Methodenartikel

Isolatie en cryopreservatie van zeer levensvatbare mononucleaire cellen van menselijk perifeer bloed uit volbloed: een gids voor beginners

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een toegankelijke gids voor het verzamelen, bewaren en ontdooien van perifere mononucleaire bloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyses en workflows zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Plasma- en buffy-jascollecties worden ook gedemonstreerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) worden vaak gebruikt in biomedisch onderzoek naar het immuunsysteem en zijn reactie op ziekten en ziekteverwekkers. Dit gedetailleerde protocol beschrijft de apparatuur, benodigdheden en stappen voor het isoleren, cryoconserveren en ontdooien van hoogwaardige en zeer levensvatbare PBMC's uit volbloedcellen die geschikt zijn voor stroomafwaartse toepassingen zoals flowcytometrie en RNA-sequencing. Protocollen voor het verwerken van plasma en buffy coat uit het volbloed parallel en gelijktijdig met PBMC's worden ook beschreven. Dit eenvoudig te volgen stap-voor-stap protocol, dat gebruik maakt van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC's te isoleren, gaat vergezeld van een checklist met benodigdheden, apparatuur en voorbereidingsstappen. Dit protocol is geschikt voor personen met enige eerdere ervaring met laboratoriumtechnieken en kan worden geïmplementeerd in klinische of onderzoekslaboratoria. Hoogwaardige cellevensvatbaarheid en RNA-sequencing waren het resultaat van PBMC's die werden verzameld door operators zonder eerdere laboratoriumervaring met het gebruik van dit protocol.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert een toegankelijke methode en workflow voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit volbloed. Dit protocol is speciaal gericht op beginnende onderzoekstechnici, studenten en klinisch laboratoriumpersoneel met als doel het verzamelen en cryopreservatie van PBMC's te vergemakkelijken zonder voorafgaande training in laboratoriumtechnieken te veronderstellen.

Dit protocol maakt gebruik van centrifugatie om de componenten van volbloed te scheiden op dichtheid. Volbloed bestaat uit vier hoofdcomponenten die worden vermeld in volgorde van afnemende dichtheid: rode bloedcellen/erytrocyten (~45% van het volume), witte bloedcellen (<1% van het volume), bloedplaatjes (<1% van het volume) en plasma (~55% van het volume)1,2,3,4,5,6. Witte bloedcellen kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun kernkenmerken: rond of meerkernig6. PBMC's worden gedefinieerd als witte bloedcellen met ronde kernen en bestaan uit de volgende celtypen: lymfocyten (T-cellen, B-cellen, NK-cellen), dendritische cellen en monocyten6. Meerkernige witte bloedcellen omvatten granulocyten, die bestaan uit de volgende celtypen: neutrofielen, basofielen en eosinofielen6. Meerkernige witte bloedcellen zijn dichter dan PBMC's6. De dichtheden van elk bestanddeel van volbloed worden gedetailleerd beschreven in tabel 1.

In dit protocol wordt volbloed verzameld in centrifugatiebuisjes met dichtheidsgradiënt. Deze buisjes bevatten een voorverpakt dichtheidsgradiëntmedium met een dichtheid van 1,077 g/ml. Na centrifugatie worden dichtere cellen, waaronder meerkernige witte bloedcellen en erytrocyten, gescheiden van PBMC's en bloedplaatjes door het dichtheidsgradiëntmedium (figuur 1A)6,7. De PBMC- en bloedplaatjesfractie wordt vervolgens verzameld, gewassen en gecentrifugeerd om bloedplaatjes te verwijderen. De resulterende gezuiverde PBMC's worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C of in vloeibare stikstof. Gecryopreserveerde PBMC's kunnen levensvatbaar worden ontdooid en direct worden gebruikt in stroomafwaartse analyses of aanvullend worden verwerkt om specifieke componentceltypen te isoleren.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor hoogwaardige RNA-sequencing van zeer levensvatbare PBMC's. In dit artikel werden PBMC's geïsoleerd en gecryopreserveerd van patiënten in een polikliniek. Vervolgens werden monocyten geïsoleerd uit PBMC's door FACS en geanalyseerd via RNA-sequencing. Het protocol kan echter op grote schaal worden aangepast aan andere experimentele behoeften, zoals celcultuur, genbewerking, ex-vivo functionele studies, analyses van één cel, fenotypering door flowcytometrie of cytometrie door vluchttijd, isolatie van DNA/RNA of eiwitten, objectglaasjes voor immunohistochemie, onder andere 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Naast PBMC-verzameling van centrifugatiebuizen met dichtheidsgradiënt, wordt in dit protocol beoordeeld hoe plasma en buffy coat kunnen worden verzameld via centrifugatie met behulp van een EDTA-buis. Na centrifugatie wordt volbloed gescheiden in plasma, erytrocyten en een dunne interfacelaag die buffy coat wordt genoemd en leukocyten bevat (Figuur 1B)6. De buffy coat wordt vaak gebruikt voor DNA-extractie en daaropvolgende genomische analyses19,20. De plasmalaag bevat de celvrije componenten van volbloed en kan worden gebruikt voor biomarkertests21,22.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de UCSD en het KUMC Human Protections Program en voldoet aan de Verklaring van Helsinki. Alle personen gaven geïnformeerde toestemming voor deelname en bloedafname.

1. Verwerking en cryopreservatie van PBMC's

  1. Druk een dag voor de bloedafname de checklist met materialen en reagentia uit die in tabel 2 worden vermeld en bereid deze dienovereenkomstig voor en etiketteer.
    OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het verzamelen van centrifugatiebuizen met 6 dichtheidsgradiënt. Elke buis levert ongeveer 12 miljoen PBMC's op, waarvan ongeveer 50% en 20% respectievelijk levende lymfocyten en monocyten zullen zijn. Schaal dienovereenkomstig voor experimentele behoeften. Merk op dat het absolute aantal cellen aanzienlijk kan verschillen tussen patiënten of behandelingsomstandigheden.
  2. Verzamel met behulp van de standaard aderlatingstechniek volbloed in 6 dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuisjes en 1 EDTA-buisje tot het gevuld is, ongeveer 6 ml volume.
    OPMERKING: Als monsters van meerdere patiënten of behandelingsomstandigheden nodig zijn, kunnen de verzamelde buisjes tot 4 uur worden bewaard en vervolgens tegelijkertijd worden verwerkt.
  3. Centrifugeer na het verzamelen alle buisjes op 1.800 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    NOTITIE: Raadpleeg aanvullende video 1 voor een demonstratie van het bedienen van een centrifuge.
  4. Open na het centrifugeren voorzichtig de centrifugatiebuis met dichtheidsgradiënt. Gebruik een transferpipet om de doorschijnende gele laag met plasma te verwijderen en weg te gooien. Verstoor de wazige laag cellen direct boven het dichtheidsgradiëntmedium niet. Neem het zekere voor het onzekere en laat overtollig plasma achter in plaats van PBMC's weg te gooien. Herhaal dit voor alle buisjes.
    OPMERKING: Na centrifugeren van de buis met het dichtheidsgradiëntmedium, zullen plasma en PBMC's zich boven het dichtheidsgradiëntmedium bevinden; Erytrocyten en granulocyten zullen naar de bodem zakken. Zie Afbeelding 1A voor een visualisatie.
  5. Met een nieuwe transferpipet pipetteert u het resterende volume met cellen en restplasma in elk buisje voorzichtig op en neer boven het dichtheidsgradiëntmedium.
  6. Na resuspensie pipetteert u de geresuspendeerde inhoud van het buisje in een gelabeld conisch buisje van 50 ml. Herhaal dit voor alle tubes.
  7. Giet oplossing 1 (RPMI Medium) in de buis van 50 ml totdat deze de lijn van 50 ml bereikt.
  8. Herhaal stap 1.4 tot en met 1.7 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat verschillende monsters niet worden gemengd en gebruik een nieuwe transferpipet om besmetting te voorkomen.
  9. Centrifugeer de tube van 50 ml op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Het protocol voor het verzamelen van plasma en buffy's dat in sectie 2 wordt beschreven, kan gedurende deze tijd worden voltooid.
  10. Gooi zoveel mogelijk supernatans weg. Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen.
    OPMERKING: Na centrifugeren bevat de pellet PBMC's en het supernatans bevat bloedplaatjes en restplasma.
  11. Giet een tube van 15 ml oplossing 2 (RPMI Medium + 12,5% humaan serumalbumine + 1 μM flavopiridol in de conische buis van 50 ml met de PBMC-pellet. Keer de buis voorzichtig om om de celpellet opnieuw te suspenderen.
  12. Aspireer 15 ml oplossing 3 (RPMI Medium + 11,25% humaan serumalbumine + 1 μm flavopiridol + 10% DMSO) op met behulp van een transferpipet. Voeg druppelsgewijs toe aan de tube van 50 ml.
    OPMERKING: Oplossing 3 bevat DMSO, dat bij kamertemperatuur giftig is voor cellen. Voeg Oplossing 3 pas toe als het klaar is om onmiddellijk te worden verwerkt.
  13. Keer de tube 3 keer voorzichtig om om te mengen.
  14. Vul elke voorgeëtiketteerde en voorgekoelde cryovial met 1 ml PBMC's met behulp van een multi-doseerpipet.
    OPMERKING: Raadpleeg aanvullende video 2 voor een demonstratie van het gebruik van een pipet met meerdere doseringen.
  15. Plaats de cryovials in een voorgekoelde vriescontainer. Verplaats de container vervolgens naar een vriezer van -80 °C.
  16. Herhaal stap 1.9 tot 1.13 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
  17. Bewaar de cryovials minimaal 12 uur in de vriescontainer en breng ze vervolgens over naar een geëtiketteerde opbergdoos bij -80 °C.
    OPMERKING: U kunt de ingevroren cryovials ook overbrengen naar vloeibare stikstof (<-135 °C) voor langdurige opslag.

2. Verwerking van plasma en buffy coat uit EDTA-buizen

  1. Centrifugeer op 1.800 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Na centrifugeren bestaat de bovenste laag uit plasma, de onderste bevat erytrocyten en het raakvlak is de buffy coat. Zie Figuur 1B voor een visualisatie.
  2. Zuig met een nieuwe transferpipet zoveel mogelijk plasma op zonder de buffy vachtlaag te verstoren. Doseer vervolgens 0,5 ml aliquots in vooraf geëtiketteerde cryovials. Zuig de buffy vachtlaag op en breng deze over naar de correct geëtiketteerde cryovial.
    OPMERKING: Sommige plasma's en erytrocyten kunnen de buffy coat-collectie besmetten.
  3. Herhaal stap 2.2 indien nodig voor elke patiënt of behandelingsaandoening.
  4. Bewaar de cryovials na het verzamelen in een vriezer van -80 °C.
    NOTITIE: U kunt ook bewaren in vloeibare stikstof (<-135 °C) voor langdurige opslag.

3. PBMC's ontdooien

  1. Druk een dag voor het ontdooien een checklist af met de materialen en reagentia die in tabel 3 worden vermeld en bereid deze dienovereenkomstig voor en etiketteer.
    OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het ontdooien van 1 tube van 1,5 ml met 1 ml PBMC's. Elke buis levert ongeveer 2 miljoen PBMC's op, waarvan respectievelijk ongeveer 50% en 20% levende lymfocyten en monocyten zullen zijn. Schaal dienovereenkomstig voor experimentele behoeften. Merk op dat het absolute aantal cellen aanzienlijk kan verschillen tussen patiënten of behandelingsomstandigheden.
  2. Breng bevroren PBMC's over uit de opslag met behulp van droogijs en ontdooi ze in een incubator van 37 °C gedurende 4 minuten, of net voor het ontdooien van het laatste ijskristal.
    OPMERKING: Indien gewenst kan een aliquot worden genomen voor het tellen van cellen en levensvatbaarheidsmetingen, zoals beschreven in hoofdstuk 4.
  3. Voeg na het ontdooien 1 ml oplossing 4 (PBS + 2 mM EDTA) toe aan elke cryovial. Giet vervolgens de inhoud in een vooraf geëtiketteerde tube van 50 ml met 10 ml oplossing 4 voor elke ontdooide PBMC-buis. Tik om achtergebleven druppels te verwijderen.
  4. Plaats de celzeef op de lege buis van 50 ml en giet vervolgens de celsuspensie door de celzeef.
    NOTITIE: Tik indien nodig lichtjes om de oppervlaktespanning te onderbreken.
  5. Centrifugeer elk buisje met de gezeefde cellen bij 400 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Giet na het centrifugeren het supernatans met DMSO eruit. Tik indien nodig om achtergebleven druppels te verwijderen.
  7. Resuspendeer de celpellet in het gewenste medium dat geschikt is voor stroomafwaartse experimentele behoeften (bijv. celkweekmedia, flowcytometrie, antilichaamcocktail, enz.).

4. Celtelling en levensvatbaarheid

  1. Onmiddellijk na het ontdooien van ingevroren PBMC's in stap 3.2, pipetteer 20 μL cellen in een buisje van 1,5 ml. Voeg een gelijk volume van 0,4% Trypan Blue-oplossing toe en pipetteer 3-4 keer voorzichtig op en neer om te mengen.
  2. Volg met behulp van een geautomatiseerde cellenteller het protocol van de fabrikant om cellen te tellen en de levensvatbaarheid te beoordelen. Zorg ervoor dat de verdunningsfactor van 2 in aanmerking wordt genomen.
    OPMERKING: Zoals elders beschreven, kan een hemocytometer worden gebruikt als een alternatieve methode voor het beoordelen van het celgetal en de levensvatbaarheid23.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na verzameling en cryopreservatie van PBMC werd de levensvatbaarheid van ontdooide PBMC's, monocyten en lymfocyten uit 56 unieke monsters beoordeeld door middel van flowcytometrie met behulp van reagentia vermeld in tabel 4 volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 2A-F). Een gemiddelde ± SD-levensvatbaarheid van PBMC's, monocyten en lymfocyten van respectievelijk 94 ± 4,0%, 98 ± 1,1% en 93 ± 5,6% werd bereikt (figuur 2G). Levensvatbaarheidsmeting door uitsluiting van Trypan Blue leverde een gemiddelde levensvatbaarheid op van 88 ± 7,5% en een celgetal van 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. Flowcytometrieanalyse toonde ook aan dat levende monocyten 17 ± 5,9% uitmaakten en lymfocyten 53 ± 13,0% van het totale aantal PBMC's.

Vervolgens werden monocyten uit ontdooide PBMC's uit 59 unieke monsters gesorteerd door middel van flowcytometrie en ingediend voor bibliotheekvoorbereiding en RNA-sequencing zoals elders beschreven24. Een gemiddelde ± SD totale sequentie van 18,0 ± 16,3 miljoen werd bereikt met een 93 ± 6,3% leesuitlijning en 49,6 ± 1,4% GC-inhoud (Figuur 3A-B). Een gemiddeld ± SD uniek in kaart gebracht leespercentage van 88 ± 3,6% werd gevonden met een subset van 56 unieke steekproeven. Deze parameters tonen aan dat zeer levensvatbare PBMC's die geschikt zijn voor downstream-toepassingen, waaronder hoogwaardige RNA-sequencing, kunnen worden verkregen door operators met elk niveau van laboratoriumtraining die dit protocol gebruiken.

BestanddeelDichtheidCitaat
Plasma1,022 g/ml tot 1,026 g/ml1
Bloedplaatjes<1,061 g/ml tot >1,070 g/ml2
PBMC's<1,077 g/ml6
Neutrofielen met lage dichtheid*<1,077 g/ml3
Granulocyten (neutrofielen*, basofielen en eosinofielen)>1,077 g/ml6
Erytrocyten1,11 g/ml4

Tabel 1: Componenten van volbloed gerangschikt in volgorde van afnemende dichtheid.

Reagant/MateriaalHoeveelheid (per 6 sondeerbuisjes en 1 EDTA-buisje)FooiVoorzichtigheid
Sondeerbuizen6Label op basis van patiënt- of monster-ID.
EDTA-buis1Label op basis van patiënt- of monster-ID.
Conische buis van 50 ml2Label naast de patiënt- of monster-ID 1 tube voor PBMC's en 1 voor afval.
Cryovials39Label 30 voor PBMC's, 8 voor EDTA-plasma en 1 voor buffy coat. Het is mogelijk dat niet alle cryovials worden gebruikt.
Meneer Frosty2Vul tot halverwege met isopropanol en laat een nacht voorkoelen bij -20°C.Isopropanol is een ontvlambaar irriterend middel. Blijf uit de buurt van vonken/vlammen. Vermijd inademing en hanteer met handschoenen en zorg.
Flavopiridol100 μL 1000X voorraadOm 1000X flavopiridol bouillon te bereiden, suspendeert u 5 mg flavopiridol in 1,14 ml DMSO voor een concentratie van 10 mM. Aliquot 200 μL in individuele containers en vervolgens invriezen. Om te gebruiken, ontdooit u individuele aliquots en verdunt u 1:10 in DNase/RNase-vrij gedestilleerd water en gebruikt u het vervolgens als een 1000X-oplossing.Flavopiridol is irriterend. Hanteren met handschoenen en voorzichtig.
Oplossing 150 mlRPMI-gemiddeld.
Gebruik 50 ml RPMI Medium om 50 ml bouillonoplossing te maken.
Oplossing 215 mlRPMI Medium + 12,5% humaan serumalbumine + 1 μM flavopiriol.
Om 50 ml bouillonoplossing te maken, gebruikt u 25 ml RPMI medium + 25 ml humaan serum albumine + 50 μl 1000X Flavopiridol.		Flavopiridol is irriterend. Hanteren met handschoenen en voorzichtig.
Oplossing 315 mlRPMI Medium + 11,25% humaan serumalbumine + 1 μM flavopiridol + 10% DMSO.
Om 50 ml bouillonoplossing te maken, gebruikt u 22,5 ml RPMI medium + 22,5 ml HSA + 5 ml DMSO + 50 μl 1000X Flavopiridol.		Flavopiridol is irriterend en DMSO is giftig en wordt gemakkelijk door de huid opgenomen. Hanteren met handschoenen en voorzichtig.

Tabel 2: Checklist van reagentia en materialen die moeten worden voorbereid en geëtiketteerd voor het verzamelen en cryopreservatie van PBMC's.

Reagant/MateriaalHoeveelheid (per 1 ml aliquot bevroren PBMC's)FooiVoorzichtigheid
Oplossing 410 mlPBS + 2 mM EDTA

Om 50 ml bouillonoplossing te maken, gebruikt u 5 ml 10X PBS + 200 μL 0,5 M EDTA + 44,8 ml DNase/RNase-vrij gedestilleerd water
Conische buis van 50 ml3Label naast de patiënt- of monster-ID 1 buisje voor voorgespannen PBMC's, 1 voor nagespannen PBMC's en 1 voor afval. Vul de buis met het etiket voor voorgekleurde PBMC's met 9 ml oplossing 4 per ml bevroren PBMC's
Tube van 1,5 ml1Voor het tellen van cellen; label met patiënt- of voorbeeld-ID
0,4% Trypan Blauwe Oplossing20 μLVoor het tellen van cellen; kan de dag ervoor van tevoren aan de tube van 1,5 ml worden toegevoegd.Trypan Blue is kankerverwekkend. Hanteren met handschoenen en voorzichtig.

Tabel 3: Checklist van reagentia en materialen die moeten worden voorbereid en geëtiketteerd voor het ontdooien en tellen van PBMC's.

Reagens/MateriaalHoeveelheid (per miljoen cellen)
Levend-dode vlek5 μL
Menselijk vertrouwen FcX5 μL
CD3-antilichaam5 μL
CD19-antilichaam5 μL
CD56-antilichaam5 μL
CD66b-antilichaam5 μL
HLA-DR-antilichaam5 μL
CD14-antilichaam5 μL
CD16-antilichaam2,5 μL
RNAsine100 Eenheden

Tabel 4: Tabel met reagentia voor de isolatie van monocyten uit PBMC's door middel van flowcytometrie.

figure-results-1
Figuur 1: Volbloedcomponenten zoals gescheiden door centrifugatie in dichtheidsgradiëntcentrifugatie of EDTA-buisjes. (A) Centrifugatie van volbloed in centrifugeerbuisjes met dichtheidsgradiënt resulteert in de scheiding van plasma, bloedplaatjes en PBMC's boven het dichtheidsgradiëntmedium met meerkernige en erytrocyten onder het dichtheidsgradiëntmedium. (B) Centrifugatie van volbloed in EDTA-buisjes resulteert in de scheiding van plasma in de bovenste laag, erytrocyten in de onderste laag en de buffy coat in het grensvlak. Gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De levensvatbaarheid van ontdooide ingevroren PBMC's werd beoordeeld door live/dead flow-kleuring en flowcytometrie. (A) Puin, aangeduid met een asterisk *, wordt uitgesloten van PBMC's door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. (B) Representatieve levende/dode analyse van hele PBMC's (C) Pan-monocyten zijn afgeschermd als HLA-DR positief en negatief voor de volgende FITC-gelabelde oppervlakteantigenen: CD3, CD19, CD56 en CD66b. (D) Representatieve levende/dode analyse van monocyten. (E) Lymfocyten die zijn afgeschermd door de volgende FITC-gelabelde oppervlakteantigenen: CD3, CD19, CD56 en CD 66b. (F) Representatieve levende/dode analyse van lymfocyten. (G) Percentage levensvatbaarheid van elk celtype, gekwantificeerd op basis van 56 monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: RNA-sequencing kwaliteit van monocyten gesorteerd uit gecryopreserveerde PBMC's. 56 unieke monsters werden gesequenced en een gemiddelde ± SD 18,0 ± 16,3 miljoen totale sequenties werden gegenereerd. (A) De afstemming was hoog, met 92,5% ± 6,3% van de sequenties die overeenkwamen met het referentiegenoom. (B) Het GC-gehalte van deze sequenties was 49,6 ± 1,4%. Gemaakt met FastQC25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: Demonstratie van het gebruik van de centrifuge Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 2: Demonstratie van het gebruik van een pipet met meerdere dispensers. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voor PBMC-verzameling en cryopreservatie is met succes geïmplementeerd door personen met en zonder voorafgaande opleiding in onderzoekslaboratoria. In onze toepassing resulteerde FACS- en RNA-sequencing van zeer levensvatbare monocyten gezuiverd uit opgeslagen PBMC's in hoogwaardige sequenties.

Een grote kracht van dit protocol is de toegankelijkheid. De techniek die in het protocol wordt gepresenteerd, maakt gebruik van buizen die zijn voorverpakt met een gradiëntmedium met vaste dichtheid. Als gevolg hiervan kan volbloed rechtstreeks in de buis worden verzameld en vervolgens onmiddellijk worden verwerkt om PBMC's te isoleren. Er is een relatief klein aantal kant-en-klare oplossingen en gespecialiseerde apparatuur nodig, waardoor de samenwerking tussen het onderzoekslaboratorium, waar reagentia kunnen worden bereid, en het klinische laboratorium, waar monsters worden verzameld en verwerkt, wordt vergemakkelijkt. De schriftelijke en videoprotocollen zijn gericht op operators op elk opleidingsniveau.

Hoewel dit protocol vers volbloed gebruikt om PBMC's te isoleren en daarom een relatief hoge verwachte opbrengst en zuiverheid van >90% heeft, is het mogelijk niet geschikt voor toepassingen die uitzonderlijk hoge zuiverheiden van >98%26,27 vereisen. Bovendien kunnen centrifugatiebuizen met dichtheidsgradiënt kostbaar zijn om te verkrijgen, vooral als er een groot aantal monsters moet worden verzameld.

Alternatieve methoden voor het verzamelen van PBMC zijn onder meer het gebruik van een medium met vloeistofdichtheidsgradiënt of immunomagnetische depletie28,29. In het kort houdt de eerste in dat een vooraf gemaakt dichtheidsgradiëntmedium onder gehepariniseerd volbloed wordt gelegd, gevolgd door centrifugeren. De laatste gebruikt magnetisch gelabelde antilichamen om niet-PBMC's te labelen, die vervolgens in een magnetische kolom worden vastgehouden terwijl niet-gelabelde PBMC's onaangetast passeren.

Ten opzichte van het gepresenteerde protocol is het gebruik van een vloeistofdichtheidsgradiëntmedium zowel goedkoper als veel minder materiaal nodig vanwege het ontbreken van dichtheidsgradiëntcentrifugatiebuizen; PBMC-isolatie kan worden uitgevoerd in een standaard buis van 50 ml8. Deze techniek is echter uitgebreider, heeft een langere verwerkingstijd en kan onderhevig zijn aan een hoger risico op gebruikersfouten. Heparine moet nauwkeurig worden toegevoegd om oververdunning te voorkomen en het dichtheidsgradiëntmedium moet zorgvuldig in de juiste hoeveelheden worden gelaagd om een goede PBMC-scheiding te garanderen26.

Ten opzichte van het gepresenteerde protocol biedt het gebruik van immunomagnetische depletie een hogere opbrengst en zuiverheid, minder hantering door gebrek aan centrifugeren, een snellere verwerkingstijd en is er veel minder materiaal nodig 30,31,32. Het belangrijkste nadeel is echter dat deze methode de duurste is van de drie beschreven methoden, vooral op schaal.

Hoewel dit protocol robuust is, kunnen bepaalde kritieke stappen extra aandacht vereisen. Zorg er gedurende het hele protocol voor dat monsters niet worden gemengd en in de correct geëtiketteerde buisjes worden geplaatst, vooral wanneer met meerdere patiënten of aandoeningen tegelijk wordt gewerkt. Zorg er voor stap 1.4 voor dat er geen PBMC's worden weggegooid; overtollig plasma zal alleen de concentratie van PBMC's verlagen, wat minder cruciaal is voor het behoud van de levensvatbaarheid en kwaliteit van het monster. Los daarvan suggereert de aanwezigheid van precipitaten in verzamelde PBMC's dat stukken van het dichtheidsgradiëntmedium zijn losgeraakt. Pipeteer voorzichtiger in stap 1.5 om dit probleem te voorkomen. Zorg er in de stappen 1.10 en 3.6 voor dat de gecentrifugeerde celpellet niet wordt weggegooid. Snel werken is van cruciaal belang voor stap 1.12 en 3.3, aangezien oplossing 3 DMSO bevat, dat bij kamertemperatuur giftig is voor cellen33. Het is ook belangrijk op te merken dat opslag van PBMC's in vloeibare stikstof wordt aanbevolen boven opslag bij -80°C. Langdurige opslag bij -80°C is in verband gebracht met verminderde cellevensvatbaarheid en veranderde genexpressie 34,35.

Dit protocol kan worden aangepast aan de experimentele behoeften. De toevoeging van flavopiridol, een remmer van RNA-polymerase en mRNA-synthese, in oplossingen 2 en 3 is bedoeld om elk hanterings- en stressgeïnduceerd artefact met RNA-sequencing te voorkomen36. flavopiridol kan echter worden weggelaten als functionele of ex vivo studies met behulp van PBMC's gewenst zijn.

Plasma dat uit EDTA-buisjes wordt verzameld, raakt besmet met EDTA, een chelaatvormer. Als gevolg hiervan is EDTA-plasma ongeschikt voor tests met coagulatie of calciumionen 37,38. Indien gewenst kan in plaats daarvan in stap 1.4 de plasmalaag in de dichtheidsgradiënt mediumbuizen na het centrifugeren worden verzameld. Deze buisjes bevatten natriumheparine als antistollingsmiddel dat kan worden verwijderd met toevoeging van heparinase39. Met name heparine remt reverse transcriptase en PCR-amplificatie, waardoor het verzamelde plasma ongeschikt is voor PCR-experimenten zonder de toevoeging van een heparineblokker40.

De verzamelde buffy coat uit EDTA-tubes wordt niet bewaard in een oplossing die DMSO of flavopiridol bevat. DMSO is belangrijk bij het verminderen van ijskristalvorming en celdood41. Flavopiridol is belangrijk voor de remming van de RNA-synthese36. De buffy coat is dus ongeschikt voor ex vivo en transcriptomische analyses. Indien gewenst kunnen stappen 1.6 tot 1.15 worden uitgevoerd met behulp van verzamelde buffy coat om de levensvatbaarheid van de cellen te maximaliseren en de RNA-synthese te remmen.

Hoewel dit protocol is ontworpen voor RNA-sequencing, omvatten andere mogelijke toepassingen van PBMC's die met behulp van dit protocol zijn verzameld en gecryopreserveerd, onder meer celcultuur, genbewerking, ex-vivo functionele studies, analyses van individuele cellen, fenotypering door flowcytometrie of cytometrie op basis van vluchttijd, isolatie van DNA/RNA of eiwitten, objectglaasjes voor immunohistochemie, onder andere.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen de patiënten bedanken die vrijwillig hun toestemming, tijd en donatie van bloedmonsters hebben gegeven. We erkennen ook Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton en Mark McClellen van het Kansas University Medical Center voor hun samenwerking en voor het implementeren van dit protocol op een afgelegen locatie. CY heeft onderzoeksondersteuning ontvangen van NIH-subsidie 1K08HL150271.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1000 µL TipsGilsonF174501Ongeveer 3 tips nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
15 mL buisBiopioneeerCNT-15Om oplossingen 2/3 te houden
2 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Ongeveer 40 cryovials nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
20 µL TipsGilsonF174201Voor gebruik in celtelling; benodigd volume is afhankelijk van de gebruikte methode voor celtelling. 1 tip is nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
50 mL Conische buisCEM Corporation50-187-76832 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
3 nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
CD14 AntilichaamBiolegend325621
CD16 AntilichaamBiolegend360723
CD19 AntilichaamBiolegend363007
CD3 AntilichaamBiolegend300405
CD56 AntilichaamBiolegend318303
CD66b AntilichaamBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
CPT Mononuclear Cell Preparation TubeBD Biosciences3627536 buizen nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Houdt 81 buizen
1 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Houdt tot 50 cryovials
DMSOInvitrogen15575020Ongeveer 2,5 mL nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
DNase/RNase-Free Gedistilleerd WaterInvitrogen10977015Ongeveer 2 mL nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Ongeveer 9 mL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
EDTA BuizenBD Biosciences3666431 buis nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntilichaamBiolegend307609
Human Serum AlbumineGeminiBio800-120Ongeveer 25 mL nodig per patiënt of behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KVoor gebruik in Mr. Frosty
Label PrinterPhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Houdt tot 18 buizen.
2 Mr. Frosty's nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Multidispense PipetteBrandtech705110
Multidispense Pipette TipsBrandtech705744Ongeveer 3 tips nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
P1000 PipetteGilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MVoor gebruik in celtelling; benodigd volume is afhankelijk van de gebruikte methode voor celtelling.
Printer LabelsPhomemoPM-M110-3020Ongeveer 45 labels nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Ongeveer 5 labels nodig per 1 mL van niet-gepoolde bevroren PBMC's om te ontdooien
RNase-Free EDTA (0,5 M)InvitrogenAM9260GOngeveer 40 µL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Ongeveer 1 mL nodig per 1 mL van bevroren PBMC's om te ontdooien
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVOngeveer 80 mL nodig per patiënt of behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Transfer PipettesFisherbrand13-711-7MOngeveer 5 nodig per patiënt/behandelingsconditie voor PBMC/Plasma/Buffy Coat Collectie
Tube HolderEndicott-Seymour14-781-15Houdt tot 80 CPT/EDTA Buizen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van PBMC sdichtheidsgradi ntcentrifugatiecryoconservering van cellenbuffycoatEDTA plasmaflowcytometrieRNA sequencingcelviabiliteitmonocytensortering

Gerelateerde artikelen