Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners

7.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een toegankelijke gids voor het verzamelen, bewaren en ontdooien van perifere mononucleaire bloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyses en workflows zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Plasma- en buffy-jascollecties worden ook gedemonstreerd.

Samenvatting

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden vaak gebruikt in biomedisch onderzoek naar het immuunsysteem en zijn reactie op ziekten en ziekteverwekkers. Dit gedetailleerde protocol beschrijft de apparatuur, benodigdheden en stappen voor het isoleren, cryoconserveren en ontdooien van hoogwaardige en zeer levensvatbare PBMC's uit volbloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse toepassingen zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Protocollen voor het verwerken van plasma en buffy coat uit het volbloed parallel en gelijktijdig met PBMC's worden ook beschreven. Dit eenvoudig te volgen stap-voor-stap protocol, dat gebruik maakt van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC's te isoleren, gaat vergezeld van een checklist met benodigdheden, apparatuur en voorbereidingsstappen. Dit protocol is geschikt voor personen met enige eerdere ervaring met laboratoriumtechnieken en kan worden geïmplementeerd in klinische of onderzoekslaboratoria. Hoogwaardige cellevensvatbaarheid en RNA-sequencing waren het resultaat van PBMC's die werden verzameld door operators zonder eerdere laboratoriumervaring met het gebruik van dit protocol.

Inleiding

Dit protocol demonstreert een toegankelijke methode en workflow voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit volbloed. Dit protocol is speciaal gericht op beginnende onderzoekstechnici, studenten en klinisch laboratoriumpersoneel met als doel het verzamelen en cryopreservatie van PBMC's te vergemakkelijken zonder voorafgaande training in laboratoriumtechnieken te veronderstellen.

Dit protocol maakt gebruik van centrifugatie om de componenten van volbloed te scheiden op dichtheid. Volbloed bestaat uit vier hoofdcomponenten die worden vermeld in volgorde van afnemende dichtheid: rode bloedcellen/erytrocyten (~45% van het volume), witte bloedcellen (<1% van het volume), bloedplaatjes (<1% van het volume) en plasma (~55% van het volume)1,2,3,4,5,6. Witte bloedcellen kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun kernkenmerken: rond of meerkernig6. PBMC's worden gedefinieerd als witte bloedcellen met ronde kernen en bestaan uit de volgende celtypen: lymfocyten (T-cellen, B-cellen, NK-cellen), dendritische cellen en monocyten6. Meerkernige witte bloedcellen omvatten granulocyten, die bestaan uit de volgende celtypen: neutrofielen, basofielen en eosinofielen6. Meerkernige witte bloedcellen zijn dichter dan PBMC's6. De dichtheden van elk bestanddeel van volbloed worden gedetailleerd beschreven in tabel 1.

In dit protocol wordt volbloed verzameld in centrifugatiebuisjes met dichtheidsgradiënt. Deze buisjes bevatten een voorverpakt dichtheidsgradiëntmedium met een dichtheid van 1,077 g/ml. Na centrifugatie worden dichtere cellen, waaronder meerkernige witte bloedcellen en erytrocyten, gescheiden van PBMC's en bloedplaatjes door het dichtheidsgradiëntmedium (figuur 1A)6,7. De PBMC- en bloedplaatjesfractie wordt vervolgens verzameld, gewassen en gecentrifugeerd om bloedplaatjes te verwijderen. De resulterende gezuiverde PBMC's worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C of in vloeibare stikstof. Gecryopreserveerde PBMC's kunnen levensvatbaar worden ontdooid en direct worden gebruikt in stroomafwaartse analyses of aanvullend worden verwerkt om specifieke componentceltypen te isoleren.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor hoogwaardige RNA-sequencing van zeer levensvatbare PBMC's. In dit artikel werden PBMC's geïsoleerd en gecryopreserveerd van patiënten in een polikliniek. Vervolgens werden monocyten geïsoleerd uit PBMC's door FACS en geanalyseerd via RNA-sequencing. Het protocol kan echter op grote schaal worden aangepast aan andere experimentele behoeften, zoals celcultuur, genbewerking, ex-vivo functionele studies, analyses van één cel, fenotypering door flowcytometrie of cytometrie door vluchttijd, isolatie van DNA/RNA of eiwitten, objectglaasjes voor immunohistochemie, onder andere 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Naast PBMC-verzameling van centrifugatiebuizen met dichtheidsgradiënt, wordt in dit protocol beoordeeld hoe plasma en buffy coat kunnen worden verzameld via centrifugatie met behulp van een EDTA-buis. Na centrifugatie wordt volbloed gescheiden in plasma, erytrocyten en een dunne interfacelaag die buffy coat wordt genoemd en leukocyten bevat (Figuur 1B)6. De buffy coat wordt vaak gebruikt voor DNA-extractie en daaropvolgende genomische analyses19,20. De plasmalaag bevat de celvrije componenten van volbloed en kan worden gebruikt voor biomarkertests21,22.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de UCSD en het KUMC Human Protections Program en voldoet aan de Verklaring van Helsinki. Alle personen gaven geïnformeerde toestemming voor deelname en bloedafname.

1. Verwerking en cryopreservatie van PBMC's

  1. Druk een dag voor de bloedafname de checklist met materialen en reagentia uit die in tabel 2 worden vermeld en bereid deze dienovereenkomstig voor en etiketteer.
    OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het verzamelen van centrifugatiebuizen met 6 dichtheidsgradiënt. Elke buis levert ongeveer 12 miljoen PBMC's op, waarvan ongeveer 50% en 20% respectievelijk levende lymfocyten en monocyten zullen zijn. Schaal dienovereenkomstig voor experimentele behoeften. Merk op dat het absolute aantal cellen aanzienlijk kan verschillen tussen patiënten of behandelingsomstandigheden.
  2. Verzamel met behulp van de standaard aderlatingstechniek volbloed in 6 dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuisjes en 1 EDTA-buisje tot het gevuld is, ongeveer 6 ml volume.
    OPMERKING: Als monsters van meerdere patiënten of behandelingsomstandigheden nodig zijn, kunnen de verzamelde buisjes tot 4 uur worden bewaard en vervolgens tegelijkertijd worden verwerkt.
  3. Centrifugeer na het verzamelen alle buisjes op 1.800 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    NOTITIE: Raadpleeg aanvullende video 1 voor een demonstratie van het bedienen van een centrifuge.
  4. Open na het centrifugeren voorzichtig de centrifugatiebuis met dichtheidsgradiënt. Gebruik een transferpipet om de doorschijnende gele laag met plasma te verwijderen en weg te gooien. Verstoor de wazige laag cellen direct boven het dichtheidsgradiëntmedium niet. Neem het zekere voor het onzekere en laat overtollig plasma achter in plaats van PBMC's weg te gooien. Herhaal dit voor alle buisjes.
    OPMERKING: Na centrifugeren van de buis met het dichtheidsgradiëntmedium, zullen plasma en PBMC's zich boven het dichtheidsgradiëntmedium bevinden; Erytrocyten en granulocyten zullen naar de bodem zakken. Zie Afbeelding 1A voor een visualisatie.
  5. Met een nieuwe transferpipet pipetteert u het resterende volume met cellen en restplasma in elk buisje voorzichtig op en neer boven het dichtheidsgradiëntmedium.
  6. Na resuspensie pipetteert u de geresuspendeerde inhoud van het buisje in een gelabeld conisch buisje van 50 ml. Herhaal dit voor alle tubes.
  7. Giet oplossing 1 (RPMI Medium) in de buis van 50 ml totdat deze de lijn van 50 ml bereikt.
  8. Herhaal stap 1.4 tot en met 1.7 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat verschillende monsters niet worden gemengd en gebruik een nieuwe transferpipet om besmetting te voorkomen.
  9. Centrifugeer de tube van 50 ml op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Het protocol voor het verzamelen van plasma en buffy's dat in sectie 2 wordt beschreven, kan gedurende deze tijd worden voltooid.
  10. Gooi zoveel mogelijk supernatans weg. Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen.
    OPMERKING: Na centrifugeren bevat de pellet PBMC's en het supernatans bevat bloedplaatjes en restplasma.
  11. Giet een tube van 15 ml oplossing 2 (RPMI Medium + 12,5% humaan serumalbumine + 1 μM flavopiridol in de conische buis van 50 ml met de PBMC-pellet. Keer de buis voorzichtig om om de celpellet opnieuw te suspenderen.
  12. Aspireer 15 ml oplossing 3 (RPMI Medium + 11,25% humaan serumalbumine + 1 μm flavopiridol + 10% DMSO) op met behulp van een transferpipet. Voeg druppelsgewijs toe aan de tube van 50 ml.
    OPMERKING: Oplossing 3 bevat DMSO, dat bij kamertemperatuur giftig is voor cellen. Voeg Oplossing 3 pas toe als het klaar is om onmiddellijk te worden verwerkt.
  13. Keer de tube 3 keer voorzichtig om om te mengen.
  14. Vul elke voorgeëtiketteerde en voorgekoelde cryovial met 1 ml PBMC's met behulp van een multi-doseerpipet.
    OPMERKING: Raadpleeg aanvullende video 2 voor een demonstratie van het gebruik van een pipet met meerdere doseringen.
  15. Plaats de cryovials in een voorgekoelde vriescontainer. Verplaats de container vervolgens naar een vriezer van -80 °C.
  16. Herhaal stap 1.9 tot 1.13 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
  17. Bewaar de cryovials minimaal 12 uur in de vriescontainer en breng ze vervolgens over naar een geëtiketteerde opbergdoos bij -80 °C.
    OPMERKING: U kunt de ingevroren cryovials ook overbrengen naar vloeibare stikstof (<-135 °C) voor langdurige opslag.

2. Verwerking van plasma en buffy coat uit EDTA-buizen

  1. Centrifugeer op 1.800 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Na centrifugeren bestaat de bovenste laag uit plasma, de onderste bevat erytrocyten en het raakvlak is de buffy coat. Zie Figuur 1B voor een visualisatie.
  2. Zuig met een nieuwe transferpipet zoveel mogelijk plasma op zonder de buffy vachtlaag te verstoren. Doseer vervolgens 0,5 ml aliquots in vooraf geëtiketteerde cryovials. Zuig de buffy vachtlaag op en breng deze over naar de correct geëtiketteerde cryovial.
    OPMERKING: Sommige plasma's en erytrocyten kunnen de buffy coat-collectie besmetten.
  3. Herhaal stap 2.2 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
  4. Bewaar de cryovials na het verzamelen in een vriezer van -80 °C.
    NOTITIE: U kunt ook bewaren in vloeibare stikstof (<-135 °C) voor langdurige opslag.

3. PBMC's ontdooien

  1. Druk een dag voor het ontdooien een checklist af met de materialen en reagentia die in tabel 3 worden vermeld en bereid deze dienovereenkomstig voor en etiketteer.
    OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het ontdooien van 1 tube van 1,5 ml met 1 ml PBMC's. Elke buis levert ongeveer 2 miljoen PBMC's op, waarvan respectievelijk ongeveer 50% en 20% levende lymfocyten en monocyten zullen zijn. Schaal dienovereenkomstig voor experimentele behoeften. Merk op dat het absolute aantal cellen aanzienlijk kan verschillen tussen patiënten of behandelingsomstandigheden.
  2. Breng bevroren PBMC's over uit de opslag met behulp van droogijs en ontdooi ze in een incubator van 37 °C gedurende 4 minuten, of net voor het ontdooien van het laatste ijskristal.
    OPMERKING: Indien gewenst kan een aliquot worden genomen voor het tellen van cellen en levensvatbaarheidsmetingen, zoals beschreven in hoofdstuk 4.
  3. Voeg na het ontdooien 1 ml oplossing 4 (PBS + 2 mM EDTA) toe aan elke cryovial. Giet vervolgens de inhoud in een vooraf geëtiketteerde tube van 50 ml met 10 ml oplossing 4 voor elke ontdooide PBMC-buis. Tik om achtergebleven druppels te verwijderen.
  4. Plaats de celzeef op de lege buis van 50 ml en giet vervolgens de celsuspensie door de celzeef.
    NOTITIE: Tik indien nodig lichtjes om de oppervlaktespanning te onderbreken.
  5. Centrifugeer elk buisje met de gezeefde cellen bij 400 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Giet na het centrifugeren het supernatans met DMSO eruit. Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen.
  7. Resuspendeer de celpellet in het gewenste medium dat geschikt is voor stroomafwaartse experimentele behoeften (bijv. celkweekmedia, flowcytometrie, antilichaamcocktail, enz.).

4. Celtelling en levensvatbaarheid

  1. Onmiddellijk na het ontdooien van ingevroren PBMC's in stap 3.2, pipetteer 20 μL cellen in een buisje van 1,5 ml. Voeg een gelijk volume van 0,4% Trypan Blue-oplossing toe en pipetteer 3-4 keer voorzichtig op en neer om te mengen.
  2. Volg met behulp van een geautomatiseerde cellenteller het protocol van de fabrikant om cellen te tellen en de levensvatbaarheid te beoordelen. Zorg ervoor dat de verdunningsfactor van 2 in aanmerking wordt genomen.
    OPMERKING: Zoals elders beschreven, kan een hemocytometer worden gebruikt als een alternatieve methode voor het beoordelen van het celgetal en de levensvatbaarheid23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na verzameling en cryopreservatie van PBMC werd de levensvatbaarheid van ontdooide PBMC's, monocyten en lymfocyten uit 56 unieke monsters beoordeeld door middel van flowcytometrie met behulp van reagentia vermeld in tabel 4 volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 2A-F). Een gemiddelde ± SD-levensvatbaarheid van PBMC's, monocyten en lymfocyten van respectievelijk 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% en 93 ± 5,6% werd bereikt (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol voor PBMC-verzameling en cryopreservatie is met succes geïmplementeerd door personen met en zonder voorafgaande opleiding in onderzoekslaboratoria. In onze toepassing resulteerde FACS- en RNA-sequencing van zeer levensvatbare monocyten gezuiverd uit opgeslagen PBMC's in hoogwaardige sequenties.

Een grote kracht van dit protocol is de toegankelijkheid. De techniek die in het protocol wordt gepresenteerd, maakt gebruik van buizen die zijn voorverpak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

We willen de patiënten bedanken die vrijwillig hun toestemming, tijd en donatie van bloedmonsters hebben gegeven. We erkennen ook Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton en Mark McClellen van het Kansas University Medical Center voor hun samenwerking en voor het implementeren van dit protocol op een afgelegen locatie. CY heeft onderzoeksondersteuning ontvangen van NIH-subsidie 1K08HL150271.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 µL TipsGilsonF174501Ongeveer 3 tips nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
15 mL buisBiopioneeerCNT-15Om oplossingen 2/3 te houden
2 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Ongeveer 40 cryovials nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
20 µL TipsGilsonF174201Voor gebruik in celtelling; benodigd volume is afhankelijk van de gebruikte methode voor celtelling. 1 tip is nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
50 mL Conische buisCEM Corporation50-187-76832 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
3 nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
CD14 AntilichaamBiolegend325621
CD16 AntilichaamBiolegend360723
CD19 AntilichaamBiolegend363007
CD3 AntilichaamBiolegend300405
CD56 AntilichaamBiolegend318303
CD66b AntilichaamBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
CPT Mononuclear Cell Preparation TubeBD Biosciences3627536 buizen nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Houdt 81 buizen
1 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Houdt tot 50 cryovials
DMSOInvitrogen15575020Ongeveer 2,5 mL nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
DNase/RNase-Free Gedistilleerd WaterInvitrogen10977015Ongeveer 2 mL nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Ongeveer 9 mL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
EDTA BuizenBD Biosciences3666431 buis nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntilichaamBiolegend307609
Human Serum AlbumineGeminiBio800-120Ongeveer 25 mL nodig per patiënt of behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KVoor gebruik in Mr. Frosty
Label PrinterPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Houdt tot 18 buizen.
2 Mr. Frosty's nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Ongeveer 3 tips nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MVoor gebruik in celtelling; benodigd volume is afhankelijk van de gebruikte methode voor celtelling.
Printer LabelsPhomemoPM-M110-3020Ongeveer 45 labels nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Ongeveer 5 labels nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
RNase-Free EDTA (0,5 M)InvitrogenAM9260GOngeveer 40 µL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Ongeveer 1 mL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVOngeveer 80 mL nodig per patiënt of behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MOngeveer 5 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Houdt tot 80 CPT/EDTA Buizen

Referenties

  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van PBMC'sdichtheidsgradiëntcentrifugatiecryoconservering van cellenbuffycoatEDTA-plasmaflowcytometrieRNA-sequencingcelviabiliteitmonocytensortering
Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.