Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het analyseren van mandibulaire botreparatie. We beschrijven een reproduceerbare techniek voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fractuur in een muismodel, waarmee het proces van endochondraal botherstel kan worden geanalyseerd met minimale weefselschade en botverlies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Minder invasieve techniek voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fractuur in muismodellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Niet-gestabiliseerde fracturen kunnen worden gemaakt op mandibulaire plaatsen bij muizen, waardoor het mogelijk wordt om botherstel te analyseren met behulp van een endochondrale ossificatiemodus. Om dit proces in vivo zo nauwkeurig mogelijk weer te geven, is het noodzakelijk om een gestandaardiseerd protocol te hebben om overmatig botverlies en schade aan zacht weefsel te voorkomen, met name op de mandibulaire plaats, een anatomische plaats die wordt gekenmerkt door minimale toegang. Voor zover wij weten, beschrijven we voor het eerst een minder invasief protocol van niet-gestabiliseerde mandibulaire fracturen bij muizen. Volwassen muizen worden verdoofd met isofluraan en krijgen een preoperatieve dosis buprenorfine via subcutane injectie. Er wordt een submandibulaire benadering uitgevoerd, waarbij een incisie in de huid wordt gemaakt langs de onderrand van de onderkaak. De kauwspier wordt verhoogd in een subperiostaal vlak langs de mandibulaire ramus met een periostale lift. Een verticale en volledige fractuur van de ramus wordt uitgevoerd van de basilaire grens tot de coronoïde inkeping (tussen condylaire en coronoïde processen), met behulp van een piëzo-elektrisch botchirurgieapparaat onder zoutoplossing serumirrigatie aan de basilaire rand en een schaar om de fractuur van de mandibulaire ramus te voltooien. De huidbenadering wordt afgesloten door zijden hechtingen. Deze gedetailleerde procedure voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fracturen biedt een efficiënte procedure die minimaal botverlies en schade aan zacht weefsel mogelijk maakt. Deze techniek zorgt voor succesvolle en consistente resultaten om het proces van endochondraal botherstel in muismodellen nauwkeurig weer te geven.
Inleiding
Botherstel impliceert zowel membraneuze als endochondrale verbenvormingsprocessen, afhankelijk van de fractuur of osteotomiestabilisatie. Botherstel na gestabiliseerde botosteotomieën of fracturen is gebaseerd op membraneuze verbenvorming, terwijl niet-gestabiliseerde fracturen of slecht gestabiliseerde osteotomieën consolideren volgens een modus van endochondrale verbening1. Vliezig botherstel wordt gekenmerkt door botvorming door directe differentiatie van mesenchymale cellen in osteoblasten, terwijl endochondraal botherstel de vorming van een voorbijgaand kraakbeenachtig sjabloon inhoudt, dat differentieert in osteoblasten om de botcallus2 te vormen.
Botherstel is afhankelijk van meerdere weefsel- en cellulaire interacties; Het wordt ook beïnvloed door plaatsspecifieke factoren en door de kracht die wordt uitgeoefend op de eelt3. Mandibulaire bot is een mobiel bot dat kauwkrachten ondersteunt, meestal gevormd door corticaal bot. Het proces van mandibulaire botreparatie wordt beïnvloed door de plaats en de richting van de fractuur. Het is algemeen bekend dat spier- en periostletsels van invloed kunnen zijn op de botconsolidatie en op belangrijk botverlies op de plaats van de fractuur 4,5,6.
Het analyseren van endochondraal mandibulaire botherstel impliceert gestandaardiseerde en reproduceerbare protocollen voor waardevolle, niet-bevooroordeelde vergelijkingen. Wat de literatuur betreft, rapporteren slechts enkele auteurs protocollen voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fracturen in muizenmodellen 3,7, en meestal met een anterieure richting op molair niveau8. Door deze techniek te ontwikkelen, streven we ernaar spier- en periostblessures te voorkomen en botverlies op de plaats van de fractuur te beperken om het proces van endochondraal botherstel zo goed mogelijk te analyseren zonder verstorende factoren. Bovendien was het doel van het ontwikkelen van een nieuwe techniek voor mandibulaire fracturen bij muizen om postoperatieve pijn en dierensterfte die vaak voorkomen bij dergelijke operaties bij kleine dieren te minimaliseren. Voor het eerst beschrijven we een minder invasief protocol voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fracturen ter hoogte van de ramus bij muizen. Dit in vivo protocol vermijdt overmatige spier- en periostschade of botverlies op de plaats van de fractuur en helpt het niveau van postoperatieve pijn en het risico op overlijden van het dier te verminderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierenverzorging van Imagine Institute en is gevalideerd door ethische commissies en het Franse ministerie (APAFIS 26995).
1. Dieren
- Bepaal het aantal dieren per groep. Wij adviseren 12 dieren per groep. Bepaal het geslacht en de leeftijd van muizen. Dit protocol is aangepast voor C57BL/6J-muizen van 6 weken oud (mannelijk of vrouwelijk).
- Geef dieren, ten minste 1 week voor de ingreep, voedingssupplementengel ter acclimatisatie.
2. Chirurgische ingreep
- Bereid het benodigde materiaal voor. Autoclaaf de instrumenten: schaar, naaldschroevendraaier, tang, inzetstuk en handstuk van het piëzo-elektrische botchirurgieapparaat en lift. Bereid steriele handschoenen, zijden hechtingen (4/0), scheerapparaat, katoenen gaas, 10% povidonjodiumoplossing, verwarmingstafel, isofluraan en het snuitmasker voor op inhalatie van isofluraan.
- Bereid buprenorfine in een dosis van 0,1 mg/kg, verdund in steriel injecteerbaar fysiologisch serum. Dien buprenorfine toe via subcutane injectie met een naald van 25 G 30 minuten voor de operatie.
- Bereid de verwarmingsplaat voor (37 °C), plaats er een schuimrubberen steun op en bevestig het snuitmasker met kleine naalden of plakband.
- Plaats de muis in de isofluraantank voor inductie, met isofluraandiffusie (4%). Test de anesthesiediepte door een teenknijp uit te voeren. Bij voldoende inductie zal een gebrek aan pedaalreflex worden waargenomen.
- Plaats de verdoofde muis op zijn rug op de verwarmingsplaat die is afgedekt door een steriel veld dat gedurende de hele procedure op 37 °C wordt gehouden. Plaats het masker op de snuit voor continue inhalatie van isofluraan (onderhoud op 2,5%). Bevestig de uiteinden van de muis met plakband.
- Breng oogsmeermiddel bilateraal aan om droge ogen veroorzaakt door algemene anesthesie te voorkomen. Scheer het submandibulaire haar, draag steriele handschoenen en desinfecteer de huid met enkele vegen 10% povidonjodiumoplossing en alcohol.
- Voer de submandibulaire cutane benadering uit zoals hieronder beschreven.
- Voer met een microschaar een huidincisie uit vanaf de mandibulaire hoek naar de 1/3 achterste - 2/3 anterieure overgang van de horizontale tak van de onderkaak.
- Ontleed de onderhuidse weefsels om de kauwspier bloot te leggen.
- Steek de kauwspier die vastzit met behulp van een periostale lift uit de onderrand van de onderkaak.
- Til de kauwspier op in een subperiostaal vlak langs de mandibulaire ramus met de lift.
- Maak een kleine osteotomie (3 mm lengte) aan de ondergrens van de onderkaak met behulp van het piëzo-elektrische botchirurgieapparaat onder serumirrigatie met zoutoplossing (maximaal 10 ml/min) aan de ondergrens van de onderkaak, anterieur ten opzichte van de onderkaakhoek, in het achterste deel van de holte (Figuur 1, Figuur 2).
- Lokaliseer de achterrand van de onderkaak en de coronoïde inkeping (met de microschaar of de pincet) en voltooi de fractuur met behulp van een kleine rechte schaar die langs de mandibulaire ramus wordt ingebracht om extra kauwspieropening en letsel te voorkomen. Om de juiste oriëntatie van de breuk mogelijk te maken, plaatst u de schaar loodrecht op de onderrand van de onderkaak.
- Controleer of de fractuur volledig is: totale mobiliteit tussen de twee botsegmenten moet worden waargenomen tijdens zachte mobilisatie van de 2 segmenten met een pincet.
- Sluit de huidbenadering met zijden hechtingen (4/0) met gescheiden hechtingen. Er is geen hechting nodig in het periosteum.
OPMERKING: Als alternatief kan de huidbenadering worden gehecht met andere niet-adsorbeerbare hechtingen (bijv. Polypropyleen hechtingen). - Voer cefale laterale röntgenfoto's uit om de richting van de breuk te bevestigen (Figuur 3).
- Plaats de muis opnieuw in de isofluraantank voor een korte herinductie voordat u de röntgenfoto's maakt. Plaats vervolgens de muis in extensie, aan de laterale zijde, met het hoofd iets in hyperextensie voor röntgenanalyse.
- In het geval van een fractuur die te naar voren is geplaatst ter hoogte van een onderkaakkies of wanneer de fractuur de onderkaakhoek heeft losgemaakt (figuur 4), observeer dan een abnormale toename van het volume van de botcallus. Sluit in deze gevallen de dieren uit van het onderzoek om vertekening in de analyse te voorkomen.
- Controleer de muizen totdat ze weer bij bewustzijn zijn voordat u ze terug in de kooi plaatst.
3. Postoperatieve zorg
- Bereid een muizenkooi voor zonder brokjes en harde verrijking om kauwkrachten te voorkomen.
- Isoleer de geopereerde muis gedurende de 1eweek in een enkele kooi totdat de huid volledig is genezen. 1 week na de operatie opereerde de groep vrouwelijke muizen samen in dezelfde kooi.
- Dien buprenorfine (0,1 mg/kg) toe via subcutane injecties 4 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur na de procedure.
- Voer muizen met zachte dieetgel tijdens alle postoperatieve perioden van dag 0 tot het einde van de consolidatieperiode (d.w.z. 28 dagen) om pijn en secundaire verplaatsing van de fractuur te voorkomen.
- Weeg de muizen dagelijks van dag 0 tot dag 4 na de fractuur, 's ochtends, vóór de injectie met buprenorfine en vervolgens 3x per week tot het offeren van het dier (14 dagen na de fractuur).
- Evalueer het postoperatieve dierenwelzijn om de postoperatieve dierenverzorging te optimaliseren. Gebruik de scoreschaal in tabel 1 om de postoperatieve toestand van het dier te evalueren en de follow-up aan te passen. Wanneer de score > 1 is, wordt een injectie met buprenorfine gegeven en wanneer de score > 3 is en/of bij gewichtsverlies > 20% van het preoperatieve gewicht ondanks voedselverrijking, moet euthanasie worden besproken (tabel 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wat betreft in vivo chirurgische ingrepen, om deze procedure van niet-gestabiliseerde mandibulaire fractuur in een muismodel optimaal uit te voeren, zijn specifiek leren en training vereist.
Deze techniek voor niet-gestabiliseerde mandibulaire fractuur maakt de studie van het endochondrale botherstelproces mogelijk. Na euthanasie werden mandibulaire monsters verzameld in 4% paraformaldehyde (24 uur). Na volledige ontkalking met EDTA pH 8 werden coupes...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De techniek maakt het mogelijk om niet-gestabiliseerde mandibulaire fracturen in een muismodel te realiseren binnen een minimale open benadering in een korte proceduretijd (ongeveer 10 minuten of minder). Deze kortetermijnprocedure beperkt het risico op morbiditeit en overlijden van dieren, vooral bij kleine dieren zoals muizen. Om vergelijkbare resultaten te verkrijgen bij de analyse van het endochondrale botherstelproces, moet bijzondere zorg worden besteed aan het uitvoeren van de man...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De studie wordt mede mogelijk gemaakt door de afdeling Filantropie van Mutuelles AXA via de Head and Heart Chair en de ANR BonyBrain. We zijn alle leden van het platform SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Parijs, Frankrijk, erkentelijk voor hun bijdrage aan de realisatie van de procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Buprenorfine : Buprecare 0.3 mg/kg | Animalcare | ||
| Lift OBWEGESER breedte 6mm Lengte 17,5cm | Collin Medical | HA 5905 | |
| Pincet : Pad Plate MORIA 11 cm N°5 | MORIA | 9906 | |
| Verwarmingstafel Bioseblab 55 cm x 33 cm | Bioseblab | 707 | |
| NAALDHOUDER : Micro Halsey Naaldhouder - Metaal | LABODERM | 21.100 | |
| Neo Clear | Merck Millipore, Darmstadt, Duitsland | 109843 | |
| Ocry Gel Tube 10 g (oogsmeermiddel) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Piezotome insert Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Micro schaar | MORIA | MC52 | |
| Zijdedraden PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Rechte schaar | MORIA | 4877A | |
| Vetflurane (isofluraan) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Referenties
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Ortho Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Ortho Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Yu, Y. Y., Lieu, S., Hu, D., Miclau, T., Colnot, C. Site specific effects of zoledronic acid during tibial and mandibular fracture repair. PLoS One. 7 (2), e31771(2012).
- Landry, P. S., Marino, A. A., Sadasivan, K. K., Albright, J. A. Effect of soft-tissue trauma on the early periosteal response of bone to injury. J Trauma. 48 (3), 479-483 (2000).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nat Commun. 12 (1), 2860(2021).
- McGuire, C., Boudreau, C., Prabhu, N., Hong, P., Bezuhly, M. Piezosurgery versus conventional cutting techniques in craniofacial surgery: A systematic review and meta-analysis. Plast Reconstr Surg. 149 (1), 183-195 (2022).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Vercellotti, T. Technological characteristics and clinical indications of piezoelectric bone surgery. Minerva Stomatol. 53, 207-214 (2004).
- Wong, S. A., et al. Chondrocyte-to-osteoblast transformation in mandibular fracture repair. J Orthop Res. 39 (8), 1622-1632 (2021).
- Tian, Y., et al. HIF-1α regulates osteoclast activation and mediates osteogenesis during mandibular bone repair via CT-1. Oral Dis. 28 (2), 428-441 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
