Methodenartikel

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66769

⸱

6 september 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Samenvatting

Microglia, als de inwonende macrofagen van de hersenen, zijn essentieel voor het handhaven van de homeostase van de hersenen. Ze vormen neuronale circuits tijdens de ontwikkeling, onderzoeken hun omgeving op puin of dode cellen en reageren op infectie en letsel in de hersenen, naast vele andere functies. Hun belangrijke rol in de neurologische ontwikkeling en synaptische plasticiteit en pathofysiologie is echter niet volledig gedefinieerd, wat de noodzaak van verder onderzoek benadrukt. Om een beter begrip te krijgen van de rol van microglia in deze processen, moeten we microglia isoleren en ze genetisch, metabolisch en functioneel karakteriseren. De isolatie van microglia uit volwassen muizen, vooral uit kleine hersenstructuren, is echter een uitdaging omdat ze een klein percentage van de totale hersencellen vertegenwoordigen en de opbrengst van geïsoleerde microglia vaak te laag is. Hier stelt de magnetische isolatie van microglia met behulp van CD11b+ microbeads ons in staat om microgliacellen te sorteren uit de hypothalamus van een vers doorbloed volwassen muizenbrein. De huidige methode stelt ons in staat om in korte tijd een relatief hoge zuiverheid en opbrengst te bereiken met behoud van cellevensvatbaarheid.

Inleiding

Microglia komen overeen met 5-20% van de totale neurale cellen en zijn de enige gliacellen die afkomstig zijn van erytromyeloïde voorlopercellen in de dooierzak en beginnen met het koloniseren van de zich ontwikkelende hersenen rond embryonale dag E9.5 1,2. Het zijn langlevende cellen met het vermogen om zichzelf langzaam te vernieuwen, onafhankelijk van van beenmerg afgeleide cellen3. Als enkele van de meest dynamische cellen zijn ze in staat om verschillende fenotypes te verwerven als reactie op contextuele en omgevingssignalen 2,4. Van de signalen die hun activiteit kunnen moduleren, zijn schade aan het centrale zenuwstelsel (CZS), neuronale activiteit en voedingsstoffen het krachtigst. Een toenemend aantal onderzoeken heeft de cruciale rol van microglia bij letsel, neurodegeneratieve ziekten en obesitas aangetoond 2,5,6. Desalniettemin vereist de precieze rol van microglia in zowel fysiologische processen als pathofysiologie verder onderzoek. Daarom is hun transcriptionele, metabole en functionele karakterisering onder verschillende omstandigheden van groot belang en vereist hun isolatie, aangezien in situ-studies geschikt zijn voor DNA-, RNA- en eiwitlokalisatie en kwalitatieve vergelijkingen, evenals morfologische karakterisering van microglia.

Er zijn verschillende technieken beschreven voor microglia-isolatie, waaronder de Percoll-gradiëntmethode7, flowcytometrie celsortering (FACS)8 en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). De keuze van de geschikte methode hangt af van de doelstellingen van het onderzoek en het zuiverheidsniveau dat vereist is voor downstreamtoepassingen. De isolatie van pure microglia uit de hersenen van volwassen muizen, vooral uit kleine hersenstructuren zoals de hypothalamus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal microgliacellen. De geautomatiseerde zachte dissociatie van de hypothalamus met behulp van Miltenyi-technologie maakt het mogelijk om in korte tijd een relatief hoge microglia-opbrengst te zuiveren, met de mogelijkheid om tot acht monsters tegelijk te verwerken met een zachteMACS Octo-dissociator.

Weefselhomogenisatie wordt gevolgd door microglia-zuivering met behulp van de MACS-kolomgebaseerde technologie en de supermagnetische CD11b+-kralen van nanoformaat. Daarom worden alle monsters op precies dezelfde manier verwerkt, wat intacte CD11b+-cellen oplevert. Het is opmerkelijk dat CD11b niet uitsluitend aanwezig is in microglia, maar ook tot expressie komt op andere myeloïde afstammingscellen, waaronder macrofagen en monocyten9. Om dit te beperken, zorgt hersenperfusie met ijskoude zoutoplossing voorafgaand aan de hypothalamusextractie (zie protocolstap 2.6) voor de eliminatie van de meeste myeloïde cellen, waardoor er slechts een potentieel klein deel van de residente macrofagen of macrofagen overblijft die aan bloedvaten vastzitten. De residente macrofagen en monocyten van een gezond steady state CZS vormen een klein percentage van de totale immuuncellen in de hersenen (respectievelijk ~10% en <2%)10,11. Daarom, wanneer hersencellen worden gesorteerd met CD11b+ kralen, kunnen zowel microglia als macrofagen worden geïsoleerd, hoewel de overgrote meerderheid microglia zijn.

De eindopbrengst van microglia en het behoud van hun levensvatbaarheid stellen ons in staat om ex vivo en in vitro tests uit te voeren, met het voordeel dat we specifieke hersengebieden van belang kunnen analyseren. Het laatste bewijs heeft aangetoond dat de microglia-populatie zeer heterogeen is en regiospecifieke genexpressie en morfologische kenmerken en functie vertegenwoordigt 2,12,13. Daarom is het huidige protocol gericht op het isoleren en analyseren van volwassen microglia op een regiospecifieke manier. We kunnen inderdaad de genetische, transcriptionele en translationele profielen van volwassen hypothalamische microglia karakteriseren met behulp van methoden zoals RT-qPCR en RNA-sequencing, evenals het uitvoeren van in vitro functionele analyse.

Protocol

Alle beschreven dierproeven zijn uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Unie (2013/63/EU) en zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Bordeaux (CEEA50) en het Franse Ministerie van Hoger Onderwijs, Onderzoek en Innovatie (niet-technische samenvatting van goedgekeurd project NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Het volgende protocol wordt uitgevoerd bij volwassen C57BL/6-muizen met een gemiddelde leeftijd van 2-4 maanden. Het kan echter worden uitgevoerd bij alle leeftijden en aandoeningen van muizen, rekening houdend met het feit dat het immuuncellandschap van het CZS kan worden veranderd en het percentage van de residente macrofagen en monocyten kan worden verhoogd (bijv. bij veroudering en neurodegeneratie).

1. Bereiding van oplossingen

OPMERKING: De volgende volumes en oplossingen zijn strikt bedoeld voor de isolatie van Cd11b+-cellen.

  1. Bepaal het totale benodigde volume D-PBS/0,5% runderserumalbumine (BSA) op basis van het aantal monsters. Bereid de oplossing met behulp van het in de handel verkrijgbare D-PBS met calcium en magnesium en BSA-poeder (zie de materiaaltabel).
  2. Bereid gelabelde dissociatiebuizen (C-buizen) voor en vul elk met 1.900 μL buffer Z, meegeleverd in de dissociatiekit voor volwassen hersenweefsel (zie de materiaaltabel). Ontdooi de enzymen en bewaar ze op het ijs, samen met alle buffers die nodig zijn in de volgende stappen.
  3. Bereid het juiste volume van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (zie de materiaaltabel) die nodig is voor de perfusie (stap 2.6) voor en leg het op ijs. Bereken 10 ml voor elk dier plus 10% overmaat.
  4. Bereid voor RT-qPCR-analyse qPCR-buffer per monster: 2,5 μL thioglycerol + 250 μL lysisbuffer, met behulp van een in de handel verkrijgbare kit om RNA te zuiveren (zie de Materiaaltabel).
  5. Bereid voor de kwantificering van het eiwit de lysisbuffer voor door de cocktail van fosfataseremmers en de proteaseremmers 1:100 te verdunnen in een extractiebuffer voor zoogdieren (zie de materiaaltabel).
  6. Voor de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de fagocytose-test bereidt u 1x HBSS van de in de handel verkrijgbare 10x HBSS (zie de materiaaltabel). Bereid vervolgens de FACS-buffer voor door 0,2% BSA toe te voegen aan 1x HBSS.

2. Verwijdering van de hersenen

  1. Verdoof het dier met een dosis van 20 mg/kg xylazine; Euthanaseer de muis vervolgens met een overdosis van 400 mg/kg pentobarbital en plaats deze op zijn rug in een snijbak.
    OPMERKING: Andere verdovingscombinaties om het dier te euthanaseren kunnen ook werken.
  2. Vul een spuit van 10 ml met 10 ml ijskoude 1x PBS en bevestig deze aan een vlindernaald van 21 G.
  3. Zodra de muis volledig is verdoofd (controleer door in de poten te knijpen om er zeker van te zijn dat er geen reactie is), stopt de ademhaling en is het hart in fibrillatie, tent de huid met een tang en open de borstholte met een schaar, ter hoogte van de laatste ribben en het borstbeen.
  4. Gebruik de schaar om een diepe snede te maken langs de zijkanten van de ribbenkast naar de bovenkant van de ribbenkast om het hart bloot te leggen.
  5. Steek de naald van 21 G in het distale deel van de linkerventrikel (zorg ervoor dat ongeveer 1/3 van de naald zich in de ventrikel bevindt). Maak onmiddellijk een incisie door de rechter boezem met behulp van de schaar.
  6. Laat 10 ml ijskoude 1x PBS trekken om de hersenen te reinigen van alle circulerende immuuncellen.
    OPMERKING: Controleer de hersenen visueel om er zeker van te zijn dat ze schoon en goed doorbloed zijn.
  7. Snijd de muizenkop af, haal de hersenen er voorzichtig uit en plaats deze op een petrischaal gevuld met ijs en bedekt met aluminiumfolie.
    OPMERKING: De petrischaal en folie helpen bij het zien van de hersenstukken. Het is gunstig om een koele omgeving te behouden tijdens het hakken van de hersenstukken om metabolische activiteiten te beperken.
  8. Isoleer de hypothalamus met een tang en snijd deze met scheermesjes in kleine stukjes.
    1. Om de hypothalamus te identificeren en te ontleden, plaatst u de hersenen ondersteboven zodat de cortex ventraal is en de hypothalamus dorsaal zichtbaar is op het bovenste oppervlak. Scheid de hypothalamus, die zich aan de onderkant van de hersenen aan beide zijden van de derde ventrikel bevindt, met behulp van een gebogen pincet. Het gemiddelde gewicht van de hypothalamus van volwassen C57BL/6 muizen is 15 mg.
      LET OP: De hersenstukken moeten zo klein mogelijk zijn (<0,5 mm). Het in kleine stukjes knippen is een cruciale stap, omdat het een betere dissociatie en een hogere opbrengst van cellen mogelijk maakt.
  9. Verzamel de stukjes van de hypothalamus in dissociatiebuisjes (C-buisjes) die eerder gevuld zijn met 1.900 μL Buffer Z (stap 1.2).
    OPMERKING: Om een goede opbrengst aan microgliacellen te hebben die voldoende is om tests uit te voeren, poolt u minimaal twee (voor eiwitkwantificering) of drie (voor qPCR en RNAseq) hypothalami per buis.

3. Weefsel dissociatie

NOTITIE: Alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd. Draai de celsuspensie in geen enkele stap vortex; meng alleen voorzichtig met een pipet van 1.000 μL.

  1. Bereid enzymmix 2 volgens tabel 1 (berekening van het totale volume voor alle buisjes + 10% overmaat). Voeg in elke C-buis 50 μl van het enzym in mix 1 (zie tabel 1) en 30 μl enzymmix 2 toe. Alle enzymen zijn aanwezig in de dissociatiekit voor volwassen hersenweefsel (zie de materiaaltabel).
  2. Sluit de C-buizen en plaats ze ondersteboven in de dissociator met de verwarmingsbeugels volgens de instructies van de fabrikant. Voer het programma 37C_ABDK_02 uit.
  3. Bereid 15 ml klikbuisjes voor (zie de tabel met materialen) met zeven van 70 μm erop. Bevochtig de zeef met 2 ml D-PBS.
  4. Wanneer het dissociatie-/verteringsprogramma is voltooid, leegt u de C-Tube op de zeef en krabt u met een punt van 200 μL om celverlies te verminderen door de celfiltratie te verhogen en de hechting van weefselhomogenaat op het filter te verminderen.
  5. Was de tube met 2 x 5 ml D-PBS, leeg de wasgoed op de zeef en krab met een tip van 200 μl tussen de wasbeurten.
  6. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en zuig het supernatans volledig op. Resuspendeer de celpellet voorzichtig met het juiste volume koude D-PBS volgens tabel 1.
  7. Meng onmiddellijk voorzichtig met 450 μl dichtheidsgradiëntreagens (oplossing voor het verwijderen van puin, zie de tabel met materialen) en bedek heel voorzichtig met 2 ml koude D-PBS (zie tabel 1).
    OPMERKING: Om de verschillende lagen met dichtheidsgradiënt te verkrijgen, moet de D-PBS voorzichtig druppel voor druppel worden aangebracht, met zo min mogelijk "verstoring", 1 ml per keer met een pipet van 1 ml.
  8. Centrifugeer bij 3.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C met langzame acceleratie en langzame rem (als 9 gelijk is aan vol, gebruik dan 5).
  9. Er worden drie fasen gevormd. Zuig de twee bovenste fasen volledig op en gooi ze weg. Zorg ervoor dat u de derde bodemfase niet opzuigt.
  10. Vul met 1800 μL koude D-PBS en keer de slang voorzichtig 3 keer om.
  11. Centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en volledige rem en zuig het supernatans volledig op. Resuspendeer de celpellet voorzichtig door langzaam op en neer te pipetteren met 2 ml D-PBS/BSA.

4. Magnetische isolatie van CD11b+ cellen

  1. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en zuig het supernatans volledig op. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 90 μL buffer D-PBS/BSA.
  2. Voeg 10 μL van het CD11b-microbead-mengsel toe en meng goed met de pipet.
  3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 2-8 °C in de koelkast, niet op ijs; was de cellen door 1 ml D-PBS/BSA toe te voegen en centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C; Zuig het supernatans volledig op. Resuspendeer voorzichtig in 500 μL D-PBS/BSA.
  4. Start het POSSEL2-programma op de separator volgens de instructies op het scherm. Plaats de kleine kolommen (zie de Tabel met Materialen) in het magnetische veld.
    OPMERKING: Er kunnen kleine of grote kolommen worden gekozen voor het sorteren van magnetische cellen, afhankelijk van het gemiddelde aantal cellen dat wordt verwacht. Kleine kolommen hebben een capaciteit van maximaal 1 × 107 gelabelde cellen en grote kolommen tot 1 × 108. Bij het isoleren van cellen uit kleine structuren, zoals de hypothalamus, worden kleine kolommen geadviseerd. De volumes van reagentia zijn anders bij gebruik van grote kolommen (zie instructies van de fabrikant).
  5. Bevochtig de kolommen (zie de Tabel met Materialen) met 500 μL D-PBS/BSA. Als de negatieve fractie van cellen (CD11b-) nodig is voor verdere analyse, plaats dan een verzamelplaat onder de kolommen en breng vervolgens celsuspensie aan in de kolommen.
  6. Voer drie wasstappen uit door 500 μL D-PBS/BSA per keer toe te voegen aan de kolom, waarbij u telkens wacht tot de buffer door de kolom is gegaan.
    LET OP: het is belangrijk om te voorkomen dat het bovenste deel van de kolom uitdroogt, dus het is aan te raden om niet te wachten tot alle buffer is gepasseerd.
  7. Breng het totale effluent van de CD11b-fractie over van de putten van de verzamelplaat naar buizen van 15 milliliter.
  8. Haal de kolom uit de separator, plaats deze op een buisje van 5 ml en pipetteer 1 ml D-PBS/BSA in de kolom.
  9. Spoel de magnetisch gelabelde celfractie onmiddellijk weg door de zuiger die bij de kolom is geleverd stevig aan te brengen.
  10. Tel uiteindelijk CD11b+- cellen met een hemacytometer of een andere methode; Verwacht ~15.000 cellen per hypothalamus.
  11. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.

5. Analyses

  1. Voor RT-qPCR-analyse resuspendeert u de celpellets met qPCR-buffer (voor de bereiding, zie stap 1.3) en bewaart u de buisjes bij - 80 °C tot mRNA-extractie. Isoleer totaal RNA, verwerk en analyseer het vervolgens volgens de MIQE-richtlijnen14. Synthese ten slotte cDNA en voer qPCR uit met behulp van een RT-PCR-apparaat. Zie de Tabel met Materialen voor alle in de handel verkrijgbare kits die worden gebruikt.
  2. Voor eiwitkwantificering wast u de celpellets minstens 2x met D-PBS (zonder BSA) om BSA te elimineren. Resuspendeer vervolgens de celpellets uit twee hypothalami met 20 μL lysisbuffer. Ga verder met eiwitkwantificering met een eiwittestkit (zie de Tabel met materialen).
    OPMERKING: We hebben de instructies van de fabrikant15 gevolgd om eiwitten te kwantificeren om de serine/threoninekinases-activiteitstest uit te voeren.
  3. Voor de detectie van Reactive Oxygen Species (ROS) in microgliacellen, resuspendeert u de pellet in 1x HBSS. Behandel de cellen volgens het protocol van de fabrikant van de kit voor flowcytometrietest (zie de materiaaltabel). Resuspendeer vervolgens de behandelde cellen in 200 μL FACS-buffer (voor bereiding, zie stap 1.5) en voer FACS uit om oxidatief gestreste cellen te detecteren.
  4. Voor de fagocytosebepaling incubeer u de gesorteerde cellen in D-PBS/BSA met fluorescerende latexkorrels (zie de materiaaltabel) gedurende 30 minuten. Pas het aantal kralen aan om gemiddeld 4 kralen per cel te hebben. Centrifugeer vervolgens bij 300 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C, resuspendeer in 200 μL FACS-buffer en lees de fluorescentie-emissie af door FACS (λex 575 nm; λem 610 nm).

Resultaten

De evaluatie van de eindopbrengst is afhankelijk van het zuiverheidsniveau en de hoeveelheid geïsoleerde cellen en kan worden bepaald door RT-qPCR, celtelling en eiwitkwantificering. De zuiverheid van de geïsoleerde magnetische cellen uit de hypothalamus werd bevestigd door de genexpressieanalyse van CD11b, C1qa, Gad1 en GFAP met RT-qPCR (Figuur 1). CD11b en C1qa worden voornamelijk tot expressie gebracht door microglia in een steady-state CNS16 en Gad1 en GFAP dienen respectievelijk als een neuronale en astrocytaire marker. Het totale cDNA van één hypothalamus varieerde van 55 tot 98 ng. Het is opmerkelijk dat alleen de positieve fractie CD11b- en C1qa-expressie vertoonde, wat wijst op de afwezigheid van enig potentieel verlies van microgliacellen in de negatieve fractie. Primers zijn opgenomen in tabel 2.

Bovendien zorgen de kleine niveaus van de neuronale en astrocytaire markers ervoor dat de overgrote meerderheid van de geïsoleerde cellen microglia zijn, aangezien residente macrofagen en monocyten slechts 10% van het totale immuuncellandschap van een gezond brein uitmaken10,11. Deze resultaten bewijzen de doeltreffendheid van de magnetische selectie en maken de weg vrij voor de toepassing van RT-qPCR om de expressieniveaus van alle genen die van belang zijn in vers gesorteerde hypothalamische microgliacellen te beoordelen. Op dezelfde manier kan een RNAseq-analyse worden uitgevoerd op hypothalamus-gesorteerde microglia om een uitgebreid beeld te krijgen van hun transcriptoom.

De hoeveelheid van de geïsoleerde cellen werd bepaald door het tellen van cellen en bleek ~15.000 cellen per hypothalamus te zijn (vermeld in protocolstap 4.10). Bovendien werd de eiwitconcentratie in gesorteerde microglia gekwantificeerd, wat een gemiddelde concentratie van 0,5 μg/μL onthulde in CD11b+- cellen geïsoleerd uit twee gepoolde hypothalami (Figuur 2). Deze kennis maakt het mogelijk om verschillende testen uit te voeren, afhankelijk van een minimale eiwitdrempel. Bovendien kan door meer hypothalami te bundelen, een hogere concentratie worden bereikt, waardoor de reikwijdte van potentiaalanalyses wordt uitgebreid. De geëxtraheerde eiwitten uit hypothalamische microglia maken diverse technieken mogelijk, waaronder AlphaLISA-immunoassays en kinase-activiteitstests.

Bovendien stelt het beschreven protocol onderzoekers in staat om verschillende ex vivo-analyses uit te voeren, waardoor de microgliale activiteit en hun rol in de hypothalamus in zowel fysiologische als pathologische contexten kunnen worden geëxploreerd. De kwantificering van de ROS-productie vertegenwoordigt een cruciaal aspect van de microgliale immuunrespons17. Daarom kunnen microglia na scheiding worden behandeld met in de handel verkrijgbare reagentia die de detectie van ROS in levende cellen mogelijk maken door bij oxidatie een verhoogd fluorescerend signaal te vertonen. Microglia magnetisch geïsoleerd uit drie gepoolde hypothalami is voldoende om ROS door FACS te detecteren, zoals weergegeven in figuur 3A, hoewel onze resultaten een vrij hoge variabiliteit van de cel-ROS-productie laten zien onder de aandoeningen die we hebben geanalyseerd. Het is opmerkelijk dat we met de bovengenoemde commerciële kit (zie de Materiaaltabel) ook in staat waren om de levensvatbaarheid van gesorteerde Cd11b+ cellen te beoordelen, dankzij een cel-ondoorbedoelde dode celkleuring die een toename van fluorescentie vertoont bij het binden van DNA. Concreet tonen onze gegevens aan dat 99% van de cellen in leven is (Figuur 3B). Poortstrategieën werden gebruikt om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen, evenals oxidatief gestreste en niet-gestreste cellen, op basis van hun fluorescentie-eigenschappen.

Een ander belangrijk kenmerk van microgliale activiteit is fagocytose, een dynamisch en strak gereguleerd proces dat een sleutelrol speelt bij immuunbewaking, weefselherstel en de algehele homeostase van het centrale zenuwstelsel18. Opmerkelijk is dat Cd11b+- cellen gesorteerd met magnetisch gekoppelde kralen gedurende 24 uur kunnen worden gekweekt en vervolgens op verschillende tijdstippen kunnen worden geïncubeerd met fluorescerende latexmicrobeads om, hetzij door FACS of door fluorescentiemicroscopie, veranderingen in de fagocytische activiteit onder verschillende omstandigheden te evalueren. Vers gesorteerde microglia kunnen ook worden blootgesteld aan fluorescerende parels of elk type pHrodo-gekoppelde deeltjes (bijv. synaptosomen) direct in de buis, en fagocytose kan worden beoordeeld door FACS-analyse.

In het bijzonder hebben we rechtstreeks geïncubeerd in de buis met gesorteerde celsuspensie, microglia geïsoleerd uit twee gepoolde hypothalami of een heel brein met fluorescerende latexkralen. Microglia die ten minste één fluorescerende kraal hebben gefagocyteerd, kunnen door flowcytometrie worden onderscheiden van niet-fagocytische cellen, aangezien fagocytische microglia een verbeterde fluorescentie zullen vertonen. Negatieve controles, niet geïncubeerd met kralen, werden gebruikt voor gating. In onze beide experimentele omstandigheden (muizen gevoed met chow versus vetrijk dieet (HFD)) zagen we een zeer laag percentage fagocytische microglia (Figuur 4A). Dit resultaat wordt hier echter getoond om de werkzaamheid van deze methode aan te tonen, die opmerkelijk genoeg ook onderscheid maakt tussen cellen die 1 kralen, 2 kralen, 3 kralen, enzovoort hebben gefagocyteerd (Figuur 4B). Ten slotte kunnen alle omics-benaderingen worden toegepast op geïsoleerde hypothalamische microglia. We stellen voor om drie hypothalami samen te voegen om voldoende cellen te hebben om deze tests uit te voeren.

figure-results-1
Figuur 1: Evaluatie van de zuiverheid van CD11b+- cellen door RT-qPCR. Kwantificering in gesorteerde cellen van de mRNA-expressie van de integrine CD11b, complement C1q subcomponent subeenheid A C1q, glutaminezuurdecarboxylase Gad1 en gliaal fibrillair zuur eiwit GFAP genormaliseerd op mRNA-niveaus van huishoudgenen Eef1a1 en Sdha. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Kwantificering van eiwitten uit hypothalamische cellen na celsortering. Kwantificering van de eiwitconcentratie in CD11b+ en CD11b- cellen. Zowel CD11b+ als CD11b- cellen werden gelyseerd in 20 μL lysisbuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Detectie van ROS in levende microgliacellen. Kwantificering van (A) oxidatief gestreste cellen en (B) levende cellen in een populatie van gesorteerde Cd11b+ cellen, met relatieve FACS contourplots. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kwantificering van microgliale fagocytische activiteit. (A) Kwantificering van fagocytische cellen in Cd11b+ cellen gesorteerd uit twee hypothalami of één hersenen, met relatieve FACS contourplot. (B) Percentage fagocytische cellen volgens het aantal gefagocyteerde parels met relatieve FACS-contourplot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Enzym mix 2
Enzym ABuffer YEnzym P
10 μL20 μL50 μL
D-PBSOplossing voor het verwijderen van puinOverlay D-PBS
15-100 mg structuur1000 μL450 μL2 ml

Tabel 1: Bereiding van het dissociatiemengsel (de volumes hebben betrekking op een enkel monster) en de gradiëntoverlagen.

GenenEiwitVoorwaartsOmkeren
ItgamIntegrine alfa M (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
SdhaSuccinaatdehydrogenase Complex Flavoproteïne Subeenheid ACCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qaComplementcomponent 1, q-subcomponent, alfa-polypeptideCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
Gad1 zei:glutamaat decarboxylase 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfapglial fibrillair zuur eiwitAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

Tabel 2: RT-qPCR primer sequenties.

Flowcytometrie cellen sorteren (FACS)Magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)
Fluorescerend gelabelde biochemische antilichamenMagnetische kralen geconjugeerd aan antilichamen
Differentiatie voorbij markers op het celoppervlakDifferentiatie alleen volgens markers op het celoppervlak
Aanzienlijk aanvangsrendementBescheiden aanvangsopbrengst
Langzamer dan MACS voor gelijktijdige verwerking van veel monstersSneller dan FACS voor gelijktijdige verwerking van veel monsters
Minder zacht dan MACSZachter dan FACS

Tabel 3: Weergave van FACS- en MACS-kenmerken en -beperkingen

Discussie

Het huidige protocol presenteert de isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door middel van magnetisch geactiveerde celsortering. De hierboven gepresenteerde resultaten bevestigen de zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen, evenals de werkzaamheid van deze methode om microglia ex vivo functioneel te karakteriseren, bijvoorbeeld door middel van fagocytische activiteit en kwantificering van de ROS-productie. Klassieke methoden voor de isolatie van een specifieke celpopulatie kunnen ook worden gebruikt voor microgliacellen. Dichtheidsgradiëntfractionering is een bekende methode voor het scheiden van verschillende cellen en hun deeltjes op basis van hun grootte en/of dichtheid. Deze techniek kan worden toegepast voor de isolatie en kweek van primaire microglia. De zuivering van volwassen microglia vereist echter verdere sortering van de geïsoleerde hersencellen met behulp van fluorescerend geactiveerde of immunomagnetische celsortering.

In het bijzonder vertrouwt FACS op fluorescerend gelabelde biochemische antilichamen om de cellen te labelen en ze te onderscheiden op basis van een groot aantal variabelen die verder gaan dan oppervlaktemarkers, zoals hun grootte en metabole status. Desalniettemin kan het proces van celzuivering langzamer en niet zo zacht zijn, waardoor het aantal dode cellen toeneemt en een aanzienlijke initiële opbrengst nodig is. Daarom is het kleine aantal hypothalamische microglia al een beperkende factor. MACS maakt gebruik van magnetische kralen die zijn geconjugeerd aan bepaalde antilichamen tegen specifieke celepitopen en zou kunnen werken met een bescheiden initiële opbrengst, wat de regiospecifieke studies naar microgliale dynamiek vergemakkelijkt. Vanwege het sterke magnetische veld van de microbeads is minimale etikettering vereist; daarom is het zachter dan FACS, waardoor de celintegriteit behouden blijft. Bovendien is MACS sneller dan FACS wanneer de gelijktijdige behandeling van meerdere monsters noodzakelijk is. Dit biedt het duidelijke voordeel dat de levensvatbaarheid van de cellen hoog blijft, wat ook het gevolg kan zijn van een kleine aanvangsopbrengst (tabel 3).

De belangrijkste uitdagingen bij de isolatie van microglia van de hypothalamus, die effectief kunnen worden aangepakt door middel van MACS-technologie, zijn onder meer het bereiken van een voldoende eindopbrengst en het waarborgen van het behoud van de celintegriteit. De vereiste hoeveelheid cellen is afhankelijk van de aard van de gekozen analyse na isolatie. Voor het onderzoek naar de functionele rol van microglia in vitro is bijvoorbeeld een aanzienlijk aantal cellen nodig. Dit onderstreept het belang van een eerste pool van hetzelfde hersengebied van verschillende muizen met identieke aandoeningen voordat wordt overgegaan tot het isolatieproces. Omgekeerd vereisen technieken zoals zeer nauwkeurige sequencing van één cel geen grote celpopulatie, en op zijn beurt is het bundelen van meerdere muizen niet vereist.

Om de celopbrengst te maximaliseren, is het van cruciaal belang om zich aan specifieke stappen in het protocol te houden. Effectieve dissociatie wordt geïnitieerd door de hypothalamus in kleine stukjes te snijden en er vervolgens voor te zorgen dat deze tijdens het proces in de buffer aan de onderkant van de buis worden gehouden. Vervolgens zorgt een combinatie van mechanische dissociatie met enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix voor een aanzienlijk hoge celopbrengst. We moeten echter uiterst voorzichtig zijn met de interpretatie van de resultaten, aangezien de enzymatische dissociatie die bij 37 °C wordt uitgevoerd, transcriptionele en translationele veranderingen kan induceren19. Om technisch gemedieerde veranderingen te voorkomen, kunnen de juiste controles met transcriptionele en translationele remmers worden gebruikt19. Het is ook mogelijk om over te gaan tot enzymatische dissociatie bij een lagere temperatuur, zoals in een koude kamer (de effectiviteit kan verminderd zijn), hoewel dissociatie meer afhankelijk kan zijn van mechanisch effect dan van enzymatisch. Na dissociatie wordt de celsuspensie voorgewassen en overgebracht naar de zeven, en worden de buizen nog twee keer grondig gewassen om celverlies te voorkomen. Een andere cruciale stap is de verwijdering van puin en myeline die wordt bereikt door de dichtheidsgradiëntcentrifugatie en de vorming van verschillende lagen. Het bereiken van een aanzienlijke eindopbrengst vereist dus een nauwgezette behandeling van zowel hypothalamisch weefsel als celsuspensie, waarbij ze altijd op ijs worden gehouden om het metabolisme te vertragen en hun in vivo fenotype te behouden.

Bovendien zijn er bepaalde punten waarop we uiterst voorzichtig moeten zijn om de hoogste zuiverheid van microglia te bereiken en het fenotype van microgliacellen te behouden. In eerste instantie is perfusie uitgevoerd bij 4 °C cruciaal voor de eliminatie van alle circulerende CD11b+- cellen, waardoor de hoogste potentiële microglia-zuiverheid wordt gegarandeerd. In het geval van verstoring van de bloed-hersenbarrière kan een hoger percentage circulerende immuuncellen de hersenen koloniseren en de studie van microglia zelf verstoren. Om dit probleem te verminderen, omvat een alternatieve benadering het implementeren van een secundaire ronde van magnetische isolatie met behulp van microbeads die zijn geconjugeerd aan het CD45-antilichaam. CD45 is een marker op het celoppervlak die een hoge expressie vertoont in macrofagen20 en de daaropvolgende doorstroming van deze ronde omvat alleen de microgliacellen. Deze strategie van het gebruik van twee rondes van magnetische isolatie verbetert de specificiteit van het proces; Desalniettemin kost het extra tijd, wat een potentieel risico met zich meebrengt dat de cellulaire integriteit en/of het microglia-fenotype worden onderbroken. Daarom is een cruciale factor voor het behoud van de functionele kenmerken en integriteit van cellen het snel isoleren van hersenweefsel en het op ijs houden totdat het dissociatieproces is gestart. Samenvattend verbetert deze analytische benadering het begrip van de functie en het gedrag van microglia's, en biedt het waardevolle inzichten in hun dynamische reacties in de hypothalamus.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

AN wordt ondersteund door het Institut Universitaire de France (IUF), de Universiteit van Bordeaux, de Franse Stichting voor Hersenonderzoek (FRC), de GLN (Lipid-Nutrition Group) en het National Research Agency (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA werd gesteund door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Dit project is gefinancierd door het Horizon Europe Research and Innovation Program van de Europese Unie in het kader van de MSCA Doctoral Networks 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healthtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi130-107-677Het kit bevat buffer Z, buffer Y, enzymen A en P, Debris Removal Solution, buffer A (om enzym A op te lossen).
Albumin Bovine FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human en muis - kleine maatMiltenyi130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay KitInvitrogenC10492
Centrifugebuis, Snap-Pop deksel 15 mLCellTreat978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvateGibco14287-072
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator met verwarmingMiltenyi130-096-427
Halt Fosfatase Inhibitor Cocktail (100x)Thermofisher78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-vrij (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, geen fenolroodThermofisher14065056
Latex-kralen, carboxylaat-gemodificeerd polystyreen, fluorescerend roodSigma-AldrichL3280
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche 4707516001Dit reagens werd gebruikt om PCR uit te voeren. 
MACS SmartStrainers (70 µm)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Protein Assay KitThermofisher23235
M-PER Mammalian Extractie BufferThermofisher78503
MS KolommenMiltenyi130-042-201Aangeduid als kleine kolommen in het protocol. 
MultiMACS Cell24 Separator PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177Het kit werd gebruikt om cDNA te synthetiseren.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011Het kit bevat 1-Thioglycerol en BL buffer (aangeduid als lysis buffer in het protocol) en het werd gebruikt om totaal RNA te isoleren.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Referenties

  1. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  3. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584(2021).
  6. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  7. Lee, J. -K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
  8. Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
  9. Lee, E., Eo, J. -C., Lee, C., Yu, J. -W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
  10. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  11. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  12. Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
  13. Tan, Y. -L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  14. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. PamGene International B. V. 1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells.pdf. PamGene International B. V. , (2022).
  16. Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48(2017).
  17. Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743(2020).
  18. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790(2019).
  19. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
  20. DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152(2019).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van microgliamagnetische cel sorteringCD11b microbeadshomeostase van de hersenencommunicatie tussen microglia en neuronenvoedingsgedragmetabole conditiescelviabiliteit
Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.