Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vitro modellering van vetafzetting bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft het gebruik van door oliezuur geïnduceerde HepG2-cellen als model voor metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte.

Samenvatting

De prevalentie van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) is sterk gestegen als gevolg van veranderingen in economische en levensstijlpatronen, wat heeft geleid tot aanzienlijke gezondheidsuitdagingen. Eerdere rapporten hebben de opstelling van dier- en cellulaire modellen voor MASLD bestudeerd, waarbij de verschillen tussen hen werden benadrukt. In deze studie werd een cellulair model gemaakt door vetophoping in MASLD te induceren. HepG2-cellen werden gestimuleerd met het onverzadigde vetzuur oliezuur in verschillende concentraties (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) om MASLD na te bootsen. De werkzaamheid van het model werd beoordeeld met behulp van celtelling kit-8-assays, Oil Red O-kleuring en analyse van het lipidengehalte. Deze studie was gericht op het creëren van een eenvoudig te bedienen cellulair model voor MASLD-cellen. Resultaten van de celtelling kit-8-assays toonden aan dat de overleving van HepG2-cellen afhankelijk was van de concentratie van oliezuur, met een GI50 van 1.875 mM. De levensvatbaarheid van de cellen in de groepen van 0,5 mM en 1 mM was significant lager dan die in de controlegroep (P < 0,05). Bovendien werd met Oil Red O-kleuring en analyse van het lipidengehalte de vetafzetting bij verschillende oliezuurconcentraties (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) op HepG2-cellen onderzocht. Het lipidengehalte van de groepen 0,25 mM, 0,5 mM en 1 mM was significant hoger dan dat van de controlegroep (P < 0,05). Bovendien waren de triglyceridenspiegels in de OA-groepen significant hoger dan die in de controlegroep (P < 0,05).

Inleiding

Metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD) omvat een reeks aandoeningen, waaronder eenvoudige steatose, niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), cirrose en hepatocellulair carcinoom 1,2,3,4,5,6, allemaal toegeschreven aan andere factoren dan alcoholconsumptie7. MASLD is de meest voorkomende leverziekte die wordt veroorzaakt door metabole leverbeschadiging en treft bijna een kwart van de wereldbevolking 8,9,10,11,12. Hoewel de precieze pathogenese van MASLD nog niet is opgehelderd, proberen verschillende theorieën de ontwikkeling ervan te verklaren. Een overheersende opvatting suggereert een afwijking van de klassieke "two-hit"-theorie in de richting van een "multiple-hit"-model1. Centraal in deze hypothesen staat de rol van insulineresistentie, waarvan wordt aangenomen dat deze cruciaal is in de pathogenese van MASLD13. Onderzoek wijst uit dat insulineresistentie in hepatocyten leidt tot verhoogde niveaus van vrije vetzuren, waardoor triglyceriden worden gevormd die in de lever worden opgeslagen14,15.

Onderzoekers hebben zowel in vivo als in vitro modellen gebruikt om vetafzetting in MASLD te simuleren; Toch blijft het een uitdaging om het pathomechanisme volledig te repliceren. Ondanks deze beperking hebben deze modellen een belangrijke rol gespeeld bij het bestuderen van potentiële therapeutische doelen voor MASLD. De ontwikkeling van een stabiel model van MASLD is echter cruciaal. Hoewel diermodellen effectief zijn, zijn ze tijdrovend en duur, wat de groeiende belangstelling voor in vitro cellulaire modellen benadrukt. Deze modellen gebruiken vaak enkelvoudige of meervoudige vrije vetzuren zoals oliezuur (OA) en palmitinezuur om door voeding geïnduceerde MASLD na te bootsen. Hiervan wordt de menselijke hepatoblastoomcellijn HepG2 vaak gebruikt om in vitro cellulaire modellen van MASLD op te stellen.

OA-inductie stimuleert HepG2-cellen om vetafzetting te repliceren, vergelijkbaar met MASLD, een methode met een gevestigde geschiedenis. Het doel van deze studie was om de levensvatbaarheid, Oil Red O (ORO)-kleuring, lipidengehalte en triglyceridenniveau (TG) aan te tonen van HepG2-cellen die werden behandeld met 0,25 mM OA. Het doel van dit experiment was om verder bewijs te leveren voor de ontwikkeling van MAFLD-modelleringsstudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.

1. Celcultuur

  1. Kweek HepG2-cellen in kweekkolven die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevatten (met 10% foetaal runderserum [FBS], 100 eenheden/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine). Houd de kweekkolven op 37 °C in een incubator van 5% CO2 .

2. Effect van oliezuur op de levensvatbaarheid van cellen zoals gemeten door celtelling kit-8

  1. Los een bepaald volume OA op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een concentratie van 200 mM te bereiken. Bewaar de oplossing bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
  2. Zaad HepG2-cellen in een plaat met 96 putjes bij een celdichtheid van 6 × 103 cellen per putje. Voeg 100 μL DMEM toe aan elk putje. Incubeer en kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator gedurende 24 uur. Verdeel de HepG2-cellen in twee groepen:
    1. Controlegroep: celkweekmedium toevoegen.
    2. OA-groep: voeg OA toe aan het celkweekmedium om eindconcentraties van 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM en 1 mM te bereiken.
  3. Gooi na 24 uur na de eerste incubatie het supernatans uit elk putje weg en voeg artrose toe volgens de gespecificeerde groepering, waarbij 100 μl per putje wordt toegevoegd. Voeg voor de controlegroep 100 μL celkweekmedium toe aan elk putje. Ga nog 24 uur door met het incuberen van de cellen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat elke groep zes replicatieputten heeft. Om verdamping te voorkomen, voegt u 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de buitenste ring van putjes in de plaat met 96 putjes.
  4. Voeg na 24 uur incubatie 10 μL celtelkit-8 (CCK-8) toe aan elk putje, meng voorzichtig en incubeer gedurende 2 uur in het donker. Haal de plaat met 96 putjes uit de incubator, plaats deze in de microplaatlezer en meet de absorptiewaarde bij 450 nm (A450). De GI50 waarden werden geteld volgens de OD.

3. Olie Rode O-kleuring om intracellulaire vorming van lipidedruppeltjes te observeren

  1. Zaad HepG2-cellen in celkweekplaten met 6 putjes met een dichtheid van 5 × 105 cellen per putje en kweek de platen gedurende 24 uur in een incubator met constante temperatuur. Zie afbeelding 1 voor een visuele weergave van de beschreven stappen.
  2. Voeg na 24 uur celkweek 2 ml celkweekmedium met artrose toe aan elk putje, zodat eindconcentraties van 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM en 1 mM worden bereikt. Verwijder na nog eens 24 uur het celkweekmedium uit elk putje en was het twee keer met PBS. Voeg 1 ml ORO fixeermiddel toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten.
  3. Bereid de ORO-kleuroplossing voor door kleuringsoplossing A te mengen met kleuringsoplossing B in een verhouding van 3:2. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur staan en filtreer het vervolgens één keer door een filter van 0,45 μm. Bewaar de gefilterde oplossing tot gebruik in een centrifugebuisje dat beschermd is tegen licht.
  4. Gooi het fixeermiddel weg en was het twee keer met gedestilleerd water. Voeg 1 ml 60% isopropanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 s. Gooi 60% van de isopropanoloplossing weg en voeg 1 ml vers bereide ORO-kleuroplossing toe aan elk putje voordat u het 20 minuten incubeert. Gooi de ORO-kleuringsoplossing weg, voeg 1 ml 60% isopropanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 s. Was 5x met water om overtollige kleurstof te verwijderen.
  5. Bedek de cellen met gedestilleerd water en observeer onder een microscoop. Zodra de afbeeldingen zijn verzameld, gooit u de vloeistof in de plaat weg en laat u deze drogen. Voeg vervolgens 2 ml isopropanol toe aan elk putje en schud de plaat gedurende 10 minuten op een orbitale shaker. Breng de vloeistof over naar een nieuwe plaat met 96 putjes, met 16 putjes in elke groep, waarbij 100 μL per putje wordt toegevoegd. Bereken het lipidengehalte door de optische dichtheid (OD) van elk putje te meten met behulp van een microplaatlezer bij 510 nm (A510).

4. Effecten van verschillende concentraties oliezuur op totaal triglyceriden in HepG2-celsupernatans

  1. Breng de kit 20 minuten op kamertemperatuur in evenwicht en bereid de benodigde platen voor het experiment voor.
  2. Verzamel het celsupernatans en centrifugeer bij 1.570 × g gedurende 10 minuten. Stel standaardputten in en testmonsterputjes. Voeg 50 μl standaardconcentratie ([S0 → S5] concentratie gevolgd door: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/l) toe aan standaardputjes. Voeg naast de lege en standaardputjes 10 μl verschillende monsters toe aan de monsterputjes, gevolgd door 40 μl monsterverdunningsmiddel aan elk putje. Voeg 100 μL detectie-antilichaam-mierikswortelperoxidase toe aan elk putje, sluit af met een plaatmembraan en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur in een oven met constante temperatuur.
  3. Gooi het bovenliggende weg, dep droog op stofvrij papier en was elk goed met 1x wasoplossing. Laat 1 minuut op kamertemperatuur staan. Herhaal het wasproces 5x.
  4. Voeg 50 μL substraat A en 50 μL substraat B toe aan elk putje. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten op 37 °C. Voeg 50 μL afsluitoplossing toe aan elk putje en meet de OD-waarde van elk putje bij 450 nm (A450) binnen 15 minuten.
  5. Plot de concentratie van de standaard langs de x-as en de bijbehorende absorptiewaarde (OD) langs de y-as om lineaire regressie uit te voeren en leid de curvevergelijking af om de concentratiewaarde van elk monster te berekenen.

5. Statistische analyse

  1. Bepaal significante verschillen in kwantitatieve gegevens.
  2. Bereken het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en geef de gegevens grafisch weer. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Effect van oliezuur op de levensvatbaarheid van cellen
HepG2-cellen werden blootgesteld aan variërende concentraties artrose (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), wat resulteerde in een afname van de celoverlevingspercentages bij 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM en 1 mM in vergelijking met 0 mM. Statistische significantie werd waargenomen bij 0,5 mM (P < 0,05) en 1 mM (P < 0,05) in vergelijking met 0 mM. De resultaten van de impact van artrose op de levensvatbaarheid van cellen, zoals be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MASLD is een klinisch-pathologisch syndroom dat wordt gekenmerkt door overmatige intracellulaire vetafzetting in hepatocyten als gevolg van factoren die verder gaan dan alcohol en andere gevestigde leverbeschadigende stoffen18. MASLD is nauw verbonden met verworven metabole stress leverbeschadiging, met name geassocieerd met insulineresistentie en genetische vatbaarheid. Om geneesmiddelen effectief te bestuderen en te screenen op MASLD, is het van cruciaal belang om een geschikt experimenteel mode...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De huidige studie werd toegekend door "Studie over de belangrijkste kwesties van het genezende effect van Koumiss op regionale ziekten van de Mongoolse geneeskunde" in 2018 Ondersteund project van het wetenschaps- en technologieprogramma van het ministerie van Wetenschap en Technologie van de autonome regio Binnen-Mongolië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm filterMillex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µm filterMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 Cell Culture FlaskCORNING430639
6-well cell culture plateCORNING3516
96-well cell culture plateCORNING3599
Blood Count PlateShanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.02270113
Cell Counting Kit-8 assaysBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. CA1210-1000T
CO2 incubatorNUAIRENU-5710E
 DMSO Dimethyl sulfoxide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum, QualifiedGibco10099141
HepG2 cells lineBeijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instructionNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Inverted Microscope for Cell CultureLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured CellsBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. G1262
Oleic acid Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A502071
Penicillin StreptomycinGibco15140122
SPSS 24.0Statistics software

Referenties

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072(2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238(2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476(2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536(2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494(2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541(2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

metabool disfunctionele levervetdepositie-modelHepG2-cellenoleïnezuurstimulatieOil Red O-kleuringlipidengehalteanalysetriglyceride-metingcelviabiliteitsassayin vitro MASLD
In vitro modellering van vetafzetting bij metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.