Postmortale diagnose van hondsdolheid bij dieren door de bijgewerkte, gemultiplexte LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactietest

Samenvatting

Dit protocol demonstreert de pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR)-assay van weefselverzameling tot resultaatinterpretatie, inclusief updates van primersequenties en formuleringen om de testprestaties voor sommige niet-rabiës, lyssavirussen en lagomorfen te verbeteren. We demonstreren ook de testopstelling voor een LN34 multiplexed (LN34M) formaat met één put.

Samenvatting

Hondsdolheid is een dodelijke zoönose die wordt veroorzaakt door Lyssavirus, rabiës (RABV) en verwante negatieve streng-RNA-virussen van het geslacht Lyssavirus (familie Rhabdoviridae). De LN34-test richt zich op het sterk geconserveerde leidergebied en het nucleoproteïne-gen van het lyssavirusgenoom en maakt gebruik van gedegenereerde primers en een TaqMan-sonde die vergrendelde nucleotiden bevat om RNA te detecteren in het diverse geslacht Lyssavirus . Een negatieve bevinding voor hondsdolheid mag alleen worden gedaan als een volledige dwarsdoorsnede van de hersenstam en drie lobben van het cerebellum worden onderzocht; identificatie van lyssavirus-RNA in elk weefsel is echter diagnostisch voor rabiësinfectie. Weefsel wordt verzameld en gehomogeniseerd in TRIzol-reagens, dat ook het virus inactiveert. RNA-extractie wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële extractiekit op basis van spinkolommen. Mastermixen worden bereid in een schone ruimte en verdeeld in een plaat met 96 putjes voordat voorbeeld-RNA wordt toegevoegd. In klinische omgevingen wordt elk monster door middel van real-time RT-PCR getest op de aanwezigheid van lyssavirus-RNA in drievoud en afzonderlijk op gastheer-β-actine-mRNA. Positieve en negatieve controles worden opgenomen bij extractie en real-time RT-PCR-stappen van het protocol. Gegevensanalyse omvat handmatige aanpassing van de drempels om Ct-waarden te standaardiseren over instrumentruns. Positieve resultaten worden bepaald door de aanwezigheid van typische amplificatie in de pan-lyssavirustest (Ct ≤ 35). Negatieve resultaten worden bepaald door de afwezigheid van typische amplificatie in de pan-lyssavirustest en detectie van gastheer-β-actine-mRNA (Ct ≤ 33). Waarneming van waarden buiten deze bereiken of falen van de testcontroles kan de run ongeldig maken of resulteren in niet-overtuigende resultaten voor een monster. Het protocol moet nauwlettend worden gevolgd om een hoge testgevoeligheid en specificiteit te garanderen. Procedurele wijzigingen kunnen de prestaties van de test beïnvloeden en leiden tot vals-positieve, vals-negatieve of niet-interpreteerbare resultaten.

Inleiding

Dit protocol beschrijft de procedure voor diagnostische tests op basis van hondsdolheid met behulp van de LN34 pan-lyssavirus real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)-assay van monsterafname tot resultaatinterpretatie. De procedure zal worden opgesplitst in drie secties: verzameling van hersenmonsters voor zover relevant voor de LN34-assay (sectie 1), handmatige kolomgebaseerde RNA-extractie met behulp van de Direct-zol RNA Miniprep-kit (Zymo Research R2051) (sectie 2) en LN34 real-time RT-PCR-assay die is ingesteld met behulp van de AgPath-ID One-Step RT-PCR-kit (ThermoFisher Scientific AM1005) (sectie 3). RNA-extractie en RT-PCR kunnen worden uitgevoerd met behulp van andere producten, maar kits moeten vóór gebruik worden gevalideerd om ervoor te zorgen dat Lyssavirus-RNA op de juiste manier wordt geëxtraheerd en geamplificeerd.

Sectie 1 beschrijft het verzamelen van de juiste hersenweefsels die moeten worden gebruikt in de LN34 real-time RT-PCR-test. Beschrijving van obductie bij dieren, onthoofding en verwijdering van de hersenen zijn niet inbegrepen. Monsters kunnen infectieuze agentia bevatten. Bioveiligheidsprocedures die worden beschreven in de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6th Edition¹ moeten worden gevolgd om risico's te beperken. Monsters moeten als infectieus worden beschouwd totdat de inactivering is voltooid. Virale inactivatie en testvalidatie moeten in elk laboratorium worden uitgevoerd volgens de normen van die instelling. Laboratoria moeten de standaard veiligheids- en kwaliteitsprocedures volgen die door hun instelling zijn vastgesteld bij het implementeren van een nieuwe diagnostische test.

Op basis van wat er bekend is over de verspreiding van het rabiësvirus tijdens infectie, zijn de hersenstam en het cerebellum de beste weefsels voor de diagnose van hondsdolheid, en deze weefsels worden aanbevolen voor het testen op hondsdolheid door de Wereldgezondheidsorganisatie en de Wereldorganisatie voor diergezondheid 2,3,4,5. Omdat de verspreiding van het virus eenzijdig kan zijn (Figuur 1), vooral bij grotere dieren, moet een volledige dwarsdoorsnede van de hersenstam en drie lobben van het cerebellum worden onderzocht op uitsluiting van hondsdolheid. Voor monsters die niet aan deze minimumcriteria voldoen, kan het laboratorium het monster afwijzen als onvoldoende voor testen of ervoor kiezen om te testen voor bewakings- of regeldoeleinden. Als de vereiste weefsels niet worden ontvangen, maar het laboratorium ervoor kiest om het monster te testen, moet een negatief testresultaat worden geïnterpreteerd als niet doorslaggevend voor hondsdolheid voor dat dier, omdat de aanwezigheid van viraal RNA in andere weefsels kan worden vertraagd, weinig overvloedig, intermitterend of niet bestaand. Afname van de benodigde monsters of aanvullend onderzoek is in dat geval nodig om hondsdolheid uit te sluiten. Identificatie van lyssavirus-RNA in elk weefsel is echter diagnostisch voor rabiësinfectie ^3,6. Voorbeelden van monsters die kunnen worden getest op rabiësvirus-RNA voor regel- of bewaking (maar niet uitsluiten) rabiësinfectie zijn cortex, hippocampus, ruggenmerg, gedegradeerde monsters, huid, speeksel en hoornvlies. Bij aankomst in het laboratorium moet een kwalitatieve beoordeling van de toestand van elk monster worden uitgevoerd. Koeling kan een monster ten minste 72 uur bewaren, maar mag niet langdurig worden gebruikt. Herhaalde vries-dooicycli kunnen de testgevoeligheid verminderen en meer dan vijf vries-dooicycli moeten worden vermeden. Als de toestand van het weefsel de betrouwbare identificatie van hersenstructuren verhindert, moet het monster als onbevredigend worden geïdentificeerd. In het geval van een onbevredigend monster kunnen nog steeds tests worden uitgevoerd om hondsdolheid uit te sluiten (maar niet uit te sluiten). Positieve testresultaten worden als zodanig gerapporteerd. Negatieve of niet-overtuigende resultaten op onbevredigend weefsel moeten als onduidelijk worden gerapporteerd om verkeerde interpretatie als een negatieve diagnose te voorkomen.

Dit protocol is ontwikkeld op basis van gepubliceerde procedures ^7,8,9 en bevat bijgewerkte primers gericht op de lyssavirus-genoomleiderregio en de nucleoproteïne-coderende sequentie. De sonde richt zich op een korte, sterk geconserveerde sequentie en maakt gebruik van vergrendelde nucleotiden om brede detectie mogelijk te maken. De test detecteert RNA van verschillende lyssavirussen in verschillende concentraties⁸. Dit protocol demonstreert de laboratoriumprocedures om de LN34 real-time PCR-test uit te voeren, maar nauwkeurige en gevoelige detectie van lyssavirus-RNA is afhankelijk van andere elementen die niet uitgebreid in dit protocol worden behandeld, zoals opslag van monsters, het bijhouden van gegevens, training/competentie van personeel, het volgen van resultaten, interpretatie van resultaten, kwaliteitsborging, veiligheidsmaatregelen in laboratoria en probleemoplossing. Op PCR gebaseerde assays zijn vatbaar voor kruisbesmetting vanwege hun hoge gevoeligheid. Kruisbesmetting kan worden voorkomen door vast te houden aan goede laboratoriumpraktijken, zoals het regelmatig verwisselen van handschoenen, het hanteren van één monster tegelijk, het desinfecteren van werkoppervlakken met effectieve ontsmettingsmiddelen tussen monsters, en het gesloten houden van buisjes en monsters gescheiden van PCR-reagentia. PCR-reagentia en -monsters kunnen eenvoudig worden gescheiden door gebruik te maken van een eenzijdige workflow en door de werkgebieden voor preamplificatie en postamplificatie te scheiden. Bereid bijvoorbeeld PCR-mastermixen voor op een locatie die fysiek gescheiden is van waar de monsters worden verwerkt. Verwissel vaak van handschoenen om besmetting van PCR-reagentia met monsters, puin of positief controle-RNA te voorkomen. De PCR-plaat of -buisjes moeten na toevoeging van de mastermix worden verplaatst naar een tweede locatie waar monster- en controle-RNA kan worden toegevoegd. Belangrijk is dat PCR-producten niet mogen worden gemanipuleerd in gebieden waar monsters of mastermixen worden bereid.

Er is geen vervanging voor hands-on oefening en ervaring bij het uitvoeren van diagnostische tests. Alle nieuwe medewerkers moeten worden opgeleid en het testpersoneel moet ten minste eenmaal per jaar worden beoordeeld op bekwaamheid volgens de vereisten van de relevante laboratoriumdirecteur. Alle waarnemingen van ongebruikelijke resultaten of falen van de test moeten onmiddellijk worden opgemerkt, onderzocht en gecorrigeerd. Elke nieuwe partij reagentia moet worden gevalideerd met behulp van monsters met bekende Ct-waarden (zoals een positieve controle of een gearchiveerd monster). Alle apparatuur moet routineonderhoud ondergaan, zoals voorgesteld door de fabrikant, en de testprestaties moeten worden geverifieerd na onderhoud of reparatie. De temperatuurniveaus moeten worden gecontroleerd op de toepasselijke apparatuur om ervoor te zorgen dat koelkasten en diepvriezers binnen de criteria blijven die zijn vastgesteld voor een aanvaardbaar temperatuurbereik voor reagentia die worden gebruikt bij diagnostische tests.

Procedurele wijzigingen kunnen de prestaties van de test beïnvloeden en kunnen leiden tot vals-positieve, vals-negatieve of niet-interpreteerbare resultaten. De aanbevelingen moeten nauwlettend worden opgevolgd om een hoge gevoeligheid en specificiteit van de test te garanderen. Een laboratorium dat wijzigingen in dit protocol wil aanbrengen, moet de gewijzigde methoden valideren en bevestigen in overleg met de CDC.

Protocol

Postmortale hersenweefselmonsters werden verkregen via routinematige bewaking of diagnostische activiteiten van de Poxvirus and Rabies Branch (CDC; Atlanta, GA, Verenigde Staten).

1. Verzameling van hersenweefsel voor postmortale diagnose van rabiës bij dieren door middel van de LN34 pan-lyssavirus real-time RT-PCR-test

OPMERKING: Monsters kunnen infectieuze agentia bevatten. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (zware rubberen handschoenen of andere snijbestendige handschoenen, laboratoriumjas, waterdicht schort, chirurgisch masker, laarzen, beschermende mouwen en een gelaatsscherm) en volg de vereiste veiligheidsvoorschriften voor gebruik, opslag en verwijdering van monsters. Vaccinatie tegen hondsdolheid vóór blootstelling, regelmatige serologische tests en booster-immunisaties (indien nodig) zijn vereist voor iedereen voorafgaand aan het werken met, testen, produceren of uitvoeren van onderzoeksactiviteiten met lyssavirussen of bekende of mogelijk geïnfecteerde exemplaren 2,3,4,6,10.

1. Label één monsterafnamebuisje per monster met een toetredingslabel. Vul elke monsterafnamebuis met 1 ml TRIzol-reagens of een andere homogenisatiebuffer en een deel van MagNA Lyser-kralen (hierna "keramische kralen"). Om keramische kralen toe te voegen, giet je voorzichtig uit de tube kralen in de tube voor monsterafname. Tubes van keramische kralen bevatten over het algemeen voldoende kralen voor 2-5 monsters, waarbij ten minste 20 kralen met een diameter van 1,4 mm per monster worden gebruikt.
   LET OP: TRIzol-reagens (hierna "homogenisatiebuffer") is een gevaarlijke chemische stof; contact met zuren of bleekmiddel maakt giftige gassen vrij; zorgen voor voldoende ventilatie; Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad voor meer informatie. Als gebruikers het TRIzol-reagens of TRI-reagens vervangen door een andere homogenisatiebuffer, is aanvullende validatie noodzakelijk. TRIzol fungeert als een monsterhomogenisatie-/lysisbuffer, lyssavirus-inactiveringsbuffer en RNA-stabiliteitsbuffer voor dit protocol. Het gebruik van een alternatieve homogenisatiebuffer vereist validatie van extractie-efficiëntie, inactivatie en stabiliteit in een gecontroleerde zij-aan-zij vergelijking.
2. Reinig en desinfecteer het werkoppervlak gedurende 2 minuten met het ontsmettingsmiddel quaternaire ammoniumverbindingen (QAC) en leg een met plastic bekleed absorberend kussen neer. Plaats alleen reagentia en benodigdheden voor het eerste monster in een biologische veiligheidskast van klasse II (BSC) met functies om gevaarlijke dampen buiten de kamer af te voeren.
   NOTITIE: Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor opslaglimieten van verdunde QAC. Zorg ervoor dat de met plastic beklede pad de luchtstroom van de biologische veiligheidskast niet blokkeert. Als de luchtstroom wordt verstoord, gebruik dan geen pad.
3. Verzamel weefsel dat een volledige dwarsdoorsnede van de hersenstam en het cerebellum vertegenwoordigt met behulp van een schoon scalpel voor eenmalig gebruik.
   OPMERKING: Manipulatie van weefsels moet worden uitgevoerd op een manier die geen vloeistoffen vernevelt of deeltjes in de lucht produceert. Zuurkasten of bioveiligheidskasten zijn niet vereist, maar geventileerde bioveiligheidskasten worden aanbevolen omdat ze extra bescherming bieden tegen geuren, dampen, ectoparasieten en botfragmenten.
   LET OP: Het gebruik van een scalpel met materiaal dat mogelijk is geïnfecteerd met lyssavirus is gevaarlijk en gebruikers moeten de juiste veiligheidsmaatregelen nemen. Het gebruik van een tang voor eenmalig gebruik wordt aanbevolen.
   1. Voor kleine dieren (zoals vleermuizen) kan de hele hersenstam en het cerebellum worden verzameld.
   2. Verzamel voor grotere dieren een volledige doorsnede van de hersenstam en het weefsel van elk van de drie lobben van het cerebellum.
   3. OPTIONEEL: Als u de directe fluorescerende antilichaamtest (DFA) uitvoert, verzamel dan op dit punt hersenindrukken. Gebruik het weefsel dat overblijft na het verzamelen van hersenafdrukken voor DFA voor RNA-extractie en testen met de LN34-test.
      OPMERKING: Als TRIzol aan monsters wordt toegevoegd, kunnen monsters niet langer worden gebruikt voor op antigeen gebaseerde detectiemethoden of virusisolatie.
4. Bereid monsters voor op homogenisatie en RNA-extractie.
   OPMERKING: De efficiëntie van RNA-extractie en virusinactivatie kan worden beïnvloed door te veel weefsel te gebruiken. De hoeveelheid weefsel mag niet groter zijn dan ongeveer 1/10 van het volume van de gebruikte homogenisatiebuffer. Als er meer weefsel wordt gebruikt, verhoog dan de hoeveelheid homogenisatiebuffer dienovereenkomstig om een efficiënte en succesvolle RNA-extractie te garanderen.
   1. Plaats voor kleine dieren alle benodigde weefsels in een buis met homogenisatiebuffer en kralen voor extractie. Overschrijd niet meer dan 100 mg monster in 1 ml homogenisatiebuffer; Verhoog voor grotere monsters het volume van de homogenisatiebuffer of gebruik meerdere buizen om een monster met een verhouding van 1:10 weer te geven: buffer.
   2. Voor grotere dieren, hak en homogeniseer het weefsel grondig en verwijder een representatief deel in een buis die vooraf is gevuld met homogenisatiebuffer en kralen. Overschrijd niet meer dan 100 mg monster in 1 ml homogenisatiebuffer; Verhoog voor grotere monsters het volume van de homogenisatiebuffer of gebruik meerdere buizen om een monster met een verhouding van 1:10 weer te geven: buffer.
      1. Optie 1 (Kralenklopper): Homogeniseer het weefsel met behulp van een kralenklopper, 1 ml buffer en keramische kralen. Het kan nodig zijn om meerdere tubes van 2 ml of grotere tubes te gebruiken.
      2. Optie 1 (Kralenklopper): Reinig en desinfecteer het werkstation, de apparatuur en de buitenste monsterbuisjes met QAC-desinfectiemiddel (1:256). Laat het 2 minuten staan.
      3. Optie 1 (Kralenklopper): Laad in de BSC een centrifugerotor met gehomogeniseerde monster(s). Centrifugeer alle monster(s) bij 10.000-16.000 g × g gedurende 2 minuten in een microcentrifuge op tafel. Laad de centrifugerotor in de BSC.
      4. Optie 1 (Kralenklopper): Laat het 2 minuten staan.
      5. Optie 1 (Kralenklopper): Breng 120 μL homogenaat over in een buis die vooraf is gevuld met 1 ml homogenisatiebuffer.
         LET OP: Homogenisatie kan aerosolen produceren en moet worden uitgevoerd in een BSC.
      6. Optie 2 (scalpel): Hak de benodigde weefsels fijn met een scalpel voor eenmalig gebruik, smeer in met een wattenstaafje en breng het wattenstaafje over naar een buisje dat vooraf is gevuld met homogenisatiebuffer en kralen. Overschrijd niet meer dan 100 mg monster in 1 ml homogenisatiebuffer; Verhoog voor grotere monsters het volume van de homogenisatiebuffer of gebruik meerdere buizen om een monster:buffer in een verhouding van 1:10 weer te geven.
         LET OP: Het gebruik van een scalpel met materiaal dat mogelijk is geïnfecteerd met lyssavirus is gevaarlijk en gebruikers moeten de juiste veiligheidsmaatregelen nemen.
5. Verzamel alle resterende tissues in de originele verpakking of in een nieuwe, lege verpakking met een toetredingslabel. Bewaar dit weefsel voor het geval hertesten of aanvullende karakterisering nodig is.
6. Reinig en desinfecteer het werkstation, de apparatuur en de buitenkant van de monsterbuisjes met QAC-desinfectiemiddel 1:256. Laat het 2 minuten staan.
7. Herhaal stap 1.2-1.5 voor alle resterende monsters.
8. Homogeniseer monsters met een mini-kralenklopper gedurende ten minste 60 s. Inspecteer de buizen visueel. Herhaal de kralenklopper nog 60 seconden als er grote stukjes weefsel achterblijven. Deze stap is optioneel als het weefsel volledig is gehomogeniseerd in stap 1.4.2.1 hierboven.
   OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het weefsel grondig wordt gehomogeniseerd. Onvolledige homogenisatie zal de RNA-opbrengst verminderen.
9. Laat minimaal 5 minuten staan bij kamertemperatuur (RT).
10. Reinig en desinfecteer de werkplek, apparatuur en de buitenkant van de monsterbuisjes met QAC-desinfectiemiddel (1:256).
    OPMERKING: Het monster wordt op dit moment als niet-infectieus beschouwd en kan uit het laboratorium voor hondsdolheid worden verwijderd.
11. Verwerk monsters onmiddellijk in een homogenisatiebuffer voor RNA-extractie, bewaar ze enkele dagen bij RT (20 °C tot 25 °C) of gekoeld (4 °C tot 8 °C), of bewaar ze bij -16 °C of kouder voor langdurige opslag.

2. Protocol voor RNA-extractie met behulp van de RNA MiniPrep-kit

1. Stel de werkruimte in onder de BSC.
   1. Reinig het BSC-werkblad met 70% ethanol voordat u met de werkzaamheden begint om stof of andere milieuverontreinigingen te verwijderen. Voer extra oppervlakteontsmetting uit met QAC-desinfectiemiddel (1:256), RNase AWAY of RNaseZap (volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
   2. Leg een met plastic bekleed absorberend werkkussen neer en plaats reagentia, benodigdheden en het monster in de BSC.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het met plastic beklede kussen de luchtstroom van de BSC niet blokkeert. Als de luchtstroom wordt verstoord, gebruik dan geen pad.
   3. Leg alle opvangbuisjes in een schoon rek voor microcentrifugebuisjes. Vul een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor met 300 μL 100% ethanol voor elk hersenmonster dat geen vleermuis is. Voor monsters met weinig weefsel (vleermuishersenmonster, niet-hersenmonster of verslechterd monster), vult u een microcentrifugebuis van 1.5 ml voor met 600 μL 100% ethanol voor elk.
2. Voorbereiding van het monster
   1. Verzamel alle monsters die in sectie 1 zijn voorbereid in een buizenrek in de BSC. Ontdooi alle bevroren monsters vlak voor het testen.
   2. Ontdooi een extractiecontrole.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een monster te kiezen zonder lyssavirus-RNA; het monster moet vooraf worden getest met een verwacht Ct-waardebereik voor de bèta-actinetest. Bijvoorbeeld voorgedimensioneerde weefselkweekcellen of een eerder getest negatief geval van hondsdolheid (mens of dier).
3. Centrifugeer alle monsters bij 10.000-16.000 g × g gedurende 2 m in een microcentrifuge op tafel.
4. Breng het bovenstaande over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis met 100% ethanol. Zorg ervoor dat het bovenstaande helder is, zonder duidelijke lipiden of vast weefsel. Vermijd het verzamelen van lipiden en vast weefsel.
   1. Voor niet-vleermuisachtig hersenweefsel: breng 300 μL supernatant over.
   2. Voor monsters met weinig weefsel (vleermuishersenmonster, niet-hersenmonster of verslechterd monster), breng 600 μL supernatant over.
   3. Bewaar het resterende homogenaat in een microcentrifugebuisje met schroefdop bij ≤-16 °C.
5. Pipetteer 10 keer op en neer om te mengen.
6. Breng voor elk monster 600 μl van het ethanol-supernatantmengsel over naar een spinkolom in een verzamelbuis.
7. Centrifugeer totdat de vloeistof door de kolom is gegaan (1 minuut bij 10.000-16.000 × g). Gooi de doorstroom weg.
8. Herhaal dit als er meer dan 600 μL ethanol-homogenisatiebuffermengsel voor een monster is.
9. Breng elke kolom over in een nieuwe opvangbuis.
10. Voeg 400 μL RNA-voorwasbuffer toe aan elke kolom en centrifugeer op 10.000-16.000 × g gedurende 30 s.
11. Gooi de doorstroom weg en plaats elke kolom terug in dezelfde opvangbuis.
12. Herhaal stap 2.10-2.11.
13. Voeg 700 μL RNA-wasbuffer toe aan elke kolom en centrifugeer op 10.000-16.000 × g gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat de wasbuffer volledig door elke kolom is gegaan.
14. Breng elke kolom voorzichtig over in een RNase-vrije buis.
15. Gooi de doorstroom en de opvangbuis vanaf 2.13 weg.
16. Voeg 50 μL DNase/RNase-vrij water rechtstreeks toe aan de kolommatrix om RNA te elueren.
    OPMERKING: Raak de kolommatrix niet aan met de pipetpunt.
17. Incubeer gedurende 30 s bij RT en centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 10.000-16.000 × g .
18. Breng het RNA voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis met schroef en platte bodem. Verplaats geëxtraheerd RNA naar ijs voor onmiddellijk testen. Langdurig bewaren bij -70 °C of kouder.
    OPMERKING: Opslag bij warmere temperaturen of herhaaldelijk vries-dooi kan leiden tot RNA-degradatie en de diagnostische resultaten beïnvloeden.

3. Protocol voor LN34 pan-lyssavirus real-time RT-PCR-assay

1. Bereid reagentia voor.
   1. Kunstmatige positieve controle
      1. Als een kunstmatig positief controle-RNA wordt geproduceerd door CDC⁸, volg dan de instructies op de verpakking voor opslag, reconstitutie en aliquoting. Sla deze stap over als er al aliquots van positief controle-RNA voor eenmalig gebruik voorhanden zijn.
         OPMERKING: Positief controle-RNA bij werkconcentraties moet worden gehanteerd in het gebied waar de sjabloon wordt toegevoegd en niet in hetzelfde gebied als de mastermix-bereiding. Positiefcontrole-RNA moet een cyclusdrempelwaarde (Ct) opleveren binnen het verwachte bereik dat voor een bepaalde partij is bepaald. Tussen de runs door mag de LN34 Ct-waarde voor het positieve controle-RNA niet meer dan ±1,5 Ct-waarden verschillen.
      2. Ontdooi een aliquot voor eenmalig gebruik uit een opslag van ≤ -70 °C vlak voor gebruik op ijs of ijsblok. Niet invriezen en ontdooien en aliquots weggooien die langere tijd bij gekoelde temperaturen zijn bewaard.
         OPMERKING: Een positieve controle moet in drievoud worden uitgevoerd in de LN34-test; De kunstmatige positieve controle⁸ zal niet amplificeren in de bèta-actinetest.
   2. Extractiecontrole en monsters: Plaats vers geëxtraheerde monsters op ijs (of ijsblok) of ontdooi monsters uit ≤ -70 °C opslag op ijs (of ijsblok) onmiddellijk voor gebruik.
      OPMERKING: RNA moet worden ontdooid en verwerkt in een gebied dat is aangewezen voor het toevoegen van monsters of sjablonen en dat gescheiden is van gebieden die worden gebruikt voor de bereiding van mastermixen of manipulatie van PCR-producten of grote hoeveelheden viraal materiaal (bijv. genereren van positieve controle, virale voortplanting)
2. Bereid de mastermix-reagentia voor in de voorbereidingsruimte van de mastermix.
   1. Mastermix-bereiding van singleplex LN34 RT-PCR-assay
      OPMERKING: Gebruikers kunnen voorbeelden testen in singleplex (stap 3.2.1) of multiplex (stap 3.2.2) formaat. Het is niet nodig om zowel 3.2.1 als 3.3.2 uit te voeren. Mastermix-preparatering, primer en sonde aliquoting, en geen sjablooncontrolereagentia mogen worden ontdooid en gemanipuleerd in een schoon gebied, gescheiden van monsterverwerking, necropsie, PCR en andere gebieden waar virale materialen worden gemanipuleerd. Dit kan worden bereikt door middel van aparte ruimtes of een kastsysteem met eenzijdige bemonsteringsstroom.
      1. Genereer primer- en sondemengsels in werkconcentraties zoals aangegeven in tabel 1 en tabel 2. Sla deze stap over als de werkende verdunningsaliquots van primers en sondes al in gebruik zijn.
      2. Aliquot primers en sondes in 1,5 ml opslagvoorraden en 50 μL werkvoorraden en bewaren bij ≤ -16°C in het donker. Sla deze stap over als de werkende verdunningsaliquots van primers en sondes al in gebruik zijn.
         OPMERKING: Het wordt aanbevolen om stap 3.2.1.2 uit te voeren.
      3. Ontdooi eenstaps RT-PCR-buffer, geen sjablooncontrole, primers en sondes van ≤ -16 °C opslag op ijs of ijsblok in de mastermix-bereidingsruimte.
         OPMERKING: Gebruik reagentia tot de vervaldatum of tot de prestatiefout, afhankelijk van wat zich het eerst voordoet.
      4. Draai en centrifugeer kort alle buffers, primers en sondes voor gebruik.
      5. Bewaar het eenstaps RT-PCR-enzym op ijs of in een ijsblok tot gebruik.
      6. RNA-monsters
         OPMERKING: Gebruik waar mogelijk vers geëxtraheerd RNA, aangezien vries-dooi de prestaties kan beïnvloeden
      7. Bewaar RNA-monsters op ijs of ijsblok tot gebruik.
      8. Ontdooi alle bevroren RNA-monsters op ijs of een ijsblok.
      9. Label één microcentrifugebuisje per test (LN34 en βA).
      10. Bepaal het aantal reacties (N) dat per test moet worden ingesteld.
      11. Bereken het aantal reacties voor de LN34-test door het aantal monsters met 3 te vermenigvuldigen en 6 toe te voegen voor controlereactieputjes plus 10% extra reacties om rekening te houden met het volumeverlies tijdens het pipetteren. (bijv. voor 10 monsters: (10 x 3) + 6 = 36 reacties; overtollige reacties: (36 x 0,1) + 36 = 3,6 + 36 = 39,6 totale reacties, of 40 reacties naar boven afgerond)
          OPMERKING: Voor klinische tests wordt voorgesteld om alle monsters in drievoud te testen op LN34. Voor bewakingsdoeleinden kan elk monster in tweevoud worden getest. Het wordt aanbevolen om drievoud te gebruiken tijdens de eerste testonboarding om een lage variabiliteit tussen replicaten en een goede techniek te garanderen.
      12. Bereken het aantal reacties voor de βA-test door het aantal monsters plus 4 controlereactieputjes plus 10% extra reacties bij elkaar op te tellen om rekening te houden met het volumeverlies tijdens het pipetteren.
      13. Bepaal het volume van elk reagens voor de LN34- en βA-mastermixen aan de hand van tabel 2.
      14. Wijs putjes aan voor elk monster dat in drievoud moet worden getest in de LN34-test en enkelvoudig voor de βA-test met behulp van een plaatkaart met 96 putjes.
      15. Doseer 23 μL LN34-assay mastermix in elke LN34 toegewezen put na kort 30 s te hebben gevortexd en naar beneden gedraaid met behulp van een tafelmodel microcentrifuge om vloeistof op de bodem van de buis te verzamelen. Vermijd het introduceren van bubbels.
      16. Doseer reagentia 23 μL βA-assay mastermix in elke βA-gelabelde toegewezen put na een korte vortex en neerdraaien gedurende 30 s in een tabletop microcentrifuge om vloeistof op de bodem op te vangen.
      17. Stel de No Template Control (NTC)-reacties in door 2 μl water van PCR-kwaliteit in elke NTC-put te pipetteren.
      18. Dek de putjes af en breng de plaat over naar het sjabloontoevoegingsgebied.
      19. Draai en centrifugeer kort de buisjes met de RNA-monsters.
      20. Pipetteer 2 μL geëxtraheerd RNA uit het eerste monster in elk putje dat voor dat monster is geëtiketteerd. Vermijd het introduceren van bubbels.
      21. Zorg ervoor dat RNA door visualisatie in de pipet is getrokken.
      22. Pipetteer aan de zijkant van de put om ervoor te zorgen dat het monster aan de juiste put wordt toegevoegd.
      23. Zwaai zoveel mogelijk niet met pipetpunten met RNA over open putjes.
      24. Herhaal stap 3.2.10 voor de overige monsters en het positieve controle-RNA.
      25. Plaats de optisch zelfklevende hoes over de putjes na het toevoegen van alle monsters en bedieningselementen. Zorg ervoor dat u alle putten afdekt en volledig afsluit.
      26. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 1 minuut bij RT in een tafelcentrifuge of gebruik een plaatcentrifuger van het type slacentrifuger.
      27. Plaats de verzegelde plaat in een real-time PCR-instrument dat is gekalibreerd voor FAM- en VIC/HEX-reporterkleurstoffen en stel het in op de cyclusparameters die worden weergegeven in tabel 3.
   2. Bereid mastermengsels voor op de LN34 Multiplexed (LN34M) test.
      1. Label één microcentrifugebuisje LN34M volgens tabel 2.
      2. Bepaal het aantal reacties (N) dat per test moet worden ingesteld.
      3. Bereken het aantal reacties voor de LN34M-test door het aantal monsters met 3 te vermenigvuldigen en voeg 6 toe voor controlereactieputjes plus 10% extra reacties om rekening te houden met het volumeverlies tijdens het pipetteren. (bijv. voor 10 monsters: (10 x 3) + 6 = 36 reacties; overtollige reacties: (36 x 0,1) + 36 = 3,6 + 36 = 39,6 totale reacties, of 40 reacties naar boven afgerond)
      4. Kies het formaat 25 μL of 12,5 μL. Bepaal het volume van elk reagens voor de LN34M-mastermix met behulp van tabel 2.
      5. Wijs putjes aan voor elk monster dat in drievoud moet worden getest in de LN34M-test met behulp van een plaatkaart met 96 putjes.
      6. Doseer reagentia voor de LN34M-test in de putten. Draai en draai kort naar beneden om vloeistof op de bodem op te vangen voordat u 23 μl (voor 25 μl reactie) of 10,5 μl (voor 12,5 μl reactie) mastermengsel in elke toegewezen put doseert. Vermijd het introduceren van bubbels.
      7. Stel de NTC-reacties in door 2 μl water van PCR-kwaliteit in elke NTC-put te pipetteren.
      8. Dek de putjes af en breng de plaat over naar het sjabloontoevoegingsgebied.
      9. Draai en draai kort buizen naar beneden de buizen met de RNA-monsters om vloeistof op de bodem te verzamelen.
      10. Pipetteer 2 μL geëxtraheerd RNA uit het eerste monster in elk putje dat voor dat monster is geëtiketteerd. Vermijd het introduceren van bubbels.
      11. Zorg ervoor dat RNA in de pipetvisualisatie wordt getrokken.
      12. Pipetteer aan de zijkant van de put om ervoor te zorgen dat het monster aan de juiste put wordt toegevoegd.
      13. Zwaai zoveel mogelijk niet met pipetpunten met RNA over open putjes.
      14. Herhaal stap 3.3.8 voor de overige monsters en het positieve controle-RNA.
      15. Plaats na het toevoegen van het laatste monster/controle de optische zelfklevende hoes over de putjes en zorg ervoor dat alle putjes volledig zijn afgedekt en afgedicht.
      16. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 1 minuut bij RT in een tafelcentrifuge of gebruik een plaatcentrifuger van het type slacentrifuger.
      17. Plaats de verzegelde plaat in een real-time PCR-instrument dat is gekalibreerd voor FAM- en VIC/HEX-reporterkleurstoffen en stel het in op de cyclusparameters, zoals weergegeven in tabel 3. Stel de passieve referentiekleurstof in op ROX en voer uit in de standaardmodus (niet in de snelle modus)
          OPMERKING: Deze instelling is specifiek voor de instrumenten die in dit protocol worden genoemd en vereist het gebruik van een eenstaps RT-PCR-reagens dat ROX als passieve kleurstof bevat. Alternatieve instrumenten vereisen verschillende benaderingen om optimale run-instellingen te bepalen. Zorg voor normaal onderhoud van het instrument volgens de fabrikant voor de beste prestaties.

4. Interpretatie van het resultaat

1. Stel een automatische basislijn en handmatige drempelberekeningen in met een waarde van 0,2 voor LN34/FAM en 0,05 voor βA/HEX/VIC.
   OPMERKING: Deze instelling is specifiek voor de instrumenten die in dit protocol worden genoemd en vereist het gebruik van een eenstaps RT-PCR-reagens dat ROX als passieve kleurstof bevat. Alternatieve instrumenten vereisen verschillende benaderingen om basis- en drempelwaarden te berekenen.
2. Bepaal het diagnostische resultaat aan de hand van de richtlijnen in tabel 4 als alle controles hebben gepresteerd zoals verwacht (tabel 5).
3. Bevestig alle Ct- of Cq-waarden door versterkingsgrafieken weer te geven.
4. Onderzoek eventuele ongebruikelijke resultaten zoals aanbevolen.

5. Bewaren en bewaren van monsters

1. Bewaar alle monsters ingevroren bij -16 °C of lager totdat het testen is voltooid en de resultaten worden gerapporteerd. Bewaar de originele weefsels om de resultaten te bevestigen of om het gastheerdier te identificeren in geval van ongebruikelijke testresultaten.
2. Gebruik unieke voorbeeld-ID's; Label alle tubes, rapporten en papierwerk met volledige unieke voorbeeld-ID's.
3. Bewaar tussenmonsters (korte termijn) voor het geval herhaling van de tests nodig is.
4. Bewaar representatieve positieve monsters indien nodig voor gebruik als controles, epidemiologische typering en andere doeleinden.
5. Bewaar RNA bij ≤-70 °C voor langdurige opslag.

Resultaten

Representatieve beelden van een succesvolle LN34-test die is uitgevoerd op een ABI ViiA7 real-time PCR-instrument worden weergegeven in figuur 2. Door de resultaten op een logaritmische schaal te bekijken, kan gemakkelijk de Ct-waarde worden bekeken, het punt waarop de curve de drempellijn overschrijdt (Figuur 2A,C). Wanneer uitgezet op een lineaire schaal, zal succesvolle versterking verschijnen als een sigmoïdale (of "S"-vormige) curve (Figuur 2B,D), terwijl negatieve resultaten moeten verschijnen als een rechte, vlakke lijn. Het wordt aanbevolen om resultaten weer te geven in zowel lineaire als logschaalweergaven om mogelijke afwijkingen of fouten te identificeren. Typische positieve en negatieve resultaten in de plotweergave met meerdere componenten zijn respectievelijk te zien in Figuur 2E,F, waar het fluorescentieniveau van de kleurstof die de sonde labelt (FAM voor LN34, VIC/HEX voor βA) kan worden waargenomen ten opzichte van de passieve kleurstof in de reactiebuffer (ROX).

Voorbeelden van afwijkende resultaten worden getoond in Figuur 3. Vergelijkingen tussen de grafieken van succesvolle runs (Figuur 2) en abnormale grafieken (Figuur 3) kunnen worden gebruikt om atypische runs en instrumentproblemen te isoleren. Figuur 3A toont een signaal dat de drempel overschrijdt, wat een Ct-waarde voor LN34 oplevert, maar de versterkingscurve is zeer atypisch en neemt lineair toe. De grafiek met meerdere componenten (Figuur 3B) toont ook een golvende lijn die niet typerend is voor een positieve steekproef. Dit voorbeeld benadrukt het belang van het bekijken van de versterkingsplots en niet simpelweg het kopiëren van Ct-waarden. Zorg er altijd voor dat de versterkingscurven er normaal uitzien voor alle samples. Het is ook aan te raden om het perceel met meerdere componenten te bekijken om er zeker van te zijn dat er geen onregelmatigheden zijn. Af en toe kunnen rommelige basislijnsignalen Ct-waarden genereren in gevallen waarin er geen versterking heeft plaatsgevonden. Als versterkingssignalen lineair lijken, wordt voorgesteld de basislijn aan te passen om te zien of de curve verdwijnt. In het geval van een ongewoon signaal moet de hele run worden herhaald. Het wordt aanbevolen om een achtergrondplaat op uw real-time PCR-instrument schoon te maken en uit te voeren als de problemen aanhouden. Indien beschikbaar, kunnen PCR-producten worden uitgevoerd op een agarosegel en/of worden gesequenced om ongebruikelijke resultaten op te lossen. Het wordt niet aanbevolen om de resultaten van gelelektroforese of sequencing te gebruiken om diagnostische resultaten te bepalen.

Eerdere studies hebben een lage variabiliteit aangetoond tussen replicaten, testrun, operator en laboratorium voor de LN34-assay⁷. Als een hoge variabiliteit (>±1,5 Ct verschil) tussen replicaten van hetzelfde monster wordt waargenomen, moet dat RNA opnieuw worden getest. Hoge variabiliteit kan worden veroorzaakt door problemen met pipetten, laboratoriumpraktijken, verkeerd pipetteren of real-time PCR-machines. Herhaalde observatie van hoge variabiliteit in verschillende monsters of in verschillende testruns kan wijzen op systemische problemen. Monsters met een laag RNA, die de testdrempel voor een positief monster (Ct 35) naderen, kunnen een grotere variabiliteit vertonen in Ct-waarden tussen replicaten. Overleg met CDC en probleemoplossing kunnen nodig zijn om de oorzaak van de aanhoudende variabiliteit, inconsistente resultaten of mislukte tests aan te pakken.

De hoge gevoeligheid van op PCR gebaseerde testen maakt ze inherent vatbaar voor besmetting. Strikte naleving van goede laboratoriumpraktijken is de beste manier om kruisbesmetting te beperken. Het is belangrijk om te weten hoe u mogelijke verontreiniging kunt identificeren. Contaminatie met reagentia moet worden vermoed als er geen sjablooncontrole is en er moet worden vermoed dat negatieve monsterputjes in een test allemaal vergelijkbare Ct-waarden opleveren. Herhaal het testen met nieuwe aliquots van PCR-reagentia (buffer, water, primers en enzym) en hetzelfde RNA. Als alle monsters en de extractiecontrole vergelijkbare CT-waarden opleveren, maar NTC negatief is, moet de verontreiniging van de extractiereagentia worden onderzocht en moet de extractie worden herhaald met nieuwe reagentia. Het is een goede praktijk om kleine hoeveelheden reagentia te maken om het risico van besmetting te verminderen en te voorkomen dat grote hoeveelheden dure reagentia worden weggegooid. Kruisbesmetting van monsters is moeilijker te identificeren. Als besmetting van het monster wordt vermoed, herhaal dan de monsterafname vanaf de originele weefsels. In sommige gevallen kan sequentiebepaling van het virale RNA besmetting bevestigen, vooral wanneer het besmettende RNA heel anders is dan de verwachte virale variant (zoals een controlevirus dat in het laboratorium wordt gebruikt). Sequencing van twee monsters die tegelijkertijd worden verwerkt, kan bepalen of de virale sequenties identiek zijn, maar kan niet informatief zijn als wordt verwacht dat de sequenties erg op elkaar lijken (bijvoorbeeld dezelfde variant die in dezelfde provincie is verzameld). Als besmetting van het monster met het positieve controle-RNA wordt vermoed, kan men de LN34-testamplicons op een agarosegel laten lopen om lyssavirus-RNA (165 bp) te onderscheiden van positiefcontrole-RNA (99 bp). De volgorde van de sjabloon die wordt gebruikt om het positieve controle-RNA te genereren dat door CDC⁸ wordt geleverd.

Voor andere pathogenen kunnen laboratoria worden gebruikt om de drempelwaarde handmatig in te stellen om "ruis" kwijt te raken, zoals de zwakke versterking die in cyaan wordt weergegeven in figuur 4. Deze praktijk wordt NIET aanbevolen voor de diagnose van hondsdolheid, omdat het kan leiden tot vals-negatieve resultaten met ernstige gevolgen, aangezien hondsdolheid bijna 100% dodelijk is. Wijzig de drempel NIET handmatig om negatieve resultaten te produceren voor monsters met zwakke of late versterking. Deze monsters moeten opnieuw worden geëxtraheerd en/of opnieuw worden getest om rabiës uit te sluiten.

Figuur 1: Gezichtsveld met eenzijdige verspreiding van rabiësvirusantigeen bij een geïnfecteerde ezel door middel van een directe fluorescerende antilichaamtest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Amplificatie en grafieken met meerdere componenten van een succesvolle LN34-testrun. (A-D) Resultaatgegevens worden uitgezet op een (A,C) logschaal en (B,D) lineaire schaal voor de LN34- en βA-assay. Panelen A en B tonen LN34 resultaten van twee monsters (in roze en cyaan) vergeleken met de positieve controle (in geel). In paneel B is er een platte groene lijn die een extra negatief monster in de run weergeeft. In A vertonen de groene lijn(en) geen versterking en worden ze weergegeven als onderbroken segmenten. De drempel voor de LN34-test is handmatig ingesteld op 0,2 en wordt weergegeven door de rode horizontale lijn. (C,D) Resultaten van de βA-test voor twee monsters (rood en cyaan). De drempel voor de βA-test werd handmatig ingesteld op 0,05. (E,F) Grafieken met meerdere componenten geven de fluorescentie (RFU) bij elke cyclus weer voor FAM (LN34), VIC (βA) en ROX (passieve kleurstof aanwezig in AgPath-ID-buffer). ROX-niveaus moeten in alle cycli gelijk blijven. Een typische positieve steekproef wordt getoond in paneel E; FAM-fluorescentie neemt toe als een sigmoïdale curve vanaf cyclus 18 voor dit monster. Een typische negatieve steekproef wordt weergegeven in paneel F, waar het FAM-niveau gedurende alle cycli parallel blijft aan het ROX-niveau. Gegevens zijn afkomstig van een ABI ViiA7 real-time PCR-instrument. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van het zeldzame, atypische signaal dat is waargenomen in LN34-assay op een ViiA7 real-time PCR-instrument. (A-F) Amplificatie (A,C,E) en multicomponent (B,D,F) plots geproduceerd als gevolg van putverontreiniging. De lineaire toename (A,C) en golvende fluctuaties (B,D) in FAM-fluorescentie vertegenwoordigen geen echte versterking op basis van de vorm van de curven en de grootte van de fluorescentieverandering. Panelen A tot en met D vertegenwoordigen waarschijnlijk negatieve monsters, ook al is er een Ct-waarde geproduceerd voor de replicaat die wordt getoond in panelen A en B. Panelen E en F vertonen een vreemd golvend signaal dat gemakkelijker te zien is in de grafiek met meerdere componenten. Dit type signaal moet worden onderzocht en kan duiden op instrumentproblemen, ook al hebben alle bedieningselementen in deze run gepresteerd zoals verwacht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: LN34 real-time RT-PCR-curven van 2 monsters die verdacht zijn van rabiës met twee methoden voor het instellen van drempelwaarden. (A) De drempel van LN34 is ingesteld op 0,2 (aanbevolen voor alle runs). (B) Handmatig een andere drempel bepalen voor elke run om het signaal te maskeren waarvan is vastgesteld dat het "ruis" is (signaal voor late versterking). De methode die in paneel B wordt gebruikt, wordt NIET aanbevolen voor hondsdolheid vanwege de ernstige gevolgen van het missen van een echt positief resultaat. Late amplificatie kan duiden op een zwak positief monster, PCR-remming of mislukte extractie in een positief geval. Het kan ook duiden op kruisbesmetting. Het gouden monster (aangegeven door zwarte pijlen) produceert een Ct-waarde bij de afkapping van de test en mag niet als negatief worden beschouwd. Monsters met late amplificatie moeten opnieuw worden geëxtraheerd en opnieuw worden getest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Primer- en sondesequenties en -concentraties gebruikt in de LN34lys (singleplex LN34), LN34M (LN34 en βA gemultiplexte) real-time RT-PCR-assays. LN34-sondes zijn gelabeld met de fluorescerende FAM-kleurstof aan het 5ʹ-uiteinde en Black Hole-quencher (BHQ1) aan het 3ʹ-uiteinde. De βA-sonde is gelabeld met de fluorescerende HEX-kleurstof aan het 5ʹ-uiteinde en Black Hole-quencher (BHQ1) aan het 3ʹ-uiteinde. Vergrendelde nucleotide-gemodificeerde basen worden aangegeven door een plus voorafgaand aan de base in de sequentie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Assay opgezet voor LN34lys-, Actin3- en LN34M-assays. Namen, sequenties en concentraties van primers en sondes zijn te vinden in tabel 1. LN34_F1 komt overeen met ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAA⁷. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Cyclusparameters voor ABI-instrumenten. BELANGRIJK: Zorg ervoor dat u in de STANDAARD-modus werkt, niet in de FAST-modus . ROX moet worden geselecteerd als de passieve referentiekleurstof. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Algoritme voor de interpretatie van LN34 real-time RT-PCR-resultaten voor singleplex (boven, blauwe tabel) en multiplex (onder, rode tabel) formaten. Een positief LN34-resultaat moet als positief worden beschouwd, zelfs als het βA-resultaat negatief of niet doorslaggevend is. Als LN34-amplicon niet wordt gedetecteerd, moet de βA Ct worden ≤ de vermelde grenswaarde om als negatief te worden beschouwd. βA Ct-waarden geven de kwaliteit van het te testen monster aan en identificeren mogelijke remming. Een lage concentratie in het originele klinische monster kan van invloed zijn op de βA-groeicurves, waardoor er geen waarneembare amplificatie is. Bijkomende factoren die bijdragen aan het niet detecteren van β-actine zijn onder meer slechte extractie van RNA als gevolg van verlies van RNA of overdracht van PCR-remmers, onjuiste testopstelling en -techniek, onbevredigend monstertype of kwaliteit, en storing van reagentia of apparatuur. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Acties en interpretaties van gemeenschappelijke resultaten voor LN34-testcontroles. Alle drie de controles (RNA voor positieve controle tegen rabiës, controle op negatieve extractie tegen hondsdolheid en geen sjablooncontrole moeten de verwachte resultaten opleveren om een run te laten slagen. Als de positieve controle mislukt of er geen sjablooncontrole is, kan dit duiden op verkeerd pipetteren, reagens of defecte apparatuur. De hele run, inclusief alle geteste RNA-monsters, moet worden herhaald. Het falen van de extractiecontrole kan duiden op een probleem tijdens de extractie, zoals falen van het reagens, verkeerd pipetteren of kruisbesmetting. De extractie van alle monsters moet worden herhaald. Het falen van de controles zou zeldzaam moeten zijn bij ervaren laboratoriumpersoneel. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Een succesvolle LN34-testrun vereist een positieve controle, extractiecontrole en geen sjablooncontrolereacties die presteren zoals verwacht in elke testrun of de run moet ongeldig worden gemaakt en worden herhaald. Alle drie de LN34-replicaatreacties met positieve controle moeten de drempelwaarde binnen het gespecificeerde bereik overschrijden, of de run moet worden herhaald. Het positieve controle-RNA dat in eerdere publicaties ^7,8 is beschreven, zal niet amplificeren in de βA-test. De controlereacties zonder sjabloon mogen geen versterkingscurven vertonen die de drempellijn voor de LN34- of de βA-test overschrijden. De afzuigregeling mag geen versterking voor LN34 vertonen. Als er onverwachte amplatie wordt waargenomen in de NTC- of extractiecontrole, kan dit duiden op verontreiniging en de uitvoer- en herhalingstest voor alle monsters ongeldig maken (zie tabel 5). Gebruikers kunnen overwegen om extra controles toe te voegen, waaronder een controle zonder proces of extractie zonder monster, om te controleren op gastheer βA-verontreiniging van extractiereagentia.

Aangezien de sterfte aan hondsdolheid de 100% nadert, wordt aanbevolen om elke zwakke of abnormale amplificatie verder te onderzoeken, zelfs als deze geen Ct-waarde oplevert. Negatieve of NTC-reacties mogen geen versterking vertonen en fluorescentie moet verschijnen als een vlakke lijn parallel aan de ROX-fluorescentie in de weergave met meerdere componenten. Waarnemingen van krommen, vooral in meerdere replicaten, kunnen duiden op kruisbesmetting of een zwak positief resultaat. Alle replicaten voor een positief monster moeten worden geamplificeerd voor een geldig positief resultaat. Als in een van beide tests slechts een subset van replicaten amplificeert, moet het monster opnieuw worden getest. Bovendien moet elke steekproef die zeer variabele resultaten oplevert (Ct-waardeverschillen > ±1,5 tussen duplo's) als ongeldig worden beschouwd en moet de steekproef opnieuw worden getest. Als het probleem zich blijft voordoen, moet het monster opnieuw worden geëxtraheerd.

Een rabiës-positief monster dat is geëxtraheerd uit op de juiste manier verzamelde en opgeslagen hersenstam en cerebellumweefsel, zal naar verwachting een Ct-waarde van minder dan 35 cycli hebben voor de LN34-test. Alle niet-doorslaggevende monsters moeten opnieuw worden getest met LN34 real-time RT-PCR. Als het monster geen uitsluitsel geeft bij herhaalde tests en alle controles worden uitgevoerd zoals verwacht, wordt aanbevolen RNA opnieuw te extraheren. Monsters met een laag viraal RNA (LN34 Ct > 35) kunnen duiden op mogelijke problemen zoals besmetting, lage virusbelasting, PCR-remming of mislukte extractie. Verzamel verse stukjes van de hersenen van het oorspronkelijke weefsel, voer RNA-extractie uit en test het monster opnieuw. Evenzo kunnen Ct-waarden > 33 (singleplex), 37 (LN34M) of geen amplificatie in de βA-test duiden op mislukte RNA-extractie. Herhaal de extractie voor dergelijke monsters en herhaal vervolgens de test voor zowel LN34 als actine. Als een monster na herhaaldelijk testen opnieuw een niet-doorslaggevend resultaat oplevert, gebruik dan een secundaire methode zoals de DFA-test (ook wel FAT genoemd), DRIT of virusisolatie. Als er aanhoudende tegenstrijdige of onduidelijke resultaten worden waargenomen, raadpleeg dan een referentielaboratorium voor hondsdolheid voor bevestigende tests.

Als er remmers aanwezig zijn in een RNA-extractie, kunnen PCR-testen een vals-negatief resultaat opleveren. Als remming wordt vermoed of remming van de βA-controlereacties (zoals Ct-waarde > 33 of Ct-waarde > 37) voor een bepaald monster wordt opgemerkt, moet geëxtraheerd RNA worden getest bij 2 of meer verdunningen (bijv. 1:10 en 1:100 in nucleasevrij water) om eventuele PCR-remmers te verdunnen. Voor moeilijke monsters kan de RNA-input in de RT-PCR-reactie worden verhoogd tot 8,5 μL door geen water toe te voegen. Dit kan leiden tot verhoogde remming (latere Ct-waarde in vergelijking met 2 μL input RNA) of een laag RNA-niveau in het originele monster (eerdere Ct-waarde bij gebruik van 8,5 μL in vergelijking met 2 μL input RNA).

De LN34-test maakt geen onderscheid tussen lyssavirussen en bepaalt geen varianten van het rabiësvirus. Het amplicon van de LN34-test kan worden gesequenced voor typering van rabiësvirusvarianten met lage resolutie of identificatie van lyssavirussoorten¹¹.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
7500 Fast	Applied Biosystems	N/A	Vervang niet zonder validatie
7500 Fast Dx	Applied Biosystems	N/A	Vervang niet zonder validatie
ABI ViiA 7	Applied Biosystems	N/A	Vervang niet zonder validatie
AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit	ThermoFisher Scientific	AM1005	Vervang niet zonder validatie
Beadbug6	Benchmark Scientific	D1036
Direct-zol RNA MiniPrep kit	Zymo Research	R2052
MagNA Lyser green beads	Roche	3358941001
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R
Optical 96-well Reaction Plates	ThermoFisher Scientific	4346907
Optical Adhesive covers	ThermoFisher Scientific	4311971	Alternatief: doppen
Polyester fiber-tipped applicator swabs	BD BBL Polyester Fiber Tipped Application Swab	220690
QuantStudio 6Flex	Applied Biosystems	4485691	Vervang niet zonder validatie
Quaternary ammonium disinfectant (1:256)	LYSOL	WBB56939	Vervang niet zonder validatie
RNase AWAY	ThermoFisher Scientific	7002PK
RNaseZap	ThermoFisher Scientific	AM9780
Single-use scalpel, a scalpel with a safety mechanism	Integra Miltex	4-510
Sterile polyproylene microcentrifuge tubes (1.5 mL), nuclease free	Sarstedt	72.692.405
Sterile polyproylene microcentrifuge tubes (2 mL), nuclease free	Sarstedt	72.694.600
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Vervang niet zonder validatie