Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66846

⸱

20 september 2024

 ,  ,  ,  , 
1Rosalind and Morris Goodman Cancer Institute, Department of Biochemistry, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

Knaagdiermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van kerngedrag dat verband houdt met autismespectrumstoornis (ASS). In dit artikel gaan we dieper in op twee gedragstests voor het modelleren van de kernkenmerken van ASS bij muizen: zelfverzorging, die repetitief gedrag beoordeelt, en de driekamertest voor sociale interactie, die sociale beperkingen documenteert.

Samenvatting

Autismespectrumstoornis (ASS) is een neurobiologisch complexe aandoening met een heterogene genetische etiologie. Klinisch wordt ASS gediagnosticeerd door sociale communicatiestoornissen en restrictief of repetitief gedrag, zoals met de hand fladderen of voorwerpen op een rij zetten. Deze gedragspatronen kunnen op betrouwbare wijze worden waargenomen in muismodellen met ASS-gekoppelde genetische mutaties, waardoor ze zeer nuttige hulpmiddelen zijn voor het bestuderen van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen bij ASS. Begrijpen hoe genetische veranderingen de neurobiologie en het gedrag beïnvloeden die worden waargenomen bij ASS, zal de ontwikkeling van nieuwe gerichte therapeutische verbindingen vergemakkelijken om de belangrijkste gedragsstoornissen te verbeteren. Ons laboratorium heeft verschillende protocollen gebruikt die goed beschreven trainings- en testprocedures omvatten die een breed scala aan gedragsstoornissen met betrekking tot ASS weerspiegelen. Hier beschrijven we twee tests om de kernkenmerken van ASS in muismodellen te bestuderen: zelfverzorging (een maat voor repetitief gedrag) en de driekamertest voor sociale interactie (een maat voor de benadering van sociale interactie en voorkeur voor sociale nieuwigheid).

Inleiding

Autismespectrumstoornis (ASS) is een ontwikkelingsstoornis van de hersenen die zich manifesteert in sociale communicatie of interactiestoornissen en beperkte, repetitieve gedragspatronen of interesses 1,2. In 2022 werd wereldwijd bij ongeveer 1 op de 100 kinderen de diagnose ASS gesteld3. Volgens de Centers for Disease Control and Prevention (CDC, VS) is de prevalentie van ASS sinds 2008 met 30% toegenomen en sinds 2000 meer dan 2-voudig 4,5. Personen met ASS kunnen ook comorbiditeiten vertonen, zoals een verstandelijke beperking (ID) (35,2%, IQ ≤ 70), aandachtstekortstoornis met hyperactiviteit (ADHD) (50%-70%) en andere genetische syndromen 2,4,6.

Het gebruik van diermodellen in ASS-onderzoek, met name knaagdieren, heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de impact van verschillende omgevingsfactoren, waaronder voeding, medicijnen, lichaamsbeweging en verrijking 7,8,9,10, evenals genetische mutaties zoals Shank, Fmr1, Mecp2, Pten en Tsc-mutant 11,12,13 , over ASS-symptomen. Muismodellen worden vaak gebruikt om ASS te onderzoeken vanwege hun sociale aard en gedeelde genetische, biochemische en elektrofysiologische kenmerken met mensen. Door bijvoorbeeld deletie van een specifiek gen (zoals Shank3, Fmr1, Cntnap2 en Pten) kan afwijkend sociaal en repetitief gedrag worden gerecapituleerd, wat een sterke validiteit van de studie oplevert 14,15,16. Hier bieden we protocollen voor het bestuderen van parallellen tussen diergenetische modellen en menselijke ASS-symptomen17. We beschrijven de zelfverzorgings- en driekamertest voor sociale interactie, die twee kernsymptomen bij ASS-patiënten weerspiegelen, namelijk respectievelijk beperkte, repetitieve gedragspatronen en sociale interactiestoornissen (communicatie).

Op basis van de DSM-V (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders of the American Psychiatric Association 5th Edition) en ICD-11 (International Classification of Diseases 11th Revision), vertonen ASS-patiënten beperkte, repetitieve en stereotiepe gedragspatronen, in het bijzonder niet-functioneel lichaamsgericht repetitief gedrag (BFRB's), zoals schommelen, stimming, nagelbijten, haren trekken, huidplukken of teenwandelen18, 19. okt. Bij dieren manifesteert repetitief gedrag zich door langdurige en repetitieve zelfverzorging. Vlooien is een van de meest voorkomende aangeboren activiteiten bij knaagdieren, waarbij ongeveer 40% van hun waaktijd wordt besteed aan vlooien20,21. Het is instinctief voor muizen om hun huid of vacht te likken om vreemd vuil van het lichaamsoppervlak te verwijderen, wat dient om het lichaam schoon te houden, letsel te voorkomen, parasieten te verwijderen en de temperatuur te reguleren. Verzorging is onderverdeeld in twee soorten: sociale verzorging (allo-verzorging), waarbij verzorging door een andere muis betrokken is, en zelfverzorging. Zelfverzorging vertoont een stereotiep en geconserveerd sequentiepatroon dat bestaat uit vier fasen (meestal discreet en niet-sequentieel)22,23. In fase I (elliptische slag) beginnen muizen met vlooien door eerst aan beide poten te likken en vervolgens met hun poten rond de neus te vlooien. In stadium II (eenzijdige beroerte) gebruiken muizen hun poten om hun gezicht asymmetrisch af te vegen. In fase III (bilaterale beroerte) vegen muizen symmetrisch hun hoofd en oren af. In fase IV (Lichaamslikken) gaan muizen over op lichaamslikken door hun hoofd naar achteren te bewegen en kunnen ze de verzorging uitbreiden naar de staart en geslachtsorganen. Wanneer muizen individueel in een doorzichtige kooi worden geplaatst, kan zelfverzorgingsgedrag gemakkelijk worden herkend en geobserveerd. Muizen verhogen het zelfverzorgingsgedrag wanneer ze worden geconfronteerd met stress, pijn of sociale ontwrichting, waardoor de zelfverzorgingstest cruciaal is bij het onderzoeken van neurologische aandoeningen22. Verschillende muismodellen van ASS, waaronder die met genetische mutaties (zoals Fmr1−/y, Shank3B-/-, NL1−/-), farmacologische interventies (zoals DO34, PolyI:C) en specifieke inteeltstammen (zoals BTBR en C58/J), hebben overmatig repetitief zelfverzorgingsgedrag aangetoond 24,25,26,27.

Veranderingen in sociaal gedrag dienen als een van de criteria voor het beoordelen van ASS. Volgens de DSM-V en de ICD-11 vertonen ASS-patiënten aanhoudende beperkingen op het gebied van sociale communicatie en sociale interactie1 8,19. Deze kunnen zich manifesteren in verbale en non-verbale communicatiestoornissen (d.w.z. abnormaal oogcontact, gebaren en gezichtsuitdrukking), gebrek aan het delen van interesse en emoties met anderen, onbewust zijn van sociale contextuele signalen of problemen met het ontwikkelen van relaties. In lijn met de symptomen van sociale beperkingen zijn verschillende gedragstaken ontworpen en geoptimaliseerd om sociale interacties bij muizen te beoordelen, zoals de directe sociale interactietest, de sociale benadering met drie kamers en de voorkeur voor sociale nieuwigheidstest en analyse van ultrasone vocalisaties (USV's)16,28. De sociale interactietest met drie kamers is een veelgebruikt experiment voor het evalueren van ASS-gerelateerd gedrag 17,29,30,31. Het apparaat bestaat uit drie met elkaar verbonden kamers; De linker- en rechterkamer bevatten een draadkooi die leeg kan zijn of door een muis kan worden bezet, waardoor de testmuis vrij met beide kooien kan communiceren. Twee metingen helpen bij het beoordelen van verschillende aspecten van sociaal gedrag in de testmuis tijdens het driekamerexperiment. Eerst wordt de testmuis gescoord voor de tijd die wordt besteed aan interactie met de lege kooi (nieuw object) versus een kooi die een nieuwe muis bevat. Dit deel van de taak geeft inzicht in de gezelligheid van de muis. Vervolgens wordt een onbekende muis in de voorheen lege draadkooi geplaatst. Het tijdsverschil in interactie van de testmuis tussen de onbekende en bekende muis meet de voorkeur voor sociale nieuwigheid. In dit deel van de taak geeft een controlemuis de voorkeur aan interactie met een onbekende in plaats van met de eerder aangetroffen muis, die al aanwezig was in het sociale gedeelte van de test. Tekorten in sociale interactie en verminderde motivatie om met nieuwe muizen om te gaan, worden over het algemeen gevonden in het muismodel van ASS. De driekamertest heeft zich sinds zijn uitvinding robuust bewezen. Het is gebruikt om sociale fenotypes te bestuderen in verschillende muismodellen van ASS, waaronder Fmr1-/-, Shank3B-/-, Cntnap2-/-, en de BTBR-inteeltstam32,33,34,35,36.

De twee tests maken gebruik van natuurlijk voorkomend, spontaan gedrag van muizen als verdienstelijke hulpmiddelen voor het bestuderen van ASS-achtig gedrag. Omdat ze als low-stress-tests worden beschouwd, is het haalbaar om beide tests binnen dezelfde groep muizen uit te voeren om ASS-achtig gedrag te meten, waarbij eerst de zelfverzorgingstest wordt uitgevoerd en de driekamertest voor sociale interactie op de volgende dagen. De protocollen die we aanbieden, vormen een essentieel hulpmiddel voor de beoordeling van ASS-achtig gedrag en de ontwikkeling van nieuwe therapieën 29,30,31. Uiteindelijk zouden ze bijdragen aan het verbeteren van de resultaten voor personen met ASS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures en experimenten met proefdieren zijn goedgekeurd door de voorschriften van het Facility Animal Care Committee (FACC), die de richtlijnen volgen die zijn opgesteld door de Canadian Council on Animal Care, het McGill University Animal Care Committee en het NIH Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW). Het garantienummer van de Public Health Service (PHS) voor McGill University is F-16-00005 (A5006-01).

1. Voorbereiding van dieren

  1. Testmuizen: Selecteer mannelijke en/of vrouwelijke muizen van 2-3 maanden (8 tot 13 weken). Alle muizen die hier in de experimenten zijn gebruikt, hebben een C57BL/6J-achtergrond. Voor zelfverzorgend gedrag en de sociale interactietests met drie kamers is het algemeen aanvaardbare bereik van muizen per voorgestelde groep n = 10-15, met een minimum van n = 8.
    1. Voor genetisch gemodificeerde muizen, voeg altijd wildtype nestgenoten toe als controle. Match de controlegroep met de experimentele groep in termen van genetische achtergrond, leeftijd, geslacht en woonomstandigheden. De homozygote transgene muizen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn normaal van grootte en vertonen geen grove fysieke afwijkingen.
      OPMERKING: In sommige meer complexe gevallen kunnen onderzoekers geïnteresseerd zijn in het evalueren van meer dan twee genotypen (d.w.z. wildtype, heterozygoot, homozygoot), het onderzoeken van de effecten van geneesmiddelen (d.w.z. behandeling, voertuigbehandeling, niet-behandeling) of het vergelijken van mannen en vrouwen. Bij het werken met vrouwelijke muizen is het van cruciaal belang om rekening te houden met hun oestrische cycli. Hoewel vrouwelijke oestrische cycli geen significante invloed hebben op zelfverzorgend gedrag, hebben studies aangetoond dat deze cycli van invloed kunnen zijn op de sociale benadering en voorkeur voor sociale nieuwigheid37,38.
  2. Vreemde muizen: Gebruik minimaal 8 wildtype muizen voor de driekamertest. Gebruik 2 kooien, 4 muizen per kooi, overeenkomend met leeftijd, geslacht en dezelfde genetische achtergrond (C57BL/6J) van de testmuizen. Zorg ervoor dat de vreemde muizen geen eerdere interactie hebben gehad met de testmuizen.
  3. Behuizing: Groepshuis 3-5 muizen per huiskooi (71/2" B x 111/2" L x 5" H plastic muizenkooien) en onderhouden op een licht/donker-cyclus van 12 uur. Geef muizen ad libitum toegang tot voedsel en water in de kooi.
    LET OP: In de woonkamers in deze studeerkamer gaat de verlichting om 7.00 uur aan.
  4. Breng muizen over naar de gedragstestfaciliteit voor dieren gedurende minimaal 1 week voorafgaand aan de experimenten39,40.
  5. Behandeling en gedragstesten: Voer de test uit op een consistent tijdstip van de dag. Pas de starttijd aan afhankelijk van de lichtcyclus in de behuizingskamers van de muis. Breng de muizen eerst over naar de testruimte en laat ze minimaal 30 minuten wennen aan de testruimte bij gedimd licht voordat u met de gedragstests begint.
    OPMERKING: In dit onderzoek werden muisexperimenten routinematig uitgevoerd tussen 7.00 uur en 15.00 uur (ten opzichte van 7.00 uur licht aan en 7.00 uur licht uit). De daadwerkelijke start van de gedragstest vindt dus plaats rond 8 uur 's ochtends.

2. Voorbereiding van de ruimte en de uitrusting

  1. Bereid een kleine kamer voor met een totale vloeroppervlakte tussen 16-36 ft (5-12 m2; 6 m2 kamer in deze studeerkamer). Zorg voor een constante temperatuur, verlichting (instelbare gedimde verlichting) en geluidsniveaus (idealiter geluiddicht) voor alle experimenten.
    1. Als u staande lichten gebruikt (lampen 23 W, 120 V), plaats deze dan op symmetrische plaatsen en aan weerszijden, op ten minste 1 m afstand van het driekamerapparaat, om de twee zijkamers gelijkmatig te verlichten.
  2. Plaats het apparaat op een draagbare witte tafel. Gebruik voor het zelfverzorgingsexperiment schone, transparante kooien (71/2" B x 111/2" L x 5" H plastic muizenkooien); Gebruik één kooi per testmuis. Vul de kooien met ongeveer 1 cm vers strooisel zonder nestmateriaal. Gebruik hetzelfde soort bodembedekking als in de thuiskooi (hier vers strooisel van maïskolven ([1/4" Strooisel van maïskolven]).
    OPMERKING: De kooien moeten even groot zijn als de kooien voor thuis, met een filterdeksel erop, maar zonder metalen rooster (dat normaal gesproken wordt gebruikt voor het bewaren van flessen en het bezorgen van eten).
  3. Gebruik voor het sociale experiment een driekamerapparaat set41. Elke kamer is 20 cm x 40 cm x 22 (h) cm en omgeven door plexiglas wanden. Elke zijkamer is vanuit het midden toegankelijk via transparante schuifdeuren die kunnen worden verwijderd (5 x 8 cm). Gebruik twee draadkooien (diameter: 7 cm, hoogte: 15 cm; met afdekdeksels (lege of met vreemde muizen). De kooi is verhoogd en omsloten door gladde roestvrijstalen draadstaven (staafdiameter: 3 mm, staafafstand: 7 mm). Neem het zitten op de kooien niet op als interactietijd.
    1. Als mannelijke en vrouwelijke muizen beide bij het experiment zijn betrokken, label dan elke draadkooi op zijn speciale functie om kruisbesmetting te minimaliseren.
  4. Stel camera's boven of aan de voorzijde in op statieven voor video-opnamen. Zorg ervoor dat de camera's volledig zijn opgeladen en voldoende opslagruimte hebben.
  5. Reinig tussen elk testmuisexperiment de driekameropstelling en draadkooien grondig met een geurloos reinigingsmiddel (hier Versa-Clean). Verdun het reinigingsmiddel in kraanwater in een verhouding van 1:40, breng het aan op het vervuilde oppervlak en droog de oppervlakken af met een papieren handdoek voor de volgende test om restgeurresten van de vorige muis te minimaliseren.
    OPMERKING: Ethylalcohol (70%) of andere ontsmettingsmiddelen met geuren mogen niet worden gebruikt om het apparaat schoon te maken tijdens sociale interactietests, omdat deze het sociale gedrag van knaagdieren kunnen beïnvloeden.
  6. Gebruik privacyjaloezieën, zoals witte plastic planken, die rond het apparaat kunnen worden geplaatst om signalen van externe kamers te elimineren.
  7. Maak een klein whiteboard en een stift klaar. Noteer essentiële informatie op het whiteboard, waaronder het muisnummer, de titel van het experiment, de datum en de tijd van het experiment.
    OPMERKING: Het whiteboard wordt aan het einde van de opname aan de camera gepresenteerd om te voorkomen dat de scorende persoon het nummer van de muis kent voordat hij het gedrag van de muis beoordeelt. De studie zorgde ervoor dat het individuele scoringsgedrag blind bleef voor de experimentele groepen om mogelijke vertekening te minimaliseren.

3. Behandeling

  1. Voer hanteringsprocedures uit gedurende drie opeenvolgende dagen voorafgaand aan de start van de gedragsexperimenten.
  2. Voer hanteringssessies uit in dezelfde testruimte op een vast tijdstip, idealiter 's ochtends wanneer de muizen actiever zijn.
  3. Breng de muizen op elk van de 3 dagen naar de testruimte en laat ze 30 minuten ongestoord bij weinig licht om te acclimatiseren.
  4. Na een acclimatisatieperiode van 30 minuten opent u de kooi en brengt u een gehandschoende hand in de kooi. Laat muizen de hand 1 minuut verkennen.
  5. Schep de muizen voorzichtig op de hand (of gebruik een kleine kartonnen koker om ze op te pakken) en houd ze losjes vast. Laat muizen 1-2 minuten de hand en pols verkennen. In gevallen waarin een muis springerig of agressief is, plaats hem dan op het raster en laat hem zichzelf samenstellen.
  6. Ga door met hanteren totdat de muis comfortabel in de hand blijft liggen. Verwissel altijd de handschoenen voordat u de handen naar de volgende kooi brengt.
  7. Nadat u elke kooi met muizen hebt gehanteerd, plaatst u ze voorzichtig in hun thuiskooi en herhaalt u de procedure.
  8. Trek nieuwe handschoenen aan en hanteer vreemde muizen wanneer alle experimentele en controlemuizen zijn behandeld om te voorkomen dat testmuizen worden beïnvloed met geurende berichten.
  9. Behandel de vreemde muizen op dezelfde manier.
  10. Optioneel: Wen de vreemde muizen 10-15 minuten aan de draadkooi en het driekamerapparaat.
    OPMERKING: Deze gewenningssessie helpt agitatie en afwijkend gedrag bij de vreemde muizen tijdens de driekamertest te verminderen. Voor de driekamertest wordt in dit onderzoek echter alleen gekeken naar het sociale toenaderingsgedrag (snuffelen) van de kooi dat door de testmuis is geïnitieerd, of er nu een vreemde muis aanwezig is of niet. Wederzijds snuffelen door de vreemde muis is niet betrouwbaar waarneembaar in deze test en wordt daarom niet meegeteld. Vanwege deze beperking van de driekamertest en om kruisbesmetting van chemische signalen (zoals geuren) tot een minimum te beperken, hadden de vreemde muizen in dit geval geen eerdere ervaring met de draadkooi en het apparaat vóór de start van het experiment.

4. Methode 1: Zelfverzorging voor repetitief gedrag (Figuur 1A)

  1. Voer alle gedragsexperimenten uit tussen 7:00 en 15:00 uur.
  2. Schakel gedimd licht in, zoals hierboven beschreven. Maak de tafel schoon en richt de kamer in.
  3. Bereid elke testkooi voor met een dunne laag vers strooisel (zoals beschreven in stap 2.2).
  4. Zet 1-2 kooien op tafel, gescheiden van elkaar en de kameromgeving door witte plastic oogkleppen.
  5. Plaats een camera voor elke kooi om de testmuis vast te leggen.
  6. Breng alle muizen over naar de kamer en bedek de kooien tijdens het overdrachtsproces met een stoffen vel om stress te voorkomen.
  7. Verwijder het laken zodra de muizen in de testruimte zijn geplaatst en laat ze ten minste 30 minuten in de kamer met gedimd licht staan voordat het experiment begint.
  8. Noteer aan het begin van de test het muisidentificatienummer en de testinformatie op een whiteboard (zoals beschreven in stap 2.7).
  9. Begin met opnemen en plaats de testmuis in de testkooi.
  10. Verlaat de kamer tijdens de opnamesessie van 20 minuten.
  11. Beschouw voor elke test de eerste 10 minuten als gewenning. Gebruik de volgende 10 minuten om het verzorgingsgedrag te observeren en te scoren (zie paragraaf 6).
  12. Keer na 20 minuten terug naar de kamer. Presenteer het whiteboard aan de camera en stop met opnemen.
  13. Plaats de testmuis voorzichtig terug in de thuiskooi en herhaal het experiment.
    OPMERKING: Tegenwicht bieden aan de volgorde van tests tussen experimentele en controlegroepen om verschillende invloeden van buitenaf te verminderen.
  14. Nadat de experimenten zijn voltooid, brengt u de muizen terug naar hun woonkamer.

5. Methode 2: Driekamertest voor sociale interactie (Figuur 2A)

  1. Voer alle experimenten uit tussen 7:00 en 15:00 uur.
  2. Maak de tafel schoon en doe de lichten aan (gedimd licht).
  3. Plaats het driekamerinstrument van plexiglas op de tafel, omringd door privacyjaloezieën.
  4. Plaats één camera boven het hoofd en zorg ervoor dat alle drie de kamers zich in het opnamekader van de camera bevinden.
  5. Breng de test en vreemde muizen over naar de kamer. Bedek de kooien tijdens het overdrachtsproces met een stoffen vel en verwijder het laken eenmaal in de kamer.
  6. Laat de muizen minimaal 30 minuten in de kamer met gedimd licht voor aanvang van het experiment.
  7. Gewenning
    1. Houd de drie kamers leeg tijdens de gewenningsfase.
    2. Selecteer om te beginnen een testmuis en schrijf het identificatienummer op het whiteboard.
    3. Plaats vervolgens de testmuis voorzichtig in het middelste compartiment terwijl de schuifdeuren nog gesloten zijn.
    4. Begin met opnemen en open de deuren zodat de testmuis de drie lege kamers kan verkennen.
    5. Verlaat de kamer en laat de testmuis 10 minuten aan het apparaat wennen.
    6. Nadat de gewenning 10 minuten is voltooid, keert u terug naar de kamer. Leid de testmuis voorzichtig naar het middelste compartiment en sluit de schuifdeuren.
    7. Toon het whiteboard en stop de camera.
  8. Sociale benadering (nieuw draadkooiobject versus nieuwe vreemde muis 1)
    1. Plaats twee draadkooien in de linker- en rechterkamer. Plaats deze kooien diagonaal tegenover elkaar in de hoeken van elke kamer, zorg voor een afstand van 5 cm tot de muur, zodat de testmuis rond de kooien kan rennen. Zorg er bovendien voor dat de kooien niet direct naar de kamerdeuren zijn gericht.
    2. Kies een vreemde muis en plaats deze in een van de draadkooien, terwijl er in de andere draadkooi geen muis aanwezig is.
    3. Om de test te starten, drukt u op record en verwijdert u beide schuifdeuren. Verlaat de kamer.
    4. Laat de testmuis gedurende 10 minuten een lege draadkooi in de ene kamer verkennen en een kooi met een vreemde muis (nieuwe vreemde muis 1 of S1) in de andere kamer.
    5. Keer na 10 minuten terug naar de kamer. Toon het whiteboard aan de camera en beëindig de opname.
    6. Breng de muis weer in het middelste compartiment en sluit de onderling verbonden deuren.
      OPMERKING: Verwijder de draadkooien niet uit de opstelling na het voltooien van de sociale benaderingstest, zodat ze gedurende de hele taak in dezelfde positie blijven.
  9. Voorkeur voor sociale nieuwigheid (nieuwe vreemde muis 2 versus nieuwe muis 1)
    1. Plaats een nieuwe, nooit aangetroffen muis in de voorheen lege draadkooi (nieuwe vreemde muis 2 of S2).
      OPMERKING: S2 moet uit een andere thuiskooi komen dan S1.
    2. Begin met opnemen en open de onderling verbonden deuren zodat de testmuis het apparaat gedurende 10 minuten kan verkennen.
    3. Verlaat de kamer. De testmuis gaat twee draadkooien verkennen: één met de eerder aangetroffen S1-muis uit de fase van de sociale benadering en de andere met de nieuw geïntroduceerde S2-muis.
    4. Keer na 10 minuten terug naar de kamer. Toon het whiteboard aan de camera en sluit de opname af.
    5. Breng alle muizen (test- en nieuwe vreemdelingmuizen) terug naar hun thuiskooien.
    6. Reinig de kamers en draadkooien grondig met een geurvrij ontsmettingsmiddel. Zorg ervoor dat het apparaat droog is voordat u het voor het volgende experiment gebruikt.
    7. Herhaal het experiment voor alle resterende testmuizen.
      OPMERKING: Wissel de plaatsing van de kooien met S1- en S2-muizen af tussen de linker- en rechterkamer voor de verschillende testmuizen. Het tegenwicht voorkomt een vertekende voorkeur voor een bepaalde kamer van het apparaat.
    8. Breng de muizen na het testen terug naar de huisvesting.
    9. Stop en start de camera tussen elk deel van de test opnieuw op, wat resulteert in 3 keer 10 minuten video's per testmuis.

6. Scoren en statistische analyse

  1. Benodigde apparatuur
    1. Gebruik twee stopwatches en een computer of laptop met de volgende software: Microsoft Excel, GraphPad Prism en andere statistische programma's zoals SPSS voor scores, het uitzetten van de grafieken en statistische analyse.
  2. Zelfverzorgende scoren
    OPMERKING: Wanneer een muis in een comfortabele omgeving wordt geplaatst, kan spontaan zelfverzorgingsgedrag met weinig stress worden waargenomen. Meestal beginnen muizen met vlooien door hun poten rond de neus en snorharen te likken (stadium I). Dit kan worden gevolgd door fase II en III, waarbij de muis zijn hele gezicht en hoofd met zijn poten afveegt. In stadium IV gaat de muis verder met het verzorgen van zijn lichaam en het likken van zijn staart14. Gezien de zeldzaamheid van het vlooien van hun oren (stadium III) en staarten (stadium IV) binnen een testperiode van 10 minuten, en met als doel de duidelijkheid van handmatige analyse te vergroten, werd zelfvlooiingsgedrag gecategoriseerd in twee primaire typen: rostale vlooiing en staartvlooiing. Rostrale verzorging omvat activiteiten zoals pootlikken, neusverzorging en grondig wassen van het gezicht, de oren en het hoofd. Caudale verzorging omvat het likken van het lichaamsdeel dat gebieden bedekt zoals de buik, rug, achterpoten en genitale gebied, evenals de staart.
    1. Observeer het vlooigedrag zorgvuldig en registreer de aanvallen. Een individuele verzorgingssessie vindt plaats wanneer de muis zich bezighoudt met een enkel geval van zelfverzorging. Overweeg een verzorgingssessie vanaf het moment dat deze begint totdat deze stopt, ongeacht het specifieke verzorgingsgedrag.
    2. Als de testmuis zijn vlooiing een paar seconden onderbreekt zonder van positie te veranderen, tel deze dan als onderdeel van hetzelfde gevecht. Als de muis echter stopt met vlooien en begint te verkennen, bedenk dan dat de vlooiwedstrijd is afgelopen.
    3. Neem bovendien alleen een volledige verzorgingssessie op als de muis continu van voren naar achteren verzorgt (van fase I naar fase IV).
    4. Documenteer de totale vlooiingstijd, het aantal vlooienperiodes en het aantal volledige vlooiperiodes dat is waargenomen tijdens de testperiode van 10 minuten, waarbij de observaties worden gemarkeerd met tussenpozen van 2 minuten, 5 minuten en 10 minuten.
  3. Driekamertest voor sociale interactie
    De analyse bepaalt de tijd en frequentie van snuffelinteractie met elke muis (nieuwe S1 en lege kooi voor sociale benadering, en S1 en nieuwe S2 voor de voorkeur voor sociale nieuwigheid).
    1. Gebruik twee timers om de interactietijd met de muis in elke kooi en de totale tijd die in elke kamer wordt doorgebracht te registreren. Noteer voor elk onderdeel van de test (sociale benadering en voorkeur voor sociale nieuwigheid) het aantal keren dat de testmuis elke kamer binnengaat (totaal aantal inzendingen).
    2. Bepaal de tijd in compartiment(en) aan de hand van de aanwezigheid van het lichaam van de testmuis in een van de kamers (er moeten vier poten naar binnen).
    3. Registreer interactietijd(en) wanneer de testmuis aan de nieuwe vreemde muis snuffelt (direct gezichtscontact of snuffelen aan de staart van de vreemde muis) of aan de lege kooi snuffelt Beschouw het zitten op de bovenkant van de kooi niet als interactie.
    4. Opnemen op 2 min, 5 min en 10 min. Voer een tijdsafhankelijke analyse uit.
    5. Vergelijk de sociale discriminatie-index (DI) binnen de groepen.
      OPMERKING: DI wordt berekend als: DI = (tijd interactie met S1 muis - tijd interactie met de lege kooi)/totale interactietijd x 100. Tijdens het sociale nieuwigheidsgedeelte zullen controlemuizen meer interactie hebben met S2 (onbekende muis) dan met S1 (bekende muis). De sociale nieuwigheid (sociaal geheugen) DI wordt berekend: DI = (tijd van interactie met S2-muis - tijd van interactie met de bekende muis (S1))/ totale interactietijd x 100.
  4. Statistische analyse
    1. Gebruik een tweezijdige T-test van een ongepaarde student om de p-waarden te berekenen met een significant niveau ingesteld op p < 0,05 voor de zelfverzorgingstijd, periodes en volledige periodes, waarbij er slechts twee groepen zijn.
    2. Gebruik voor de driekamertoets de T-toets van een student om de statistische significantie van het totale aantal inzendingen tussen twee groepen te berekenen. Wanneer niet wordt voldaan aan de aanname van de gelijke variantie van gegevens tussen groepen (Levene's test p < 0,05), voer dan een Welch's T-test uit om de afwijking aan te passen en de gemiddelden van onafhankelijke groepen te vergelijken.
      OPMERKING: Het meten van het totale aantal inzendingen beoordeelt de algehele activiteit van muizen. Er kunnen mogelijke zorgen ontstaan (gerelateerd aan motorische stoornissen en hoge angstniveaus van muizen) als de experimentele groep het driekamerapparaat aanzienlijk minder verkent dan de controlegroep. Om dit aan te pakken, kunt u overwegen de motorische functie en angstachtig gedrag te evalueren met depressieve gedragstests, aangezien verminderde exploratie aan deze aandoeningen kan worden toegeschreven42.
    3. Gebruik een ANOVA op gemengde wijze om de tijd in elke kamer en de interactietijd voor elke test te vergelijken. Afhankelijk van het aantal groepen en factoren, gebruik een gemengde tweeweg ANOVA (2 factoren: genotype en kant van de kamer, of interactie met lege kooi en S1, of S1 en S2), of een gemengde drieweg ANOVA (3 factoren: genotype, behandeling en kant van de kamer, of interactie met leeg en S1, of S1 en S2). Deze analyse is met name nuttig voor het onthullen van de statistisch significante sociale interactie van muizen tussen verschillende factoren.
      OPMERKING: Deze factoren omvatten het belangrijkste effect van het genotype (impact van verschillende genetische achtergronden op sociaal gedrag), het belangrijkste effect van interactie met de kooi (snuffelen en voorkeur voor een nieuwe vreemdeling versus een lege kooi of eerder aangetroffen muis), het belangrijkste effect van de behandeling (impact van verschillende medicamenteuze behandelingen op het sociale gedrag van muizen), en de genotype x behandelingsinteractie (onthullen hoe de toegepaste behandeling het genotype beïnvloedt).
    4. Gebruik vervolgens de post-hoctest van Bonferroni (α-niveau ingesteld op 0,05) om de vergelijking tussen verschillende groepen verder te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR) vervult een cruciale rol in het centrale zenuwstelsel (CZS) door de novo eiwitsynthese te reguleren en autofagie te onderdrukken43. Ontregeling van de mTOR-route en synaptische eiwitsynthese is betrokken bij ASS28. Genoombrede studies bij ASS-patiënten hebben verschillende ASS-geassocieerde genmutaties geïdentificeerd, waaronder die welke van invloed zijn op eiwitten die betrokken zijn bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meeste etiologische oorzaken, pathologische veranderingen en biologische markers van ASS zijn niet bekend of beschikbaar. De diagnose van ASS is voornamelijk gebaseerd op twee vastgestelde reeksen klinische symptomen: aanhoudende tekorten in sociale communicatie en overmatig repetitief gedrag 18,19,55. Aangezien ASS een spectrumstoornis is die een breed scala aan symptomen omvat, is het een u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Karim Nader (Department of Psychology, McGill University) voor het verlenen van toegang tot de faciliteit voor diergedrag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1/4'' Teklad Corncob Bedding Harlan, TEKLAD7092-7097De grondstof voor corncob beddengoedproducten  is 100% maïskolb. Er worden geen andere componenten of additieven gebruikt. 
HD Video Recording Cameratraditional Video CameraSonyHDRCX40550 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 bij 60P, AVCHD en MP4 codecs. 30x Optische / 60x Clear Image Zoom om dichter bij de actie te komen. 26,8 mm groothoek ZEISS Lens.
Nitrile Powder Free Examination GlovesAurelia, TransformASTM D6319-00Getest voor gebruik met chemotherapie medicijnen volgens ASTM D6978
Rodent Plastic Cage BottomsAncareAN75PLFAN75 Muis 7½” B x 11½” L x 5” H
TÅGARP vloerlamp en lampen IEKA604.640.49Lampen zijn 23 W 120 V.
Ugo Basile Sociability ApparatusStoelting 60450De sociaal gedragstest (3-kamer sociaal test) is een waardevol hulpmiddel om sociaal gedrag bij muizen te bestuderen.
Versa-Clean FisherbrandPVCLN04Reinigingsmiddel
Whiteboard en  Low Odor Dry Erase MarkerEXPONADry-erase markers in vet zwart

Referenties

  1. Esler, A., Ruble, L. DSM-5 diagnostic criteria for autism spectrum disorder with implications for school psychologists. Int J Sch Educ Psychol. 3 (1), 1-15 (2015).
  2. Lord, C., et al. Autism spectrum disorder. Nat Rev Dis Primers. 6 (1), 5(2020).
  3. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778-790 (2022).
  4. Maenner, M. J., et al. Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years - autism and developmental disabilities monitoring network, 11 sites, United States, 2018. MMWR Surveill Summ. 70 (11), 1-16 (2021).
  5. Maenner, M. J., et al. Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years- Autism and developmental disabilities monitoring network, 11 Sites, United States, 2020. MMWR Surveill Summ. 72 (2), 1-14 (2023).
  6. Hours, C., Recasens, C., Baleyte, J. M. ASD and ADHD co-morbidity: What are we talking about. Front Psychiatry. 13, 837424(2022).
  7. Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behav Brain Res. 208 (2), 553-559 (2010).
  8. Sheng, Z., et al. Fentanyl induces autism-like behaviours in mice by hypermethylation of the glutamate receptor gene grin2b. Br J Anaesth. 129 (4), 544-554 (2022).
  9. Ruskin, D. N., et al. Ketogenic diet improves core symptoms of autism in BTBR mice. PLoS One. 8 (6), e65021(2013).
  10. Queen, N. J., et al. Environmental enrichment improves metabolic and behavioral health in the btbr mouse model of autism. Psychoneuroendocrinology. 111, 104476(2020).
  11. Provenzano, G., Zunino, G., Genovesi, S., Sgadó, P., Bozzi, Y. Mutant mouse models of autism spectrum disorders. Dis Markers. 33 (5), 225-239 (2012).
  12. Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral profiles of mouse models for autism spectrum disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
  13. Jiang, Y. -H., Ehlers, M. D. Modeling autism by shank gene mutations in mice. Neuron. 78 (1), 8-27 (2013).
  14. Arakawa, H. From multisensory assessment to functional interpretation of social behavioral phenotype in transgenic mouse models for autism spectrum disorders. Front Psychiatry. 11, 592408(2020).
  15. Kazdoba, T. M., Leach, P. T., Crawley, J. N. Behavioral phenotypes of genetic mouse models of autism. Genes Brain Behav. 15 (1), 7-26 (2016).
  16. Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 490-502 (2010).
  17. Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 10 (4), 248-258 (2004).
  18. APA PsycNet. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-5th Edition. , American Psychiatric Association. Washington, DC. (2022).
  19. World Health Organization. ICD-11 for Mortality and Morbidity Statistics. 2024, World Health Organization. (2023).
  20. Spruijt, B. M., Van Hooff, J. A., Gispen, W. H. Ethology and neurobiology of grooming behavior. Physiol Rev. 72 (3), 825-852 (1992).
  21. Bolles, R. C. Grooming behavior in the rat. J Comp Physiol Psychol. 53, 306-310 (1960).
  22. Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nat Rev Neurosci. 17 (1), 45-59 (2016).
  23. Kalueff, A. V., Aldridge, J. W., Laporte, J. L., Murphy, D. L., Tuohimaa, P. Analyzing grooming microstructure in neurobehavioral experiments. Nat Protoc. 2 (10), 2538-2544 (2007).
  24. Gandhi, T., Lee, C. C. Neural mechanisms underlying repetitive behaviors in rodent models of autism spectrum disorders. Front Cell Neurosci. 14, 592710(2020).
  25. Fyke, W., Alarcon, J. M., Velinov, M., Chadman, K. K. Pharmacological inhibition of the primary endocannabinoid producing enzyme, dgl-α, induces autism spectrum disorder-like and co-morbid phenotypes in adult C57bl/J mice. Autism Res. 14 (7), 1375-1389 (2021).
  26. Kazlauskas, N., Robinson-Agramonte, M. D. L. A., Depino, A. M. Neuroinflammation in Animal Models of Autism. Translational Approaches to Autism Spectrum Disorder. , Springer. Cham. (2015).
  27. Ryan, B. C., Young, N. B., Crawley, J. N., Bodfish, J. W., Moy, S. S. Social deficits, stereotypy and early emergence of repetitive behavior in the C58/J inbred mouse strain. Behav Brain Res. 208 (1), 178-188 (2010).
  28. Crawley, J. N. Mouse behavioral assays relevant to the symptoms of autism. Brain Pathol. 17 (4), 448-459 (2007).
  29. Stoppel, D. C., Mccamphill, P. K., Senter, R. K., Heynen, A. J., Bear, M. F. Mglur5 negative modulators for fragile x: Treatment resistance and persistence. Front Psychiatry. 12, 718953(2021).
  30. Kazdoba, T. M., et al. Translational mouse models of autism: Advancing toward pharmacological therapeutics. Curr Top Behav Neurosci. 28, 1-52 (2016).
  31. Gantois, I., et al. Metformin ameliorates core deficits in a mouse model of fragile x syndrome. Nat Med. 23 (6), 674-677 (2017).
  32. Meyza, K. Z., Blanchard, D. C. The BTBR mouse model of idiopathic autism - current view on mechanisms. Neurosci Biobehav Rev. 76 (Pt A), 99-110 (2017).
  33. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  34. Crawley, J. N. Twenty years of discoveries emerging from mouse models of autism. Neurosci Biobehav Rev. 146, 105053(2023).
  35. Wang, Z., et al. Effects of fmr1 gene mutations on sex differences in autism-like behavior and dendritic spine development in mice and transcriptomic studies. Neuroscience. 534, 16-28 (2023).
  36. Peñagarikano, O., et al. Absence of cntnap2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
  37. Chari, T., Griswold, S., Andrews, N. A., Fagiolini, M. The stage of the estrus cycle is critical for interpretation of female mouse social interaction behavior. Front Behav Neurosci. 14, 113(2020).
  38. Zeng, P. Y., Tsai, Y. H., Lee, C. L., Ma, Y. K., Kuo, T. H. Minimal influence of estrous cycle on studies of female mouse behaviors. Front Mol Neurosci. 16, 1146109(2023).
  39. Gray, S., Hurst, J. L. The effects of cage cleaning on aggression within groups of male laboratory mice. Anim Behav. 49 (3), 821-826 (1995).
  40. Rasmussen, S., Miller, M. M., Filipski, S. B., Tolwani, R. J. Cage change influences serum corticosterone and anxiety-like behaviors in the mouse. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (4), 479-483 (2011).
  41. Stoelting. Ugo basile sociability apparatus. , https://stoeltingco.com/Neuroscience/Ugo-Basile-Sociability-Apparatus~9840 (2024).
  42. Heinz, D. E., et al. Exploratory drive, fear, and anxiety are dissociable and independent components in foraging mice. Translational Psychiatry. 11 (1), 318(2021).
  43. Takei, N., Nawa, H. mTOR signaling and its roles in normal and abnormal brain development. Front Mol Neurosci. 7, 28(2014).
  44. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  45. Kwon, C. H., et al. Pten regulates neuronal arborization and social interaction in mice. Neuron. 50 (3), 377-388 (2006).
  46. Napoli, I., et al. The fragile x syndrome protein represses activity-dependent translation through cyfip1, a new 4e-bp. Cell. 134 (6), 1042-1054 (2008).
  47. Auerbach, B. D., Osterweil, E. K., Bear, M. F. Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology. Nature. 480 (7375), 63-68 (2011).
  48. Winden, K. D., Ebrahimi-Fakhari, D., Sahin, M. Abnormal mTOR activation in autism. Annu Rev Neurosci. 41, 1-23 (2018).
  49. Sharma, A., et al. Dysregulation of mTOR signaling in fragile X syndrome. J Neurosci. 30 (2), 694-702 (2010).
  50. Amorim, I. S., Lach, G., Gkogkas, C. G. The role of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) in neuropsychiatric disorders. Front Genet. 9, 561(2018).
  51. Pause, A., et al. Insulin-dependent stimulation of protein synthesis by phosphorylation of a regulator of 5'-cap function. Nature. 371 (6500), 762-767 (1994).
  52. Banko, J. L., et al. The translation repressor 4e-bp2 is critical for eIF4F complex formation, synaptic plasticity, and memory in the hippocampus. J Neurosci. 25 (42), 9581-9590 (2005).
  53. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  54. Wiebe, S., et al. Inhibitory interneurons mediate autism-associated behaviors via 4E-BP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 18060-18067 (2019).
  55. Lord, C., Elsabbagh, M., Baird, G., Veenstra-Vanderweele, J. Autism spectrum disorder. Lancet. 392 (10146), 508-520 (2018).
  56. Willner, P. Validation criteria for animal models of human mental disorders: Learned helplessness as a paradigm case. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 10 (6), 677-690 (1986).
  57. Jabarin, R., Netser, S., Wagner, S. Beyond the three-chamber test: Toward a multimodal and objective assessment of social behavior in rodents. Mol Autism. 13 (1), 41(2022).
  58. Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Age-related changes in behavior in c57bl/6j mice from young adulthood to middle age. Mol Brain. 9 (1), 11(2016).
  59. Arakawa, H. Revisiting sociability: Factors facilitating approach and avoidance during the three-chamber test. Physiol Behav. 272, 114373(2023).
  60. Rein, B., Ma, K., Yan, Z. A standardized social preference protocol for measuring social deficits in mouse models of autism. Nat Protoc. 15 (10), 3464-3477 (2020).
  61. Monteiro, P., Feng, G. Shank proteins: Roles at the synapse and in autism spectrum disorder. Nat Rev Neurosci. 18 (3), 147-157 (2017).
  62. Sala, C., Vicidomini, C., Bigi, I., Mossa, A., Verpelli, C. Shank synaptic scaffold proteins: Keys to understanding the pathogenesis of autism and other synaptic disorders. J Neurochem. 135 (5), 849-858 (2015).
  63. Enginar, N., Hatipoğlu, İ, Fırtına, M. Evaluation of the acute effects of amitriptyline and fluoxetine on anxiety using grooming analysis algorithm in rats. Pharmacol Biochem Behav. 89 (3), 450-455 (2008).
  64. Silverman, J. L., Tolu, S. S., Barkan, C. L., Crawley, J. N. Repetitive self-grooming behavior in the BTBR mouse model of autism is blocked by the mGluR5 antagonist MPEP. Neuropsychopharmacology. 35 (4), 976-989 (2010).
  65. Chadman, K. K. Fluoxetine but not risperidone increases sociability in the btbr mouse model of autism. Pharmacol Biochem Behav. 97 (3), 586-594 (2011).
  66. Kalueff, A. V., Tuohimaa, P. The grooming analysis algorithm discriminates between different levels of anxiety in rats: Potential utility for neurobehavioural stress research. J Neurosci Methods. 143 (2), 169-177 (2005).
  67. Tartaglione, A. M., et al. Aberrant self-grooming as early marker of motor dysfunction in a rat model of Huntington's disease. Behav Brain Res. 313, 53-57 (2016).
  68. Wilson, C. A., Koenig, J. I. Social interaction and social withdrawal in rodents as readouts for investigating the negative symptoms of schizophrenia. Eur Neuropsychopharmacol. 24 (5), 759-773 (2014).
  69. Samsom, J. N., Wong, A. H. Schizophrenia and depression co-morbidity: What we have learned from animal models. Front Psychiatry. 6, 13(2015).
  70. Planchez, B., Surget, A., Belzung, C. Animal models of major depression: Drawbacks and challenges. J Neural Transm (Vienna). 126 (11), 1383-1408 (2019).
  71. Ang, M. J., Lee, S., Kim, J. C., Kim, S. H., Moon, C. Behavioral tasks evaluating schizophrenia-like symptoms in animal models: A recent update. Curr Neuropharmacol. 19 (5), 641-664 (2021).
  72. Samson, A. L., et al. Mousemove: An open source program for semi-automated analysis of movement and cognitive testing in rodents. Sci Rep. 5 (1), 16171(2015).
  73. Barbera, G., et al. An open-source capacitive touch sensing device for three chamber social behavior test. MethodsX. 7, 101024(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Muismodellenautismespectrumstoornisself-groomingtestthree-chamber-testsociale interactierepetitief gedraggenetische mutatiesgedragsbeoordelingEif4ebp2-knock-out
Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.