Deze studie beschrijft een gecombineerd protocol van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en laag-intensiteit gepulseerde gerichte ultrasone golf (FUS), gebruikmakend van levende ratten met katheterisatie van de halsader om de opening van de bloed-hersenbarrière (BBB) te monitoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Monitoring van de bloed-hersenbarrièreopening bij ratten met een preklinisch gerichte echografiesysteem
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De hersenen hebben een zeer selectieve semipermeabele bloedbarrière, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB), die de aflevering van therapeutische macromoleculaire middelen in de hersenen voorkomt. De integratie van MR-gestuurde laag-intensiteit gepulseerde gerichte echografie (FUS) met microbubbel-pre-injectie is een veelbelovende techniek voor niet-invasieve en niet-toxische BBB-modulatie. MRI kan superieur wekweefselterugslag en verschillende kwantitatieve beoordelingen bieden, zoals vasculaire permeabiliteit, perfusie en de ruimte-tijdelijke verdeling van MRI-contrastmiddelen. Opmerkelijk is dat contrast-versterkte MRI-technieken met gadolinium-gebaseerde MRI-contrastmiddelen de gouden standaard zijn gebleken voor het detecteren van BBB-openingen. Dit onderzoek beschrijft een uitgebreide methodologie met betrekking tot MRI-protocollen en dierproeven voor het monitoren van BBB-opening in een rattenmodel. Het rattenmodel biedt het extra voordeel van de gebruik van een jugulaire venekatheter, wat een snelle medicatietoediening mogelijk maakt. Een stereotactisch geleide preklinische FUS-transducer vergemakkelijkt de verfijning en stroomlijning van dierproeven en MRI-protocollen. De resulterende methoden worden gekenmerkt door reproduceerbaarheid en eenvoud, waardoor de behoefte aan gespecialiseerde chirurgische expertise wordt geëlimineerd. Dit onderzoek streeft ernaar bij te dragen aan de optimalisatie van preklinische procedures met rattenmodellen en moedigt verder onderzoek aan naar de modulatie van de BBB om therapeutische interventies bij neurologische aandoeningen te verbeteren.
Inleiding
De BBB reguleert de beweging van ionen, moleculen en cellen tussen de bloedvaten en hersenweefsels1. Deze functie maakt het mogelijk om neuronale functie en gezondheid te behouden terwijl de aflevering van therapeutische macromoleculaire agentia naar de hersenweefsels wordt voorkomen. De beperkte permeabiliteit van de BBB kan resulteren in een verminderde werkzaamheid en effectiviteit van behandelingen voor hersentumoren en neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Alzheimer2. Daarom zijn verschillende benaderingen, zoals convectie-verbeterde aflevering, directe intracraniële injecties, osmotische verstoring en verbeterd medicijnontwerp, onderzocht om de BBB te omzeilen voor gecontroleerde aflevering van therapeutische agentia3,4,5.
Deze benaderingen hebben echter intrinsieke beperkingen zoals invasiviteit, risico op infectie, risico op bloeding, heterogeniteit en snelle uitstroom van geneesmiddelen. Laag-intensiteit gepulseerde gerichte echografie (FUS) met de injectie van microbubbels is een veelbelovende niet-invasieve techniek die gelokaliseerde en omkeerbare BBB-verstoring toelaat. De mechanische effecten van echografie gekoppeld aan microbubbels kunnen tijdelijk de permeabiliteit van de BBB veranderen (d.w.z. BBB-opening)6,7. Voor verdere vorderingen in behandelingstoepassingen die gebruikmaken van BBB-opening zijn in vivo experimenten met kleine dieren essentieel.
In deze studie introduceerden we MRI-protocollen en dierprocedures om BBB-opening in een ratmodel te monitoren. Het protocol omvatte een ratmodel met een Jugularis veneuze katheter die door een commerciële organisatie werd gecanuleerd (zie Tabel van Materialen). Een ratmodel van jugularis veneuze katheterisatie heeft de potentiële voordelen van snelle medicatietoediening, hemodynamische monitoringtests en stabiele katheterisatie. BBB-opening werd bereikt met behulp van een preklinisch FUS-systeem. Speciaal ontworpen voor BBB-opening in kleine diermodellen zoals ratten en muizen, bevat dit systeem essentiële componenten, zoals een tafelsysteem, besturingscomputer, transducer, waterontgasser en bijbehorende accessoires. Het gebruik van dit stereotactisch-geleide preklinische FUS-systeem verbetert niet alleen de precisie, maar stroomlijnt ook dierprocedures en MRI-protocollen, wat bijdraagt aan de reproduceerbaarheid en eenvoud van het algehele experimentele protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven in dit onderzoek zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, San Francisco (UCSF). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (200-250 g) werden gebruikt in dit onderzoek. De ratten werden gehuisvest en verzorgd volgens de richtlijnen van het National Institutes of Health Office of Animal Care and Use voor muizen en ratten. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel van materialen.
1. Bereiding van dieren
OPMERKING: Voor interne procedures werden de dieren naar de voorbereidingskamer vervoerd en de procedures werden als volgt uitgevoerd:
- Plaats de ratten individueel in een Lucite-kamer en exposeer ze aan isofluraan (2%-3%) gemengd met zuurstof uit een medische zuurstoftank totdat ze bewusteloos zijn (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
OPMERKING: Anesthesie met isofluraan maakt de implementatie van een langdurig MRI-protocol mogelijk. - Verwijder de ratten uit de kamer en scheer het haar van de voorste en achterste delen van de nek met behulp van een haarentferningscrème (depilatiecrème).
- Breng smeermiddelzalf aan op de ogen.
- Plaats de neus in de neuskoker om anesthesie te handhaven met spontane ademhaling (isofluraanverdamper tussen 2%-2,5%, zuurstofflowmeter naar 1-1,5 L/min).
- Plaats de anesthetiseerde rat op een verwarmde operatietafel en bevestig dit met een teenprik.
OPMERKING: Het MRI-protocol omvatte contrastversterkte sequenties, zoals T1-wegewogen gradiëntecho-beeldvorming en T2-wegewogen spinecho-beeldvorming. Deze sequenties werden zowel vóór als na injectie van gadolinium (GAD)-gebaseerde contrastmiddelen uitgevoerd om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) te beoordelen. Dit omvat het toedienen van GAD-contrastmiddelen terwijl de rat zich in een MRI-scanner bevindt7. Om dit proces te vergemakkelijken, werd gebruik gemaakt van katheterslang die zich uitstrekt van de katheter die in de rat is gecanuleerd. De verlengslang omvatte een katheterconnector en polyethyleenslang van 30 cm. Om de doorlaatbaarheid te garanderen en lekkage te voorkomen, werd de verlengslang doorgespoeld met heparine-glycerol (250 IE heparine/1 mL glycerol).
2. Stereotactisch-geleide gefocuste echografie systeem
OPMERKING: De dieren werden overgebracht en op een tafel in een stereotactisch FUS-systeem geplaatst. De neus van de rat werd in de neuskoker geplaatst om anesthesie te handhaven. Het FUS-systeem bestaat uit een functiegenerator, een RF-versterker en een oscilloscoop. Voordat we de transducer instelden, zorgden we ervoor dat alle apparaten correct met het systeem waren verbonden. De instelling van de transducer werd voltooid met behulp van de volgende stappen:
- Plaats een scherpe wijzer op de positie van de Bregma in de schedel en sla de positie op. De positie van Bregma kan worden geïdentificeerd door de locatie van 9,0 mm anterior van Lambda op de middenlijn aan te wijzen8. De Lambda kan worden gevonden in het midden van de lijn tussen bilaterale trommelvliezen9.
- Breng ultrasone gel aan op het hoofd van de rat, waterkoppelingszak en de transducer (1 MHz frequentie). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn tussen de huid van de rat, de waterkoppelingszak en de transducer.
- Sluit een coaxiale BNC-kabel van de transducer aan op de ingang van het FUS-systeemmodule.
- In een besturingscomputer) Klik op laden voor vooraf geregistreerd rattenbeeld; een aantal focale spots en akoestische druk worden gekozen.
- In een besturingscomputer) Klik op de bewegingstest in de behandelingsmodule om ervoor te zorgen dat de transducer kan verschuiven tussen spots binnen een burstperiode.
- Stel de sonicatieparameters in die in stap 3 zijn beschreven.
3. Microbubbelinfusie en sonicatie
- Activeer de microbubbel.
OPMERKING: De microbubbel die in dit onderzoek werd gebruikt, werd gekenmerkt door een diameter van 1,7 μm en een concentratie van 0,2 × 109 deeltjes per milliliter10. De microbubbelfles werd geactiveerd op basis van de voorschrijfinstructies van de leverancier en een eerder gepubliceerd rapport11.- Bereid een 5 mL-spuit voor met een luerlock-tip en gevuld met 5 mL additiefvrij 0,9% natriumchloride-injectie.
- Verwijder de groene dop en verbind de spuit met de geventileerde doseerpen (zie Tabel van materialen) door deze met de klok mee vast te schroeven.
- Verwijder de penbescherming en plaats deze in het midden van de rubberen stop van de fles. Druk stevig naar beneden totdat de punt volledig in de stop is ingebracht.
- Leeg de volledige 5 mL-spuit in de fles door op de zuigerstang te duwen.
- Schud de fles krachtig gedurende 20 s om alle inhoud te mengen. Een consistente witte, melkachtige vloeistof geeft aan dat er zwavelhexafluoride lipide microsferen zijn gevormd.
- Om de vereiste dosis te verkrijgen, keer de spuit om en trek langzaam het beoogde volume van de suspensie in een 5 mL-spuit.
- Gebruik een infusiepomp.
OPMERKING: De infusiebenadering12 werd gebruikt om microbubbels aan ratten toe te dienen met behulp van een spuitpomp. Een spuit met microbubbels werd aangesloten op een katheterconnector die in de rat werd ingebracht. Microbubbels werden overgebracht via polyethyleenbuis en de infusiesnelheid van de pomp werd ingesteld op 0,66 mL/min. Deze infusiesnelheid maakt de injectie van 2 mL microbubbels uit een 3 mL-spuit mogelijk gedur
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze studie presenteert een preklinisch protocol voor het monitoren van de opening van de bloed-hersenbarrière (BBB) in een ratmodel met behulp van een commercieel FUS-systeem voor dieren. Het FUS-systeem werd opgesteld op een werkbank of een grote transportwagen (Figuur 1). Ratten werden geanestheseerd met isofluraan gemengd met zuurstof via de neuskegel in het frame met de transducerhouder. Een hydrofoon met een resonantie van 500 kHz voor het detecteren van akoestische cavitatie werd in d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een protocol en dierprocedure met behulp van een rattenmodel voor katheterisatie van de halsslagader voor BBB-openingstudies is ontwikkeld. Hoewel er talrijke preklinische protocollen bestaan, bevat dit protocol een commercieel verkrijgbaar FUS-systeem en een rattenmodel, waardoor diervoorbereidingsprocedures worden geminimaliseerd en experimentele reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd.
In dit protocol was de selectie van microbubbels gebaseerd op de stabiliteit en opslag bij kamertemperatuur...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Grant K99DE032397, UCSF Department Seed Grant (No. 7504831), UCSF RAP-subsidie (PI: Kazim Narsinh, MD), en de Duitse Onderzoeksstichting (DFG, GA 3535/1-1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL spuit | BD plastipak | ||
| 20 mL, Sodium Chloride 0.9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| 3 mL spuit | BD plastipak | ||
| 5 mL spuit | BD plastipak | ||
| Blunt naald, 21 G | SAI infusion technologies | B21-50 | |
| Catheter connector, 21 G | SAI infusion technologies | CC-25-25 | |
| Catheter lock oplossing | SAI infusion technologies | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glycerol |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE isoflurane Verdamper | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Spuitpomp | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurane USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason microbubbel | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| Mannelijke Sprague-Dawley ratten (200–250 g) | Charles River Laboratories | ||
| Naald, 18 G | BD Precisionglide | ||
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Polyethyleen buis | BD Intramedic | ||
| Preklinische 3T cryogenvrije Bruker Biospin scanner | Bruker | Biospec3T | |
| Raad met jugulaire venenkavernisatie | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 gefocuste ultrasone transducer | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 tafelgemonteerde gefocuste ultrasone systeem | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, USA | ||
| Geventileerde doseerspuit | B Braun | 4550560 |
Referenties
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
