Methodenartikel

Een efficiënte transgenesebenadering voor genafgifte in het embryonale hart van muizen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66754

⸱

24 mei 2024

 ,  ,  , 
1Tissue and Organ Homeostasis Program, Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO), 2Cardiovascular Regeneration Program, National Cardiovascular Research Center (CNIC), 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), 4Department of Experimental Biology, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gedetailleerd methodologisch kader voor op elektroporatie gebaseerde transgenese van hartcellen in zich ontwikkelende muizenharten. De video-items die hier worden aangeboden, vergemakkelijken het leren van deze veelzijdige techniek.

Samenvatting

Het hart van zoogdieren is een complex orgaan dat tijdens de ontwikkeling wordt gevormd via zeer diverse populaties van voorlopercellen. De oorsprong, het tijdstip van rekrutering en het lot van deze voorouders zijn van vitaal belang voor de goede ontwikkeling van dit orgaan. De moleculaire mechanismen die de morfogenese van het hart bepalen, zijn essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van aangeboren hartaandoeningen en embryonale hartregeneratie. Klassieke benaderingen om deze mechanismen te onderzoeken, gebruikten de generatie van transgene muizen om de functie van specifieke genen tijdens de cardiale ontwikkeling te beoordelen. Transgenese van muizen is echter een complex, tijdrovend proces dat vaak niet kan worden uitgevoerd om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van het hart te beoordelen. Om dit aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld voor efficiënte elektroporatie en kweek van embryonale harten van muizen, waardoor transiënte transgenese snel het effect van functiewinst of functieverlies van genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van het hart kan beoordelen. Met behulp van deze methodologie hebben we Meis1 met succes tot overexpressie gebracht in het embryonale hart, met een voorkeur voor epicardiale celtransfectie, wat de mogelijkheden van de techniek aantoont.

Inleiding

Het hart is het eerste orgaan dat tijdens de embryonale ontwikkeling wordt gevormd. Dit proces omvat de spatiotemporele coördinatie van verschillende populaties voorlopercellen uit verschillende delen van het embryo. Dit alles gebeurt terwijl het zich ontwikkelende hart blijft kloppen en functioneren, met de nadruk op de opmerkelijke coördinatie die nodig is voor de vormingervan 1,2,3. Gezien de cruciale rol van het hart is een strakke regulatie op cellulair en moleculair niveau essentieel voor de juiste vorming ervan 4,5. Het identificeren van de mechanismen die de ontwikkeling van het hart regelen, is van groot belang geweest, omdat ze cruciaal zijn voor het ontrafelen van aangeboren hartaandoeningen, die een aanzienlijk aantal patiënten wereldwijdtreffen6. Bovendien is het begrijpen van de ontwikkeling van het hart cruciaal bij het ontcijferen van hartregeneratie, aangezien postnatale zoogdierharten een regeneratief vermogen behouden dat op volwassen leeftijd verloren gaat of wordt belemmerd 7,8. Daarom is het ontleden van moleculaire regulatoren van de ontwikkeling van het hart absoluut noodzakelijk om de onderzoeksinspanningen op het gebied van aangeboren hartaandoeningen en hartregeneratie te bevorderen.

Bij het nastreven van dit doel is er een groeiende focus op het onderzoeken van de rol van het epicardium in de ontwikkeling en regeneratie van het hart. Het epicardium is een dunne laag mesotheelweefsel die de buitenste laag van het hart van zoogdieren vormt (figuur 1). Recente studies hebben het belang van het epicardium tijdens hartletsel aangetoond, waaruit blijkt dat dit weefsel in staat is om proliferatiesignalen naar cardiomyocyten in het getroffen gebied te sturen om de schade te beperken10,11. Ondanks het belang van het epicardium, is het uitvoeren van verder moleculair onderzoek uitgedaagd door de immense heterogeniteit ervan. Single-cell RNAseq-experimenten hebben de heterogeniteit van het epicardium onthuld, met subpopulaties van meerdere cellen met verschillende transcriptomische handtekeningen 12,13,14,15,16. Een strategie om potentiële regulatoren van de cardiale ontwikkeling te screenen, moet dus rekening houden met de diversiteit van epicardiale voorlopercellen.

In die zin heeft de gevoeligheid van het muismodel voor genetische modificatie de identificatie van talrijke genen die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van het hart vergemakkelijkt, waardoor mutante lijnen met gain-of-function (GOF) of loss-of-function (LOF) van specifieke genen kunnen worden gegenereerd. Deze benaderingen impliceren echter een aanzienlijke investering van tijd en experimentele middelen; Daarom zijn ze onpraktisch bij het beoordelen van de rollen van een groot aantal kandidaat-genen. Bovendien oefenen ontwikkelingsgenen vaak pleiotrope functies uit in verschillende weefsels of zijn ze nodig voor de vroege embryonale ontwikkeling, waardoor de interpretatie van hun bijdrage aan de ontwikkeling in een specifiek proces wordt belemmerd. Hoewel het mogelijk is om de genfunctie te richten op specifieke structuren of ontwikkelingstijdstippen, vereist dit meestal het gebruik van complexere genetische constructies, die moeilijk te genereren kunnen zijn of over het algemeen niet beschikbaar zijn.

Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een methodologie om embryonale harten van muizen te elektropoleren voor voorbijgaande transgenese (Figuur 2). In combinatie met ex vivo-cultuur en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), demonstreert deze strategie zijn mogelijkheden door middel van voorbijgaande GOF van Meis1, een goed gekarakteriseerd gen dat betrokken is bij de ontwikkeling en regeneratie van het hart 17,18,19. In dit artikel worden ook andere mogelijke toepassingen van deze methodologie onderzocht en worden de voordelen en beperkingen ervan besproken, evenals vergeleken met bestaande protocollen voor het tijdelijk moduleren van genexpressie. Wij zijn van mening dat het gepresenteerde raamwerk en de visuele voorbeelden het begrip van de epicardiumbiologie tijdens ontwikkeling en ziekte zullen vergroten.

figure-introduction-1
Figuur 1: Embryonale hartlagen van muizen. Schematisch diagram van een coronaal aanzicht van een E13-14 muisembryonaal hart. De drie belangrijkste cellulaire lagen van het hart worden weergegeven in geel (endocardium), rood (myocardium) en blauw (epicardium). Het hartzakje wordt weergegeven in een bruine lijn. De vier kamers van het hart worden afgekort als LV, linkerventrikel; RV, rechter ventrikel; LA, linker atrium; RA, rechter atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: Schematisch overzicht van het hartelektroporatieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de CNIC Ethische Commissie voor dierproeven en voldoen aan de huidige wetgeving, waaronder EU-richtlijn 2010/63EU en Aanbeveling 2007/526/EG, zoals gehandhaafd door de Spaanse wet onder Real Decreto 53/2013. Voor dit protocol werden vrouwelijke wildtype CD-1-muizen van 15-21 weken oud gebruikt. Details over de dieren, reagentia en gebruikte apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Plasmide en gereedschapsvoorbereiding

  1. Bereid eerst de elektroporatiemix voor door het gewenste plasmide-DNA in ijs toe te voegen in een eindconcentratie van 1 μg/μL. Voltooi vervolgens het mengsel door sucrose toe te voegen in een eindconcentratie van 6% (opgelost in PBS), een biocompatibele kleurstof in 0,01% en voltooi met PBS tot een eindvolume van 30 μL.
    OPMERKING: Per monster wordt ongeveer 1-2 μL van het elektroporatiemengsel gebruikt. Schaal de verhoudingen van het elektroporatiemengsel op basis van het aantal monsters in het experiment. Houd er rekening mee dat DNA voor elektroporatie moet worden gezuiverd uit de bacteriecultuur, waardoor optimale stabiliteit en minimale verontreinigingen worden gegarandeerd. Voor meer informatie over de plasmiden die voor dit onderzoek zijn gebruikt, verwijzen wij u naar de sectie representatieve resultaten.
  2. Bereid Growth Medium voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 2% Hepesbuffer en 1% penicilline/streptomycine. Bewaar het medium in een incubator bij 37 °C tot gebruik. Verwarm daarnaast 1x PBS bij 37 °C, samen met het groeimedium.
  3. Bereid de naalden voor door een glazen capillair met een diameter van 20 μm uit te rekken met behulp van een pipettrekker met de volgende voorwaarden: warmte = 550; trekken = 100; snelheid = 250; tijd = 120. De uiteindelijke diameter na het trekken moet ongeveer tussen de 5-8 μm liggen.
  4. Stel de parameters van de elektroporator in op vijf cycli van 50 ms bij 40 V met intervallen van 900 ms. Bereid de elektroden, de mondpipet en de stompe naald voor (Figuur 3A). Rust de pipet uit met de naald om het DNA te laden (Figuur 3A).

2. Embryodissectie en hartextractie

  1. Zet een kruising op tussen wild-type CD-1 muizen. Selecteer de volgende ochtend de vrouwtjes die een vaginale plug vertonen en noteer deze tijd als embryonale dag E0.5. Euthanaseren van de dieren op embryonale dag E12-12.5 door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Haal de baarmoeder voorzichtig uit de muis en leg deze in een droge papieren handdoek. Knip vervolgens de baarmoeder af met een fijne schaar door de punt van de schaar in de mesometriumzijde te steken en de rand van het mes langzaam over de hele lengte te laten lopen. Leg de deciduae bloot en breng ze over naar het groeimedium. Zie voor meer details het werk van Behringer et al.20.
  3. Ontleed de deciduae om de embryo's te extraheren en plaats de embryo's vervolgens in een petrischaal van 60 mm met warm groeimedium. Snijd met een fijne tang voorzichtig de staart en het hoofd van het embryo af, zodat alleen de romp van het lichaam overblijft. Het stadium van de embryo's kan worden geverifieerd door anatomische kenmerken te beoordelen, zoals beschreven door Wong et al.21.
  4. Verwijder vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk weefsel uit de romp van het embryo zonder het hart of de long- en aortaslagaders te beschadigen. Zodra het hart is blootgesteld, plaatst u het onmiddellijk in een nieuw, warm groeimedium en bewaart u het in een incubator bij 37 °C tot elektroporatie.
    OPMERKING: Het op peil houden van de temperatuur van het hart is cruciaal voor het voortbestaan. Zorg ervoor dat het medium altijd warm is en vervang het elke 5-10 min. Aan de andere kant kunnen monsters worden gehanteerd zonder de steriliteit te behouden, omdat dit de efficiëntie van de procedure niet zal beïnvloeden. Houd er rekening mee dat het groeimedium antibiotica bevat.

3. Hartelektroporatie en ex vivo cultuur

  1. Laad ongeveer 10 μL plasmidemengsel (bereid in stap 1.1) in de naald door voorzichtig op te zuigen met de mondpipet.
  2. Bereid een enkel hart voor op elektroporatie door het in een schone petrischaal van 60 mm te plaatsen met steriel 1x PBS opgewarmd tot 37 °C. Plaats de schaal onder de snijmicroscoop (Figuur 3A).
  3. Bereid de elektroden voor door de afstand tussen de positieve en negatieve polen in te stellen op ongeveer 4 mm (Figuur 3B).
    OPMERKING: 4 mm is de diafragmaafstand waarin E12.5-muisharten in de elektroden passen die in dit werk worden gebruikt. Overweeg om deze afstand te wijzigen op basis van verschillende monstergroottes of elektrodespecificaties.
  4. Prik voorzichtig in de meest oppervlakkige laag van het hart met de naald in de mondpipet. Pipetter voorzichtig 1-2 μL van het plasmidemengsel en verwijder de naald. Er kunnen meerdere injecties worden uitgevoerd om een optimale penetratie te garanderen en om het aantal geëlektropoleerde cellen uit te breiden.
  5. Houd de elektroden op hun plaats zodat het hart zich tussen beide polen bevindt (Figuur 3C). Elektropoleer vervolgens het hart met de hierboven gespecificeerde voorwaarden.
    OPMERKING: Om een maximale elektroporatie-efficiëntie te garanderen, is het mogelijk om de polariteit van de elektroden te veranderen en een andere puls te geven.
  6. Breng het geëlektropoleerde hart over op een nieuwe plaat met 12 putjes met 1 ml groeimedium en plaats deze op 37 °C, 5% CO2.
  7. Herhaal stap 3.1 tot en met 3.6 totdat alle monsters in het experiment zijn geëlektroporeerd. Incubeer ten slotte alle harten in een incubator bij 37 °C, 5% CO2, gedurende 24 uur of tot de analyse.
    OPMERKING: In onze handen kunnen harten tot 48 uur in cultuur worden gelaten zonder duidelijke tekenen van achteruitgang (aanvullende film 1; Aanvullende film 2; Aanvullende figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 3: Elektroporatie instellen. (A) Opstelling gebruikt voor elektroporatie. Rode pijlen geven de elektroporator, elektroden en petrischaal aan waar harten worden geëlektroporeerd. (A') Nauwkeurig detail van de elektroporatienaald zoals gemarkeerd in (A) door de witte rechthoek. (B) Detail van de aangepaste afstand van de elektroden die worden gebruikt in E12.5-harten. (C) Schematische weergave van de elektroporatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Celsortering en immunohistochemische analyse

  1. Voor de analyse van de celsortering van de monsters bereidt u een digestiemedium voor om het weefsel te dissociëren door 400 μL liberase (5 mg/ml), 300 μL dispase (0,1 g/ml), 4 μL CaCl2 (0,4 μM), 50 μL MgCl2 (5 μM) te mengen en te voltooien tot 10 ml DMEM. Bewaar op ijs tot gebruik. Elk hart heeft ongeveer 1 ml Digestion Medium nodig. Pas de volumes aan op basis van het aantal monsters.
    OPMERKING: Voor immunohistochemie fixeert u de harten direct in 1,5 ml 4% PFA gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C. Was de volgende dag de harten 3x met PBS en ga verder met stroomafwaartse histologische en immunokleuringsprocedures. Voor een gedetailleerd immunohistochemisch protocol, zie Morris et al.22.
  2. Breng elk hart in cultuur over in een nieuw buisje met 1 ml ijskoud digestiemedium.
  3. Om de dissociatie te vergemakkelijken, hakt u het weefsel fijn door het 3-4 keer voorzichtig met een spuit aan te brengen en onmiddellijk te incuberen op een hete plaat bij 37 °C, 600 tpm gedurende 45 minuten.
  4. Filtreer het vergistingsmengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuwe buis en laat deze door de zwaartekracht leeglopen. Sla vervolgens het doorgeefvolume op en filtreer het opnieuw met behulp van een celzeef van 40 μm in een nieuwe buis van 50 ml.
  5. Voeg 500 μL foetaal runderserum (FBS) toe en vul aan tot 30 ml met koude DMEM.
  6. Centrifugeer het mengsel op 240 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Gooi het supernatans weg en plaats de tube van 50 ml ondersteboven op keukenpapier om volledig te drogen.
    OPMERKING: Dit is een handig punt om het experiment te pauzeren door de celpellet in te vriezen. Als dat het geval is, resuspendeer de cellen dan met 10% DMSO in FBS en bewaar ze bij -80 °C.
  8. Voor het sorteren van cellen, resuspendeert u de cellen in 300 μL sorteerbuffer (1% FBS, 1% penicilline/streptomycine in PBS) en voegt u 0,3 μL DAPI (1000x) toe. Voer celsortering uit.

Resultaten

Om de effectiviteit van deze techniek aan te tonen bij het uitvoeren van gain-of-function (GOF) experimenten voor relevante hartontwikkelingsregulatoren, werd een construct geëlektropoleerd dat de Meis1-transcriptiefactor tot overexpressie bracht. Om dit te bereiken, werd RNA geëxtraheerd uit E9.5-embryo's en werd omgekeerde transcriptie uitgevoerd om complementair DNA (cDNA) te verkrijgen. Met behulp van het cDNA als sjabloon werd de Meis1-coderende sequentie gekloond (aanvullende tabel 1) tot een pCAG-expressieplasmide (hierna pCAG::Meis1 genoemd), terwijl een constitutief GFP-expressieplasmide (pCAG::GFP) als controle werd gebruikt. Harten werden vervolgens geëlektropoleerd met pCAG::GFP alleen of in combinatie met pCAG::Meis1.

Na 24 uur na elektroporatie (hpe) klopten de harten en leken ze in goede conditie te zijn (Figuur 4A; Aanvullende film 1; Aanvullend filmpje 2). Om de levensvatbaarheid van de geëlektropoleerde cellen te beoordelen, werd apoptose geanalyseerd door middel van immunohistochemische kleuring van caspase 3. Hoewel er enkele positieve cellen in het hart werden gedetecteerd, bleken noch het myocardium, noch het epicardium, waar de meerderheid van de geëlektropoleerde cellen zich bevinden, te worden beïnvloed door apoptose (aanvullende figuur 1C). Toen de fluorescentieactiviteit werd beoordeeld, werd een mozaïek GFP-signaal waargenomen in bijna alle vier de kamers van het hart, wat aangeeft dat dit protocol in staat is om de meerderheid van de hartstructuren te bereiken (Figuur 4A). Om te bepalen welke hartceltypen werden geëlektroporeerd, werden pCAG::GFP-geëlektropoleerde harten immunogekleurd tegen markers van het epicardium, WT12 en myocardium, MF2023, en vervolgens afgebeeld met een confocale microscoop (Figuur 4B). De meeste GFP+-cellen bevonden zich bij voorkeur in het externe gebied van het hart, wat grotendeels overeenkwam met het WT1-signaal, wat aangeeft dat deze methode het meest efficiënt is in het bereiken van epicardiale cellen (Figuur 4B, witte pijlpunten).

Aan de andere kant werden pCAG::Meis1-geëlektropoleerde of controleharten (pCAG::Alleen GFP) gedissocieerd en werden de cellen onderworpen aan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om GFP+-cellen van het hele orgaan te isoleren, zoals beschreven in stap 4 van het protocol. RNA werd geëxtraheerd uit de gesorteerde cellen en reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) werd uitgevoerd om de expressieniveaus van Meis1 in de getransfecteerde cellen te beoordelen (Figuur 4C, aanvullende tabel 1). De totale Meis1-genexpressie werd genormaliseerd met behulp van de expressieniveaus van het muizenhuishoudgen Eef224, en de relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de ΔΔCt-methode25. Een significante opregulatie van de Meis1-RNA-spiegels werd waargenomen in de harten die werden geëlektropoleerd met het pCAG::Meis1-plasmide in vergelijking met die met alleen het pCAG::GFP-plasmide (Figuur 4C). Dit toont dus het potentieel van de techniek aan om genen van belang tot overexpressie te brengen en de moleculaire uitkomst aan te pakken.

figure-results-1
Figuur 4: Moleculaire analyse van geëlektropoleerde E12,5 harten. (A) GFP-fluorescentie van één CAG::GFP-geëlektropoleerd hart 24 uur na elektroporatie. De onderste afbeelding toont GFP-fluorescentie, terwijl de bovenste afbeelding een samensmelting van GFP en een helder veld van hetzelfde hart laat zien. (B) Immunofluorescentie van histologische secties van geëlektropoleerd E12.5-hart. MF20 markeert cardiomyocyten, terwijl WT1 epicardiale cellen markeert. Afbeeldingen aan de rechterkant komen overeen met zoom-ins van de witte rechthoek. Witte pijlpunten geven GFP+-cellen aan die zich in het epicardium bevinden, ruwweg begrensd door een gestippelde witte lijn. (C) RT-qPCR-analyse van harten geëlektropoleerd met pCAG::Meis1 of pCAG::GFP (controle). Elke stip vertegenwoordigt een biologische replicaat die wordt verkregen door het samenvoegen van drie harten. In totaal werd qPCR-analyse uitgevoerd in drievouden met drie verschillende biologische replicaten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de Student's t-test (*P < 0,05). Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Efficiëntie van hartelektroporatie en levensvatbaarheid van cellen. (A) Expressie van GFP in twee verschillende E12.5-harten geëlektropoleerd met het controleplasmide pCAG::GFP 24 uur of 48 uur na elektroporatie (hpe). Het GFP-signaalbeeld werd over een helder veldbeeld van hetzelfde hart gelegd. (B) Kwantificering van GFP+-cellen in harten van 24 hpe en 48 hpe, geëlektropoleerd met controle-pCAG::GFP. Stippen geven verschillende monsters aan; Ononderbroken lijnen geven het gemiddelde aan, terwijl foutbalken de standaarddeviatie aangeven. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen beide aandoeningen (niet-parametrische t-toets; P > 0,9). (C) Confocaal beeld van een E12.5-hart geëlektropoleerd met pCAG::GFP immunogekleurd tegen gespleten caspase 3 en MF20. De stippellijn stelt de myocardlaag van het hart voor. Afbeeldingen aan de rechterkant zijn ingezoomd vanuit de witte rechthoek. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Samenvatting en sequenties van de inleiding. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 1: pCAG::GFP-geëlektropoleerd hart na 24 uur. Video waarin één hart wordt geëlektropoleerd met pCAG::GFP-controleplasmide 24 uur na de procedure. Het hart blijft kloppen en geëlektropoleerde cellen brengen GFP-signalen tot expressie. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullende film 2: pCAG::GFP-geëlektropoleerd hart na 48 uur. Film van een geëlektropoleerd hart met controle pCAG::GFP, 48 uur na elektroporatie. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussie

Over het algemeen biedt de hier beschreven methodologie een robuust kader voor het tot expressie brengen van transgene constructen in het zich ontwikkelende epicardium (Figuur 4B), zoals aangetoond door Meis1-overexpressie (Figuur 4C). Met de juiste constructen kan dit protocol worden gebruikt om de impact van functiewinst (GOF) of functieverlies (LOF) van een specifiek gen tijdelijk te beoordelen. LOF kan in de techniek worden geïmplementeerd door een plasmide te transfecteren dat zich richt op een kandidaat-gen via RNA-interferentie26. De snelle beoordeling van het gen GOF of LOF is bijzonder voordelig, vooral gezien de grote transcriptomische heterogeniteit van epicardiale cellen12, waardoor het onpraktisch is om transgene dieren te genereren om elk kandidaat-gen afzonderlijk te evalueren.

Omdat dit protocol gebruik maakt van ex vivo cultuur, biedt het de mogelijkheid om het lot van epicardiale cellen binnen een tijdsvenster te onderzoeken. Het zich ontwikkelende epicardium speelt een cruciale rol bij het vormgeven van verschillende regio's in het volwassen hart 13,27,28; Het begrijpen van de bijdragen ervan aan de ontwikkeling van het hart is dus van groot belang bij het ontleden van de basis van aangeboren hartafwijkingen. Hoewel dit artikel niet ingaat op deze toepassing, kunnen de richtlijnen die in het protocol worden uiteengezet mogelijk nuttig zijn voor toekomstige studies naar het in kaart brengen van het lot van het epicardium

Ondanks het praktische nut van de huidige methode, moeten bepaalde beperkingen worden erkend. Aangezien deze methodologie gebaseerd is op voorbijgaande transgenese, kan plasmide-expressie in de loop van de tijd verloren gaan of afnemen, waardoor het bereik van het protocol om een specifiek ontwikkelingsvenster te bestuderen wordt beperkt29. In deze studie werd de overexpressie van GFP echter gehandhaafd gedurende de gehele duur van de post-elektroporatieculturen (48 hpe). Bovendien belemmeren mogelijke beperkingen in de huidige ex vivo kweektechnologieën de toepasbaarheid van de methode voor het beoordelen van late embryonale of postnatale ontwikkelingsstadia, vooral wanneer ex vivo cultuur na elektroporatie een uitdaging wordt30. Hoewel er meer geavanceerde methoden voor ex vivo embryocultuur bestaan31,32, kunnen deze het gebruik van apparatuur vereisen die minder toegankelijk is voor onderzoekers en het voortbestaan van het monster niet garanderen.

Hoewel het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om zo eenvoudig mogelijk te zijn om de reproduceerbaarheid te verbeteren, bevat het cruciale stappen die essentieel zijn voor succes. Ten eerste moet embryodissectie zorgvuldig en snel worden uitgevoerd om hartschade tot een minimum te beperken, die de overleving van het orgaan na elektroporatie in gevaar zou kunnen brengen. Speciale zorg tijdens deze stap, samen met het gebruik van optimale dissectieapparatuur, wordt sterk aanbevolen. Een ander cruciaal aspect van het protocol is het uitvoeren van de elektroporatie zelf, omdat onvoldoende plasmide-injectie tot ongewenste resultaten kan leiden. Daarom is het raadzaam om meerdere injecties op een enkel hart uit te voeren, en het injecteren van het monster op een nogal oppervlakkige manier kan gunstig zijn om de overleving van organen te verbeteren. Ten slotte moet celdissociatie tijdens de hartverwerking rigoureus worden uitgevoerd, waarbij de tijden in het protocol worden nageleefd om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren.

Concluderend is het identificeren van sleutelgenen bij de vorming van het hart van cruciaal belang voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van aangeboren hartaandoeningen en regeneratie. De hier vastgestelde methodologie maakt een snelle screening van gen-gain-of-function (GOF) en loss-of-function (LOF) effecten in het zich ontwikkelende hart mogelijk. Hoewel deze methode bepaalde beperkingen erkent, vertoont ze een aanzienlijk potentieel voor extrapolatie naar verschillende ontwikkelingsstadia of voor het in kaart brengen van het lot van embryonale epicardiale cellen. Door middel van de visuele richtlijnen in dit artikel willen we een waardevolle toolbox bieden voor het beoordelen van de immense complexiteit en het potentieel van het zich ontwikkelende epicardium.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidie RTI2018-097617-J-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en Acción 9 van Universidad de Jaén aan O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 van het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación en grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 van het EU Horizon 2020-programma aan MT. JMG werd ondersteund door een PhD-beurs van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Zowel de CNIC als de CBMSO worden ondersteund door het Spaanse Ministerie van Wetenschap en de CNIC wordt ondersteund door de ProCNIC Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#55 ForcepsDumont 11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture PlateBD Falcon353043
35 mm vise table GrandadoSKU 8798771617573
40 µm Cell StrainerFischer Scientific08-771-1
50 mL tubesBD Falcon352070
70 µm Cell StrainerCorningCLS431751
Anti-GFP Policlonal AntibodyInvitrogenA102621:1000 verdunning gebruikt
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal AntibodyInvitrogen14-6503-821:500 verdunning gebruikt
CD1 Wild Type miceVerstrekt door Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) AntibodyCell Signalling Technologies96611:400 verdunning gebruikt
DAPICell Signalling Technologies40831:1000 verdunning gebruikt
Dispase/collagenaseRoche10269638001
Gedestilleerde water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco10313021
Fetal Bovine SerumInvitrogen10438-026
Heracell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0Leica11524102
LiberaseRoche5401119001
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentSU-P-97
pCAG expressie plasmideAddgene#89689
Penicilline-streptomycineInvitrogen15070-063
Petri schotels 35 × 10 mmBD Falcon351008
Petri schotels 60 × 15 mmBD Falcon353002
Fenol RoodMerckP3532
PipetpuntenHergebruikt van oud laboratoriumapparatuur
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SDJanvier Labs9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) AntibodyAbcamab899011:300 verdunning gebruikt
Square Wave Electroporator CUY21SCNepa GeneCUY664-10X15
Steriele PBSVerstrekt en geautoclaveerd door technische eenheid
SuikerMillipore84100
Twee-pinselektroden met variabele openingNepa GeneCUY650P5

Referenties

  1. Tyser, R. C., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, e17113(2016).
  2. Tyser, R. C. V., et al. Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium. Science. 371 (6533), 2986(2021).
  3. Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).
  4. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, e30668(2017).
  5. Ai, D., et al. Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth. PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).
  6. Zimmerman, M. S., et al. regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).
  7. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).
  8. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  9. Cao, J., Poss, K. D. The epicardium as a hub for heart regeneration. Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).
  10. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  11. Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PLOS One. 7 (9), e44692(2012).
  12. Hesse, J., et al. Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart. eLife. 10, e65921(2021).
  13. Streef, T. J., Smits, A. M. Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium. Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).
  14. Sanchez-Fernandez, C., et al. Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).
  15. Quijada, P., et al. Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium. Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).
  16. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).
  17. Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration. Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).
  18. Stankunas, K., et al. Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease. Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).
  19. Liu, Y., et al. Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice. J Adv Res. 39, 275-289 (2022).
  20. Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  21. Wong, M. D., et al. 4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging. Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).
  22. Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
  23. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).
  24. Eissa, N., et al. Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis. PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA. Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).
  27. Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium. FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).
  28. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).
  29. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. Peer J. 9, e11165(2021).
  30. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications. JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).
  31. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  32. Dyer, L. A., Patterson, C. A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart. J Vis Exp. (75), e50359(2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muistransgenesehartontwikkelingelektroporatie van het hartplasmidtransfectieprogenitorcellencel sorterenepicardiale cellenfluorescentieanalyse

Gerelateerde artikelen