Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het hart van zoogdieren is een complex orgaan dat tijdens de ontwikkeling wordt gevormd via zeer diverse populaties van voorlopercellen. De oorsprong, het tijdstip van rekrutering en het lot van deze voorouders zijn van vitaal belang voor de goede ontwikkeling van dit orgaan. De moleculaire mechanismen die de morfogenese van het hart bepalen, zijn essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van aangeboren hartaandoeningen en embryonale hartregeneratie. Klassieke benaderingen om deze mechanismen te onderzoeken, gebruikten de generatie van transgene muizen om de functie van specifieke genen tijdens de cardiale ontwikkeling te beoordelen. Transgenese van muizen is echter een complex, tijdrovend proces dat vaak niet kan worden uitgevoerd om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van het hart te beoordelen. Om dit aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld voor efficiënte elektroporatie en kweek van embryonale harten van muizen, waardoor transiënte transgenese snel het effect van functiewinst of functieverlies van genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van het hart kan beoordelen. Met behulp van deze methodologie hebben we Meis1 met succes tot overexpressie gebracht in het embryonale hart, met een voorkeur voor epicardiale celtransfectie, wat de mogelijkheden van de techniek aantoont.
Inleiding
Het hart is het eerste orgaan dat tijdens de embryonale ontwikkeling wordt gevormd. Dit proces omvat de spatiotemporele coördinatie van verschillende populaties voorlopercellen uit verschillende delen van het embryo. Dit alles gebeurt terwijl het zich ontwikkelende hart blijft kloppen en functioneren, met de nadruk op de opmerkelijke coördinatie die nodig is voor de vormingervan 1,2,3. Gezien de cruciale rol van het hart is een strakke regulatie op cellulair en moleculair niveau essentieel voor de juiste vorming ervan 4,5. Het identificeren van de mechanismen die de ontwikkeling van het hart regelen, is van groot belang geweest, omdat ze cruciaal zijn voor het ontrafelen van aangeboren hartaandoeningen, die een aanzienlijk aantal patiënten wereldwijdtreffen6. Bovendien is het begrijpen van de ontwikkeling van het hart cruciaal bij het ontcijferen van hartregeneratie, aangezien postnatale zoogdierharten een regeneratief vermogen behouden dat op volwassen leeftijd verloren gaat of wordt belemmerd 7,8. Daarom is het ontleden van moleculaire regulatoren van de ontwikkeling van het hart absoluut noodzakelijk om de onderzoeksinspanningen op het gebied van aangeboren hartaandoeningen en hartregeneratie te bevorderen.
Bij het nastreven van dit doel is er een groeiende focus op het onderzoeken van de rol van het epicardium in de ontwikkeling en regeneratie van het hart. Het epicardium is een dunne laag mesotheelweefsel die de buitenste laag van het hart van zoogdieren vormt (figuur 1). Recente studies hebben het belang van het epicardium tijdens hartletsel aangetoond, waaruit blijkt dat dit weefsel in staat is om proliferatiesignalen naar cardiomyocyten in het getroffen gebied te sturen om de schade te beperken10,11. Ondanks het belang van het epicardium, is het uitvoeren van verder moleculair onderzoek uitgedaagd door de immense heterogeniteit ervan. Single-cell RNAseq-experimenten hebben de heterogeniteit van het epicardium onthuld, met subpopulaties van meerdere cellen met verschillende transcriptomische handtekeningen 12,13,14,15,16. Een strategie om potentiële regulatoren van de cardiale ontwikkeling te screenen, moet dus rekening houden met de diversiteit van epicardiale voorlopercellen.
In die zin heeft de gevoeligheid van het muismodel voor genetische modificatie de identificatie van talrijke genen die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van het hart vergemakkelijkt, waardoor mutante lijnen met gain-of-function (GOF) of loss-of-function (LOF) van specifieke genen kunnen worden gegenereerd. Deze benaderingen impliceren echter een aanzienlijke investering van tijd en experimentele middelen; Daarom zijn ze onpraktisch bij het beoordelen van de rollen van een groot aantal kandidaat-genen. Bovendien oefenen ontwikkelingsgenen vaak pleiotrope functies uit in verschillende weefsels of zijn ze nodig voor de vroege embryonale ontwikkeling, waardoor de interpretatie van hun bijdrage aan de ontwikkeling in een specifiek proces wordt belemmerd. Hoewel het mogelijk is om de genfunctie te richten op specifieke structuren of ontwikkelingstijdstippen, vereist dit meestal het gebruik van complexere genetische constructies, die moeilijk te genereren kunnen zijn of over het algemeen niet beschikbaar zijn.
Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een methodologie om embryonale harten van muizen te elektropoleren voor voorbijgaande transgenese (Figuur 2). In combinatie met ex vivo-cultuur en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), demonstreert deze strategie zijn mogelijkheden door middel van voorbijgaande GOF van Meis1, een goed gekarakteriseerd gen dat betrokken is bij de ontwikkeling en regeneratie van het hart 17,18,19. In dit artikel worden ook andere mogelijke toepassingen van deze methodologie onderzocht en worden de voordelen en beperkingen ervan besproken, evenals vergeleken met bestaande protocollen voor het tijdelijk moduleren van genexpressie. Wij zijn van mening dat het gepresenteerde raamwerk en de visuele voorbeelden het begrip van de epicardiumbiologie tijdens ontwikkeling en ziekte zullen vergroten.
Figuur 1: Embryonale hartlagen van muizen. Schematisch diagram van een coronaal aanzicht van een E13-14 muisembryonaal hart. De drie belangrijkste cellulaire lagen van het hart worden weergegeven in geel (endocardium), rood (myocardium) en blauw (epicardium). Het hartzakje wordt weergegeven in een bruine lijn. De vier kamers van het hart worden afgekort als LV, linkerventrikel; RV, rechter ventrikel; LA, linker atrium; RA, rechter atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch overzicht van het hartelektroporatieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de CNIC Ethische Commissie voor dierproeven en voldoen aan de huidige wetgeving, waaronder EU-richtlijn 2010/63EU en Aanbeveling 2007/526/EG, zoals gehandhaafd door de Spaanse wet onder Real Decreto 53/2013. Voor dit protocol werden vrouwelijke wildtype CD-1-muizen van 15-21 weken oud gebruikt. Details over de dieren, reagentia en gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Plasmide en gereedschapsvoorbereiding
- Bereid eerst de elektroporatiemix voor door het gewenste plasmide-DNA in ijs toe te voegen in een eindconcentratie van 1 μg/μL. Voltooi vervolgens het mengsel door sucrose toe te voegen in een eindconcentratie van 6% (opgelost in PBS), een biocompatibele kleurstof in 0,01% en voltooi met PBS tot een eindvolume van 30 μL.
OPMERKING: Per monster wordt ongeveer 1-2 μL van het elektroporatiemengsel gebruikt. Schaal de verhoudingen van het elektroporatiemengsel op basis van het aantal monsters in het experiment. Houd er rekening mee dat DNA voor elektroporatie moet worden gezuiverd uit de bacteriecultuur, waardoor optimale stabiliteit en minimale verontreinigingen worden gegarandeerd. Voor meer informatie over de plasmiden die voor dit onderzoek zijn gebruikt, verwijzen wij u naar de sectie representatieve resultaten. - Bereid Growth Medium voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 2% Hepesbuffer en 1% penicilline/streptomycine. Bewaar het medium in een incubator bij 37 °C tot gebruik. Verwarm daarnaast 1x PBS bij 37 °C, samen met het groeimedium.
- Bereid de naalden voor door een glazen capillair met een diameter van 20 μm uit te rekken met behulp van een pipettrekker met de volgende voorwaarden: warmte = 550; trekken = 100; snelheid = 250; tijd = 120. De uiteindelijke diameter na het trekken moet ongeveer tussen de 5-8 μm liggen.
- Stel de parameters van de elektroporator in op vijf cycli van 50 ms bij 40 V met intervallen van 900 ms. Bereid de elektroden, de mondpipet en de stompe naald voor (Figuur 3A). Rust de pipet uit met de naald om het DNA te laden (Figuur 3A).
2. Embryodissectie en hartextractie
- Zet een kruising op tussen wild-type CD-1 muizen. Selecteer de volgende ochtend de vrouwtjes die een vaginale plug vertonen en noteer deze tijd als embryonale dag E0.5. Euthanaseren van de dieren op embryonale dag E12-12.5 door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Haal de baarmoeder voorzichtig uit de muis en leg deze in een droge papieren handdoek. Knip vervolgens de baarmoeder af met een fijne schaar door de punt van de schaar in de mesometriumzijde te steken en de rand van het mes langzaam over de hele lengte te laten lopen. Leg de deciduae bloot en breng ze over naar het groeimedium. Zie voor meer details het werk van Behringer et al.20.
- Ontleed de deciduae om de embryo's te extraheren en plaats de embryo's vervolgens in een petrischaal van 60 mm met warm groeimedium. Snijd met een fijne tang voorzichtig de staart en het hoofd van het embryo af, zodat alleen de romp van het lichaam overblijft. Het stadium van de embryo's kan worden geverifieerd door anatomische kenmerken te beoordelen, zoals beschreven door Wong et al.21.
- Verwijder vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk weefsel uit de romp van het embryo zonder het hart of de long- en aortaslagaders te beschadigen. Zodra het hart is blootgesteld, plaatst u het onmiddellijk in een nieuw, warm groeimedium en bewaart u het in een incubator bij 37 °C tot elektroporatie.
OPMERKING: Het op peil houden van de temperatuur van het hart is cruciaal voor het voortbestaan. Zorg ervoor dat het medium altijd warm is en vervang het elke 5-10 min. Aan de andere kant kunnen monsters worden gehanteerd zonder de steriliteit te behouden, omdat dit de efficiëntie van de procedure niet zal beïnvloeden. Houd er rekening mee dat het groeimedium antibiotica bevat.
3. Hartelektroporatie en ex vivo cultuur
- Laad ongeveer 10 μL plasmidemengsel (bereid in stap 1.1) in de naald door voorzichtig op te zuigen met de mondpipet.
- Bereid een enkel hart voor op elektroporatie door het in een schone petrischaal van 60 mm te plaatsen met steriel 1x PBS opgewarmd tot 37 °C. Plaats de schaal onder de snijmicroscoop (Figuur 3A).
- Bereid de elektroden voor door de afstand tussen de positieve en negatieve polen in te stellen op ongeveer 4 mm (Figuur 3B).
OPMERKING: 4 mm is de diafragmaafstand waarin E12.5-muisharten in de elektroden passen die in dit werk worden gebruikt. Overweeg om deze afstand te wijzigen op basis van verschillende monstergroottes of elektrodespecificaties. - Prik voorzichtig in de meest oppervlakkige laag van het hart met de naald in de mondpipet. Pipetter voorzichtig 1-2 μL van het plasmidemengsel en verwijder de naald. Er kunnen meerdere injecties worden uitgevoerd om een optimale penetratie te garanderen en om het aantal geëlektropoleerde cellen uit te breiden.
- Houd de elektroden op hun plaats zodat het hart zich tussen beide polen bevindt (Figuur 3C). Elektropoleer vervolgens het hart met de hierboven gespecificeerde voorwaarden.
OPMERKING: Om een maximale elektroporatie-efficiëntie te garanderen, is het mogelijk om de polariteit van de elektroden te veranderen en een andere puls te geven. - Breng het geëlektropoleerde hart over op een nieuwe plaat met 12 putjes met 1 ml groeimedium en plaats deze op 37 °C, 5% CO2.
- Herhaal stap 3.1 tot en met 3.6 totdat alle monsters in het experiment zijn geëlektroporeerd. Incubeer ten slotte alle harten in een incubator bij 37 °C, 5% CO2, gedurende 24 uur of tot de analyse.
OPMERKING: In onze handen kunnen harten tot 48 uur in cultuur worden gelaten zonder duidelijke tekenen van achteruitgang (aanvullende film 1; Aanvullende film 2; Aanvullende figuur 1).
Figuur 3: Elektroporatie instellen. (A) Opstelling gebruikt voor elektroporatie. Rode pijlen geven de elektroporator, elektroden en petrischaal aan waar harten worden geëlektroporeerd. (A') Nauwkeurig detail van de elektroporatienaald zoals gemarkeerd in (A) door de witte rechthoek. (B) Detail van de aangepaste afstand van de elektroden die worden gebruikt in E12.5-harten. (C) Schematische weergave van de elektroporatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Celsortering en immunohistochemische analyse
- Voor de analyse van de celsortering van de monsters bereidt u een digestiemedium voor om het weefsel te dissociëren door 400 μL liberase (5 mg/ml), 300 μL dispase (0,1 g/ml), 4 μL CaCl2 (0,4 μM), 50 μL MgCl2 (5 μM) te mengen en te voltooien tot 10 ml DMEM. Bewaar op ijs tot gebruik. Elk hart heeft ongeveer 1 ml Digestion Medium nodig. Pas de volumes aan op basis van het aantal monsters.
OPMERKING: Voor immunohistochemie fixeert u de harten direct in 1,5 ml 4% PFA gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C. Was de volgende dag de harten 3x met PBS en ga verder met stroomafwaartse histologische en immunokleuringsprocedures. Voor een gedetailleerd immunohistochemisch protocol, zie Morris et al.22. - Breng elk hart in cultuur over in een nieuw buisje met 1 ml ijskoud digestiemedium.
- Om de dissociatie te vergemakkelijken, hakt u het weefsel fijn door het 3-4 keer voorzichtig met een spuit aan te brengen en onmiddellijk te incuberen op een hete plaat bij 37 °C, 600 tpm gedurende 45 minuten.
- Filtreer het vergistingsmengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuwe buis en laat deze door de zwaartekracht leeglopen. Sla vervolgens het doorgeefvolume op en filtreer het opnieuw met behulp van een celzeef van 40 μm in een nieuwe buis van 50 ml.
- Voeg 500 μL foetaal runderserum (FBS) toe en vul aan tot 30 ml met koude DMEM.
- Centrifugeer het mengsel op 240 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatans weg en plaats de tube van 50 ml ondersteboven op keukenpapier om volledig te drogen.
OPMERKING: Dit is een handig punt om het experiment te pauzeren door de celpellet in te vriezen. Als dat het geval is, resuspendeer de cellen dan met 10% DMSO in FBS en bewaar ze bij -80 °C. - Voor het sorteren van cellen, resuspendeert u de cellen in 300 μL sorteerbuffer (1% FBS, 1% penicilline/streptomycine in PBS) en voegt u 0,3 μL DAPI (1000x) toe. Voer celsortering uit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de effectiviteit van deze techniek aan te tonen bij het uitvoeren van gain-of-function (GOF) experimenten voor relevante hartontwikkelingsregulatoren, werd een construct geëlektropoleerd dat de Meis1-transcriptiefactor tot overexpressie bracht. Om dit te bereiken, werd RNA geëxtraheerd uit E9.5-embryo's en werd omgekeerde transcriptie uitgevoerd om complementair DNA (cDNA) te verkrijgen. Met behulp van het cDNA als sjabloon werd de Meis1-coderende sequentie gekloond (aanvullende tabel 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Over het algemeen biedt de hier beschreven methodologie een robuust kader voor het tot expressie brengen van transgene constructen in het zich ontwikkelende epicardium (Figuur 4B), zoals aangetoond door Meis1-overexpressie (Figuur 4C). Met de juiste constructen kan dit protocol worden gebruikt om de impact van functiewinst (GOF) of functieverlies (LOF) van een specifiek gen tijdelijk te beoordelen. LOF kan in de techniek worden geïmplementeerd door een plasmide ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door subsidie RTI2018-097617-J-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en Acción 9 van Universidad de Jaén aan O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 van het EU Horizon 2020-programma aan MT. JMG werd ondersteund door een PhD-beurs van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Zowel de CNIC als de CBMSO worden ondersteund door het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de CNIC wordt ondersteund door de ProCNIC Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate | BD Falcon | 353043 | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µm Cell Strainer | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anti-GFP Policlonal Antibody | Invitrogen | A10262 | 1:1000 verdunning gebruikt |
| Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody | Invitrogen | 14-6503-82 | 1:500 verdunning gebruikt |
| CD1 Wild Type mice | Verstrekt door Animalary Unit (CNIC) | ||
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signalling Technologies | 9661 | 1:400 verdunning gebruikt |
| DAPI | Cell Signalling Technologies | 4083 | 1:1000 verdunning gebruikt |
| Dispase/collagenase | Roche | 10269638001 | |
| Gedestilleerde water | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Stereoscopic Microscope S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase | Roche | 5401119001 | |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| pCAG expressie plasmide | Addgene | #89689 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri schotels 35 × 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri schotels 60 × 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Fenol Rood | Merck | P3532 | |
| Pipetpunten | Hergebruikt van oud laboratoriumapparatuur | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody | Abcam | ab89901 | 1:300 verdunning gebruikt |
| Square Wave Electroporator CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| Steriele PBS | Verstrekt en geautoclaveerd door technische eenheid | ||
| Suiker | Millipore | 84100 | |
| Twee-pinselektroden met variabele opening | Nepa Gene | CUY650P5 |
Referenties
- Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
- Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), 2986(2021).
- Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668(2017).
- Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
- Zimmerman, M. S., et al. regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692(2012).
- Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921(2021).
- Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).
- Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).
- Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).
- Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
- Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
- Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
- Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
- Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).
- Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
- Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165(2021).
- Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. (75), e50359(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
