Geavanceerde modellering van abdominale aorta-aneurysma's bij muizen door combinatie van topisch elastase en oraal ß-aminopropionitril

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methodische chirurgische benadering voor het modelleren van geavanceerde abdominale aorta-aneurysma's bij muizen door een combinatie van het rechtstreeks aanbrengen van elastase op de infrarenale aorta en het toedienen van ß-aminopropionitril via drinkwater.

Samenvatting

Het topische elastase-muizenmodel van abdominaal aorta-aneurysma (AAA) wordt verbeterd wanneer het wordt gecombineerd met met ß-aminopropionitril (BAPN) aangevuld drinkwater om op betrouwbare wijze echte infrarenale aneurysma's te produceren met gedrag dat menselijke AAA's nabootst. Het plaatselijk aanbrengen van elastase op de adventitia van de infrarenale aorta veroorzaakt structurele schade aan de elastische lagen van de aortawand en initieert aneurysmale dilatatie. Gelijktijdige toediening van BAPN, een lysyloxidaseremmer, bevordert aanhoudende wanddegeneratie door crosslinking van collageen en elastine te verminderen. Deze combinatie resulteert in grote AAA's die geleidelijk uitzetten, intraluminale trombus vormen en kunnen scheuren. Het verfijnen van chirurgische technieken, zoals het omtrekselijk isoleren van het gehele infrarenale aortasegment, kan helpen de procedure te standaardiseren voor een consistente en grondige toepassing van varkenspancreaselastase, ondanks verschillende operators en anatomische variaties tussen muizen. Daarom is het elastase/BAPN-model een verfijnde benadering voor het chirurgisch induceren van AAA bij muizen, die menselijke aneurysma's beter kan recapituleren en extra mogelijkheden biedt om de groei van aneurysma's en het risico op scheuren te bestuderen.

Inleiding

Een aneurysma wordt gedefinieerd als een pathologische verwijding van een bloedvat van meer dan 50% van de gezonde vaatdiameter¹. Ondanks dat abdominale aorta-aneurysma's (AAA) een veel voorkomende aandoening zijn bij de vergrijzende bevolking, met een incidentie van ongeveer >5% van de mannen > de leeftijd van 65 jaar, zijn er geen gerichte therapeutische strategieën voor de behandeling van AAA¹. De huidige behandeling van AAA is beperkt tot het verminderen van risicofactoren en chirurgisch herstel met open of endovasculaire chirurgie op basis van aortadiameter of groeisnelheid². Het grootste gevaar van AAA is een aneurysmaruptuur, die dodelijk is als het niet wordt behandeld, en reparatie in deze opkomende omgeving kan sterfterisico's van meer dan 90% met zich ^meebrengen1.

De pathofysiologie van AAA is gecompliceerd, multifactorieel en niet volledig begrepen³. Kenmerken van menselijke AAA zijn onder meer echte aneurysmale dilatatie van de aortawand met een infiltratie van ontstekingscellen, de aanwezigheid van intraluminale trombus en progressieve dilatatie die leidt tot uiteindelijke ruptuur ^3,4. Bovendien worden AAA's geassocieerd met een hoge leeftijd, hebben ze een 9:1 man:vrouw geslachtsoverwicht en komen ze meestal voor in de infrarenale aorta⁵. Het modelleren van alle kenmerken en gedragingen van menselijke AAA's bij dieren blijft een voortdurende uitdaging⁶.

De huidige AAA-modellering wordt voornamelijk uitgevoerd bij muizen en aneurysma's worden vaak geïnduceerd met behulp van een van de drie methoden: door angiotensine II (AngII) infusie via een subcutaan geïmplanteerde osmotische pomp en door directe toepassing van calciumchloride (CaCl₂) of elastase op de aorta⁷. Bij de laatste methode wordt varkenspancreaselastase (PPE) aangebracht op een segment van de infrarenale aorta en veroorzaakt enzymatische afbraak van elastinevezels in de elastische lamel van de tunica media. Deze structurele schade resulteert in de verzwakking van de aortawand en naar buiten gerichte aneurysmale dilatatie. Het gebruik van topische elastase alleen produceert echter relatief kleine infrarenale aneurysma's, die in de loop van de tijd niet geleidelijk groter worden of scheuren. Meer recentelijk verbeterden Lu et al. dit model door extra β-aminopropionitril (BAPN), een onomkeerbare remmer van lysyloxidase, toe te dienen aan hun met elastase behandelde muizen⁸. Door de verknoping van elastine- en collageenvezels te voorkomen, zorgt BAPN-suppletie ervoor dat door elastase beschadigde aorta's geleidelijk verwijden tot het punt van scheuren. Het elastase/BAPN-model heeft bovendien een hogere incidentie van AAA dan het topische elastasemodel, en de geproduceerde aneurysma's zijn ook groter en bevatten intraluminale trombus⁸.

In het elastase/BAPN-model kan de mate van chirurgische dissectie en blootstelling van de aorta aan elastase van invloed zijn op het succes en de reproduceerbaarheid van dit model. In dit manuscript beschrijven we dat gelijktijdige toediening van BAPN-drinkwater en topische toediening van elastase op de aorta na omtreksisolatie van het gehele infrarenale aortasegment de reproduceerbaarheid verbetert, rekening houdt met anatomische verschillen tussen dieren en resulteert in een grotere AAA-inductiesnelheid, aneurysmagroottes en ruptuurincidentie. In dit artikel beschrijven we een gestandaardiseerde aanpak voor het betrouwbaar induceren van geavanceerde abdominale aorta-aneurysma's bij muizen met behulp van een combinatie van topisch elastase en BAPN-aangevuld water.

Protocol

Dierprotocollen zijn goedgekeurd door de University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (M005792).

1. Onderhoud van dieren

1. Voed muizen op met standaard onderhoudsvoer. Gebruik volwassen muizen of jongvolwassen muizen (8-12 weken oud).
   OPMERKING: Het gebruik van volwassen dieren zorgt ervoor dat de dieren volledig volwassen zijn en beperkt de kans dat veranderingen in de aortadiameter verband houden met de groei van het dier. Voor deze studie gebruikten we mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen van 22-24 weken oud op het moment van de operatie. Lu en collega's zagen geen significante verschillen in de aneurysmale respons tussen jongere en oudere muizen⁸. Bovendien, terwijl de meeste aneurysmamodellering wordt uitgevoerd bij mannelijke muizen, induceert dit model met succes AAA's bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen⁹.
2. Bepaal de duur van het onderzoek en wijs de dieren toe aan behandelings- of schijngroepen (controlegroepen). Dien 0,2% BAPN-drinkwater toe aan muizen uit de behandelingsgroep en onderwerp ze aan een operatie met plaatselijke toepassing van actieve elastase op de infrarenale aorta. Dien onbehandeld water toe om dieren onder controle te houden en onderwerp ze aan een operatie met de toepassing van gedenatureerde elastase op de infrarenale aorta.

2. Start van met B-aminopropionitril (BAPN) aangevuld drinkwater

1. Start twee dagen voor de operatie de behandeling muizen op 0,2% BAPN drinkwater. Bereid BAPN-water in grotere hoeveelheden en bewaar het maximaal 28 dagen in het donker bij 4 °C. Zorg ervoor dat het BAPN-water op kamertemperatuur is voordat u het aan de muizen geeft.
   OPMERKING: We raden aan om BAPN-water in kooien elke 7 dagen te vervangen gedurende de duur van het onderzoek.

3. Dag van de voorbereiding van het operatiemateriaal

1. Snijd chirurgische handschoenen in stroken van 5 mm x 10 mm, die later zullen worden gebruikt om de aorta te isoleren voordat ze met elastase worden behandeld. Bereid een chirurgisch laken voor door een ovaal van ~ 1,5 cm x 3 cm in het midden van een chirurgisch laken te knippen. Vouw het gaas van 2 x 2 inch open en snijd het doormidden om stroken gaas van ongeveer 2,5 cm x 10 cm te maken die later kunnen worden gebruikt voor het intrekken van de buikinhoud. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten (zie de Tabel met Materialen) en richt een steriel chirurgisch veld in zoals weergegeven in het voorbeeld in Figuur 1.

Figuur 1: Voorbeeld van de opstelling van de steriele chirurgie ter voorbereiding op het elastase/BAPN-muizenmodel van AAA. Afkortingen: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominaal aorta-aneurysma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereid een postoperatieve herstelkooi voor door een schone kooi onder een warmtelamp te plaatsen en een zoutoplossing in de buurt van de lamp te plaatsen om op te warmen tot lichaamstemperatuur (37 °C). Zorg ervoor dat de warmtelamp veilig is geplaatst, zodat de herstelkooi en de zoutoplossing warm zijn, maar niet hoger zijn dan 37 °C. Zet de waterpomp aan om warm water door het verwarmingskussen te laten circuleren.

4. Voorbereiding van dieren op een operatie

1. Plaats de muizen in een inductiekamer en verdoven ze met 5% isofluraan bij 200 ml/min met behulp van een elektronische verdamper met een laag debiet. Weeg tijdens de verdoving elke muis en dien subcutaan 0,6 mg/kg buprenorfine ER en 20 mg/kg carprofen toe voor analgesie. Gebruik elektrische tondeuses om de vacht op de buik te knippen, van de onderbuik tot de inferieur van het xyfoïde proces. Gebruik een gaasje of een laboratoriumdoekje om overtollig haar weg te borstelen. Breng de muizen terug naar hun kooi en wacht ten minste 20 minuten totdat de analgesie effect heeft voordat u doorgaat met de operatie.
2. Na ten minste 20 minuten sinds de analgesie is toegediend, plaatst u de muis in een anesthesie-inductiekamer en dient u opnieuw 5% isofluraan toe met 200 ml/min met behulp van een elektronische verdamper met laag debiet totdat de muis verdoofd is.
3. Haal de verdoofde muis uit de inductiekamer en plaats deze op uw rug op het operatieveld. Breng ooggel aan en zet de neuskegel vast met chirurgische tape. Verminder de toegediende geïnhaleerde isofluraan tot een onderhoudspercentage van 1-2% bij 50 ml/min. Zet de voor- en achterpoten van de muis vast met chirurgische tape.
4. Onderzoek de onderbuik van de muis op zoek naar de blaas. Oefen voorzichtig externe druk uit op de blaas tussen duim, wijs- en middelvinger om urineren op te wekken; Gebruik ondertussen een gaasje om de urine weg te zuigen.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat u het operatieveld niet besmet.
5. Begin met het desinfecteren van de buik door een scrub op basis van jodium of chloorhexidine en 70% alcohol met wattenstaafjes aan te brengen. Begin in het midden van de buik en werk 3x in een cirkelvormige beweging naar buiten. Laat het gebied tussen het aanbrengen door kort drogen.
6. Controleer of er geen teenknijpreactie is om er zeker van te zijn dat de anesthesie voldoende is. Zorg ervoor dat de neuskegel en ledematen goed vastzitten. Plaats een chirurgisch laken over de muis, met de opening direct boven de chirurgisch geprepareerde buik.
   OPMERKING: Sleep het laken niet over de muis om mogelijke besmetting te voorkomen.

5. Chirurgische inductie van AAA

1. Het betreden van de buikholte:
   1. Was de handen en draag schone nitril of steriele chirurgische handschoenen. Voordat u in contact komt met het operatieveld, moet u altijd de handschoenen met 70% EtOH inspuiten en de gehandschoende handen tegen elkaar wrijven tot ze droog zijn.
   2. Gebruik een stompe tang om de huid in de buik van de middellijn te tenten. Gebruik een chirurgische schaar om een kleine inkeping in de huid te maken en verleng vervolgens de incisie in de lengterichting, ongeveer 2-3 cm lang.
   3. Gebruik een tang om de rectusspieren op te tillen om de doorschijnende linea alba te identificeren. Gebruik een schaar om de buikholte binnen te gaan via de linea alba en verleng vervolgens proximaal en distaal langs de linea alba.
2. Blootleggen van de abdominale aorta:
   1. Bevochtig een strook gaas en twee wattenstaafjes met wattenstaafjes met verwarmde zoutoplossing. Maak een buikrol door het ene uiteinde van het gaas halverwege strak op te rollen, zodat er een royale staart overblijft.
   2. Gebruik een huidretractor om de rechter buikwand in te trekken.
   3. Voer met behulp van bevochtigde wattenstaafjes een rechts-mediale viscerale rotatie uit door de dunne en dikke darm voorzichtig naar het linker bovenste kwadrant te vegen en de aorta en inferieure vena cava (IVC) te visualiseren. Gebruik een buikrol om de darm uit het zicht terug te trekken - stop het opgerolde uiteinde van het gaas onder de darm en breng het uiteinde vervolgens rond en uit het lichaam om de darm voorzichtig in te bakeren. Oefen lichte spanning uit op de staart van het gaas om de darm uit het gezichtsveld te houden. Pas de buikrol en huidretractor aan om een optimaal zicht op de retroperitoneale organen te krijgen, zoals weergegeven in figuur 2A.
      OPMERKING: De buikrol helpt de darm vochtig te houden en te voorkomen dat deze per ongeluk wordt beschadigd door chirurgische instrumenten. Zorg ervoor dat het gaasje tijdens de procedure vochtig blijft om te voorkomen dat de darm uitdroogt. Zorg ervoor dat u de darm niet met kracht terugtrekt, omdat dit knikken van de superieure mesenteriale slagader en darmvasculatuur kan veroorzaken, wat mogelijk ischemische schade kan veroorzaken. Bovendien moet u bij het eerste vegen van de dunne darm voorzichtig zijn met een dunne doorschijnende aanhechting tussen de dikke darm en de inferieure lever (hepatocolisch ligament), die, als u niet voorzichtig bent, gemakkelijk het leverkapsel kan afscheuren en bloedingen kan veroorzaken. Als er tijdens het intrekken spanning op dit ligament staat, verdeel het dan scherp met een schaar.

Figuur 2: Weergave van abdominale retractie en het optimale chirurgische beeld voor blootstelling van de infrarenale aorta van de muis. (A) Het plaatsen van een gaasrol in de buik helpt de intra-abdominale organen terug te trekken, terwijl een tegenoverliggende retractor helpt bij het visualiseren van het retroperitoneum. Een steriel chirurgisch laken (transparant om de oriëntatie van het dier aan te geven) wordt over het verdoofde dier geplaatst om de steriliteit te behouden. (B) De retroperitoneale fascia (groene doos) bedekt de aorta anterieur. (C) Voorbeeld van de infrarenale aorta na dissectie van de retroperitoneale fascia. Isolatie van de aorta van de IVC kan worden bereikt door te beginnen bij een potentiële ruimte tussen de aorta en IVC die zich net distaal van de linker nierader bevindt terwijl deze naar voren kruist (gele cirkel). Afkorting: IVC = inferieure vena cava. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Omtrekdissectie en isolatie van de infrarenale aorta:
   1. Bevestig dat de IVC en de infrarenale aorta volledig in beeld zijn. Begin met het blootleggen van de aorta door eerst de retroperitoneale (RP) fascia binnen te gaan en te verdelen (Figuur 2B). Identificeer de gonadale (testiculaire of eierstok) slagaders die parallel lopen langs de voorste infrarenale aorta (Figuur 2B en Figuur 3). Gebruik een tang om de fascia botweg tussen de gonadale slagaders te verdelen en ga in de lengterichting door om de aorta naar voren bloot te leggen (Figuur 2C).
      OPMERKING: De RP-fascia is een dunne, doorschijnende laag bindweefsel die lymfevaten en de splanchnische plexus bevat. Het is noodzakelijk om door de RP-fascia te ontleden om de aorta bloot te leggen. Ontleed echter niet door het bindweefsel van de aorta-adventitia. Een scheur in de adventitia (wit bindweefsel) zal de media blootleggen (lijkt helderrood) en de aorta zal waarschijnlijk op deze plaats scheuren zodra elastase is aangebracht.
   2. Begin vervolgens met het isoleren van de abdominale aorta van de IVC. Begin deze dissectie bij een kleine opening tussen de IVC en de aorta, net onder de onderrand van de linker nierader terwijl deze de aorta kruist (Figuur 2C). Gebruik de punten van een tang om de bindweefselvezels tussen de aorta en IVC voorzichtig uit elkaar te spreiden en blijf op dit niveau in de omtrek rond de aorta werken.
      OPMERKING: De IVC is zeer dunwandig en hecht nauw aan de aorta door een fijn laagje vezelig bindweefsel. Zorg ervoor dat u de IVC zoveel mogelijk vermijdt om de IVC aan te raken of schoon te maken. Door eerst de rechterkant van de aorta van de IVC te ontleden (voordat de linkerkant van de aorta van de omliggende spieren wordt ontleed) kan de aorta "wegvallen" van de IVC.
   3. Ga botweg door met het ontleden van het vlak tussen de aorta en IVC en werk caudaal naar de aorta-vertakking toe. Stop verdere distale dissectie zodra de aorta-bifurcatie is bereikt.
      OPMERKING: Neem extra voorzorgsmaatregelen bij het ontleden rond de inferieure mesenteriale slagader (IMA), die zich meestal in de buurt van het middengedeelte van de infrarenale aorta bevindt en lateraal over de IVC loopt.
   4. Zodra de rechterrand van de aorta is gescheiden van de IVC, keert u proximaal terug naar het niveau van de linker nierader. Ontleed de RP-fascia van de laterale linkerrand van de aorta en werk rondom totdat de aorta volledig geïsoleerd is. Zie figuur 3 voor de relevante anatomie van de retroperitoneale dissectie.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het ontleden achter de aorta, aangezien er een grote variabiliteit is in de locatie en het aantal lumbale aders en slagaders. Zie figuur 4 voor referentie van gebieden met een hoog risico op bloedingen bij deze dissectie.
   5. Inspecteer zorgvuldig of de aorta zoveel mogelijk rondom geïsoleerd is van de IVC en de omliggende spieren, met zorgvuldige dissectie rond de aortasegmenten die zijn vastgemaakt door de IMA en lumbale slagaders.
   6. Plaats een strook handschoen langs de rechter- en linkerrand van de aorta, zoals weergegeven in figuur 5A. Probeer zoveel mogelijk van de IVC te behandelen.
   7. Gebruik een handschuifmaat om de breedste aortadiameter te meten en noteer drie metingen. Spuit de punten van de remklauwen in met 70% EtOH voor en na metingen. Vermijd direct contact met de aorta met de punten van de schuifmaat om besmetting te voorkomen.
      OPMERKING: Foto's met een gekalibreerde microscoop die geschikt is voor een camera kunnen ook worden gebruikt.

Figuur 3: Anatomie van de bloedtoevoer naar de onderbuik, het bekken en het retroperitoneum van de muis. Afkortingen: R = rechts; L = links. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Plaatsen met een hoog risico op letsel en bloeding tijdens de retroperitoneale dissectie en omtrekisolatie van de infrarenale aorta. Afkortingen: L = links; IMA = inferieure mesenteriale slagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Intraoperatieve reacties op het aanbrengen van elastase of schijnvertoning tijdens het elastase/BAPN-muizen AAA-model. (A) Segmenten van de handschoen worden langs de lengte van de aorta geplaatst voorafgaand aan het aanbrengen van elastase om de IVC en darm te helpen beschermen tegen blootstelling aan elastase, terwijl de aorta doordrenkt blijft met elastase (B) Toepassing van gedenatureerde elastase veroorzaakt geen verwijding van de aorta (blauwe doos). De maximale diameter van de aorta bedroeg 0,627 mm bij aanvang en vervolgens 0,607 mm na 5 minuten topisch gedenatureerd elastase. (C) Toepassing van elastase veroorzaakt aortadilatatie na 5 minuten behandeling. In dit voorbeeld is de aorta (groen) verwijd van 0,607 mm naar 0,953 mm, een toename van 57% in diameter. Afkortingen: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominaal aorta-aneurysma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Elastase toepassing:
   1. Gebruik een wattenstaafje om eventueel extra bloed of vocht van de aorta te deppen.
   2. Plaats vervolgens een stuk droog gaas van 10 mm x 2 mm op de aorta. Gebruik een pipet om 5 μL elastase (of controleer gedenatureerd elastase) te doseren om het gaasje en de aorta te verzadigen. Vouw de stukken van de handschoen voorzichtig om de aorta.
      OPMERKING: Om gedenatureerde elastase te bereiden voor gebruik in schijn- of controlegroepen, kookt u elastase op 100 °C gedurende 30 minuten.
   3. Wacht 5 minuten totdat elastase op de aorta inwerkt. Laat tijdens deze incubatieperiode, indien nodig, een deel van de spanning los die wordt veroorzaakt door de buikrol en de huidretractor.
      OPMERKING: Vanwege het batch-effect met elastase raden we onderzoekers aan om dezelfde fles elastase te gebruiken voor alle experimenten binnen een bepaald onderzoek. Bij elk nieuw flesje elastase raden we aan om een dosis-respons uit te voeren om ervoor te zorgen dat er geen overweldigend aantal vroege rupturen is (vóór 4 weken). De duur van de toepassing van elastase kan ook worden aangepast tussen 4 en 6 minuten, afhankelijk van de respons op elastase.
   4. Reset na 5 minuten de darmretractie en vouw de stukken van de handschoen open. Spoel de buikholte met 1 ml warme 0,9% steriele normale zoutoplossing, terwijl u voorzichtig het gaasje en de stukjes handschoen van de aorta verwijdert. Absorbeer de zoutoplossing in de buik met gaas van 10 cm x 10 cm. Herhaal het irrigeren van de buik voor een totaal van 3 x 3 ml.
   5. Gebruik draagbare schuifmaten om de breedste aortadiameter na het aanbrengen van elastase opnieuw te meten en 3x op te nemen. Zie figuur 5B,C voor voorbeelden van de aortadilatatie tot behandeling met schijn en actief elastase.
      OPMERKING: De gemiddelden van de drie pre- en post-elastasemetingen kunnen worden gebruikt om de procentuele verandering in aortadiameter bij behandeling te berekenen. Doorgaans is er een opmerkelijke dilatatie ~30-50% onmiddellijk na de behandeling met elastase, wat kan helpen ervoor te zorgen dat de elastase functioneel is en de aorta adequaat is behandeld. De diameter van de aorta mag niet veranderen door het aanbrengen van gedenatureerde elastase of mag iets kleiner zijn (waarschijnlijk door spasmen).
5. Sluiting van de buikholte:
   1. Verwijder de buikrol voorzichtig van onder de darm en uit het lichaam. Breng indien nodig extra zoutoplossing aan op de darm om te voorkomen dat deze tijdens het verwijderen aan de buikrol blijft plakken. Controleer of de darm er roze uitziet en voldoende doorbloed is.
      OPMERKING: Het is niet nodig om te proberen de darm terug te plaatsen op zijn oorspronkelijke locatie; Als u dit probeert, bestaat het risico op verdraaiing van de darm of inwendige hernia's.
   2. Benader de abdominale fascia opnieuw met behulp van een lopende 5-0 niet-resorbeerbare monofilamenthechting. Sluit de huid met 3-4 huidnietjes.

6. Postoperatieve dierenverzorging

1. Plaats de muis in de herstelkooi met een warmtelamp. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kooi warm is, niet heet.
2. Dien een subcutane vloeistofbolus van 0,5-1 ml van 0,9% normale zoutoplossing toe.
3. Laat de muis zelf herstellen in de verwarmde kooi gedurende ~20 minuten totdat hij actief is volgens het institutionele protocol, en keer dan terug naar een huisvestingskooi.
4. Dien volgens het instellingsprotocol carprofen 20 mg/kg toe 24 uur na de operatie op postoperatieve dag 1 en ga dagelijks door gedurende 3 dagen.

7. Aortameting en weefseloogst

1. Na euthanasie met isofluraan en cervicale dislocatie de buikholte heropenen. Verleng de incisie door het borstbeen om toegang te krijgen tot de thorax. Snijd de rechterboezem weg en doordrenk de linkerventrikel met 10 ml koude 1% DPBS-oplossing gedurende 2 minuten. Reseceer de longen, lever en milt.
   OPMERKING: Pas op dat u de darm niet verwondt; Het morsen van darminhoud kan van invloed zijn op weefselanalyse.
2. Leg de abdominale aorta bloot en meet de maximale diameter van de infrarenale aorta, zoals hierboven beschreven. Ga door met het ontleden van de hele aorta en het hart. Zodra het hart en de aorta zijn geïsoleerd, snijdt u alle arteriële vertakkingen en gemeenschappelijke iliacale slagaders af en laat u korte segmenten intact op de aorta. Plaats het hart en de aorta op een contrasterende achtergrond naast een liniaal en een afbeelding.

8. Data-analyse en rapportage

1. Om rekening te houden met menselijke fouten, meet u de aortadiameters ten minste 3x elk bij gebruik van draagbare schuifmaten en rapporteert u vervolgens de diameter als de gemiddelde waarde.
2. Definieer AAA als een toename van 50% in de gezonde aortadiameter. Zorg ervoor dat u zowel de bruto aortadiameters als de procentuele verandering in diameter in de onderzoeksresultaten opneemt.

Resultaten

Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 22-24 weken werden in deze studie gebruikt. Infrarenale aorta's werden behandeld met 5 μl elastase-enzym (6,9 mg eiwit/ml, 6 eenheden/mg eiwit) of gedenatureerd elastase gedurende 5 minuten. Met elastase behandelde mannelijke muizen vertoonden een toename van 43,4% in aortadiameter na 5 minuten blootstelling aan elastase in vergelijking met onbehandelde baseline aortadiameters, terwijl de behandelde vrouwelijke aorta's toenamen met 33,6% (P = 0,0342). Aortadiameters van schijnvertoningen vertoonden relatief geen verandering gedurende 5 minuten blootstelling aan gedenatureerd elastase (mannen 0,5%; vrouwen -2,8%). Er waren geen chirurgisch gerelateerde sterfgevallen onder de 12 behandelde en 6 nepmuizen. Gegevens voor de 28-daagse studie worden weergegeven in tabel 1. Van de met vrouwtjes behandelde muizen stierven er 3 van de 6 aan AAA-ruptuur; één op postoperatieve dag 20 en twee op dag 25 (figuur 6). Er waren geen AAA-rupturen bij behandelde mannen. AAA's (gedefinieerd als een toename >50% van de uitgangswaarde van de aortadiameter of dood door AAA-ruptuur) werden met succes geïnduceerd bij alle behandelde muizen (12 van de 12). Na 28 dagen was de gemiddelde AAA-diameter van de behandelde mannetjes 2,86 ± 0,31 mm, met een gemiddelde verandering van 257 ± 54%, terwijl de AAA-diameters van de overlevende behandelde vrouwelijke muizen 3,60 ± 1,87 mm waren, met een gemiddelde procentuele verandering van 417 ± 286% (Figuur 7). Schijnmuizen vertoonden relatief geen verandering in aortadiameters.

Figuur 6: Overleving van mannelijke en vrouwelijke B6-muizen gedurende een 28-daags elastase/BAPN-model van AAA. (A) AAA-ruptuur trad op bij 3 van de 6 behandelde vrouwelijke muizen (één muis na 20 dagen, daarna twee muizen na 25 dagen), terwijl er geen rupturen waren bij de 6 behandelde mannelijke muizen na 28 dagen. (B) Representatieve beelden bij autopsie van een vrouwelijke muis die stierf aan een AAA-ruptuur. AAA-ruptuur wordt aangetoond door een groot retroperitoneaal hematoom (links) en de aanwezigheid van een infrarenale AAA met een wanddefect (rechts). Afkortingen: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominaal aorta-aneurysma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Maximale aortadiameters van elastase/BAPN en nep-mannelijke en -vrouwelijke B6-muizen na 28 dagen. (A) Behandelde muizen vertonen significant grotere infrarenale diameters na 28 dagen in vergelijking met schijnvertoningen. (B) De combinatie van elastase en BAPN produceert met succes grote infrarenale AAA's bij zowel mannelijke als vrouwelijke B6-muizen. Afkortingen: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominaal aorta-aneurysma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

			86 mannelijke Sham	86 vrouwelijke Sham	86 mannelijk Elastase/8APN	86 vrouwelijk Elastase/8APN
Aantal muizen			3	3	6	6
Leeftijd (weken)			22,3 ± 0,0	22,7 ± 0,7	23,1 ± 0,2	23,2 ± 0,2
Gewicht (g; bij operatie)			36,3 ± 2,5	23,7 ± 1,2	32,8 ± 1,7*	23,7 ± 0,8
Diameter aorta voorbehandeling (mm)			0,89 ± 0,02	0,75 ± 0,04	0,81 ± 0,07	0,73 ± 0,09
Diameter aorta na de behandeling (mm)			0,90 ± 0,03	0,73 ± 0,01	1,15 ± 0,03**	0,98 ± 0,12**
Procentuele verandering na behandeling van 5 minuten (%)			0,5 ± 4,4	-2,8 ± 5,3	43,4 ± 10,2***	33,6 ± 4,5***
Incidentie van AAA (%)			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
AAA scheurt met 28 dagen			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
Overleving tot 28 dagen			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
Maximale aortadiameter op 28 dagen (mm)			0,85 ± 0,01	0,64 ± 0,01	2,86 ± 0,31*	3,60 ± 1,87**
Procentuele verandering aortadiameter na 28 dagen (%)			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

Tabel 1: Resultaten van een 28-daags model van het elastase/BAPN muizenmodel van AAA. De gegevens zijn gemiddeld ± SD. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0001 vergeleken met schijnvertoning van hetzelfde geslacht via eenrichtingstest van ANOVA Fischer. Afkortingen: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominaal aorta-aneurysma.

Discussie

Inzicht in de complexe pathofysiologie van AAA is van cruciaal belang voor het verbeteren van de behandeling van aorta-aneurysma-aandoeningen. Hoewel er actief nieuwere strategieën worden ontwikkeld om de chirurgische resultaten te verbeteren, blijven AAA's wijdverbreid in onze vergrijzende samenleving en blijft aneurysmaruptuur een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten¹⁰. Daarom rechtvaardigen de onvervulde behoeften op het gebied van AAA-detectie-, preventie- en behandelingsstrategieën verder fundamenteel onderzoek naar aneurysma's¹¹.

Diermodellen die de kenmerken en het gedrag van menselijke AAA's nauwkeurig en efficiënt samenvatten, zijn essentieel voor mechanistische studies van de pathofysiologie van aneurysma's en het identificeren van potentiële therapeutische doelen. Hoewel de huidige diermodellen de belangrijkste aspecten van de aneurysmale veranderingen die optreden bij menselijke ziekten kunnen nabootsen, vertegenwoordigt geen enkel model volledig de ware complexiteit van menselijke AAA's. Momenteel zijn muizen de meest geaccepteerde soort voor AAA-modellering bij dieren. Onderzoekers moeten rekening houden met de verschillende sterke en zwakke punten van elk muizenmodel voor hun specifieke aneurysma-onderzoek, zoals die vakkundig worden beschreven in beoordelingen van Daugherty et al. en Busch et ^al.12,13.

Het gebruik van elastase om AAA bij knaagdieren te induceren werd voor het eerst beschreven door Anidjar et al. in 1990¹⁴. Perfusie van de aorta met varkenspancreaselastase met behulp van een spuitpomp zorgt voor een initiële dilatatie tussen ongeveer 50% en 70%, en de verwijde segmenten vertonen gunstig vergelijkbare pathologische kenmerken van menselijke AAA's, zoals mediale degeneratie en adventitiële ontsteking. Het klassieke perfusiemodel is echter misschien wel het technisch meest uitdagende aneurysmamodel, en de aneurysma's die doorgaans in de tweede week worden gevormd, beginnen daarna geleidelijk te verdwijnen. Bhamidipati et al. in 2012 toonden vervolgens aan dat adventitiële toepassing van elastase ook met succes vergelijkbare aneurysma's zou kunnen induceren die beter reproduceerbaar zijn in maat¹⁵. Een veel minder uitdagend model, het topische elastasemodel, werd op grote schaal toegepast in onderzoek naar aneurysma's. Aanvullende methodologie en voordelen van het topische elastasemodel worden besproken in de methodenpaper van Xue en collega's¹⁶.

Het elastase/BAPN-model van muizen AAA werd in 2017 ontwikkeld door Lu en collega's⁸. De introductie van 0,2% BAPN-drinkwater verbeterde veel van de kritieken op het klassieke topische elastasemodel, dat nu aneurysma's produceert die voortdurend uitzetten tot het punt van AAA-ruptuur. In hun studie uit 2017 toonden ze aan dat muizen in de met elastase / BAPN behandelde groep significant hogere AAA-vormingssnelheden hadden in vergelijking met de elastasegroep (93% versus 65%, P < 0,01), die ook meer geavanceerde AAA's waren. Gedurende een onderzoeksperiode van 100 dagen bleven AAA's in de elastase/BAPN-groep verwijden tot >800% basislijndiameter en vormden ze intraluminale trombus (53,8%) en 46,2% scheurde spontaan voor het einde van het experiment. Dit model heeft onderzoekers in staat gesteld om factoren te onderzoeken die van invloed kunnen zijn op de progressie en stabiliteit van het aneurysma in de loop van de tijd.

Berman et al. onderzochten het elastase/BAPN-model verder door de concentratie van topisch elastase, de duur van het onderzoek, de timing van BAPN-toediening en de impact van^{diergeslacht te} variëren. Behandeling met 5 μl hoger geconcentreerd elastase (5 mg/ml of 10 mg/ml) produceerde grotere aneurysma's dan 2,5 mg/ml gedurende 56 dagen. De prevalentie van intraluminale trombusvorming hing ook af van de elastaseconcentratie, die optrad bij 28,6% van de met 5 mg/ml behandelde muizen en 62,5% van de met 10 mg/ml behandelde muizen. Ze toonden ook aan dat het elastase/BAPN-model aneurysma's bij vrouwelijke muizen kan induceren. Hoewel slechts een paar vrouwelijke muizen werden bestudeerd (n=5), ontdekten ze dat de aneurysma's bij vrouwtjes vatbaarder waren voor scheuren (2 van de 5 muizen) en significant groter waren dan mannelijke AAA's na 56 dagen.

In dit artikel willen we een methode bieden om een van de grootste beperkingen van chirurgische modellering aan te pakken, namelijk de variatie in de chirurgische procedure. Zonder een duidelijke consensus over de mate van dissectie en het gebied van de aorta dat met elastase is behandeld, kunnen de resultaten van dit model sterk variëren tussen dieren, onderzoekers en instellingen. We hebben talloze anatomische variaties tussen muizen waargenomen, waaronder het aantal en de grootte van lumbale slagaders en aders, en de locatie van de IMA, het opstijgen van de linker gonadale ader, onder andere, wat beperkend kan zijn bij het behandelen van slechts een deel of een specifiek segment van de infrarenale aorta. Hier tonen we aan dat het circumferentieel ontleden van de gehele lengte van de infrarenale aorta van de linker nierslagader proximaal tot de aorta-bifurcatie distaal helpt om reproduceerbare graden van blootstelling aan de aorta te bieden, ondanks anatomische verschillen, terwijl het succes van aneurysma-inductie wordt vergroot en duidelijke grenzen worden gesteld aan de operator. Bovendien heeft de grootte en de meer anterieure positie van de IVC de neiging om het grootste deel van de aorta te bedekken, wat van invloed kan zijn op de hoeveelheid behandelde aorta als deze niet wordt geïsoleerd van de IVC. Hoewel het noodzakelijk is om de retroperitoneale fascia te verwijderen om de aorta bloot te leggen, is het belangrijk om het bindweefsel van de adventitia niet volledig van de aorta te ontleden en een van de medialagen bloot te leggen, omdat dit meestal resulteert in ruptuur tijdens de elastase-incubatieperiode van 5 minuten. Dit zou kunnen dienen als een extra interne controle in de mate van de dissectie met dit model, maar kan een frustrerende leercurve zijn bij het toepassen van dit model. Operators zullen bovendien gebieden met een hoger risico leren (Figuur 4) die gemakkelijk tijdens de operatie gewond kunnen raken en tot oncontroleerbare bloedingen kunnen leiden.

Hoewel het belangrijk is dat de procedurele stappen van dit model consistent zijn, kan de duur van het onderzoek en de timing van intervalechografie variëren, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Aortadilatatie begint onmiddellijk met het aanbrengen van elastase, maar studies met dit model volgen muizen gewoonlijk gedurende 28 dagen na de operatie⁷, zoals in dit voorbeeldexperiment. Verlenging van de studieduur moet worden overwogen bij het bestuderen van gevorderde AAA's, groei op lange termijn, intraluminale trombusvorming of ruptuur.

Aanvullende perioperatieve maatregelen, zoals het handhaven van de lichaamstemperatuur en hydratatiestatus van het dier, kunnen helpen om de overleving van het dier van deze invasieve procedure te verbeteren. Het gebruik van een verwarmingskussen tijdens de operatie en plaatsing in een warme herstelkooi kan onderkoeling helpen voorkomen. Zoutoplossing moet worden opgewarmd voordat het wordt gebruikt om de buikholte te irrigeren. Een onderhuidse vloeistofbolus direct na de operatie kan ongevoelige vochtverliezen tijdens de operatie verklaren en het dier helpen voldoende hydratatie te behouden tijdens de onmiddellijke herstelfase. Met een zorgvuldige weefselbehandeling en een consistente methodische aanpak kan het elastase/BAPN-model door een ervaren operator tussen 30 minuten en 45 minuten per muis worden uitgevoerd en op betrouwbare wijze AAA produceren met zeer lage perioperatieve complicaties.

Onze resultaten tonen aan dat de combinatie van BAPN in combinatie met circumferentiële dissectie van de infrarenale aorta voorafgaand aan het aanbrengen van elastase grote, continu expanderende AAA's produceert, met grotere diameters en ruptuurincidentie bij kortere perioden. In dit experiment werden AAA's met succes geïnduceerd bij alle mannelijke (6 van de 6) en vrouwelijke (6 van de 6) muizen die werden behandeld met actief elastase. Blootstelling aan elastase gedurende 5 minuten resulteerde in een onmiddellijke toename van de aortadiameter met ongeveer 30-40%, wat nuttig is bij het bevestigen van een succesvolle en consistente toepassing van elastase onder behandelingsgroepen. Net als Berman et al. hebben we aangetoond dat dit model AAA's kan induceren bij vrouwelijke muizen, die ook een grotere ruptuurrespons hebben dan mannetjes. De helft van de vrouwelijke muizen (3 van de 6) scheurde binnen 28 dagen, vergeleken met 0 van de 6 mannetjes, maar vrouwelijke muizen wegen minder dan mannetjes. Mannelijke muizen vertoonden een toename van de AAA-diameter met 257% vergeleken met -4% van de mannelijke controles, terwijl de overlevende vrouwtjes een toename van de diameter van 417% vertoonden, vergeleken met -16% van de vrouwelijke controles. De diameters van de aorta verschilden niet significant tussen de overlevende mannelijke en vrouwelijke behandelde muizen na 28 dagen vanwege het hogere aantal rupturen in de vrouwelijke groep. We speculeren dat de nepmuizen tegen het einde van het onderzoek kleinere aortadiameters vertonen, omdat de aorta de neiging heeft om tijdens de eerste dissectie licht te verwijden en vervolgens na 28 dagen littekenweefsel vormt.

Het elastase/BAPN-model heeft bepaalde beperkingen. Circumferentiële dissectie van de aorta vereist fijne chirurgische vaardigheden, maar helpt de reproduceerbaarheid en de mate van aneurysma-inductie te verbeteren. Net als bij het topische elastasemodel is er ook een batch-effect in de activiteit van het elastase-enzym, wat, zoals eerder vermeld, daarom belangrijk is om in een bepaald experiment voor alle dieren dezelfde fles elastase te gebruiken. Hoewel de incidentie van AAA intraluminale trombus en ruptuur toeneemt met de tijd en de ernst van het aneurysma, zijn deze in dit model niet gegarandeerd of volledig voorspelbaar.

Samenvattend produceert het elastase/BAPN-model grote, echte infrarenale AAA's bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, die in de loop van de tijd geleidelijk uitzetten, intraluminale trombus vormen en in staat zijn om te scheuren. Deze sterke punten van dit muizenmodel helpen om sommige gedragingen en kenmerken van aneurysma's bij mensen beter samen te vatten. Hoewel technisch moeilijk, kan een zorgvuldige en grondige dissectie van de aorta de aneurysmale respons versterken. Momenteel is de elastase/BAPN-methode een geavanceerd model voor het bestuderen van infrarenale abdominale aorta-aneurysma's.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 L inductiekamer	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS	anesthesie-inductiekamer
0.9% natriumchloride-injectie, USP, 20 mL	Hospira	NDC 0409-4888-03	normale zoutoplossing
3 mL-sering Luer-Lok Tip met BD PrecisionGlide-naald 22 G x 3/4	BD	REF 309569	sering, 22 G-naald
3-aminopropionitrilfumaraat	TCI	A0796	BAPN
3-aminopropionitrilfumaraat zout	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Avant Delux gaasjesponsjes, 2" x 2" 4-laags	Medline	NON26224	gaasjesponsjes
Haar knippers	Whal Clipper Corporation	8110	haar knippers
betadine chirurgische scrub (povidon-jodium, 7,5%)	Avrio	NCD 67618-154-16	betadine chirurgische scrub
stompe pincet	ROBOZ	RS-5130	stompe pincet
Buprenorfine ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	buprenorfine
carprofen	Norbrook	NDC 55529-131-11	carprofen
CASTROVIEJO 5,75" recht met vergrendeling	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo-naaldhouder
katoenen dopjes, 6"	Dynarex	No. 4302	katoenen dopjes
DESMARRES 5,5' rektractor	ROBOZ	RS-6672	huidrektractor
digitale calliper, 0-150 mm	World Precision Instruments	501601	digitale calliper
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
Elastase van varkenspancreas Type I	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	elastase >4,0 eenheden/mg eiwit
Ethanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701	ethanol verdund tot 70%
oogsmeer	Optixcare	14716	oogsmeer
Germinator 500 droge sterilisator	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	droge kralensterilisator
warmtetherapiemat	Adroit Medical Systems	V016	warmtetherapiemat
warmtetherapiepomp	Adroit Medical Systems	HTP-1500	warmtetherapiepomp
isofluraan, USP	Akorn Animal Health	NCD 59399-106-01	isofluraan
L-10 pipet	Rainin	LTS 0.5-10 uL	pipet
Laag profiel anesthesiemasker, klein	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	anesthesie neusdop
micro dissectorscharen	ROBOZ	RS-5619	micro dissectorscharen
microscoop	Leica	S9i	microscoop
Nii-LED hoog intensiteit LED-verlichting LED externe licht	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED	externe dissectielicht
nylon 5-0 monofilament, zwart niet-absorbeerbare hechting	Oasis	MV-661-V	5-0 nylon hechting
polyisopreen chirurgische handschoenen, GAMMEX Non-Latex PI Micro, maat 7,5	Ansell	20685975	niet-latex chirurgische handschoenen
Reflex 7 mm roestvrijstalen wondclips	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	wondclips
weegschaal	Ohaus	Compass CR2200	weegschaal
SomnofFlo-toebehorenset	Kent Scientific Corporation	10-8000-71	slangen voor elektronische verdamper
SomnoFlo elektronische verdamper	Kent Scientific Corporation	SF2992	elektronische verdamper met lage stroom
SomnoPath Flow Diverter	Kent Scientific Corporation	SP1016	stroomafleider voor elektronische verdamper
SS/45 scherpe pincet	ROBOZ	RS-4941	scherpe pincet
chirurgische schaar	ROBOZ	RS-6010SC	chirurgische schaar
vaatklemmen	Dumont	VES 0.35	vaatklemmen