc.)	NA	EMG-acquisitiehardware en -software
Elektrode-interfaceboard (EIB)	EIB, EIB16-QC, Neuralynx Inc.	31-0603-0007	NA
Signaalgenerator	5 MHz Functiegenerator, B&K Precision	4005DDS220V	$387,46
Potentiostaat	PGSTAT1 potentiostaat (EcoChemie, Utrecht, Nederland)	NA	NA
Roestvrijstalen schroef	Fine Science Tools	19010-00	$98
Ex Vivo Testmaterialen
			Aantal & prijs per elektrode
Rodent loopband	Exer 3/6 Open Loopband, Columbus Instruments	NA	NA
Tandartscement	Excel Formula® Pourable Dental Material, St. George Technology Inc.	#24211	$125,60
Lichtmicroscoop	Keyence BZ-X800, Keyence Corporation, Osaka, Japan	NA	NA
Bewegingsregistratiesysteem	Optitrack Color Camera, Optitrack, NaturalPoint Inc.	NA	NA
Piekdetectie-algoritme	“SciPy.signal.find_peaks - SciPy v1.8.1 Handleiding”, 2022	NA	NA
Python-software	Python Software Foundation. Python Language Reference, versie 3.9. Beschikbaar op http://www.python.org	NA	NA
Ratten	HsdBlu: LE, Envigo	140	NA
Statistische software	GraphPad Prism versie 10.0.0 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA)	NA	NA