Methodenartikel

Gebruik van micropipet-geleide medicijntoediening als alternatieve methode voor orale sonde in knaagdiermodellen

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66836

⸱

26 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we micropipetgeleide medicijntoediening (MDA) als een alternatieve methode voor orale maagsonde die het onderzoeksdier stimuleert om behandelingen gemakkelijk in te nemen met minimale stress en ongemak.

Samenvatting

Orale maagsonde (OG) met behulp van een canule bevestigd aan een spuit is een van de meest gebruikelijke methoden die worden gebruikt om nauwkeurige dosering van verbindingen in de maag van proefdieren te brengen. Helaas brengt deze methode moeilijkheden met zich mee voor zowel de operator als het onderzoeksdier. Studies hebben aangetoond dat OG kan leiden tot complicaties, waaronder oesofagitis, perforatie van de slokdarm en onbedoelde toediening van tracheale geneesmiddelen. Bovendien wordt OG in verband gebracht met verhoogde plasma- en fecale corticosteronspiegels (als gevolg van stress), veranderde bloeddruk en verhoogde hartslag, wat de onderzoeksresultaten negatief kan beïnvloeden of vertekenen. Een eerder ontwikkelde alternatieve methode, micropipetgeleide medicijntoediening (MDA) genaamd, stimuleert het dier om behandelingen gemakkelijk te consumeren op een minimaal invasieve manier. Hierin presenteren we voorbeelden van het gebruik van de MDA-techniek met behandelingen die in verschillende vehikels zijn gereconstitueerd en demonstreren we een effectieve toediening van de gevarieerde behandelingen aan meerdere verschillende muizenstammen. We tonen verder aan dat MDA een techniek is die de timing en invasiviteit van medicijntoediening vermindert en geen invloed heeft op de samenstelling van het darmmicrobioom zoals beoordeeld door kwantitatieve analyse van de belangrijkste microbiële soorten in de darm. Over het algemeen kan MDA een minder stressvol en effectief alternatief bieden voor OG.

Inleiding

Toediening van geneesmiddelen aan knaagdiermodellen wordt gewoonlijk bereikt via orale maagsonde (OG), die bestaat uit het rechtstreeks toedienen van een vloeibaar preparaat aan de maag met behulp van een canule die is bevestigd aan een spuit met de oplossing. Deze techniek resulteert in een consistente en nauwkeurige dosering van de behandeling aan het dier, maar heeft ook meerdere nadelen. OG is onder de loep genomen omdat het de blootstelling van de mens via de voeding niet adequaat heeft gemodelleerd 1,2. Bovendien verhoogt OG het risico op onbedoelde verwondingen aan het bovenste spijsverteringsstelsel (perforatie van de slokdarm en maag), aspiratie van de toegediende behandeling en laesies van de luchtwegen3. OG wordt ook geassocieerd met ongemak4, verhoogde bloeddruk en hartslag5, evenals stress 6,7 en soms de dood8 als gevolg van verminderde tolerantie voor maagsonde door het dier. Deze fysiologische veranderingen kunnen experimentele resultaten verstoren of verwarren; Daarom zijn er nieuwe procedures onderzocht om deze bijwerkingen te voorkomen. Studies hebben alternatieve procedures voor OG gebruikt, zoals het gebruik van gelatine als medicijnmiddel9, oraal oplossende strips (ODS)10, met sucrose gecoate sondenaalden11, flexibele voedingssondes, tarwekoekjes12, honing13 en pindakaaspellets14. Helaas zijn er beperkingen met deze aanpassingen aan de OG-techniek, waaronder onverenigbaarheid met in water onoplosbare medicijnen, langere voorbereidingstijd voor de behandeling15, smakelijkheid en stabiliteit van het medicijn15, en vertrouwdheid van het dier met het voedsel. Bovendien is er kans op minder nauwkeurige dosering wanneer dieren ad lib voeren.

Scarborough et al.7 ontwikkelden eerder een alternatieve orale behandelingsmethode bij muizen, die zij micropipet-geleide medicijntoediening (MDA) noemden. Deze wijze van toediening is gebaseerd op een gezoete gecondenseerde melkoplossing als vehikel voor farmacologische stoffen, waardoor de proefdieren worden gemotiveerd om het bereide vehiculum en/of de geneesmiddeloplossingen gemakkelijk te consumeren door de oplossing te doseren met een enkelkanaals pipet en pipetpunt. Om deze techniek te introduceren, ondergaan knaagdieren een trainingssessie (minimaal 2 dagen) om de behandelingstijden te verkorten en het onderzoeksdier vertrouwd te maken met het drinken uit de pipetpunt4. Eerste validatiestudies door Scarborough et al.7 en Schalbetter et al.16 suggereren dat de MDA-procedure eenvoudig te implementeren, kosteneffectief, minimaal invasief en minder stressvol voor de dieren is dan conventionele orale maagsondemethoden. Scarborough et al. introduceerde het gebruik van de MDA-techniek in een muismodel van maternale immuunactivering (MIA) van neurologische ontwikkelingsstoornissen7. Deze studie toonde aan dat de farmacokinetische profielen van muizen die werden behandeld met het antipsychoticum risperidon met behulp van MDA vergelijkbaar waren met het gebruik van OG. Bovendien veroorzaakte MDA geen verhoging van de corticosteronspiegels (een stresshormoon) bij de muizen, en chronische behandeling met risperidon met behulp van de MDA-techniek leidde tot een dosisafhankelijke afname van MIA-geïnduceerde sociale interactietekorten en overgevoeligheid voor amfetamine7. Aanvullende studies hebben de werkzaamheid van MDA versus OG onderzocht in zowel muis17 - als rat18-modellen . MDA is ook vergeleken met intraperitoneale injectie en bleek even effectief te zijn bij het toedienen van clozapine-N-oxide aan muizen16. Vanwege het gerapporteerde succes van MDA bij het verminderen van stress bij dieren en de therapeutische werkzaamheid, willen we nu de MDA-techniek verder onderzoeken als een effectieve methode voor medicijnafgifte met behulp van aanvullende muizenmodellen. Hier beschrijven we de implementatie van de MDA-methode voor de behandeling van verschillende muizenstammen, waaronder de immuuncompetente FVB/NJ- en C57BL/6J-stammen en de immuungecompromitteerde NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)-stam met verschillende orale behandelingen, waaronder levende bacteriën, experimentele verbindingen toegediend in in water onoplosbare oplossingen (maïsolie) en voertuigcontroles. We beoordeelden de activiteit en aanwezigheid van de verschillende behandelingen in serum en feces, en we evalueerden veranderingen in de kerndarmmicrobiota in relatie tot de MDA-methode.

Protocol

Alle dierstudies werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en onder de door de Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurde protocollen M021M197 en M023M195. De gebruikte muizenstammen (mannelijke muizen, 7 weken oud) worden beschreven in de materiaaltabel. Het gebruik van mannelijke muizen was te wijten aan hun gebruik in de lopende onderzoeken naar prostaatkanker. Van de MDA-methode is eerder ook aangetoond dat deze ook effectief is bij vrouwelijke muizen 7,17. Muizen werden gerandomiseerd naar hun respectievelijke kooien/behandelingsgroepen. De muizen werden behandeld in kooien en in willekeurige volgorde. De onderzoeker die de behandelingen toediende, was blind voor de behandelingsgroep. Het nummer dat aan een muis was toegewezen, verwees naar hun ID en niet naar de volgorde waarin ze werden behandeld. De gegevens werden gedurende de tijdlijn van het onderzoek verzameld en aan het einde geanalyseerd om vertekening te voorkomen. Experimentele testen werden geblindeerd voor de behandelingsgroep totdat alle gegevens waren verzameld.

OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van Scarborough et al.7.

1. Voorbereiding van behandelingen

  1. Bereid een oplossing van gezoete gecondenseerde melk (ingrediënten: melk en suiker) en water van moleculaire biologiekwaliteit in een verhouding van 3:10 van melk tot water. Meet de gezoete gecondenseerde melk af met een conische buis van 15 ml vanwege de viscositeit van de melk.
  2. Meng met behulp van een conische buis van 50 ml water van moleculaire biologiekwaliteit met de gezoete gecondenseerde melk door langzaam 5 ml water per keer met de melk te mengen.
    OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden met behulp van een bioveiligheidskast.
  3. Bereid aliquots van de melkoplossing (bewaard als 500 μl aliquots) en bewaar de aliquots bij 4 °C totdat ze gecombineerd zijn met de betreffende behandeling.
  4. Resuspendeer de behandelingen in hun respectievelijke vehicula in de juiste concentratie op basis van het lichaamsgewicht van het dier voordat u ze combineert met de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing.

2. MDA-training

OPMERKING: In dit gedeelte worden muismodellen beschreven; de MDA-techniek kan echter naar behoefte worden opgeschaald met grotere volumes/pipetpunten voor grotere knaagdiermodellen.

  1. OPTIONEEL: Houd het onderzoeksdier voorzichtig in bedwang door het nekvel met één hand vast te houden.
  2. Bied het onderzoeksdier alleen 100 μL gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing aan (zonder toevoeging van de experimentele behandeling) met behulp van een enkelkanaals pipet en een 200 μL pipetpunt die naar de mond wordt geleid.
  3. Giet de melk/wateroplossing langzaam af om te voorkomen dat het dier zijn bek mist. Zorg ervoor dat het dier de melkoplossing tussen 5-15 s gemakkelijk consumeert.
    OPMERKING: Deze training duurt minimaal 2 opeenvolgende dagen (één trainingssessie per dag), zonder wijzigingen in het toegediende volume. Een zachte terughoudendheid door nekvel was nodig voor de MDA-trainingen. Scarborough et al.7 bevelen aan om het dier volledig in bedwang te houden op de eerste dag van de MDA-training en vervolgens op de tweede dag aan de staart. De methode van fixatie kan verschillen voor grotere knaagdiermodellen. Vanhecke et al.17 daarentegen hielden de muizen slechts licht bij de staart vast tijdens de training.

3. Muizenbehandelingen met behulp van de MDA-methode

  1. Combineer de onderzoeksbehandeling met de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing (zie voorbeelden met validatie-experimenten [sectie 4 en sectie 5] hieronder).
  2. OPTIONEEL: Houd het onderzoeksdier voorzichtig in bedwang door het nekvel met één hand vast te houden.
    OPMERKING: Scarborough et al.7 melden dat muizen na de trainingsperiode niet langer fixatie nodig hebben en gemakkelijk uit de pipetpunt zullen drinken. Vanhecke et al.17 daarentegen melden dat voor sommige behandelingen (bijv. tamoxifen) die een milde smaakaversie kunnen hebben, MDA het beste kan worden uitgevoerd door de muizen tijdens alle behandelingen voorzichtig via nekvel in bedwang te houden. Deze studie stelde ook vast dat het positioneren van het dier op zijn rug met een zacht nekvel de tijd en werkzaamheid van de behandelingsconsumptie verbetert.
  3. Dien 100 μL behandeling toe met behulp van een enkelkanaals pipet en een 200 μL pipetpunt die naar de bek van het dier wordt geleid, zoals uitgevoerd tijdens de trainingssessies.
  4. Behandel een enkel dier tegelijk.
  5. Plaats elk dier na de behandeling terug in hun respectievelijke kooi.
    LET OP: Behandelingen met behulp van de MDA-methode kunnen dagelijks of herhaald worden gegeven 7,17.

4. Validatie-experiment #1 - orale toediening van darmbacteriën aan muizen met behulp van MDA

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het gebruik van de MDA-methode beschreven om oraal levende bacteriën af te leveren voor darmkolonisatiestudies bij muizen. In dit representatieve pilotexperiment wordt de grampositieve bacterie Clostridium scindens afgeleverd bij C57BL/6J-muizen. De muizen werden gedurende twee opeenvolgende dagen in het drinkwater behandeld met antibiotica (cefoxitine) voorafgaand aan bacteriële inoculatie met MDA.

  1. Bacteriële cultuur
    1. Kweek C. scindens stam ATCC 35704 in versterkte clostridiale bouillon (RCB) met behulp van een bevroren glycerolbouillon om 500 μL bacteriën te inoculeren in een RCB-buis van 7 ml. Kweek anaeroob 's nachts bij 37 °C.
    2. Gebruik 500 μL van de nachtelijke bacteriecultuur om een nieuwe RCB-buis te inoculeren en anaeroob gedurende 24 uur te incuberen. Haal dit buisje uit de anaërobe kamer en gebruik het om de bacteriële behandeling voor MDA voor te bereiden. Gebruik dezelfde buis om de kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml) te berekenen.
  2. Berekening van C. scindens CFU/ml
    1. Maak een verdunning van 1:3 van de C. scindens-cultuur met 3,5 ml van de geëoculeerde cultuur in 7 ml RCB-media. Gebruik een monster van deze verdunning om een 20% 1 ml glycerolvoorraad (1:1) te maken die wordt bewaard bij -80 °C.
    2. Plaat 100 μL van de 1:3 verdunning op versterkte clostridiale agar (RCA) platen. Gebruik de eerste verdunning om vervolgens de volgende seriële verdunningen te maken en in totaal nog drie keer te plaateren.
    3. Tel na incubatie van de RCA-platen de kolonies en bereken de CFU. Gebruik de volgende vergelijking om de concentratie van bacteriecellen in de verdunde en originele monsters te berekenen:
      CFU in verdund monster (cellen/ml) = (aantal kolonies geteld op de RCA-plaat)/(hoeveelheid verdund monster toegevoegd aan de RCA-plaat in ml)
      CFU in origineel monster (cellen/ml) = (CFU in verdund monster)/(verdunning van de RCA-plaat)
  3. Voorbereiding van de C. scindens-behandeling voor MDA
    1. Combineer een oplossing van 50 μl (1,265 x 106 kve/ml in dit voorbeeld) C. scindens + 50 μl van de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing.
      OPMERKING: Als een specifieke CFU nodig is, kan een alternatieve methode voor het kwantificeren van bacteriële cellen worden gebruikt, zoals het maken van een standaardcurve met metingen van optische dichtheid (OD) bij 600 nm.
  4. Orale behandeling van muizen met C. scindens met behulp van MDA
    1. Maak de muizen op dag 1-3 vertrouwd met de melkoplossing zoals beschreven in rubriek 2 (MDA-trainingssessie).
    2. Dien op dag 4 100 μL van de C. scindens + melkoplossing of PBS (controle) + melkoplossing via MDA toe aan C57BL/6J-muizen. Behandel muizen één keer voor de duur van het onderzoek.
  5. Fecale monsterafname
    1. Houd de muis vast bij een zacht nekvel en wacht tot ze een fecale korrel hebben afgegeven. Verzamel fecale pellets rechtstreeks uit het rectum in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar de monsters tot gebruik bij -80 °C.
  6. C. scindens kwantitatieve PCR (qPCR)
    1. Voer fecale DNA-extractie uit met behulp van een eerder gepubliceerd protocol19,20.
    2. Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een DNA-fluorometer voor detectie met hoge gevoeligheid. Normaliseer DNA-monsters tot 10 ng/μL en bewaar ze bij -20 °C tot gebruik.
    3. Gebruik qPCR om de overvloed te onderzoeken van: (i) C. scindens-bacteriën met behulp van geconserveerde primers tegen het desA-gen van C. scindens-stam ATCC 35704, (ii) totale bacteriën met behulp van primers die zijn ontworpen tegen het V6-hypervariabele gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen zoals eerder beschreven20,21.
      OPMERKING: De gebruikte qPCR-voorwaarden en primers staan vermeld in tabel 1. Een standaardcurve met behulp van C. scindens stam ATCC 35704 DNA werd gebruikt om de kopieën van desA+-bacteriën te schatten.

5. Validatie-experiment #2 - experimentele medicijnafgifte aan muizen met behulp van MDA

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het gebruik van de MDA-methode beschreven om een experimentele verbinding aan muizen af te leveren. In dit representatieve pilotexperiment wordt de sojametaboliet equol (S-equol) afgeleverd aan NSG- en FVB/NJ-muizen.

  1. Bereiding van de S-equol behandeling
    OPMERKING: Zowel S-equol als dimethylsulfoxide (DMSO) worden verdeeld en tot gebruik bij -20 °C bewaard.
    1. Reconstitueer S-equol in DMSO in combinatie met maïsolie (90%). Meng het verdeelde S-equol in maïsolie (220 μl) met 480 μl van de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing. Combineer en meng deze oplossing in de dierenruimte om te voorkomen dat de olie van de melk scheidt.
      OPMERKING: Als scheiding van de oplossing wordt waargenomen, meng de oplossing dan vóór de behandeling. De toegediende dosis S-equol is 25 mg/kg/dag. De muizen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren allemaal vergelijkbaar in gewicht, dus ze kregen dezelfde dosis. De dosis van de behandeling moet mogelijk worden aangepast en in meerdere preparaten worden verwerkt op basis van het gewicht van het onderzoeksdier.
    2. Combineer DMSO-voertuig met maïsolie (90%). Meng verdund DMSO in maïsolie (220 μL) met 480 μL van de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing. Combineer en meng deze oplossing in de dierenruimte om te voorkomen dat de olie van de melk scheidt.
      OPMERKING: Als scheiding van de oplossing wordt waargenomen, meng de oplossing dan vóór de behandeling.
  2. Orale behandeling van muizen met S-equol met behulp van MDA
    1. Maak de muizen op dag 1 en 2 vertrouwd met de melkoplossing zoals beschreven in rubriek 2 (MDA-trainingssessie).
      OPMERKING: Voor validatie-experiment #1 werd de trainingstijd gevolgd die is beschreven in Scarborough et al., wat een acclimatiseringstijd van 3 dagen suggereerde. In dit experiment werd een kortere trainingstijd (2 dagen) getest en bleek dat dit de toediening van de betreffende behandelingen niet veranderde.
    2. Behandel muizen op dag 3-43 met (i) PBS-controle, (ii) DMSO-vehiculum of (iii) S-equol, allemaal in combinatie met de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing. Maak een mastermix van de oplossing om een homogene oplossing van de behandelingen aan alle proefdieren te leveren. Dien eenmaal daags, 5 dagen per week, gedurende in totaal 43 dagen een totaal volume van 100 μl toe aan elke muis.
  3. Bloedafname
    1. Bloed afnemen na euthanasie (overdosis kooldioxide) via een hartpunctie. Breng het bloed over naar een microtainer-serumseparatorbuisje, meng en bewaar het bij kamertemperatuur (RT) tot verdere verwerking.
    2. Centrifugeer het bloedmonster tot een volledige scheiding bij 254 x g gedurende 5 minuten. Verzamel serum (bovenste scheidingslaag) en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
  4. S-equol vloeistofchromatografie met tandem massaspectrometrie (LC/MS/MS) assay
    1. Raadpleeg het bestand met materiaalopgaven voor de chemicaliën en reagentia die voor dit experiment zijn gebruikt.
    2. Kalibratiestandaarden en kwaliteitscontrole: Bereid voorraadoplossingen van S-equol en interne standaard (racemische equol-d4) in DMSO in concentraties van 1 mg/ml en bewaar bij -20 °C.
    3. Verdun de standaardoplossingen met acetonitril:water (50:50) om een gemengde werkoplossing met verschillende concentraties te bereiden. Bereid de interne standaard in ethylacetaat als extractieoplossing in een concentratie van 100 ng/ml. Bewaar bouillon en werkoplossingen bij 4 °C en gebruik dagelijks, verdund of direct.
    4. Extractie van monsters
      1. Bereid het monster voor door middel van eiwitprecipitatie door extractieoplossing (ethylacetaat plus interne standaard, zie punt 5.4.3), gevolgd door centrifugeren en verdampen van het bovenstaande onder droge stikstof (50 °C).
      2. Reconstitueer het monster in 100 μl 50% acetonitril en breng het over naar autosampler-injectieflacons voor LC/MS/MS-analyse.
    5. Scheiding van monsters
      1. Bereik scheiding met een C18-kolom, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Gebruik 0,1% mierenzuur als mobiele fase A en 0,1% mierenzuur in acetonitril mobiele fase B.
      2. Gebruik een gradiënt en houd mobiele fase B op 40% met een debiet van 0,3 ml/min gedurende 0,5 min. Verhoog vervolgens het debiet tot 100% gedurende 1 minuut, houd daar 2 minuten vast en keer dan terug naar 40% B gedurende 1 minuut.
      3. Bewaak het effluent van de kolom met behulp van een massaspectrometrische detector met behulp van elektrospray-ionisatie, die in negatieve modus werkt. Programmeer de spectrometer om de volgende overgangen van meervoudige reactiemonitoring (MRM) te bewaken: 241 → 119.1 voor S-equol en 245 → 123 voor de interne standaard, equol-d4.
      4. Bereken de kalibratiecurve voor S-equol met behulp van de oppervlakteverhoudingspiek van de analyse ten opzichte van de interne standaard met behulp van een kwadratische vergelijking met een 1/x2 wegingsfunctie met behulp van de kalibratiebereiken van 5-500 ng/ml.

6. Het meten van het effect van MDA-behandeling op de kerndarmmicrobiota

OPMERKING: In dit gedeelte wordt het gebruik van qPCR beschreven om de niveaus van de kerndarmmicrobiota na MDA-behandeling te meten.

  1. Voer fecale monsterafname en DNA-extractie uit zoals beschreven in stap 4.5.1 en 4.6.1.
  2. Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een DNA-fluorometer voor detectie met hoge gevoeligheid. Normaliseer DNA-monsters tot 10 ng/μL en bewaar ze bij -20 °C tot gebruik.
  3. Gebruik qPCR om de overvloed aan leden van de darmmicrobiota te onderzoeken: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp., en (v) totale bacteriën met behulp van primers die zijn ontworpen tegen het V6-hypervariabele gebied van het bacteriële 16S rRNA-gen zoals eerder beschreven 20,21,22.
    OPMERKING: De gebruikte qPCR-voorwaarden en primers worden vermeld in tabel 2.

Resultaten

MDA kan worden gebruikt bij de orale toediening van bacteriestammen in muismodellen. C57BL/6J-muizen werden gedurende 2 dagen behandeld met antibiotica (cefoxitine in het drinkwater) om commensale microbiële gemeenschappen te verwijderen voordat ze met de MDA-trainingssessie begonnen. De gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing werd eenmaal daags achtereenvolgens toegediend gedurende 3 dagen voorafgaand aan de toediening van de behandeling. Muizen werden tijdens de toediening van de MDA-behandeling kort in bedwang gehouden door een zacht nekvel. Op dag 4 werden de muizen eenmaal behandeld met PBS (negatieve controle, n = 4) of een anaërobe cultuur van C. scindens (desA+ bacteriën, n = 4) die eerder opnieuw was gesuspendeerd in de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing. Alle muizen namen de behandelingen over het algemeen binnen enkele seconden en dronken de volledige dosis (100 μL). Om de afgifte en aanwezigheid van de anaërobe bacteriën te valideren, vergeleken we fecale monsters die na een antibioticabehandeling waren verzameld met fecale monsters die 24 uur na behandeling met PBS of C. scindens waren verzameld (Figuur 1). Fecaal DNA werd geïsoleerd, gekwantificeerd en genormaliseerd tot 10 ng/μL om qPCR uit te voeren met behulp van C. scindens ATCC 35704 desA-genspecifieke primers (Tabel 1). We zagen dat de met antibiotica behandelde muizen minimale tot geen desA+ bacteriën hadden. Zoals verwacht zagen we een aanzienlijk hogere hoeveelheid desA+-bacteriën in de met C. scindens behandelde muizen, wat significant verschilde van die in de PBS-controlegroep (p = 0,0286, Figuur 1).

Toediening van een experimentele verbinding (S-equol) met behulp van de MDA-methode. NSG (n = 15) en FVB/NJ (n = 18) muizen ondergingen twee dagen voor de toediening van de behandeling een training met de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing. NSG-muizen ondergingen een antibioticabehandeling (cefoxitine in het drinkwater) om equol-producerende darmbacteriën en dus endogene equolproductie te elimineren. FVB/NJ-muizen kregen een sojavrij dieet om de endogene productie van equol te elimineren. Alle muizen werden kort in bedwang gehouden door een zacht nekvel om de behandelingen toe te dienen. De controlegroep kreeg de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing in combinatie met maïsolie, de DMSO-groep (mediumcontrole voor S-equol) kreeg de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing en DMSO in maïsolie, en de equol-groep kreeg gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing en equol in maïsolie. Muizen werden vijf dagen per week behandeld met de MDA-techniek voor een totaal van 43 dagen. Muizen namen de behandelingen over het algemeen binnen enkele seconden en dronken de volledige dosis (100 μL). Over het algemeen consumeerden alle muizen ten minste de helft van de dosis op een bepaalde dag (gedeeltelijke dosis op een bepaalde dag, maar volledige dosis de dag ervoor of de volgende dag). Geen van de muizen weigerde de behandeling volledig in de loop van het onderzoek. We zagen dat na het krabbelen het plaatsen van de muizen op hun rug de tijd van behandelingsconsumptie verbeterde en ervoor zorgde dat het dier de volledige dosis innam.

Circulerende equol-niveaus tonen een effectieve toediening van MDA-medicijnen aan. Bloedmonsters werden genomen van de NSG-muizen na euthanasie aan het einde van de studie om te valideren dat de MDA-toediening van equol leidde tot circulerende equol-niveaus bij de studiedieren. We hebben niet genoeg bloed teruggevonden van een van de met equol behandelde muizen om de LC/MS/MS-test uit te voeren. Serumequolspiegels werden gemeten door LC/MS/MS bij de Analytical Pharmacology Shared Resource aan de Johns Hopkins University School of Medicine. We zagen geen circulerende equol in de controle- en DMSO-groep (equol vehicle), terwijl de met equol behandelde muizen een detecteerbare circulerende equol hadden (Figuur 2). Belangrijk is dat we enige variatie verwachten in circulerende equol-niveaus bij de met equol behandelde muizen als gevolg van verschillende data en tijden van het offeren van dieren in dit experiment.

Microbiële darmgemeenschappen blijven onveranderd na MDA-behandeling. Het effect van de MDA-melkoplossing (met en zonder equol) op de darmmicrobiota werd beoordeeld met behulp van de FVB/NJ-muizen. We kwantificeerden de microbiële samenstelling van monsters die bij aanvang werden genomen (geen behandelingen/geen MDA) en monsters die 7 dagen na de start van de behandeling werden genomen (9 dagen na de start van MDA, inclusief trainingsdagen). We zagen geen significante veranderingen in de totale bacteriële belasting of de algehele microbiële samenstelling van de kerndarmmicrobiota (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) zoals beoordeeld door soortspecifieke qPCR-analyse (Figuur 3) zoals eerder beschreven21,22. Eén kooi vertoonde een significant verschil in Lactobacillus tussen baseline en na MDA-behandeling; deze bevinding werd echter waargenomen in de DMSO-voertuigbesturing en was niet consistent in alle kooien.

figure-results-1
Figuur 1: MDA levert anaërobe bacteriën aan de darm van muizen die kunnen worden gekwantificeerd via fecale qPCR. C57BL/6J-muizen werden gedurende twee opeenvolgende dagen in het drinkwater behandeld met antibiotica. Muizen werden vervolgens behandeld met de anaërobe bacterie C. scindens met behulp van de MDA-methode. Fecale C. scindens (desA+) bacteriële belasting werd gemeten door qPCR voor het desA-gen, zowel na antibioticabehandeling als 24 uur na MDA-behandeling (PBS of C. scindens). (A) C. scindens-specifieke desA-genkwantificering wordt aangetoond tussen met PBS en C. scindens behandelde muizen na antibioticabehandeling en 24 uur na MDA-behandeling. (B) Dezelfde gegevens die 24 uur na MDA in (A) worden weergegeven, worden weergegeven als een kolomgrafiek. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een niet-parametrische Mann-Whitney-test. (*) p = 0,0286, foutbalken = SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Analyse van circulerende equol-niveaus in NSG-muizen die via de MDA-techniek met equol zijn behandeld. Serumequolspiegels werden gekwantificeerd via LC/MS/MS in controlemuizen (n = 5), DMSO (vehiculum, n = 5) en equol (n = 4). Er werd niet genoeg bloed teruggevonden van een van de met equol behandelde muizen om LC/MS/MS uit te voeren. Deze behandelingen werden toegediend met behulp van de MDA-methode. Serumequol was alleen detecteerbaar in de met equol behandelde groep. Limiet van bepaalbaarheid < 5 ng/ml. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een niet-parametrische eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen (Dunn's correctie). (**) p = 0,0053, foutbalken = SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kerndarmbacteriën en totale bacteriële belastingsniveaus zijn onveranderd in FVB/NJ-muizen na MDA-behandeling. Er werden geen significante veranderingen waargenomen in de qPCR Cq-waarden voor de beoogde microbiële gemeenschappen voor en na toediening van de behandeling met behulp van de MDA-methode. Lactobacillus vertoonde alleen in kooi 3 een significant verschil (*, p = 0,0321) tussen de basislijn en de MDA-behandeling. Deze bevinding was niet consistent tussen kooien. Kooinummers zijn gemarkeerd als C1-C4. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen (Tukey-correctie). Foutbalken = SD. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Naam van de primerPrimer sequentiesPCR-voorwaarden
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93 °C 3 min, 34 cycli (95 °C 30 s, 54 °C 30 s)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tabel 1: Primers en qPCR-voorwaarden voor desA+ bacteriën (C. scindens).

Naam van de primerPrimer sequentiesPCR-voorwaarden
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5' -CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 min
36 cycli
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 cycli
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5 '-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95 °C, 3 min
36 cycli
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5 '-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 min
44 cycli
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 cycli
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

Tabel 2: Primers en qPCR-condities die worden gebruikt om het effect van MDA op de kerndarmmicrobiota te meten.

Discussie

OG kan een belangrijke bron van stress zijn bij proefdieren die een verstorende variabele kan creëren, zoals eerder beoordeeld in meerdere onderzoeken 7,9,11,12,13,14,15,23. Vanwege de invasiviteit van OG zijn alternatieve technieken gebruikt om de uitdagingen van OG te minimaliseren 9,10,12,13,14,15. Micropipetgeleide medicijntoediening (MDA) is een nieuwe techniek die het mogelijk maakt om geneesmiddelen op een minder invasieve manier toe te dienen met behulp van een enkelkanaalspipet en een mix van het betreffende geneesmiddel met een gezoete gecondenseerde melkoplossing7. Een cruciale stap voor deze techniek is de trainingssessie (minimaal 2 dagen) die het dier in staat stelt meer vertrouwd te raken met de pipetpunt en de gezoete gecondenseerde melksmaak, en in het algemeen de behandelingstijden en het ongemak verkort. Deze trainingssessie stelt de muizen ook in staat om de medicijnen die in de gezoete gecondenseerde melkoplossing zijn verwerkt, veel sneller te consumeren dan andere technieken en met een precieze dosering.

Onze studies volgden nauwlettend de bereiding en levering van de gezoete gecondenseerde melk/wateroplossing die in Scarborough et al.7 wordt gepresenteerd. Tijdens de duur van het onderzoek werden muizen niet beroofd van water of voedsel voorafgaand aan de dosering. Ze werden in hun respectievelijke huisvestingskooi gehouden en de timing van de behandelingen was minder dan 1 minuut. Een belangrijk verschil in onze studies was dat, mogelijk vanwege het potentieel voor visuele beperking in de albinomuisstammen die we gebruikten en het potentieel voor lichte smaakaversie bij medicamenteuze behandeling, alle muizen een korte terughoudendheid nodig hadden door zachtjes te krabben als onderdeel van het trainings- en behandelingsprotocol. Deze aanpassing aan de MDA-behandelingen wordt aanbevolen door Vanhecke et al.16. Het zachte nekvel, samen met het positioneren van de muizen op hun rug, moedigde de muizen aan om gretig de melkoplossing te consumeren. We concluderen dat de noodzaak van zacht nekkreten als onderdeel van de trainings- en behandelingsstappen optioneel is en studieafhankelijk zal zijn. Toediening van de behandelingen (gecorrigeerd voor het lichaamsgewicht van het dier, indien van toepassing) werd gegeven in een gestandaardiseerd volume en muizen vertoonden geen gedragsveranderingen. Andere kleine wijzigingen ten opzichte van de oorspronkelijke studie7 waren onder meer een afname van het aantal trainingssessies en de volumes die bij elke sessie werden toegediend. Enkele van de beperkingen die we in dit onderzoek zijn tegengekomen, zijn onder meer de resistentie van sommige muizen om de volledige dosis (100 μL) van de melkoplossing te drinken op de eerste trainingsdag en op tijdstippen tijdens het onderzoek. Dit werd overwonnen door de muizen op hun rug te plaatsen terwijl ze werden vastgehouden. Deze studie beoordeelde niet de interactie van het medicijn met de gezoete gecondenseerde melkoplossing, verschillen in consumptie tussen muizengeslachten (hoewel eerder is aangetoond dat MDA ook effectief is bij vrouwelijke muizen 7,17), of verhoging van stressmarkers, zoals corticosteronspiegels 7,11,14, geassocieerd met OG.

In deze studie hebben we ons gericht op het vermogen van de MDA-techniek om een precieze dosis van een experimentele behandeling toe te dienen en vervolgens de fecale en/of circulerende niveaus van de behandelingen die van belang zijn bij de studiedieren beoordeeld. We hebben ook beoordeeld of MDA-behandeling de darmmicrobiota verandert, en we hebben minimale tot geen veranderingen waargenomen in de kern fecale microbiota of de totale fecale bacteriële belasting van de onderzoeksdieren. We zagen ook geen verwondingen bij de dieren als gevolg van MDA-behandeling. Concluderend kan MDA dienen als een alternatieve methode voor korte- en langetermijnbehandeling in knaagdiermodellen. Over het algemeen heeft MDA een positieve invloed op het dierenwelzijn door het risico op OG-gerelateerde verwondingen te verminderen. MDA overwint enkele van de beperkingen van andere technieken en we stellen voor dat het op grote schaal kan worden gebruikt in translationeel onderzoek in veel verschillende knaagdiermodellen24.

Dankbetuigingen

We willen graag de onderzoeksondersteuning erkennen van de Prostate Cancer Research Program Award W81XWH-20-1-0274 van het ministerie van Defensie en de Prostate Cancer Foundation Challenge Award 16CHAL13. We willen Dr. Michelle Rudek, Dr. Noushin Rastkari, Dr. Nicole Anders en Linping Xu van de Analytical Pharmacology Shared Resource bij Johns Hopkins bedanken en erkennen voor hun hulp bij equol LC/MS/MS.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
200 µL pipette tipsMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 mass-spectrometric detectorSciexN/A
Akkermansia muciniphila strain muc genomisch DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
AmmoniumacetaatSigma–Aldrich5.43834
C57BL/6J muizenJackson LaboratoriesStrain# 000664
C. scindens strain 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitineSagent NDC25021-109-10
MaïsolieMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
ethanolFisher ScientificAC611050040
MierenzuurSigma–Aldrich5.33002
FVB/NJ muizenJackson LaboratoriesStrain# 001800
GlycerolSigma–AldrichG5516
HexaanFisher Scientific02-002-996
LC-MS grade waterFisher Scientific14-650-357
MethanolFisher Scientific02-003-340
Microtainer serumscheidingsbuisBecton Dickinson02-675-185
Moleculair biologie kwaliteit waterCorning46-000-CI
NSG muizenJackson LaboratoriesStrain# 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemisch equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Versterkte Clostridial agarAnaerobe SystemsAS-6061
Versterkte Clostridial bouillonAnaerobe SystemsAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-equol referentiestandaard voor LC-MSCayman Chemical10010173
Enkelkanaals pipettenRainin17008652
Streptococcus salivarius genomisch DNAAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Gezoete gecondenseerde melkCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidase uit Helix pomatiaSigma–AldrichG7017

Referenties

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Toediening van geneesmiddelen via micropipettoediening van geneesmiddelen bij muizenminimaal invasieve techniekdarmmicrobioomprostaatkankermodellenmethoden voor stressreductiemethoden voor toediening van geneesmiddelengezoete melk als dragervloeistof

Gerelateerde artikelen