PyOKR: een semi-geautomatiseerde methode voor het kwantificeren van het vermogen om optokinetische reflexen te volgen

Samenvatting

We beschrijven hier PyOKR, een semi-geautomatiseerde kwantitatieve analysemethode die direct oogbewegingen meet die het gevolg zijn van visuele reacties op tweedimensionale beeldbewegingen. Een op Python gebaseerde gebruikersinterface en analyse-algoritme zorgen voor een hogere doorvoer en nauwkeurigere kwantitatieve metingen van eye-trackingparameters dan eerdere methoden.

Samenvatting

De studie van gedragsreacties op visuele stimuli is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de functie van het visuele systeem. Een opmerkelijke reactie is de optokinetische reflex (OKR), een sterk geconserveerd aangeboren gedrag dat nodig is voor beeldstabilisatie op het netvlies. De OKR biedt een robuuste uitlezing van het vermogen om beelden te volgen en is uitgebreid bestudeerd om de circuits en functie van het visuele systeem te begrijpen bij dieren met verschillende genetische achtergronden. De OKR bestaat uit twee fasen: een langzame volgfase waarbij het oog een stimulus volgt naar de rand van het visuele vlak en een compenserende snelle fasesaccade die de positie van het oog in de baan reset. Eerdere methoden voor het bijhouden van kwantificering van winsten, hoewel betrouwbaar, zijn arbeidsintensief en kunnen subjectief of willekeurig worden afgeleid. Om een snellere en reproduceerbare kwantificering van het vermogen om ogen te volgen te verkrijgen, hebben we een nieuw semi-geautomatiseerd analyseprogramma ontwikkeld, PyOKR, dat het mogelijk maakt om tweedimensionale oogvolgbewegingen te kwantificeren als reactie op elke gerichte stimulus, naast dat het kan worden aangepast aan elk type video-oculografieapparatuur. Deze methode biedt geautomatiseerde filtering, selectie van langzame volgfasen, modellering van verticale en horizontale oogvectoren, kwantificering van oogbewegingswinsten ten opzichte van stimulussnelheid en organisatie van resulterende gegevens in een bruikbare spreadsheet voor statistische en grafische vergelijkingen. Deze kwantitatieve en gestroomlijnde analysepijplijn, gemakkelijk toegankelijk via PyPI-import, biedt een snelle en directe meting van OKR-reacties, waardoor de studie van visuele gedragsreacties wordt vergemakkelijkt.

Inleiding

Beeldstabilisatie is gebaseerd op nauwkeurige oculomotorische reacties om te compenseren voor de wereldwijde optische stroom die optreedt tijdens zelfbeweging. Deze stabilisatie wordt voornamelijk aangedreven door twee motorische reacties: de optokinetische reflex (OKR) en de vestibulo-oculaire reflex (VOR)^1,2,3. Langzame globale beweging over het netvlies induceert de OKR, die reflexieve oogrotatie in de overeenkomstige richting uitlokt om het beeld te stabiliseren ^1,2. Deze beweging, bekend als de langzame fase, wordt onderbroken door compenserende saccades, bekend als de snelle fase, waarin het oog snel in de tegenovergestelde richting reset om een nieuwe langzame fase mogelijk te maken. Hier definiëren we deze fast-phase saccades als eye-tracking bewegingen (ETM's). Terwijl de VOR vertrouwt op het vestibulaire systeem om oogbewegingen op te wekken om hoofdbewegingen te compenseren³, wordt de OKR in het netvlies geïnitieerd door het afvuren van ON en de daaropvolgende signalering naar het Accessory Optic System (AOS) in de middenhersenen ^4,5. Vanwege de directe afhankelijkheid van retinale circuits, is de OKR vaak gebruikt om het visuele volgvermogen te bepalen in zowel onderzoeks- als klinische omgevingen ^6,7.

De OKR is uitgebreid bestudeerd als een hulpmiddel voor het beoordelen van het basisvisuele vermogen ^2,6,8, de ontwikkeling van DSGC ^9,10,11,12, oculomotorische reacties¹³ en fysiologische verschillen tussen genetische achtergronden⁷. De OKR wordt geëvalueerd bij dieren met een hoofdfixatie die een bewegende stimulus krijgen¹⁴. Oculomotorische reacties worden meestal vastgelegd met behulp van een verscheidenheid aan videotools, en eye-tracking bewegingen worden vastgelegd als OKR-golfvormen in horizontale en verticale richtingen⁹. Om het volgvermogen te kwantificeren, zijn twee primaire metrieken beschreven: volgversterking (de snelheid van het oog ten opzichte van de snelheid van de stimulus) en ETM-frequentie (het aantal snelle fasesaccades gedurende een bepaald tijdsbestek). Berekening van de versterking is in het verleden gebruikt om de hoeksnelheid van het oog direct te meten om het volgvermogen te schatten; Deze berekeningen zijn echter arbeidsintensief en kunnen willekeurig worden afgeleid op basis van video-oculografie-verzamelmethoden en daaropvolgende kwantificering. Voor een snellere OKR-beoordeling is het tellen van de ETM-frequentie gebruikt als alternatieve methode voor het meten van de volgscherpte⁷. Hoewel dit een vrij nauwkeurige schatting geeft van het volgvermogen, vertrouwt deze methode op een indirecte metriek om de trage faserespons te kwantificeren en introduceert het een aantal vertekeningen. Deze omvatten een waarnemersbias bij het bepalen van saccade, een vertrouwen op tijdelijk consistente saccadische responsen gedurende een bepaald tijdperk en een onvermogen om de omvang van de langzame faserespons te beoordelen.

Om deze problemen met de huidige OKR-beoordelingsbenaderingen aan te pakken en om een diepgaande kwantificering van OKR-parameters met hoge doorvoer mogelijk te maken, hebben we een nieuwe analysemethode ontwikkeld om OKR-golfvormen te kwantificeren. Onze aanpak maakt gebruik van een toegankelijk, op Python gebaseerd softwareplatform met de naam 'PyOKR'. Met behulp van deze software kan het modelleren en kwantificeren van langzame OKR-responsen diepgaander en met verhoogde parametrisering worden bestudeerd. De software biedt toegankelijke en reproduceerbare kwantitatieve beoordelingen van reacties op een groot aantal visuele stimuli en ook tweedimensionale visuele tracking als reactie op horizontale en verticale beweging.

Protocol

Alle dierproeven die werden uitgevoerd aan de Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het JHUSOM. Alle experimenten die werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, San Francisco (UCSF) werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het UCSF Institutional Animal Care and Use Program.

1. Verzamelen van gedragsgegevens

1. Neem OKR-oogbewegingen op met behulp van de video-oculografiemethode naar keuze om golfgegevens te genereren (d.w.z. een tijdreeks van de kijkhoek van het oog in sferische coördinaten).
   OPMERKING: Representatieve gegevens die bij JHUSOM zijn verzameld, werden verkregen met behulp van hoofdpostimplantatiechirurgie en video-oculografie, zoals eerder beschreven ^9,13 (Figuur 1). Representatieve gegevens verzameld van UCSF werden verkregen door middel van de hoofdpostimplantatiechirurgie en de video-oculografiemethode, zoals beschreven in eerder¹⁰ (Figuur 7).
   1. Noteer stimulus- en opnameparameters: opnameframesnelheid, stimulussnelheid en -richting, en tijdsduur tussen en na stimulustijdperken. Let bij sinusvormige stimuli ook op de amplitude en frequentie van de stimulusgolf.
2. Verzamelde golfgegevens exporteren als een . CSV-bestand met horizontale en verticale (azimut en elevatie) golfgegevens.
   1. Organiseer golfgegevens als een door tabs gescheiden . CSV-bestand met twee kolommen met horizontale gegevens (epxWave) en verticale gegevens (epyWave).

2. Installatie van analysesoftware

1. Download en installeer Python.
   1. Voor het toezicht op grafieken installeert u Spyder via Anaconda.
   2. Om ervoor te zorgen dat grafieken correct werken in Spyder, ga naar Tools > Preferences > Ipython Console > Graphics > Graphics Backend. Stel Inline in op Automatisch.
2. Creëer een nieuwe Anaconda-omgeving met Python.
3. Installeer PyOKR via PyPi met pip installeer PyOKR om de nieuwste versie te installeren, samen met pakketafhankelijkheden (aanvullend coderingsbestand 1 en aanvullend coderingsbestand 2)
4. Als een Windows-computer wordt gebruikt, voert u vanuit PyOKR import OKR_win uit als o en vervolgens o.run().
5. Als een Mac-computer wordt gebruikt, voer dan uit vanuit PyOKR import OKR_osx als o en vervolgens o.run().

3. Analyse van golfgegevens

1. Initialisatie van analyse en importeren van bestanden
   1. Voer o.run() uit in een .py script om de gebruikersinterface te openen.
   2. Gebruik onder Bestand de functie Open of het commando Ctrl+O [iOS-opdracht] om een browser te openen waarmee de gebruiker het gewenste wave-bestand kan selecteren.
   3. Gebruik onder Bestand de knop Map exporteren of het commando Ctrl+E om een mappenbrowser te openen die het mogelijk maakt om een uitvoermap te selecteren waarnaar de uiteindelijke analyses worden geëxporteerd.
   4. Voer de uiteindelijke naam van het analysebestand in onder het uitvoerbestand in een aanbevolen indeling, zoals AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Stel het programma voor een individueel dier in met behulp van het commando Set Subject under File of het commando Ctrl+S om de dataset voor een individueel dier te initialiseren.
2. Definitie van parameters van golfbestanden
   1. Om te beginnen met het instellen van stimulusparameters, definieert u directionaliteit onder Selecteer stimulusrichting door een van de vier windrichtingen te selecteren. Selecteer voor sinusvormige stimuli er een die dienovereenkomstig (Horizontaal) of (Verticaal) bevat, waarbij de kardinale richting de initiële richting van de sinusvormige golf bepaalt.
   2. Stel het stimulustype in onder Selecteer stimulustype als unidirectioneel, oscillerend of schuin.
   3. Nadat u de directionaliteit hebt ingesteld, importeert u ofwel de eigen dataset voor de stimuluspositie (Importeer eigen stimulusvectorgegevens) of genereert u automatisch een vector op basis van parameters (Genereer stimulusvector uit parameters). Als u een stimulusvector importeert, gaat u verder met 3.2.3.1 en gaat u verder met stap 3.3. Als u een stimulusvector genereert, gaat u verder met de volgende stappen.
      1. Als u uw eigen vectorgegevens importeert, importeert u de afstandswaarden van de stimulus (d.w.z. een tijdreeks die beschrijft hoe ver de stimulus beweegt tussen elk aangrenzend acquisitieframe) in hetzelfde formaat als beschreven in stap 3.2.1. Analyseer bovendien de hele dataset als één epoch in plaats van deze op te splitsen in individuele epochs, aangezien de functionaliteit voor het subsetten van geïmporteerde stimuluswaarde nog niet is toegevoegd vanaf PyOKR v1.1.2.
   4. Stel onder Stimulusparameters de parameters in van de stimulus die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens.
      1. Stel de tijdsduur van geen stimulus aan het begin (kop) en einde (staart) van een bepaalde proef in met kop en staart.
      2. Stel de hoeveelheid tijd in dat een stimulus wordt weergegeven, de hoeveelheid tijd van geen stimulus na en het aantal totale epochs binnen een bepaalde proef met respectievelijk Lengte van epoch, Lengte van post-stimulus en Aantal epochs.
      3. Voor unidirectionele en schuine stimuli stelt u de stimulussnelheid in graden per seconde in met Horizontale Snelheid en Verticale Snelheid.
      4. Stel de opnamesnelheid van de verzamelcamera in met Framesnelheid vastleggen.
      5. Genereer voor sinusvormige stimuli de sinusvormige golf voor het modelleren van oscillerende stimuli met frequentie en amplitude.
   5. Maak na parametrisering het juiste model op basis van de hierboven ingevoerde stimulusinformatie met Stimulusvector genereren uit parameters.
   6. Selecteer een bepaald tijdperk voor de ingevoerde stimulus met behulp van Selecteer tijdperk om door het totale golfbestand te scannen.
3. Begeleide selectie van trackingfasen
   1. Om gebieden met langzame tracking te identificeren, selecteert u automatisch snelle fasesaccades met voorlopige aanpassing door te klikken op Ongefilterde gegevens of Gefilterde gegevens, die potentiële saccades labelen op basis van maximale snelheidsveranderingen.
   2. Controleer onder Ongefilterde gegevens of de saccades nauwkeurig zijn geselecteerd met een blauwe stip. Als de automatische selectie niet nauwkeurig is, verwijdert u handmatig punten met de linkermuisknop (LMB) of voegt u punten toe met de rechtermuisknop (RMB). Wanneer snelle fasesaccades voldoende zijn geselecteerd, slaat u de punten op met de middelste muisknop (MMB) en sluit u de grafiek.
   3. Als automatisch filteren gewenst is, stelt u een Z-Score-drempel in en klikt u op Gefilterde gegevens om saccades automatisch te filteren. Gebruik indien nodig hetzelfde handmatige toezicht als beschreven in stap 3.3.2 om eventuele ruis te verwijderen.
   4. Nadat u de juiste saccade hebt geselecteerd, drukt u op Puntaanpassing om het gebied te selecteren dat u wilt verwijderen. Wijzig de boven- en onderpunten door middel van een soortgelijk controleschema als eerder beschreven in stap 3.3.2. Bewerk de bovenste (groene) punten met de LMB of de RMB en bewerk de onderste (rode) punten met de Shift+LMB of Shift+RMB. Als de punten goed zijn geplaatst, gebruik je de MMB om de punten op te slaan.
      OPMERKING: als u een Mac gebruikt, bevinden de aanpassing van het onderste en bovenste punt zich in twee afzonderlijke knoppen en volgen ze hetzelfde bedieningsschema als beschreven in stap 3.3.2.
4. Analyse van slow-tracking fasen
   1. Stel de volgorde van het polynomiaalmodel in met behulp van Polynoomvolgorde instellen om het polynoommodel te definiëren dat zal worden aangepast aan individuele langzame fasen.
      OPMERKING: Voor unidirectionele of schuine stimuli is de standaardwaarde 1, aangezien lineariteit nodig is om de volgversterking te berekenen. Voor sinusvormige stimuli is een hogere orde nodig om de curve van de golf te modelleren, met een standaard van 15.
   2. Om het spoor te analyseren, selecteert u Eindanalyse om de langzame fasemodellen te genereren (Figuur 2) voor de geselecteerde langzame fasen (zie Figuur 2A-D) en berekent u de afstanden, snelheden en volgwinsten gemiddeld over het tijdperk (Figuur 2E).
   3. Als u de tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) grafiek van de geselecteerde gebieden wilt weergeven, selecteert u respectievelijk 2D-grafiek weergeven of 3D-grafiek weergeven .
   4. Selecteer Epoch toevoegen om de verzamelde waarden die in stap 3.4.2 zijn gegenereerd op te slaan. Als u alle toegevoegde waarden voor een bepaald dier en de gemiddelden voor verzamelde proeven wilt weergeven, selecteert u Huidige gegevensset weergeven.
   5. Nadat een epoch is toegevoegd, bladert u door de rest van het bestand met Select epoch, waarbij u de stappen 3.3.1 tot 3.4.4 volgt.
   6. Zodra een golfbestand volledig is geanalyseerd, herhaalt u dit proces voor alle andere bestanden voor een bepaald dier door nieuwe bestanden te openen, de juiste parameters in te stellen en deze dienovereenkomstig te analyseren. Door de stappen 3.2.1-3.4.5 voor elk bestand te herhalen, genereert u een definitieve dataset met alle golfgegevens voor een bepaald dier.
5. Definitieve export van gegevens
   1. Nadat de gegevensanalyse voor een bepaald dier is voltooid, waarbij alle richtingen of stimuli zijn geanalyseerd, exporteert u de gegevensset via Gegevens exporteren.
      OPMERKING: De onbewerkte dataset wordt geëxporteerd op basis van de naam van het uitvoerbestand en opgeslagen langs het pad dat is ingesteld door de uitvoermap als een CSV-bestand met individuele epoch-gegevens met het totale gemiddelde voor elke stimulusparameter.
   2. Nadat u een individueel dier hebt geëxporteerd, initialiseert u de gegevensset opnieuw met Ctrl+S en herhaalt u vervolgens alle voorgaande stappen om een nieuw dier te analyseren.
   3. Indien nodig kunt u alle uitvoergegevens die voor meerdere dieren zijn verzameld, opnieuw ordenen voor eenvoudigere analyse met behulp van de opdracht Gegevens sorteren onder het tabblad Analyse .
      OPMERKING: Deze functie compileert en sorteert alle gemiddelde waarden voor alle geanalyseerde dierbestanden die in de uitvoermap zijn opgeslagen, zodat er gemakkelijker grafieken en statistische vergelijkingen kunnen worden gemaakt. Het sorteren is afhankelijk van de naamgeving van de bestanden vanaf v1.1.2. Gebruik het aanbevolen naamgevingsschema zoals beschreven in stap 3.1.4 voor elk bestand (bijv. WT_123_Analysis).

Resultaten

Om de hierboven beschreven analysemethode te valideren, hebben we de OKR-trackingwinst gekwantificeerd op golfsporen verzameld van wildtype muizen en een voorwaardelijke knock-outmutant met een bekend trackingtekort. Om de bredere toepasbaarheid van onze analysemethode te testen, analyseerden we bovendien sporen afkomstig van een afzonderlijk cohort wildtype muizen die waren verkregen met behulp van een andere video-oculografie-verzamelmethode. De automatische filtering van saccades vergemakkelijkt de verwerking en analyse van OKR-gegevens (Figuur 3). Met behulp van opnames van unidirectionele en sinusvormige stimuli (Figuur 1D), berekenden we OKR-volgwinsten in de vier windrichtingen (Figuur 2F) voor wildtype dieren (n = 13) tot unidirectionele stimuli en ook volgwinsten als reactie op horizontale en verticale sinusvormige stimuli (Figuur 4). Het verschil in volgvermogen ten opzichte van de stimulusrichting voor zowel unidirectionele als sinusvormige stimuli wordt consequent waargenomen bij alle wildtype muizen, met even robuuste horizontale responsen die significant hogere volgwinsten vertonen dan verticale responsen, zoals is beschreven². Verder wordt ook asymmetrische volgwinst tussen opwaartse en neerwaartse reacties waargenomen bij wildtype muizen die beide video-oculografie-verzamelmethoden gebruiken, zoals eerder is gemeld ^2,10. De relatieve omvang en de consistentie van trackingwinsten in vergelijking met gepubliceerde karakterisering van OKR-antwoorden geven aan dat trackingwinsten die met behulp van de software worden berekend, het trackingvermogen nauwkeurig weerspiegelen. Naast berekeningen van de versterking in één richting, kunnen horizontale en verticale oogbewegingen tegelijkertijd worden gemodelleerd (Figuur 5), waardoor een driedimensionale reconstructie van de oogbeweging als reactie op een bepaalde stimulus mogelijk is. Dit biedt een extra kwantificeringsmogelijkheid die nuttig is voor toekomstige studies die kruisgekoppelde horizontale en verticale responsen onderzoeken⁹.

Om het nut van de software voor het identificeren van significante gedragsveranderingen in verschillende experimentele omstandigheden te valideren, hebben we onze gepubliceerde gegevens^{opnieuw geanalyseerd 9} om te bevestigen dat tekorten in verticale tracking die in die studie werden beoordeeld door handmatige telling van snelle fasesaccades worden weerspiegeld in trackingwinsten met behulp van de hier gepresenteerde methodologie. Eerder werk toont aan dat genetische inactivatie in het netvlies van de transcriptiefactor T-box Transcriptiefactor 5 (Tbx5) door voorwaardelijke knock-out met behulp van Protocadherin 9-Cre (Pcdh9-Cre) specifiek verlies van opwaarts afgestemde ON Direction-Selective Ganglion Cells (up-oDSGC's) veroorzaakt, en dat Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); Pcdh9-Cre-mutanten vertonen specifiek verlies van verticale OKR-tracking⁹. Kwantitatieve analyse met behulp van de hier beschreven methode laat zien dat Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-dieren behouden normale horizontale volgversterkingen (figuur 6A), vergelijkbaar met die welke eerder zijn beschreven en die zijn verkregen door handmatige telling van snelfasesaccades (ETM's) (figuur 2F); deze muizen vertonen echter een aanzienlijk verlies van verticale tracking, met bijna geen winst als reactie op zowel opwaartse als neerwaartse stimuli (Figuur 6B,C). Bovendien bevestigt analyse van sinusvormige responsen dat Tbx5 cKO-dieren grotere horizontale volgwinsten vertonen, terwijl ze significant verminderde verticale volging vertonen (Figuur 6D-F). Een heranalyse van dit eerder beschreven fenotype met behulp van PyOKR toont de precisie en gevoeligheid van deze nieuwe methodologie aan, die kwantitatieve vergelijkingen van OKR-responsen bij muizen van verschillende genetische stammen mogelijk maakt.

Ten slotte analyseerden we wild-type verticale OKR-sporen die bij UCSF waren verzameld om het nut van de softwaretoepassing te valideren met verschillende video-oculografiemethoden en stimulusparameters. Gegevens van UCSF werden verzameld met behulp van een halfrond projectiesysteem waarbij bewegende roosters aan de muis worden gepresenteerd door de reflectie van een projector met een golflengte van 405 nm op een halfrond rond het dier met het hoofd¹⁰ (Figuur 7A). Unidirectionele verticale roosters werden aan muizen gepresenteerd met een snelheid van 10 graden per seconde, en de OKR-reacties werden geregistreerd met intervallen van 60 seconden (Figuur 7B,C). Verticale sporen werden kwantitatief geanalyseerd via de PyOKR, en opwaartse reacties werden vergeleken met neerwaartse reacties (Figuur 7D). Opwaartse reacties waren significant sterker dan neerwaartse, zoals verwacht¹⁰; de volgwinsten waren echter iets verminderd in vergelijking met de sporen die bij JHUSOM werden geregistreerd (Figuur 2F). Bovendien werd de kwantificering van sinusvormige responsen geanalyseerd via PyOKR (Figuur 7E), en een significante asymmetrie in de verticale reacties op sinusvormig bewegende stimuli wordt weerspiegeld in berekende winsten (Figuur 7F). Verschillen tussen versterkingswaarden verzameld bij JHUSOM en UCSF kunnen worden toegeschreven aan verschillen tussen stimulusparameters, waaronder verschillende stimulussnelheden, typen en golflengten; De algehele consistentie die we waarnemen in onze analyse van gegevens die met elke verzamelmethode zijn verkregen, toont echter aan dat onze PyOKR gemakkelijk kan worden aangepast buiten ons JHUSOM OKR-gegevensverzamelingssysteem en kan worden toegepast op andere OKR-opnames, onafhankelijk van video-oculografiemethoden. Deze resultaten tonen aan dat het hier beschreven softwareplatform nauwkeurig is en algemeen kan worden toegepast op de studie van oculomotorische reacties, waardoor nauwkeurige kwantitatieve vergelijkingen tussen dieren die tot verschillende groepen behoren mogelijk zijn om de studie van visuele beeldstabilisatiecircuits te bevorderen.

Figuur 1: Verzameling van OKR-responsgegevens. (A) OKR-apparaat voor virtuele arena's voor gedragsstimulatie, zoals eerder beschreven ^9,13. Vier monitoren omringen een dier met het hoofd (1) en geven een continu bewegende dambordstimulus weer (2). De virtuele trommel kan unidirectionele bewegingen in alle vier de windrichtingen presenteren, evenals oscillerende sinusvormige stimuli. Het linkeroog van de muis wordt verlicht door een infrarood (IR) licht en opgenomen met een camera (3) om visuele systeemreacties vast te leggen die worden weerspiegeld in eye-tracking. (B) Analyse van eye-tracking vindt plaats door het vastleggen van de pupil en een hoornvliesreflectie die wordt gegenereerd door IR-licht. Het verzamelen van gegevens en het berekenen van oogbewegingen als reactie op de virtuele trommel werden uitgevoerd zoals eerder beschreven ^9,13. (C) Schema van oogvectoren die verticaal (Y-golf) en horizontaal (X-golf) bewegen. (D) Steekproef van sporen van de volgreactie van een oog op unidirectionele opwaartse en achterwaartse beweging, en ook verticale en horizontale sinusvormige beweging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Tracking-analyse van unidirectionele visuele reacties. (A-D) Identificatie en selectie van langzame trackingfasen voor versterkingsanalyse. Voorbeeldsporen in één richting worden weergegeven met visuele reacties op voorwaartse (A), achterwaartse (B), opwaartse (C) en neerwaartse (D) beweging ten opzichte van het oog van de muis. Langzame fasen worden geïdentificeerd door de toevoeging van rode en groene punten beschreven in stap 3 om saccades te verwijderen, en de geselecteerde langzame fasen worden geel gemarkeerd. Polynomiale regressies worden als lijnen over de sporen heen gelegd. (E) Kwantificering van de monstersporen (A-D) zoals georganiseerd in de PyOKR-uitlezing. Voor elk spoor worden de totale XY-snelheden en de respectieve winsten berekend, ongeacht de richting. Bij unidirectionele reacties zullen deze totale snelheden meestal de individuele snelheid in een bepaalde richting weerspiegelen; Voor sinusvormige responsen geeft deze waarde echter de gemiddelde totale snelheid van het oog weer. Horizontale en verticale snelheidscomponenten worden opgesplitst om de snelheid in elke respectievelijke richting weer te geven. De winst wordt vervolgens berekend op basis van de gepresenteerde stimulussnelheden. (F) Berekende volgwinsten van wildtype dieren (n = 13) in de vier windrichtingen vergeleken met hun bijbehorende ETM-kwantificering. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Gegevens geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Automatische filtering van saccades vergemakkelijkt de verwerking en analyse van OKR-gegevens. (A-D) Automatische filtering van sporen uit Figuur 2A-D verwijdert saccades en modelleert alleen langzame fasebeweging door snelle snelheidsveranderingen te verwijderen en langzame fasen aan elkaar te hechten. De uiteindelijke helling vertegenwoordigt de totale oogbeweging over het gegeven tijdperk. (E) Kwantificering van de voordelen van gefilterde steekproefgegevens, zoals georganiseerd in de PyOKR-uitlezing. (F) Vergelijking van versterkingswaarden tussen ongefilterde versus gefilterde oogsporen van monsters weerspiegelt geen significante verschillen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Gegevens geanalyseerd met een Mann-Whitney U-test tussen ongefilterde en gefilterde resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Afleiding van volgwinsten in reactie op oscillerende visuele stimuli. (A,B) Verticale (A) en horizontale (B) oogbewegingsreacties op sinusvormig bewegende stimuli kunnen worden gemodelleerd ten opzichte van gedefinieerde oscillerende stimulusparameters. Geselecteerde gebieden zijn geel gelabeld met de polynomiale benadering over het spoor heen. Een model van de stimulus wordt gepresenteerd als een oranje sinusoïde golf achter het spoor om te kunnen verwijzen naar wat de stimulus op elk punt is. (C) Winstberekeningen van wild-type sinusvormige responsen (n = 7) weerspiegelen asymmetrische responsen tussen horizontaal en verticaal volgvermogen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Gegevens geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. **p<0.01,***p<0.005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Directional tracking kan worden gemodelleerd in zijn horizontale en verticale componenten. (A) Verticale component van een eye tracking golf als reactie op een opwaartse stimulus. (B) Horizontale component van een eye-trackinggolf als reactie op een opwaartse stimulus. (C) Totale oogbaan in zowel verticale als horizontale richting. (D) Driedimensionaal model van de bewegingsvector van het oog in de loop van de tijd als reactie op neerwaartse beweging. Ruwe spoorgegevens worden in rood weergegeven en het regressiemodel van het traject wordt in blauw weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Analyse van de OKR in Tbx5f/f; Pcdh9-Cre-muizen vertonen significante tekorten in unidirectionele verticale volgwinsten. (A) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre dieren vertonen geen significante verandering in de horizontale volgversterking. (B,C) Tbx5f/f; Pcdh9-Cre dieren vertonen een significante vermindering van de winst in hun verticale reacties: naar boven (B) en naar beneden (C). (D,E) Sinusoïdale responsen van Tbx5f/f; Pcdh9-Cre dieren als reactie op horizontale (D) en verticale (E) oscillerende stimuli. f) kwantificering van Tbx5f/f; Pcdh9-Cre oscillerende responsen vertonen een significante toename van horizontale volgversterkingen, maar vertonen een afname van verticale responsen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Gegevens geanalyseerd met Mann-Whitney U-tests. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Toepassing van PyOKR op gegevens verkregen uit alternatieve video-oculografiemethoden. (A) Apparaat voor virtuele OKR-drumstimulatie, zoals beschreven¹⁰. Een DLP-projector met een golflengte van 405 nm wordt via een bolle spiegel op een halve bol gereflecteerd om een virtuele trommel te creëren die het gezichtsveld van het dier omringt. Oogbewegingen worden gemeten met behulp van een NIR-camera die buiten het halfrond is geplaatst. Unidirectionele en sinusvormige staafroosters worden in verticale richtingen getoond aan een dier met een kop vast. (B,C) Opwaartse (B) en neerwaartse (C) volgfasen worden geïdentificeerd en geselecteerd voor kwantitatieve analyse. Langzame fasen zijn geel gemarkeerd. (D) Traceerwinsten berekend op basis van verticale tracking van wildtype dieren (n=5) met behulp van hier beschreven methoden. Asymmetrisch volgvermogen wordt waargenomen, met een significante afname van neerwaartse volging. (E) Oscillerende respons op sinusvormige stimuli gemodelleerd om volgwinsten bij wildtype dieren te kwantificeren (n=8). Langzame fasen zijn geel gemarkeerd. (F) Kwantificering van sinusvormige winsten laat verminderde neerwaartse volgwinsten zien in vergelijking met opwaartse winsten. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Gegevens geanalyseerd met Mann-Whitney U-tests. *blz<0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend coderingsbestand 1: PyOKR Windows Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: PyOKR Mac Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

PyOKR biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van visuele reacties die worden weerspiegeld in oogbewegingen. Deze omvatten opties voor nauwkeurigheid, toegankelijkheid en gegevensverzameling, naast de mogelijkheid om parametrisering en variabele stimulussnelheden op te nemen.

Directe beoordeling van de oogtracering biedt een nauwkeurige karakterisering van oogbewegingen die een directere kwantitatieve metriek is dan traditionele handmatige telling van snelle fasesaccades (ETM's). Hoewel nuttig, biedt het tellen van saccades een indirecte beoordeling van de werkelijke volgbeweging. Het PyOKR-softwareplatform biedt directe kwantificering van volgsnelheden, rekening houdend met aanvullende parameters, waaronder saccade-amplitudes en de lengte van langzame fasen. Bovendien is het tellen van saccades in snelle fasen gebaseerd op de beoordeling van de saccadefrequentie gedurende een bepaalde periode, waarbij vereist is dat elk spoor weinig tot geen ruis heeft, inclusief willekeurige saccades van dierstress. Deze factoren leiden ertoe dat veel verzamelde sporen onbruikbaar zijn en voegen daarom veel tijd toe voor het verzamelen van gegevens om eye-tracking nauwkeurig te beoordelen. De hier beschreven software pakt dit probleem echter aan door individuele langzame fasen binnen een bepaald spoor direct te kwantificeren en winsten te berekenen op onmiddellijke punten langs het spoor. Het bereikt dit door de snelheid van de oogbeweging te vergelijken met de snelheid van de stimulus op een bepaald punt. Aangezien de saccadische frequentie niet langer de bepalende parameter voor analyse is, kan ruis gemakkelijk worden verwijderd door toezicht van de gebruiker, waardoor de impact van ruis op de kwaliteit van de analyse wordt verminderd. Dit zorgt voor meer bruikbare verzamelde gegevens en een hoger statistisch vermogen bij het analyseren van deze gegevens, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid toenemen bij het kwantificeren van eye-tracking en het karakteriseren van OKR-parameters voor individuele muizen en verschillende groepen muizen. Geautomatiseerd filteren van saccades op basis van snelle veranderingen in oogsnelheid gevonden via een Z-scoremethode is ook gebruikt om tracking gain¹⁰ te karakteriseren. Om deze filtermethode in de software op te nemen, hebben we dit type snelheidsfiltering opgenomen, maar met aanvullende hulpmiddelen zoals drempelparametrisering en handmatig saccadetoezicht om mogelijke fouten die door deze aanpak worden gegenereerd, te verminderen. Als ruwe sporen worden gebruikt voor analyse in plaats van geautomatiseerde filtering te gebruiken, worden snelle veranderingen in oogbewegingen veroorzaakt door saccades, knipperen of muisleed geïdentificeerd door maximale snelheidsveranderingen via een Gaussiaanse kerneldichtheidsschatting van de sporensnelheid. Dit maakt de automatische selectie van segmentatieregio's mogelijk en uiteindelijk verwijdering op basis van handmatig gebruikerstoezicht. Handmatig toezicht zorgt voor een hogere tolerantie voor sporen van ruis, waardoor gebruikers snel fout-positieve of vals-negatieve markeringen kunnen corrigeren voor snelle oogveranderingen. Bovendien, aangezien PyOKR polynomiale benaderingen gebruikt om algemene oogbewegingen in een bepaalde richting te modelleren, wordt ruis op individuele punten gladgestreken, waardoor trajectsnelheden kunnen worden beoordeeld met enige tolerantie voor ruis in het spoor. Alleen in het geval van een extreem slechte gegevenskwaliteit over het hele spoor of onjuiste kalibratie tijdens het verzamelen van gegevens, zal de software niet in staat zijn om nauwkeurige gegevensanalyse te genereren. Alles bij elkaar genereert de hier beschreven PyOKR-softwaretoepassing trackingwinsten met hoge nauwkeurigheid en directere metrische gegevens dan eerdere methoden, door gebruikerstoezicht, filtering en onmiddellijke versterkingsberekeningstools te integreren.

PyOKR heeft ook veel functies waarmee OKR-analyses kunnen worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker. De invoer van stimulusparameters, evenals ruwe stimulusvectoren, stelt de gebruiker in staat om elke gewenste stimulus nauwkeurig te definiëren. Dit kunnen unidirectionele, sinusvormige of schuine stimuli zijn, die de software allemaal kan gebruiken om nauwkeurige volgwinsten te genereren voor de bijbehorende visuele reacties. Met de stimulusparametrisering van deze methodologie kunnen onmiddellijke winsten die bij elk frame worden berekend, betrouwbaar en met hoge nauwkeurigheid worden gegenereerd, ongeacht de ingevoerde stimulus. Hoewel gegevens over schuine stimuli hier niet werden geanalyseerd, kunnen nauwkeurige winsten worden berekend door middel van ontbonden XY-snelheidsvectoren om een schuine hoek te reconstrueren, waardoor nauwkeurige versterkingsberekeningen van schuine stimuli mogelijk zijn. Door toegankelijke parametrisering van stimuli-instellingen is onze tool breed toepasbaar op het traceren van golven als reactie op elke visuele stimulus. Bovendien maakt de software een hogere doorvoer en reproduceerbare kwantificering mogelijk in vergelijking met eerdere methoden. Het sorteren van OKR-sporen is tijdrovend en arbeidsintensief; de gestroomlijnde gebruikersinterface van PyOKR is echter in staat om gemakkelijk door veel sporen te screenen met een hogere snelheid dan voorheen mogelijk was. Dit zorgt niet alleen voor een snellere kwantificering van sporen, maar onthult ook aanvullende OKR-parameters, waaronder directe kwantificering van oogsnelheden, directionele vectorcomponenten van oogbeweging en onmiddellijke winsten ten opzichte van de stimulus in zowel de horizontale als verticale componenten van de bewegingsvector. Verder, gezien de geautomatiseerde identificatie van saccades en de berekening van volgsnelheden die door onze methode worden geboden, wordt de potentiële vooringenomenheid van experimentatoren in gegevensanalyse aanzienlijk verminderd in vergelijking met andere kwantificeringsmethoden, zoals handmatige ETM-telling of geautomatiseerde sporenfiltering, die valse negatieven kunnen genereren. Verder kunnen grote hoeveelheden gedragsgegevens worden gegenereerd en automatisch worden gecompileerd voor vereenvoudigde stroomafwaartse analyse. Via de gegevensexport- en sorteerfuncties die beschikbaar zijn in PyOKR, kunnen trackinggegevens over meerdere dieren en omstandigheden automatisch worden verwerkt om georganiseerde gegevensopslag en snelle statistische analyse mogelijk te maken. Voor het uitvoeren van experimenten die gebruik maken van meerdere condities tijdens dezelfde opnamesessie, zoals circuitmanipulatie of visuele reacties, raden we aan om gegevens te verzamelen in discrete golfbestanden of gesubsette epochs die de opslag van afzonderlijke datasets mogelijk maken op basis van de onafhankelijke variabelen die van belang zijn afgeleid van deze enkele opnamesessie. Een voorbeeld zou zijn dat als men verschillen in reacties op verschillende sinusvormige golffrequenties test binnen een experimenteel paradigma, we zouden aanbevelen om verschillende parameters op te slaan in verschillende golfbestanden voor afzonderlijke analyse, zoals WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis en WT_1_Freq0.3Analysis. In de huidige versie is er, zodra epochs zijn geanalyseerd, geen functionaliteit voor het selecteren van individuele epoch-waarden binnen de dataset, hoewel dit in de toekomst indien nodig kan worden toegevoegd.

Ten slotte is onze methode aanpasbaar aan meerdere video-oculografie-verzamelmethoden en biedt het een robuust analyseplatform dat gemakkelijk kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van een laboratorium. Door analyse van wild-type en bestaande mutante OKR-gegevens, en ook wild-type OKR-gegevens verzameld met behulp van verschillende methoden en stimuli, laten we hier zien dat onze analysetool in staat is om a) OKR-tracking van elke gerichte stimulus te kwantificeren met hoge nauwkeurigheid en doorvoer; b) het identificeren van gedragsverschillen in het visuele systeem als gevolg van genetische verstoring; en c) het beoordelen van visuele trackinggegevens van verschillende video-oculografiemethoden. De toegankelijkheid en het algemene aanpassingsvermogen van ons analyseplatform vergemakkelijken verdere studie van OKR-antwoorden en zullen gedragsstudies verbeteren die de assemblage en dynamiek van neurale circuits karakteriseren in de context van oculomotorische responsen.

Om nauwkeurige metingen en daaropvolgende nuttige gegevensanalyses te verkrijgen, zijn verschillende stappen nodig voor het verzamelen van gegevens. We raden aan om OKR-gegevens over meerdere sessies te verzamelen om het dier te laten acclimatiseren aan het gedragstestapparaat en de impact van dierstress op gedragsreacties te verminderen; overmatige registratie kan echter leiden tot versterking van de OKR-respons¹³, dus voorzichtigheid bij het ontwerpen van testregimes wordt aanbevolen. Tijdens het verzamelen van OKR-gegevens is een goede kalibratie van de video-oculografieapparatuur van cruciaal belang voor nauwkeurige kwantificering, aangezien de kwaliteit van de geanalyseerde gegevens een directe functie is van het verwerkte spoor. Belangrijk is dat het gebruik van de Spyder IDE noodzakelijk is voor het toezicht op grafieken via Matplotlib. Gezien de toegankelijkheid en het framework-ontwerp van ons platform, zijn alle benodigde tools beschikbaar voor anderen om de mogelijkheden van de software uit te breiden en dit platform aan te passen aan verschillende gedragsexperimentele paradigma's.

Tot slot beschrijven we hier een nieuw, toegankelijk en veelzijdig hulpmiddel voor de analyse van OKR-gedragsreacties in meer diepgang en met meer kwantitatieve kracht dan momenteel beschikbaar is met behulp van bestaande methodologieën. PyOKR kan gemakkelijk worden gebruikt door beginnende Python-gebruikers en bevat een gevestigde analysepijplijn en interface voor de snelle en nauwkeurige analyse van OKR-golven met verhoogde nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Het aanpassingsvermogen van deze software biedt een flexibel kader dat gebruikers gemakkelijk kunnen aanpassen aan hun specifieke behoeften en procedures voor gegevensverzameling. We verwachten dat deze kwantitatieve methode de studie van oculomotorische reacties zal bevorderen en ons begrip van de ontwikkeling en functie van de neurale circuits die het gedrag van het visuele systeem aansturen, zal vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C57BL/6J  muizen	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex opnamekamer - JHUSOM	Op maat gemaakt	N/A	Zoals beschreven in Al-Khindi et al.(2022)9 en Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex opnamekamer - UCSF	Op maat gemaakt	N/A	Zoals beschreven in Harris en Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ muizen	Gift van B. Bruneau	N/A	Zoals beschreven in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD