Methodenartikel

Een op live-cell beelden gebaseerde machine learning-strategie om pluripotente stamceldifferentiatie te monitoren

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66823

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University, 2MOE Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, Institute of Molecular Medicine, College of Future Technology, Peking University, 4Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 5College of Engineering, Peking University, 6Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Beschikbare differentiatiesystemen voor pluripotente stamcellen (PSC) naar functionele cellen worden momenteel belemmerd door problemen van ernstige variabiliteit van lijn tot lijn en van partij tot partij. Hier presenteren we, met cardiale differentiatie als belangrijkste voorbeeld, een protocol om het proces van PSC-differentiatie intelligent te monitoren en te moduleren op basis van beeldgebaseerde machine learning.

Samenvatting

Pluripotente stamceltechnologieën (PSC) worden op grote schaal gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen, ziektemodellering en regeneratieve geneeskunde. Beschikbare PSC-naar-functionele celdifferentiatiesystemen worden echter belemmerd door problemen van ernstige variabiliteit van lijn tot lijn en van partij tot partij. Nauwkeurige controle van de celdifferentiatie in real time is daarom belangrijk. In dit protocol beschrijven we een niet-invasieve en intelligente strategie die de variabiliteit in celdifferentiatie overwint door gebruik te maken van machine learning op basis van helderveldbeelden. Door de differentiatie van PSC naar cardiomyocyten als voorbeeld te nemen, biedt deze methodologie gedetailleerde informatie voor controle van de initiële PSC-toestand, vroege beoordeling en interventie in differentiatieomstandigheden, en eliminatie van de verkeerd gedifferentieerde celbesmetting, samen het realiseren van consistent hoogwaardige differentiatie van PSC's naar functionele cellen. In principe kan deze strategie worden uitgebreid naar andere celdifferentiatie- of herprogrammeringssystemen met meerdere stappen om de celproductie te ondersteunen, en om ons begrip van de mechanismen tijdens de conversie van het lot van cellen te vergroten.

Inleiding

Pluripotente stamcellen (PSC's) bezitten het opmerkelijke vermogen om in vitro te differentiëren in vele soorten cellen. Deze gedifferentieerde functionele cellen kunnen worden gebruikt voor celtherapie, ziektemodellering en medicijnontwikkeling, allemaal waardevol voor onderzoek of klinische toepassingen 1,2,3. Er zijn bijvoorbeeld verschillende methoden ontwikkeld om PSC's te differentiëren tot cardiomyocyten (CM's)4,5,6,7. Deze CM's kunnen worden toegepast voor cardiotoxiciteitstesten van geneesmiddelen, modellering van hartaandoeningen en celtransplantatie 8,9,10,11.

De conversie van PSC naar de terminale gedifferentieerde cellen is echter een stapsgewijs proces en meerdere verstoringen tijdens het differentiatieproces kunnen ertoe leiden dat cellen het lot van de cellen uiteenlopen. Verschillende genetische achtergronden en epigenetische kenmerken van PSC-lijnen beïnvloeden het potentieel voor differentiatie naar een specifieke afstammingslijn 12,13,14,15; het aantal PSC-passages en geaccumuleerde genmutaties zijn ook bronnen van PSC-heterogeniteit; Verschillen in de experimentele operaties die door verschillende onderzoekers worden gebruikt, kunnen ook leiden tot totaal verschillende differentiatieresultaten 16,17,18,19,20. Daarom is momenteel een van de belangrijkste problemen bij de productie van PSC-afgeleide cellen de instabiliteit tussen cellijnen en batches 21,22,23,24,25. Instabiliteit in PSC-differentiatie leidt vaak tot meerdere herhaalde experimenten, die veel tijd en arbeidsmiddelen verbruiken. Om dit probleem aan te pakken, is het van cruciaal belang om een strategie te ontwikkelen die de variabiliteit tussen cellijnen en batches minimaliseert, waardoor de stabiliteit en robuustheid van de differentiatie wordt verbeterd.

Onlangs hebben ontwikkelingen op het gebied van hoge-resolutiemicroscopie en machine learning (ML) de toepassing van op ML gebaseerde kwantitatieve beeldanalyse in de celbiologie mogelijk gemaakt, waardoor het mogelijk is om waardevolle informatie te gebruiken in celbeeldvormingsfuncties 26,27,28,29,30,31,32,33,34 . In ons eerdere werk stelden we een op live-cell beelden gebaseerde ML-strategie voor om de PSC-differentiatiestatus in realtime te monitoren en in te grijpen om de stabiliteit en efficiëntie van de PSC-differentiatie te verbeteren (Figuur 1)35. Met PSC-naar-cardiomyocyt differentiatie als voorbeeld, evalueerden we de initiële PSC-toestand met behulp van willekeurige bosmodellen, voorspelden we de optimale differentiatieconditie met behulp van logistische regressiemodellen en herkenden we succesvol gedifferentieerde cellen met behulp van op deep learning gebaseerde Grad-CAM36 en pix2pix37. ML-modellen leerden cellijnen te identificeren op basis van een reeks helderveldmorfologische kenmerken, waaronder kenmerken over oppervlakte, omtrek, convexiteit, vastheid, helderheid, bewegingssnelheid en andere impliciete kenmerken die werden geëxtraheerd door diepe convolutionele neurale netwerken. Op basis van gevolgtrekkingen uit deze gevestigde ML-modellen realiseerden we controle van de initiële PSC-toestand, vroege beoordeling en interventie in differentiatiecondities, en eliminatie van de verkeerd gedifferentieerde celbesmetting, samen zorgen voor een uitgebreide en nauwkeurige modulatie van het cardiale differentiatieproces. Hier geven we een stapsgewijs protocol voor het ontwikkelen van de strategie.

Protocol

1. Celdifferentiatie en karakterisering

  1. Bereiding van kweekreagentia en kweekplaten
    1. Bereid PSC-kweekmedium voor door 2 ml supplement en 0,2% penicilline-streptomycine toe te voegen aan 48 ml basaal medium. Aliquot en bewaar het supplement bij -20 °C. Bewaar dit medium maximaal 4 weken bij 4 °C.
    2. Bereid PSC-preparaat voor door 1 ml supplement en 0,2% penicilline-streptomycine toe te voegen aan 500 ml basaal medium. Verwarm het medium bij gebruik voor eenmalig gebruik en bewaar het medium maximaal 3 weken bij 4 °C.
    3. Bereid CM-differentiatiemedium voor door 1x B27-supplement minus insuline en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen aan RPMI 1640. Bereid CM-onderhoudsmedium voor door 1x B27-supplement en 1% penicilline-streptomycine toe te voegen aan RPMI 1640. Bewaar deze twee soorten medium gedurende 2 weken bij 4 °C.
    4. Dompel de Matrigel onder in ijs en houd deze een nacht op 4 °C. Zorg ervoor dat Matrigel volledig is ontdooid; vervolgens aliquot in aliquots van 1 ml die bij -80 °C zijn bewaard voor later gebruik, en voeg 1 ml Matrigel toe aan 49 ml DMEM/F12 bij 4 °C om de Matrigel-werkoplossing te bereiden. Voeg 850 μL van deze Matrigel-werkoplossing toe per putje van een kweekplaat met 6 putjes en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Voor de kweekplaat met 96 putjes die wordt gebruikt bij CM-differentiatie, voegt u 35 μl Matrigel-werkoplossing per putje toe.
      OPMERKING: Bewaar Matrigel te allen tijde op ijs; de pipetpunten en -buisjes moeten worden voorgekoeld bij 4 °C. De matrigel-werkoplossing kan gedurende 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Wees voorzichtig met het vermijden van luchtbellen bij het pipetteren van de Matrigel-werkoplossing.
  2. PSC-onderhoud en -passage
    1. Bewaar PSC's in kweekplaten met 6 putjes. Bevestig de celdichtheid onder een microscoop en bereid u voor op doorgang wanneer de samenvloeiing ~70% bereikt (Figuur 2A).
    2. Gebruik EDTA om de cellen te verteren voor passaging. Verwarm PSC-kweekmedium, PBS en EDTA in een waterbad van 37 °C en voeg Y27632 toe aan het medium tot een eindconcentratie van 5 μM.
    3. Was de PSC's met 1 ml PBS, voeg 1 ml EDTA per putje toe en broed de plaat 3 minuten uit in een incubator van 37 °C.
    4. Zuig de EDTA op voordat de cellen loskomen van de kweekplaat en gebruik vervolgens de 1 ml PSC-kweekmedium om de bodem van het putje voorzichtig 3-4x af te spoelen om de cellen te resuspenderen.
      OPMERKING: Dit stelt ons in staat om de stap van centrifugeren over te slaan en celbeschadiging bij passaging-bewerkingen te verminderen.
    5. Aspireer de DMEM/F12 uit een met matrigel gecoate put van een 6-wells kweekplaat en voeg 2 ml vers PSC-kweekmedium toe per putje (Y27632 toegevoegd). Voeg de celsuspensie toe aan de putten met de splitverhouding van 1:6 tot 1:12. Plaats de plaat in de incubator van 37 °C met 5% CO2.
    6. Vervang het PSC-kweekmedium (zonder Y27632) 12 tot 24 uur na het passeren; Verander vervolgens het medium en controleer elke dag de celstatus en samenvloeiing.
  3. Cardiale differentiatie van PSC's
    1. Voor CM-differentiatie zaait u PSC's in een kweekplaat met 96 putjes in PSC-bereidingsmedium (Y27632 toegevoegd). Voor CM-differentiatie volgt u dezelfde stappen hierboven (stappen 1.2.2-1.2.6) om PSC's te zaaien in een kweekplaat met 96 putjes in PSC-bereidingsmedium (Y27632 toegevoegd).
      OPMERKING: In dit stadium kan de duur van de EDTA-behandeling op passende wijze worden verlengd (5 minuten of meer) om PSC's voldoende te dissociëren, zodat de klonen na passage kleiner kunnen zijn. Onze studie heeft aangetoond dat binnen hetzelfde gebied kleinere kolonies bevorderlijk zijn voor differentiatie.
    2. Fase I: Wanneer PSC's 80-90% confluentie bereiken, schakelt u het medium over naar CM-differentiatiemedium met 2-20 μM CHIR99021 (CHIR) (Figuur 2B). Het tijdstip van mediumomschakeling wordt dag 0 genoemd. Na 24-48 uur CHIR-behandeling, verander het medium in vers CM-differentiatiemedium.
      OPMERKING: CHIR is een GSK3beta-remmer voor mesoderm-inductie. De optimale CHIR-dosis voor CM-differentiatie fluctueert met verschillende cellijnen en batches. De optimale CHIR-dosis is bijvoorbeeld 8-10 μM, 48 uur voor iPS-B1. Om diverse helderveldbeelden te verzamelen voor het trainen van het ML-model, hebben we hier CHIR-concentraties getitreerd voor elke batch experimenten voor verschillende differentiatie-efficiënties.
    3. Fase II: Vervang na 72 uur (dag 3) het medium door het CM-differentiatiemedium aangevuld met 5 μM IWR1 en kweek gedurende 48 uur (dag 5). Vervang het medium met CM-differentiatiemedium gedurende 1-2 dagen (tot dag 6-7). Op dit punt differentiëren PSC's tot cardiale voorlopercellen (CPC).
    4. Stap III: Vervang het medium door CM onderhoudsmedium en vervang het medium elke 3 dagen. Oogst op dag 10 of dag 12 de CM voor verdere analyse.
  4. Immunofluorescentiekleuring van CM
    1. Was op dag 10 of dag 12 de cellen met PBS en fixeer ze met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de CM's 2x met PBS en bewaar de plaat maximaal ~1 week bij 4 °C.
      OPMERKING: Paraformaldehyde is een giftig reagens met een penetrante geur. Werk in een chemische kap en bescherm ogen en handen.
    2. Behandel de cellen op het moment voor kleuring met een permeabiliserende oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur; incubeer vervolgens cellen in een blokkeringsoplossing (0,1% Triton X-100 met 3% Donkey Serum in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer het monster met cardiaal troponine T (cTnT) primair antilichaam (1:300) verdund in blokkeringsoplossing 's nachts bij 4 °C om de CM's te identificeren.
      1. Verzamel het primaire antilichaam en was de cellen 3x met PBS. Incubeer het monster met secundaire antilichamen in PBS met 1% runderserumalbumine gedurende 1 uur bij 37 °C in een donkere omgeving.
        OPMERKING: Het verzamelde primaire antilichaam kan 2-3x in 1 week worden hergebruikt.
    4. Verwijder het secundaire antilichaam uit de cellen en was de cellen 3x met PBS. Gebruik Hoechst 33342 (1:1.000 in PBS) om kernen 5 minuten bij kamertemperatuur te kleuren. Spoel de cel 3x met PBS en voeg 100 μL PBS per putje toe om uitdroging te voorkomen. Bewaar de plaat bij 4 °C op een donkere plaats en maak binnen 1 week fluorescerende beelden.

2. Acquisitie van beeldstromen gedurende het differentiatieproces

  1. Opzetten van experimenteel ontwerp voor het verzamelen van afbeeldingen
    1. Gebruik een geautomatiseerde microscoop die levende celcultuur en beeldvorming ondersteunt om helderveldbeelden te verzamelen van verschillende stadia in CM-differentiatie en cTnT immunofluorescerende beelden van de differentiatie-uitkomst (Figuur 2A-E). Gebruik de microscoopondersteunende software om het experimenteerprogramma te ontwerpen en de microscoop te besturen.
    2. Open de software en maak een nieuw experimenteel ontwerp. Kies een 5x objectief en een 2x buislens voor beeldvorming. Controleer de opties Tegels en Z-stapel.
    3. Voeg TL Brightfield-kanaal toe voor helderveldbeeldvorming in het menu Kanalen. Voeg AF488- en H3342-kanalen toe voor immunofluorescentiebeeldvorming. Wijzig het lichtpad in het menu Imaging Setup voor beeldvorming met de externe digitale CMOS-camera.
    4. Open het menu Acquisitiemodus en stel 2 x 2 binning in om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
    5. Open het Z-stack menu en kies het Center model. Stel het aantal plakjes en intervallen in tijdens het scannen. Kies 3-5 segmenten met intervallen van 3-6 μm voor scherpe beelden in de analyse.
    6. In het venster Navigatie en tegels stelt u de tegelgebieden in op Carrier en stelt u 25 tegels (5 kolommen x 5 rijen) in voor één put. Selecteer in het menu Tegels de sjabloon Multiwell 96 in Sample Carrier en stel een overlapping van 5%-15% in op aangrenzende regio's.
    7. Als continue beeldvorming nodig is, vinkt u de optie T ime-serie aan en stelt u de duur en het interval in het menu Tijdreeksin. Voor het verzamelen van de beeldstroom in fase I stelt u een duur van 12 uur in zonder intervallen.
  2. Acquisitie van helderveld- en immunofluorescerende beelden
    1. Voor het verkrijgen van beelden plaatst u eerst de celkweekplaat in de monsterbak en plaatst u het monster in de microscoop. Selecteer de Multiwell 96-sjabloon die overeenkomt met het experimentele ontwerp. Als het monster uit levende cellen bestaat, open dan het verwarmingssysteem en de CO2 -pomp om de juiste toestand voor de kweek te behouden (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Open het vooraf ingestelde experimentele project en sla het op als een nieuw project. Open het menu Tegels en kalibreer de positie van de plaat handmatig. Selecteer in het venster Navigatie en tegels de benodigde putten en klik op Maken om tegelgebieden voor deze putten te maken.
    3. Klik op de Tegelregio's verifiëren in het menu Tegels en voer Autofocus uit om alle putten te verifiëren. Corrigeer vervolgens handmatig de scherpstelling van elk putje onder het heldere veld door met het muiswiel te scrollen.
    4. Vink de benodigde kanalen aan en stel de belichtingstijden in het menu Kanalen in. De aanbevolen belichtingstijden zijn 1.625 ms voor Bright, 100 ms voor H3342 en 550 ms voor AF488. Voer een enkele snap uit om de afbeeldingen van alle kanalen te controleren.
    5. Klik ten slotte op de knop Experiment starten en wacht op automatische beeldvorming. Doorgaans duurt het ~1,2 uur om het scannen van een hele kweekplaat met 96 putjes te voltooien (96 putjes, drie lagen, 25 tegels voor elk putje onder het helderveld). Kies in het verwerkingsframework Image Export, selecteer het bestandstype van de niet-gecomprimeerde TIFF-indeling of PNG-indeling en pas toe. Gebruik afbeeldingen van 9 tegels (3 x 3) in het midden van de put voor de verdere analyse (Figuur 2A-E).

3. Vaststelling van de op afbeeldingen gebaseerde ML-strategie in elke fase van het differentiatieproces

  1. Voorbereiding van de software
    1. Installeer de Python-omgeving, met pakketten pytorch (1.9.0), numpy, scipy, scikit-learn, pandas, visdom, scikit-image, opencv-python en matplotlib.
    2. Installeer Jupyter Notebook.
    3. Installeer MATLAB.
    4. Download de code en de voorbeelddatasets van https://github.com/zhaoyanglab/ML-for-PSC-differentiation.
      OPMERKING: De prestaties van ML zijn afhankelijk van de kwaliteit van de datasets en de keuze van modellen en hyperparameters. Het is niet gegarandeerd dat de voorbeeldimplementatie voor alle omstandigheden optimaal is. ML-ingenieurs moeten de code aanpassen en het model en de hyperparameters afstemmen op hun specifieke behoeften.
  2. ML-strategie in de PSC-fase: Controle van de initiële PSC-koloniestaten
    Dataset: paren van helderveldbeelden na 0 uur (vóór CHIR-behandeling) en uiteindelijke differentiatie-efficiëntie
    Model: willekeurig bos
    1. Bereid een dataset voor die bestaat uit helderveldbeelden om 0 uur (vóór CHIR-behandeling) en de uiteindelijke cTnT-fluorescentiebeelden. Om de diversiteit van morfologische profielen van 0 uur helderveldbeelden te vergroten, moet u ervoor zorgen dat de dataset PSC-kolonies van verschillende cellijnen bevat, waarbij differentiatie wordt geïnitieerd over een tijdsinterval na passage. Behandel putten in de dataset met de optimale CHIR-condities in fase I.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat kolonies worden behandeld met de optimale CHIR-omstandigheden, kunnen putjes binnen dezelfde batch worden behandeld met getitreerde CHIR-doses. Alleen putten met zeer efficiënte CHIR-omstandigheden worden in de dataset opgenomen.
    2. Kwantificeer de differentiatie-efficiëntie van elk putje aan de hand van de differentiatie-efficiëntie-index die is berekend op basis van de cTnT-fluorescentiebeelden, die wordt gedefinieerd door figure-protocol-1 (waar figure-protocol-2 de fluorescentie-intensiteit op pixellocatie (i, j) in het W × W fluorescentiebeeld vertegenwoordigt, en de som wordt genomen over alle pixellocaties met intensiteit boven een drempelwaarde α, meestal ingesteld op 0,5). Bereken binnen elke cellijn de maximale differentiatie-efficiëntie-index voor alle putten in deze cellijn en normaliseer hun differentiatie-efficiëntie-indexen met de maximale waarde.
      OPMERKING: Aangezien het differentiatiepotentieel van elke cellijn inherent verschillend is, zal een dergelijke normalisatie meer de nadruk leggen op de morfologische kenmerken van de kolonie die worden gedeeld door verschillende cellijnen die bijdragen aan de differentiatie-uitkomst. Normalisatie maakt PSC-kolonies van verschillende cellijnen inderdaad vergelijkbaar en vermindert de vertekening die door cellijnen wordt veroorzaakt.
    3. Kwantificeer de morfologische profielen van 0 uur helderveldbeelden door hoogdimensionale kenmerken die de eigenschappen van de kolonievorm onthullen. Om koloniegebieden in helderveldafbeeldingen te schetsen, berekent u de lokale entropie (met straal r); Pixels met een lokale entropie groter dan een drempelwaarde σ worden geïdentificeerd door bedekt met cellen. Gebruik een parameterinstelling van r = 10 pixels en σ = 3. Verander de werkmap naar "./colony_control"; sla de helderveldbeelden, binaire beelden van celgebieden en cTnT-fluorescentiebeelden op "colony_control/ image_data/CD00-*/[brightfield|cell_region|ctnt]/S*.png"; en voer de Jupyter Notebook "Compute_features.ipynb" uit om functies te berekenen die verband houden met onder andere koloniegebied, omtrek, stevigheid, convexiteit, circulariteit en centroid-contourafstanden.
    4. Verdeel de dataset willekeurig in een trainingsset en een testset, waarbij de trainingsset tussen de 50% en 80% van de totale gegevens uitmaakt. Voer het laatste blok uit: Splits de gegevensset in het Jupyter-notebook om de gegevensset te splitsen (Afbeelding 3A).
    5. Train een willekeurig bosregressiemodel op de trainingsset om de differentiatie-efficiëntie te voorspellen op basis van 0 uur helderveldbeeldfuncties. Voer de Jupyter Notebook 'Machine_learning.ipynb' uit om het model te trainen en te testen.
    6. Evalueer het getrainde willekeurige forest-model op de testset. Bevestig dat de voorspelde differentiatie-efficiëntie sterk correleert met de werkelijke met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt (Figuur 3B).
      OPMERKING: Aangezien de testset niet betrokken is bij de trainingsfase, geeft een hoge consistentie tussen de voorspelde en de werkelijke differentiatie-efficiëntie op de testset aan dat het model goed kan generaliseren op ongeziene steekproeven.
    7. Verkrijg het belang van objecten uit het getrainde random forest-model en selecteer 8 objecten met het meeste belang. Visualiseer hun relatie met de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie door het bereik van functies in opslaglocaties te verdelen en de gemiddelde differentiatie-efficiëntie in elke opslaglocatie te berekenen. Voer het Jupyter-notebook "Feature_importance.ipynb" uit om de visualisatie uit te voeren (Afbeelding 3C).
      OPMERKING: De visualisatie kan helpen begrijpen hoe veranderingen in de vorm van de PSC-kolonie bijdragen aan de differentiatie.
    8. Pas het getrainde model toe in nieuwe batches om de status van PSC-kolonies in realtime te bewaken. Leg het helderveldbeeld op elk uur vast, geef het beeld door aan het getrainde model en verkrijg de voorspelde differentiatie-efficiëntie. Zodra de voorspelde efficiëntie een drempel overschrijdt (bijv. 50%), start het differentiatieproces. Als de voorspelde efficiëntie de drempel niet kan bereiken, gooi deze monsters dan weg.
      OPMERKING: Tijdens de PSC-fase zal het differentiatiepotentieel van PSC-kolonies eerst stijgen en later afnemen. Real-time monitoring stelt onderzoekers in staat om het meest gunstige tijdstip te identificeren om differentiatie te starten.
  3. ML-strategie in fase I: vroege beoordeling en aanpassing van CHIR-doses
    Dataset: paren van helderveldbeeldstreams bij 0-12 uur en CHIR-concentratielabels (laag/optimaal/hoog)
    Model: logistische regressie
    1. Bereid een dataset voor die bestaat uit helderveldbeeldstromen in de hele put, waarbij elk uur tussen 0 uur en 12 uur beelden worden verkregen. Noteer de CHIR-doses (d.w.z. combinaties van CHIR-concentraties en duur) van elk putje. Zorg ervoor dat de dataset verschillende batches en putjes bevat met getitreerde CHIR-doses (bijv. concentratie = 2, 4, 6, 8, 10 en 12 μM; duur = 24, 36 en 48 uur) om de diversiteit te vergroten. Verander de werkdirectory naar "./stage_I"; sla de afbeeldingen op als "./data/image/CD01-*/S*/T*.png", waarbij CD01-* (CD01-1, CD01-2, CD01-3, CD01-4) de batchnaam is, S* (S1, S2, ..., S96) de index van de put is en T*.png (T1.png, T2.png, ..., T10.png) het voorbewerkte helderveldbeeld is van de put op verschillende tijdstippen van de beeldstroom.
    2. Bereken in elke batch het percentage cTnT+- cellen voor elk putje, dat wordt berekend door het aantal cTnT+- cellen te delen door het totale aantal Hoechst+- cellen in het fluorescentiebeeld. Gemiddeld het percentage cTnT+- cellen over parallelle putten met dezelfde CHIR-dosisconditie. Sla de CHIR-dosisconditie en het percentage cTnT+ -cellen voor elk putje op in een csv-bestand "./data/image/CD01-*/CD01-?_exp_config.csv".
    3. Bepaal in elke batch het "lage", "optimale" en "hoge" CHIR-concentratiebereik onder elke CHIR-duur volgens de volgende criteria. CHIR-concentraties met een gemiddeld percentage cTnT+- cellen boven een drempel (bijv. 20%) worden als "optimaal" geïdentificeerd. CHIR-concentraties buiten het optimale bereik worden geïdentificeerd als "laag" of "hoog". Label de putten onder elke CHIR-duur als "laag", "optimaal" en "hoog" volgens hun overeenkomstige CHIR-concentraties.
      OPMERKING: Empirisch gezien is er een negatieve correlatie tussen CHIR-concentraties en de duur van hoogrenderende putten binnen een batch: voor een hogere CHIR-duur nemen de optimale concentraties af. Met andere woorden, de optimaliteit van CHIR-concentraties hangt af van de CHIR-duur, en dus verschillen de labels van putjes tussen verschillende CHIR-duurs.
    4. Bereken in elke batch, onder elke CHIR-duur, de ΔCHIR-concentratie voor elke concentratie c om de afwijking van het optimum te kwantificeren. Geef het optimale CHIR-concentratiebereik aan met [c1, c2], en vervolgens ΔCHIR-concentratie(c) = c - c1 (als c < c1), 0 (als c1 ≤ c ≤ c2) of c - c2 (als c > c2).
    5. Extraheer kenmerken van de beeldstromen in de dataset en zorg ervoor dat ze de morfologische veranderingen van cellen tijdens fase I weerspiegelen. Als u afbeeldingskenmerken wilt berekenen over lokale entropie, oppervlakte, omtrek, helderheid, optische stroom en fractale dimensie, voert u
      cd ./gegevens
      Python compute_features.py
      cd..
      OPMERKING: Om de morfologische veranderingen te benadrukken, kunnen de waarden van sommige kenmerken (bijv. oppervlakte, omtrek en optische stroom) worden genormaliseerd op basis van hun initiële basislijnwaarden in de beeldstromen.
    6. Verdeel de dataset willekeurig in een trainingsset en een testset. Voer het Jupyter-notebook "./data/prepare_dataset.ipynb" uit om de gegevensset te splitsen en de gegevenssets te ordenen als gegevensframes (afbeelding 3D).
    7. Train voor elke CHIR-duur een logistisch regressiemodel om het CHIR-concentratielabel (laag/optimaal/hoog) te voorspellen op basis van de beeldstroomfuncties op de trainingsset. Evalueer de classificatieprestaties van het getrainde logistische regressiemodel op de testset met behulp van nauwkeurigheid, precisie, terugroepactie, F1-score en oppervlakte onder de curve (AUC). Voer het Jupyter-notebook "machine_learning.ipynb" uit voor training en testen (Afbeelding 3E).
    8. Evalueer de prestaties van het model bij de beoordeling van de CHIR-dosis. Voeg in de testset voorspelde labels van parallelle putten met dezelfde CHIR-concentratie samen met behulp van afwijkingsscores (variërend van -1 tot 1), gedefinieerd door figure-protocol-3 , waarbij Nc het aantal putten met concentratie c aangeeft en figure-protocol-4 figure-protocol-5 en putten daaronder worden voorspeld als respectievelijk "laag" en "hoog". Bevestig dat de voorspelde afwijkingsscores sterk correleren met de werkelijke ΔCHIR-concentratie voor elke CHIR-dosis met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt.
    9. Voer een cross-batch validatie uit om de generalisatieprestaties van het model te testen. Laat in elke ronde één batch achter om te testen, terwijl je andere gebruikt voor training. Vergelijk de voorspelde afwijkingsscores en de werkelijke ΔCHIR-concentratie voor elke CHIR-dosis in elke testbatch met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Voer het Jupyter-notebook "cross_batch_validation.ipynb" uit om de validatie voor meerdere batches te implementeren (Afbeelding 3F).
      OPMERKING: Voor een geselecteerde CHIR-duur h wordt de voorspelling voor alle putten met concentratie uit het logistische regressiemodel dat onder duur h is getraind, omgezet in een afwijkingsscore, die de optimaliteit van de CHIR-concentratie c weerspiegelt. Een afwijkingsscore dicht bij 0 suggereert dat concentratie c optimaal wordt voorspeld onder duur h, terwijl een negatieve of positieve afwijkingsscore een onder- of overdosistoestand suggereert, wat kan dienen als een signaal voor latere aanpassing van CHIR-doses. Merk op dat, aangezien de voorspelling vroeg wordt gedaan (12 uur), de uiteindelijke CHIR-duur en CHIR-concentratie tijdens de rest van fase I nog kunnen worden aangepast.
    10. Pas de getrainde logistische regressiemodellen toe om CHIR-doses in nieuwe batches te beoordelen. Bereken voor een bepaalde CHIR-concentratie 0-12 uur beeldstroomfuncties voor parallelle putten met concentratie, geef de kenmerken door aan de logistische regressiemodellen die zijn getraind onder verschillende CHIR-duurtijden en verkrijg dienovereenkomstig de voorspelde labels voor elke put. Bereken op basis van de voorspelling van de modellen afwijkingsscores om elke CHIR-concentratie onder verschillende CHIR-duur te beoordelen.
    11. Met de modelgebaseerde CHIR-dosisbeoordeling kunnen putten onder elke suboptimale CHIR-concentratie dienovereenkomstig worden gered door hun CHIR-duur of -concentratie aan te passen naar optimaal vóór 48 uur.
      1. Duur aanpassen: volgens de modelvoorspelling over de optimale CHIR-duur, pas je het tijdstip aan waarop het CHIR-bevattende medium in deze putten wordt overgeschakeld naar het CM-differentiatiemedium. Als het optimale tijdstip wordt gemist, gooi deze monsters dan weg.
      2. Concentratie aanpassen: onder de vooraf ingestelde CHIR-duur, als de huidige concentratie als "laag" wordt voorspeld, voeg dan direct een hoge concentratie CHIR toe aan het medium om de CHIR-concentratie te verhogen. Verdun CHIR in DMSO (50 mM) met PBS indien nodig, voeg een geschikte hoeveelheid vloeistof toe en schud de plaat voorzichtig. Als de huidige concentratie als "hoog" wordt voorspeld, aspireer dan een bepaald volume CHIR-bevattend medium en vul aan met hetzelfde volume CM-differentiatiemedium.
        OPMERKING: In de eerste 48 uur van differentiatie zullen cellen factoren afscheiden om de celgroei en differentiatie te verbeteren, dus verander het medium niet volledig. Bovendien is het noodzakelijk om het gemiddelde volume constant te houden in differentiatie. Zorg er daarom voor dat de hoeveelheid toegevoegde vloeistof zo klein mogelijk is bij het aanpassen van de CHIR-concentratie.
  4. ML-strategie in fase II: erkenning van CM-gecommitteerde CPC's
    Dataset: paren van helderveldafbeeldingen op dag 6 en handmatig geannoteerde maskers van CM-vastgelegde CPC's
    Model: ResNeSt38 met Grad-CAM36 voor zwak begeleid leren
    1. Bereid een dataset voor die bestaat uit helderveldbeelden op dag 6. Annoteer handmatig CM-vastgelegde CPC's in de helderveldafbeeldingen door de cTnT+ -cellen in de afbeeldingsstreams van dag 12 terug naar dag 6 te volgen.
    2. Snijd de helderveldafbeeldingen en de bijbehorende handmatige annotatie (maskers genoemd) van CM-vastgelegde CPC's bij tot patches, waarbij elke patch een grootte heeft van 1/5,5 van de afbeeldingsgrootte van de hele put. Extraheer patches op een overlappende manier waarbij aangrenzende patches een overlapping van 50% delen in de trainingsset en een overlapping van 75% in de testset. Label patches met ≥30% CM-gecommitteerde CPC's als 'positief'. Label patches zonder CM-vastgelegde CPC's als 'negatief'. Zet de werkmap op "stage_II". Voer "./Crop_and_Reconstruct/mask_crop.m" uit om de afbeeldingen bij te snijden. Voer "./Crop_and_Reconstruct/classification.m" uit om labels (0: negatief; 1: positief) toe te wijzen aan helderveldpatches (Afbeelding 3G).
    3. Verdeel de gelabelde afbeeldingspatches willekeurig in een trainingsset en een testset.
    4. Train een diep convolutioneel neuraal netwerk, ResNeSt38 , om te leren deze patches te classificeren. Evalueer de getrainde ResNeSt op de testset om te bevestigen dat het model een hoge classificatienauwkeurigheid vertoont. Voer "train.py" en "test.py" uit voor respectievelijk training en testen (Afbeelding 3H).
    5. Gebruik Grad-CAM36 om de regio's te markeren die het meest bijdragen aan de gevolgtrekking van ResNeSt, weergegeven door heatmaps. Binariseer de heatmaps (met behulp van een drempelwaarde, bijvoorbeeld 10% × maximum) om de voorspelde CM-gecommitteerde CPC-regio's te krijgen, die imaged-recognized CPC (IR-CPC) regio's worden genoemd.
    6. Vergelijk de IR-CPC-regio's met handmatig geannoteerde maskers op de testset met behulp van nauwkeurigheid, F1-score, precisie, herinnering, specificiteit en intersection-over-union (IoU). Vergelijk het aandeel IR-CPC-regio's met differentiatie-efficiëntie-indexen (berekend op basis van de uiteindelijke cTnT-fluorescentiebeelden) met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Voer "./Evaluation/index_calculate.m" en "./Evaluation/Pearson_correlation.m" uit voor prestatie-evaluatie (Figuur 3I).
    7. Pas het getrainde model toe om CPC's voor nieuwe batches in fase II te herkennen. Snijd helderveldafbeeldingen van de hele put bij tot patches, geef de patches door aan de getrainde ResNeSt en verkrijg de IR-CPC-regio's op patchniveau, die vervolgens worden samengevoegd om de IR-CPC-regio's voor de hele put op te leveren. Bereken de fractie van IR-CPC-regio's als een indicator van de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie. Zuiver de IR-CPC's om celcontaminatie te verminderen (hieronder beschreven).
      OPMERKING: Aangezien het CPC-herkenningsmodel een vroege beoordeling kan maken van de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie, kan het ook dienen als een high-throughput uitlezing voor het screenen van kleine moleculen die bevorderlijk zijn voor het differentiatieproces, wat het differentiatieprotocol verder kan optimaliseren35.
  5. Regioselectieve zuivering van afgebeelde CPC's
    OPMERKING: Fotoactiveringsexperimenten zijn gebaseerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die wordt gefaciliteerd met een gemotoriseerde tafel.
    1. Volgens de IR-CPC-regio's die door het getrainde model worden voorspeld, gooit u de putten weg die geen IR-CPC's konden genereren. Om deze CM-toegewijde CPC's te zuiveren, gebruikt u een niet-cytotoxische foto-activeerbare sonde, Dual-Activatable Cell Tracker 1 (DACT-1) om niet-CPC39 regioselectief te labelen.
    2. Los de DACT-1 (10 mM) op in DMSO en bewaar deze bij -20 °C. Incubeer dag 6 cellen met 1 μM DACT-1 in CM-differentiatiemedium gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    3. Inspecteer de levende cellen onder een microscoop en selecteer het interessegebied (ROI) als polygonen in MATLAB. Teken parallelle lijnen met een tussenruimte van 20 μm binnen de veelhoek en bereken de coördinaten van de snijpunten.
    4. Stel de bewegende baan van de gemotoriseerde tafel in volgens spoorlijnen, dan zou de tafel met 0,12 mm/s bewegen, zodat een laserlijn van 405 nm (20 μm in diameter) die op de tafel is gemonteerd, de ROI globaal kan scannen om niet-CPC's beperkt te fotoactiveren. Detecteer na bestraling de DACT-1-gelabelde cellen met behulp van een laserlijn van 561 nm.
    5. Dissocieer cellen met 0,05% trypsine-EDTA (verdund door PBS) bij 37 °C gedurende 5-7 minuten en schud de plaat voorzichtig in een incubator gedurende 2 minuten. Filtreer de cellen door een celzeef van 40 μm en centrifugeer bij 500 × g gedurende 3 minuten. Resuspendeer de cellen in 0,5% BSA en houd de buis op het ijs tot het gesorteerd is. Bereid ook een niet-doorstraald monster voor als negatieve controle voor het sorteren.
    6. Start het sorteersysteem voor flowcytometrie op en stel de sorteersoftware in. Kies de lasers met een golflengte van 561 nm en gebruik een banddoorlaatfilter van 610/20 voor DACT1+-sortering. Gebruik voor elk monster een veelhoekig gating-hulpmiddel om de celpopulatie te omcirkelen in een bivariate plot van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) voor het selecteren van de enkele cel. Voer vervolgens de negatieve controle uit om de achtergrondfluorescentie te bevestigen, voer het regioselectief bestraalde monster uit en teken de poort voor de DACT1+ -populatie.
    7. Verzamel en resuspendeer de gesorteerde cellen in CM-onderhoudsmedium met 10% FBS en 5 μM Y27632, en zaai de gesorteerde cellen in een met Matrigel gecoate plaat met 96 putjes.
    8. Vervang de volgende dag het medium door CM-onderhoudsmedium en wacht met het oogsten van CM's met een hoge zuiverheid.
  6. ML-strategie in fase III: erkenning van CM's
    Dataset: paren van helderveldbeelden op dag 12 en de uiteindelijke cTnT-fluorescentiebeelden
    Model: pix2pix37
    1. Bereid een dataset voor die bestaat uit helderveldbeelden van CM's en de bijbehorende cTnT-fluorescentiebeelden. Om de diversiteit te vergroten, moet u ervoor zorgen dat de dataset putten bevat met verschillende differentiatie-efficiënties en cellijnen.
    2. Verdeel de dataset willekeurig in een trainingsset en een testset. Zet de werkmap op "stage_III". Sla de helderveldbeelden en de bijbehorende cTnT-fluorescentiebeelden op bij respectievelijk "./pix2pix/datasets/(CM|CM_new_cell_lines)/A/(train|test)/*.png" en ".../B/(train|test)/*.png". Voer de volgende opdracht uit:
      cd pix2pix/datasets
      python combine_A_and_B.py --fold_A ./CM/A --fold_B ./CM/B --fold_AB ./CM/ --no_multiprocessing
      cd..
    3. Train de pix2pix model37 op de trainingsset. Voer de volgende opdracht uit (Afbeelding 3J):
      python train.py --dataroot ./datasets/CM --naam brightfield2fluorescentie --model pix2pix --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 256 --lr 2e-4 --n_epochs 1000 --n_epochs_decay 0 --norm instantie --netD n_layers --n_layers_D 1 --batch_size 16 --richting AtoB --save_epoch_freq 100 --dataset_mode uitgelijnd --use_resize_conv --zaad 1234
    4. Pas het getrainde pix2pix-model toe op de testset. Voer de volgende opdracht uit:
      python test.py --dataroot ./datasets/CM --naam brightfield2fluorescence --model pix2pix --richting AtoB --input_nc 1 --output_nc 1 --load_size 1536 --crop_size 1536 --use_resize_conv --eval --num_test 1000
    5. Vergelijk de fluorescentiebeelden die door het model worden voorspeld met de echte (d.w.z. experimenteel verkregen) beelden. Vergelijk op pixelniveau de voorspelde intensiteiten en de werkelijke intensiteiten met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Vergelijk bovendien op afbeeldingsniveau de voorspelde differentiatie-efficiëntie-indexen met de echte met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Voer "stage_III/evaluation/pixel_correlation.m" en "image_correlation.ipynb" uit voor deze vergelijkingen (Figuur 3K,L).
    6. Pas het getrainde model toe om CM's in nieuwe batches te herkennen in fase III. Geef nieuwe helderveldbeelden van CM's door aan het getrainde pix2pix-model en verkrijg een in-silico voorspelling van de fluorescentiebeelden en differentiatie-efficiëntie.
      OPMERKING: Om celcontaminatie te verminderen, is op DACT-1 gebaseerde fotoactieve celsortering ook van toepassing op het zuiveren van CM's die door het model worden erkend.

Resultaten

Op basis van brightfield imaging en ML kan het algehele differentiatieproces intelligent worden bewaakt en geoptimaliseerd. In de PSC-fase ontwikkelden we een ML-model dat de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie kon voorspellen op basis van de morfologische kenmerken van de initiële PSC-kolonies, om het meest geschikte of geschikte tijdstip te bepalen om differentiatie te starten (Figuur 4A,B). De differentiatie-efficiëntie die door het random forest-model wordt voorspeld, is sterk gecorreleerd met de werkelijke differentiatie-efficiëntie (Pearson's r = 0,76, P < 0,0001) (Figuur 4B). Het getrainde model benadrukt ook kenmerken die het belangrijkst zijn voor de differentiatie. Van alle morfologische kenmerken van de kolonie zijn de standaarddeviatie, de minimale en min/max-verhouding van de centrum-contourafstanden (CCD), evenals de omtrek, de oppervlakte, de oppervlakte/omtrekverhouding, de convexiteit en de cirkelvormigheid, de 8 kenmerken met het meeste gewicht. De relatie tussen deze kenmerken en de uiteindelijke efficiëntie suggereert dat initiële PSC-kolonies met een matig oppervlak en met langere, onregelmatige periferieën over het algemeen een hogere differentiatie-efficiëntie hadden (Figuur 4A), wat ons inspireert om de differentiatie-efficiëntie te verbeteren door de verwerkingstijd van de vergistingsoplossing te verlengen om kleinere kolonies met langere, meer onregelmatige grenzen te verkrijgen (zie Protocolstap 1.3.1). ML-gebaseerde monitoring van PSC-kolonies en de geoptimaliseerde celpassaging-operaties realiseren de optimalisatie van de initiële celtoestand.

In stadium I van cardiale differentiatie hebben we de dosis CHIR (een inductor voor vroege cardiale differentiatie) beoordeeld en aangepast met behulp van ML. Met behulp van logistische regressie kan de CHIR-dosis vroeg worden geëvalueerd met behulp van 0-12 uur time-lapse helderveldbeelden. De logistische regressieclassificatie bereikt een nauwkeurigheid van 93,1%, een precisie van 88,7%, een recall van 94,5%, een F1-score van 91,1% en een AUC van 97,2% wanneer de duur van de CHIR is geselecteerd op 24 uur. De afwijkingsscores (voorspeld resultaat) zijn sterk gecorreleerd met "ΔCHIR-concentratie" (echt resultaat) voor elke CHIR-dosisconditie in experimenten (Pearson's r = 0,82, P < 0,0001) (Figuur 4C,D), wat suggereert dat ML-voorspelling de afwijking van CHIR-doses van optimaal kan weerspiegelen. Met een vroege evaluatie van CHIR-doses kunnen we de duur of concentratie van de CHIR-behandeling vóór 48 uur aanpassen naar het optimale, waardoor we het verkeerd gedifferentieerde celtraject onmiddellijk kunnen corrigeren en de CM-differentiatie met hoge efficiëntie kunnen ondersteunen.

We hebben ook ML-modellen gebouwd om CPC's en CM's informatief te herkennen uit helderveldbeelden in stadium II en fase III van differentiatie (Figuur 5A-D). Door helderveldbeelden van levende cellen in te voeren, kunnen getrainde ML-modellen de regionale verdeling van CPC's en CM's voorspellen en de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie niet-invasief evalueren. Voor CPC-herkenning komen de door ResNeSt en Grad-CAM voorspelde CPC-segmentatiemaskers overeen met handmatig geannoteerde maskers (Figuur 5A), met een gemiddelde IoU van 59,0%. Het voorspelde aandeel van CPC-regio's kan ook dienen als indicator voor de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie (Pearson's r = 0,88, P < 0,0001) (Figuur 5B). Voor CM-herkenning kan het pix2pix-model cTnT-fluorescentiebeelden genereren die vergelijkbaar zijn met echte (experimenteel verkregen) cTnT-fluorescentiebeelden (Figuur 5C), met een hoge correlatie tussen voorspelde en echte Differentiation Efficiency Index voor hele put (Pearson's r = 0,93, P < 0,0001) (Figuur 5D). Deze aanpak voorkomt onomkeerbare schade aan cellen veroorzaakt door immunofluorescentiekleuring of flowsorting. Op basis van een fotoactieve sonde (DACT-1) hebben we met succes een efficiënte regioselectieve CPC-zuivering bereikt zonder biomarkers (Figuur 5E,F), waardoor real-time zuivering van het gewenste celtype tijdens het differentiatieproces mogelijk is.

Door gebruik te maken van live-cell brightfield-beeldvorming en ML, realiseert de methodologie dus real-time voorspelling van de celafstamming en efficiëntie-evaluatie in het gehele differentiatieproces, waardoor PSC-differentiatie wordt gemoduleerd en gestabiliseerd.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de ML-ondersteunde CM-differentiatieworkflow. De onderzoeker voert cardiale differentiatie uit en verkrijgt time-lapse helderveldcelbeelden van een microscoop; beelden in elk stadium van CM-differentiatie worden doorgegeven aan getrainde ML-modellen voor voorspelling; Met behulp van de voorspelling als feedback moduleren en optimaliseren onderzoekers het differentiatieschema in realtime om stabiele, zeer efficiënte differentiatie te bereiken. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Acquisitie van celbeelden. (A) Voorbeeld van een helderveld live-celbeeld uit het PSC-stadium met 70% celconfluentie. (B) Voorbeeld van een helderveld live-cell beeld van het PSC-stadium met 80-90% celconfluentie. (C) Voorbeeld van een helderveld live-cell beeld van de CPC-fase. (D) Voorbeeld van een helderveld live-cell beeld van de CM-tafel. (E) Voorbeeld van een helder veld en fluorescentie na immunofluorescentiekleuring vanuit hetzelfde gezichtsveld. (A-E) Schaal balk = 250 μm. Afkortingen: PSC = pluripotente stamcel; CPC = cardiale voorlopercel; CM = cardiomyocyt; cTnT = cardiaal troponine T. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Schermafbeeldingen voor ML-gebruik. (A-C) Representatieve schermafbeeldingen voor ML in de PSC-fase, inclusief (A) voorbereiding van de dataset, (B) testmodelprestaties en (C) interpretatie van het belang van functies. (D-F) Representatieve screenshots voor ML in fase I, inclusief (D) voorbereiding van de dataset en (E,F) modelevaluatie. (G-I) Representatieve screenshots voor ML in fase II, inclusief (G) voorbereiding van de dataset, (H) modeltraining en (I) modelevaluatie. (J-L) Representatieve screenshots voor ML in fase III, inclusief (J) modeltraining en (K,L) modelevaluatie. Afkortingen: ML = machine learning; PSC = pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve resultaten in de PSC-fase en fase I voor ML-gebaseerde CM-differentiatie. (A) Resultaten van functievisualisatie in de PSC-fase. De relatie tussen differentiatie-efficiëntie en de acht belangrijkste kenmerken wordt getoond. Het belang van functies wordt bepaald door het getrainde ML-model. Het assortiment van elke functie is verdeeld in 20 bakken. Differentiatie-efficiëntie-indexen voor putten binnen elke bak worden gemiddeld en weergegeven op kleur. De trend van de kleurverandering geeft aan hoe elk morfologische kenmerk de uiteindelijke differentiatie-efficiëntie beïnvloedt. Deze resultaten samen suggereren dat een matig gebied, langere omtrekken, meer variërende afstanden tussen het centrum en de contouren, een lagere cirkelvormigheid en een hogere convexiteit meer bevorderlijk zijn voor differentiatie. (B) Evaluatie van de prestaties van ML in het PSC-stadium door middel van correlatieanalyse tussen de werkelijke en de voorspelde differentiatie-efficiëntie-index. De hoge correlatie geeft aan dat het differentiatiepotentieel van PSC-kolonies kan worden voorspeld op basis van de morfologische kenmerken. n = 584 putten. (C) Prestatie-evaluatie van ML in fase I met behulp van correlatieanalyse tussen voorspelde afwijkingsscores en werkelijke ΔCHIR-concentraties voor elke CHIR-dosisconditie in een batch. Afwijkingsscores (variërend van -1 tot 1) worden niet-invasief voorspeld door ML met behulp van 0-12 uur helderveldbeeldstreams. ΔCHIR-concentraties (..., -4 μM, -2 μM, 0, 2 μM, 4 μM, ...) worden experimenteel bepaald door de uiteindelijke differentiatieresultaten om de werkelijke afwijking van optimale omstandigheden voor elke CHIR-conditie te meten. Voorspelde afwijkingsscores zijn zeer indicatief voor de werkelijke ΔCHIR-concentraties, wat suggereert dat ML-voorspelling kan dienen als een signaal voor de beoordeling en aanpassing van de CHIR-dosis. Blauwe en rode vakken geven respectievelijk onderdosering en overdosering aan. (D) Evaluatie van de prestaties van ML in fase I met behulp van cross-batch validatie. In elke ronde wordt één batch gebruikt voor testen, terwijl andere voor training zijn, om het generalisatievermogen van ML-modellen op nieuwe batches te testen. Er wordt een correlatieanalyse uitgevoerd tussen voorspelde afwijkingsscores en werkelijke ΔCHIR-concentraties (onder een CHIR-duur van 24 uur). De kleur van de stippen staat voor verschillende testbatches. n = 20 CHIR-doses. Dit cijfer is ontleend aan Yang et al.35. Afkortingen: ML = machine learning; PSC = pluripotente stamcel; CHIR = CHIR99021. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve resultaten in het CPC-stadium en het CM-stadium voor CM-differentiatie op basis van ML. (A) Typisch resultaat van ML voor CPC-herkenning in fase II. Getoond worden de echte cTnT-fluorescentiebeelden op dag 12 (links), de handmatig geannoteerde CPC-gebieden (midden) en de CPC-gebieden voorspeld door ML met behulp van helderveldbeelden op dag 6 (rechts). De voorspelde resultaten lijken sterk op de werkelijke experimentele resultaten. Schaalbalk = 1 mm. (B) Prestatie-evaluatie van ML in fase II met behulp van correlatieanalyse tussen de echte differentiatie-efficiëntie-index (vanaf dag 12 cTnT-fluorescentielabels) en het voorspelde percentage CPC-regio's (vanaf dag 6 helderveldbeelden). De hoge correlatie suggereert dat de differentiatie-efficiëntie niet-invasief kan worden voorspeld in stadium II. Echte differentiatie-efficiëntie-indexen zijn genormaliseerd tussen 0% en 100%. n = 35 putten. (C) Typisch resultaat van ML voor CM-herkenning in stadium III. Getoond worden de echte cTnT-fluorescentieresultaten (links), de voorspelde cTnT-fluorescentieresultaten (midden) en de heatmap voor het vergelijken van voorspelde en werkelijke fluorescentie-intensiteiten op elke pixel (rechts). Het formaat van fluorescentieafbeeldingen wordt gewijzigd in 512 x 512 pixels en de getallen in de heatmap-opslaglocaties vertegenwoordigen het frequentieaantal pixels per 100. Een groot deel van de pixels bevindt zich langs de diagonale lijn van de heatmap, wat aangeeft dat de voorspelde en werkelijke fluorescentie-intensiteiten dicht bij elkaar liggen. Schaalbalk = 1 mm. (D) Prestatie-evaluatie van ML in fase III met behulp van correlatieanalyse tussen de werkelijke en voorspelde differentiatie-efficiëntie-indexen. Echte en voorspelde differentiatie-efficiëntie-indexen zijn genormaliseerd tussen 0% en 100%. n = 36 putten. (E) Beeldgeïdentificeerd CPC-zuiveringseffect van dag 6. Na FACS en 6 dagen kweek vertonen niet-gelabelde beeldgeïdentificeerde CPC's een hoge CM-zuiverheid in vergelijking met DACT-1-gelabelde niet-CPC's en cellen van de controlegroep (CTL). Schaalbalk = 100 μm. (F) Kwantitatieve analyse van het zuiveringseffect door vergelijking van het percentage cTnT+- cellen in (E). Gegevens zijn middelen ± SD. n = 5 afbeeldingen. * P < 0,05; P < 0,0001 door eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstests van Dunnett. Dit cijfer is ontleend aan Yang et al.35. Afkortingen: ML = machine learning; PSC = pluripotente stamcel; CPC = cardiale voorlopercel; CM = cardiomyocyt; cTnT = cardiaal troponine T. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Waargenomen probleemMogelijke redenOplossing
ML-modellen presteren niet goed op de trainingsset.1. De training van het ML-model sluit niet goed op elkaar aan.
2. Voor traditionele ML zijn de geëxtraheerde afbeeldingskenmerken niet informatief genoeg om celtoestanden en afstammingslijnen weer te geven.
3. Voor deep learning is de representatiekracht van het ontworpen neurale netwerk niet voldoende om de taak uit te voeren.
4. De taak zelf is moeilijk te leren.		1. Stem hyperparameters af, verhoog bijvoorbeeld het aantal epochs en wijzig de leersnelheid.
2. Observeer de afbeeldingen om morfologische aanwijzingen te vinden over de celtoestanden. Ontwerp biologisch plausibele kenmerken.
3. Wijzig de netwerkarchitectuur om de complexiteit te vergroten.
4. Onderzoek de dataset en zorg ervoor dat de kenmerken van doelcellen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Als het model er niet in slaagt de taak te leren, probeer dan ML toe te passen in een stadium waarin de beeldvormingsaanwijzingen duidelijker zijn of om een eenvoudigere taak te ontwerpen.
ML-modellen presteren niet goed op de trainingsset, maar niet op de testset.1. Het model past te veel bij de trainingsset.1. Verrijk de trainingsdatasets en train het model opnieuw. Vergroot de diversiteit van de trainingsdatasets door meer cellijnen, differentiatievoorwaarden en beeldvormingsvoorwaarden op te nemen.
Voor traditionele ML kan het gebruik van functieselectie om het aantal invoerfuncties te verminderen ook het generalisatievermogen van het model vergroten.
ML-modellen presteren niet goed op nieuwe batches of nieuwe cellijnen.1. Microscoop- en beeldvormingsparameters veranderen.
2. Morfologische kenmerken van verschillende cellijnen kunnen verschillen.		1. Zorg ervoor dat het beeldvormingsapparaat hetzelfde is als tijdens de modeltraining.
2. Verzamel gelabelde gegevens die zijn verkregen van nieuwe cellijnen en/of nieuwe beeldvormingsomstandigheden, train of verfijn de ML-modellen.
ML-geleide modulatie van het differentiatieproces lijkt de differentiatie-uitkomst niet te verbeteren.1. De ML-uitvoer is onnauwkeurig.
2. Er zijn problemen met de experimentele reagentia of procedures.
3. De cellijn heeft onderliggende problemen, zonder het vermogen om te differentiëren.		1. Probeer de hierboven genoemde stappen voor probleemoplossing.
2. Inspecteer de laboratoriumreagentia en experimentele procedures.
3. Verander cellijnen.
Celtypebesmetting bestaat nog steeds na zuivering.1. Onnauwkeurige voorspellingsresultaten.
2. Sommige ongewenste cellen die zich aan de rand van het gezuiverde gebied bevonden, werden ingekapseld.		1. Optimaliseer de ML-voorspelde resultaten.
2. Gebruik de ML-voorspelde resultaten conservatiever, d.w.z. een passende vermindering van de grootte van de CM-regio.
Slechte celstatus na zuivering.1. Laser fototoxiciteit.
2. Langzaam werkingsproces.
3. Celbeschadiging veroorzaakt door spijsvertering.
4. Celbeschadiging veroorzaakt door het sorteerproces van de stroom.		1. Elimineer de ongewenste cellen via laserbestraling in plaats van doelcellen.
2. Snellere werking.
3. Pas de passaging-methode aan, zoals het verminderen van de concentratie van spijsverteringsenzymen.
4. Pas de sorteermethode aan, zoals het verlagen van de tijdens het sorteerproces ingestelde celstroomsnelheid.

Tabel 1: Tabel voor probleemoplossing.

Discussie

Hier hebben we een gedetailleerd protocol beschreven om een van de grootste problemen in de huidige PSC-toepassing en -vertaling op te lossen: de variabiliteit in celdifferentiatie. Door gebruik te maken van live-cell brightfield-beeldvorming en ML, hebben we de PSC-differentiatie iteratief geoptimaliseerd om een consistent hoge efficiëntie te bereiken over cellijnen en batches. In het bovenstaande differentiatieproces hebben verschillende kritieke stappen in het protocol echter een doorslaggevende invloed op het al dan niet slagen van de differentiatie. Aangezien de celtoestand in het PSC-stadium en stadium I cruciaal is, moeten onderzoekers speciale aandacht besteden aan de vroege celmorfologie, celsamenvloeiing op dag 0 en de omstandigheden van CHIR-behandeling. Bovendien moeten onderzoekers proberen het oorspronkelijke medium te behouden en het volume van het celkweekmedium ongewijzigd te houden terwijl de CHIR-dosis gedurende 0-48 uur wordt gemoduleerd. Bovendien moet bij het fotograferen en zuiveren rekening worden gehouden met fototoxiciteit. Celbeschadiging kan worden verminderd door te kiezen voor helderveldbeeldvorming in plaats van fluorescentiebeeldvorming; om deze reden hebben we ook UV gebruikt om ongewenste cellen te fotoactiveren in plaats van doelcellen. Bovendien zijn de zuiveringsstappen die we hierboven hebben beschreven op basis van beeldinformatie omslachtig en moeten ze meerdere stappen doorlopen van beeldvoorspelling, regionale fotoactivering, doorstroming en passaging, wat het moeilijk maakt om de zuivering van grote aantallen cellen te realiseren. In-situ zuivering kan worden overwogen als er andere regio-geselecteerde celdodende apparaten beschikbaar zijn, waardoor de celpasseerstap niet nodig is.

Er moeten echter ook verschillende zaken in overweging worden genomen bij het toepassen van ML om het differentiatieproces te moduleren. De kwaliteit van datasets en de keuze van modellen en hyperparameters hebben een grote impact op de prestaties van ML. Het is niet gegarandeerd dat onze specifieke implementatie optimaal is voor alle differentiatiesystemen en celtypen; daarom moeten ervaren ML-ingenieurs de implementatie aanpassen aan hun eigen behoeften. Bij het trainen en testen van de ML-modellen, als de testprestaties veel achterblijven bij de trainingsprestaties, kan het model overfit zijn; Probeer in dit geval de trainingssets te verrijken en het model opnieuw te trainen. Als het model zelfs op de trainingsset niet goed kan presteren, onderzoek dan de dataset en zorg ervoor dat het kenmerk van doelcellen gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Het afstemmen van hyperparameters kan ook helpen. Zorg er bovendien bij het toepassen van ML-modellen in praktijkscenario's voor dat de microscoop- en beeldvormingsparameters identiek zijn aan die tijdens de modeltraining; anders zullen de prestaties van getrainde ML-modellen verslechteren. Als de verandering van de beeldvormingsomstandigheden onvermijdelijk is, verkrijg dan gelabelde gegevens van nieuwe omstandigheden en train of verfijn de ML-modellen. Ten slotte, als celdifferentiatie niet succesvol blijft na ML-hulp, moet rekening worden gehouden met aspecten zoals de inherente differentiatieneiging van de PSC-lijn of batchverschillen in experimentele reagentia, die fundamenteler kunnen zijn en niet kunnen worden aangepakt met behulp van onze strategie. Er is een gids voor probleemoplossing opgenomen om te helpen bij het identificeren en oplossen van mogelijke problemen (tabel 1).

Deze methodologie heeft het potentieel om te worden toegepast in andere celonderzoeksgebieden. De variabiliteit bestaat vaak in het PSC-differentiatieproces, zoals PSC-gedifferentieerde neuronen, hepatocyten, eilandjes en darmen 40,41,42,43,44, waardoor de grootschalige celproductie ernstig in gevaar komt. Cellen belichamen echter vaak rijke en gevarieerde morfologische kenmerken tijdens overgangen van het lot van cellen, die aanwijzingen geven om het differentiatieproces te moduleren met behulp van op afbeeldingen gebaseerde ML. We hebben eerder de waarde aangetoond van het toepassen van de strategie voor differentiatiesystemen voor niervoorlopercellen en hepatocyten35. Deze methode zou hopelijk kunnen worden toegepast om andere inductiesystemen voor het lot van cellen te standaardiseren, zoals organoïde differentiatie, directe transdifferentiatie of celherprogrammering, in het bijzonder voor die onstabiele systemen die meerdere stappen en complexe inductoren vereisen.

Openbaarmakingen

Yang Zhao, Jue Zhang, Xiaochun Yang, Yao Wang en Daichao Chen dienen een patent in voor de PSC-differentiatiestrategie die in dit artikel wordt gerapporteerd (202210525166.X).

Dankbetuigingen

We danken Qiushi Sun, Yao Wang, Yu Xia, Jinyu Yang, Chang Lin, Zimu Cen, Dongdong Liang, Rong Wei, Ze Xu, Guangyin Xi, Gang Xue, Can Ye, Li-Peng Wang, Peng Zou, Shi-Qiang Wang, Pablo Rivera-Fuentes, Salome Püntener, Zhixing Chen, Yi Liu en Jue Zhang voor het leggen van de basis van deze strategie. Dit werk werd ondersteund door het National Key R&D-programma van China (2018YFA0800504, 2019YFA0110000) en het Space Medical Experiment Project van het China Manned Space Program (HYZHXM01020) aan Yang Zhao. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056Verdunde digests werden gebruikt voor CPC en CM-digestie
4% Paraformaldehyde in PBSKeyGEN BioTECHKGIHC016
6-well Cell Culture PlateNEST703001
96-well Cell Culture PlateNEST701001
B27 SupplementGibco17504044
B27 Supplement Minus InsulinGibcoA1895601
Bovine serum albumin (BSA)GPC BIOTECHAA904-100G
Celldiscoverer 7ZeissInstrumenten die worden gebruikt om heldere-veldbeelden te maken tijdens differentiatie en uiteindelijke cTnT-beelden
CHIR99021SelleckS1263
DMEM/F12Gibco12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoA-21202Secundaire antilichaam
FACSAria IIIBD BiosciencesFlow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)VISTECHSE100-B
Hoechst 33342YEASEN40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined MediumCauliscell Inc400105Basismedium van PSC-voorbereidingsmedium
iPS-18TaKaRaY00300
iPS-B1CellapyCA4025106
iPS-FNuwacellRC01001-B
iPS-MNuwacellRC01001-A
IWR1-1-endoSelleckS7086IWR1
Jupyter NotebookN/AVersie 6.4.0https://jupyter.org/
MATLABMathWorksVersie R2020aSoftware voor wetenschappelijke berekening en afbeeldingsannotatie
Matrigel MatrixCorning354230Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnTThermoMA5-12960cTnT primaire antilichaam
Normal Donkey SerumJackson017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CUDe digitale camera geassembleerd op Celldiscoverer7
PBSNEB21-040-CVR
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal mediumCellapyCA1007500-1Basismedium van PSC-kweekmedium
Pluripotency Growth Mater 1 supplementCellapyCA1007500-2Supplement van PSC-kweekmedium
PrismGraphpadVersie 8/9Statistisch software voor statistische analyse en plotten
PythonN/Aversie 3.6Python 3-omgeving voor wetenschappelijke berekening, met packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python en matplotlib software voor wetenschappelijke berekening en afbeeldingsannotatie.
RPMI 1640Gibco11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)Cauliscell Inc00015Supplement van PSC-voorbereidingsmedium
TiENikonEen omgekeerde fluorescentiemicroscoop (met wijzigingen) voor region-selevtive zuivering
Triton X-100Amresco9002-93-1
Versene SolutionThermo15040066EDTA-oplossing voor PSC-digestie
Y27632SelleckS6390
ZenZeissVersie 3.1Een ondersteunende software van Celldiscoverer7 voor  beeldverwerving, verwerking en analyse

Referenties

  1. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells 10 years later: for cardiac applications. Circ Res. 120 (12), 1958-1968 (2017).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat Rev Drug Discov. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  4. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Mordwinkin, N. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. A review of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for high-throughput drug discovery, cardiotoxicity screening, and publication standards. J Cardiovasc Transl Res. 6 (1), 22-30 (2013).
  6. Vanden Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes under defined conditions. Methods Mol Biol. 1353, 163-180 (2016).
  7. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87, 1-15 (2015).
  8. Li, J., et al. Human pluripotent stem cell-derived cardiac tissue-like constructs for repairing the infarcted myocardium. Stem Cell Rep. 9 (5), 1546-1559 (2017).
  9. Smith, A. S. T., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. -H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnol Adv. 35 (1), 77-94 (2017).
  10. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nat Protoc. 13 (12), 3018-3041 (2018).
  11. Mehta, A., et al. Identification of a targeted and testable antiarrhythmic therapy for long-QT syndrome type 2 using a patient-specific cellular model. Eur Heart J. 39 (16), 1446-1455 (2018).
  12. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 357-368 (2013).
  13. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  14. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genet. 10 (6), e1004432(2014).
  15. Kim, K., et al. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (12), 1117-1119 (2011).
  16. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307(2015).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Matoba, N., Yamashita, T., Takayama, K., Sakurai, F., Mizuguchi, H. Optimal human iPS cell culture method for efficient hepatic differentiation. Differentiation. 104, 13-21 (2018).
  19. Volpato, V., et al. Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study. Stem Cell Rep. 11 (4), 897-911 (2018).
  20. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Rep. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  21. Sepac, A., et al. Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC lines. Cell Transplant. 21 (11), 2523-2530 (2012).
  22. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  23. Volpato, V., Webber, C. Addressing variability in iPSC-derived models of human disease: guidelines to promote reproducibility. Dis Model Mech. 13 (1), 042317(2020).
  24. Hu, B. -Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  25. Huo, J., et al. Evaluation of batch variations in induced pluripotent stem cell-derived human cardiomyocytes from 2 major suppliers. Toxicol Sci. 156 (1), 25-38 (2017).
  26. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based machine learning for identification of macrophage subsets. Sci Rep. 7 (1), 3521(2017).
  27. Christiansen, E. M., et al. In silico labeling: Predicting fluorescent labels in unlabeled images. Cell. 173 (3), 792-803 (2018).
  28. Buggenthin, F., et al. Prospective identification of hematopoietic lineage choice by deep learning. Nat Methods. 14 (4), 403-406 (2017).
  29. Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A., Meissner, A. Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event. Nat Biotechnol. 28 (5), 521-526 (2010).
  30. Fan, K., Zhang, S., Zhang, Y., Lu, J., Holcombe, M., Zhang, X. A machine learning assisted, label-free, non-invasive approach for somatic reprogramming in induced pluripotent stem cell colony formation detection and prediction. Sci Rep. 7 (1), 13496(2017).
  31. Kusumoto, D., et al. Automated deep learning-based system to identify endothelial cells derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 10 (6), 1687-1695 (2018).
  32. Zhu, Y., et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 2614(2021).
  33. Qian, T., et al. Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation. Nat Commun. 12 (1), 4580(2021).
  34. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nat Methods. 15 (11), 917-920 (2018).
  35. Yang, X., et al. A live-cell image-based machine learning strategy for reducing variability in PSC differentiation systems. Cell Discovery. 9 (1), 53(2023).
  36. Selvaraju, R. R., et al. Grad-CAM: Visual explanations from deep networks via gradient-based localization. Proc IEEE Int Conf Computer Vision (ICCV). , 618-626 (2017).
  37. Isola, P., Zhu, J. -Y., Zhou, T., Efros, A. A. Image-to-image translation with conditional adversarial networks. Proc IEEE Conf Computer Vision Pattern Recognition (CVPR). , 5967-5976 (2017).
  38. Zhang, H., et al. ResNeSt: Split-attention networks. Proc IEEE/CVF Conf Computer Vision Pattern Recognition Workshops (CVPRW). , 2735-2745 (2022).
  39. Halabi, E. A., et al. Dual-activatable cell tracker for controlled and prolonged single-cell labeling). ACS Chem. Biol. 15 (6), 1613-1620 (2020).
  40. Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 8 (2), 430-437 (2013).
  41. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2454, 109-115 (2022).
  42. Harding, M. J., McGraw, H. F., Nechiporuk, A. The roles and regulation of multicellular rosette structures during morphogenesis. Development. 141 (13), 2549-2558 (2014).
  43. Najm, F. J., et al. Rapid and robust generation of functional oligodendrocyte progenitor cells from epiblast stem cells. Nat Methods. 8 (11), 957-962 (2011).
  44. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β cells from multiple human stem cell lines. Nat Protoc. 16 (9), 4109-4143 (2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Pluripotente stamcellenlive cell imagingbright field imagingcelslotconversiecardiomyocytdifferentiatiebeeldgebaseerde analysecellijnvariabiliteithigh throughput imaging
Een op live-cell beelden gebaseerde machine learning-strategie om pluripotente stamceldifferentiatie te monitoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.