Methoden om ruimtelijke transcriptomics van botweefsels mogelijk te maken

Summary

Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om vers verkregen botweefsel te ontkalken en RNA van hoge kwaliteit te behouden. Er wordt ook een methode geïllustreerd voor het in secties verdelen van Formaline Fixed Paraffine Embedded (FFPE) monsters van niet-gedemineraliseerde botten om resultaten van goede kwaliteit te verkrijgen als er geen vers weefsel beschikbaar is of niet kan worden verzameld.

Abstract

Het begrijpen van de relatie tussen de cellen en hun locatie in elk weefsel is van cruciaal belang om de biologische processen bloot te leggen die verband houden met normale ontwikkeling en ziektepathologie. Ruimtelijke transcriptomics is een krachtige methode die de analyse van het hele transcriptoom in weefselmonsters mogelijk maakt, waardoor informatie wordt verkregen over de cellulaire genexpressie en de histologische context waarin de cellen zich bevinden. Hoewel deze methode op grote schaal is gebruikt voor veel zachte weefsels, was de toepassing ervan voor de analyses van harde weefsels zoals bot een uitdaging. De grootste uitdaging ligt in het onvermogen om RNA en weefselmorfologie van goede kwaliteit te behouden tijdens het verwerken van de harde weefselmonsters voor secties. Daarom wordt hier een methode beschreven om vers verkregen botweefselmonsters te verwerken om effectief ruimtelijke transcriptomics-gegevens te genereren. De methode maakt het mogelijk om de monsters te ontkalken, waardoor succesvolle weefselsecties met behoud van morfologische details worden verkregen, terwijl RNA-afbraak wordt vermeden. Daarnaast worden gedetailleerde richtlijnen gegeven voor monsters die eerder in paraffine waren ingebed, zonder demineralisatie, zoals monsters die zijn verzameld bij weefselbanken. Met behulp van deze richtlijnen worden hoogwaardige ruimtelijke transcriptomics-gegevens getoond die zijn gegenereerd uit weefselbankmonsters van primaire tumor- en longmetastasen van botosteosarcoom.

Introduction

Bot is een gespecialiseerd bindweefsel dat voornamelijk bestaat uit vezels van collageen type 1 en anorganische zouten¹. Als gevolg hiervan is bot ongelooflijk sterk en stijf, terwijl het tegelijkertijd licht en traumabestendig is. De grote kracht van bot komt voort uit het mineraalgehalte. Sterker nog, voor elke gegeven toename van het percentage mineraalgehalte neemt de stijfheid toe met een factor^vijf. Bijgevolg worden onderzoekers geconfronteerd met aanzienlijke problemen wanneer ze door middel van histologische doorsnede de biologie van een botmonster analyseren.

Niet-ontkalkte bothistologie is haalbaar en soms vereist, afhankelijk van het type onderzoek (bijv. om de microarchitectuur van bot te bestuderen); Het is echter een grote uitdaging, vooral als de exemplaren groot zijn. In deze gevallen vereist weefselverwerking voor histologische doeleinden verschillende aanpassingen van de standaardprotocollen en -technieken³. Over het algemeen wordt botweefsel direct na fixatie ontkalkt om gemeenschappelijke histologische evaluaties uit te voeren, een proces dat enkele dagen tot enkele weken kan duren, afhankelijk van de grootte van het weefsel en het gebruikte ontkalkingsmiddel⁴. Ontkalkte secties worden vaak gebruikt voor het onderzoek van het beenmerg, de diagnose van tumoren, enz. Er zijn drie hoofdtypen ontkalkingsmiddelen: sterke zuren (bijv. salpeterzuur, zoutzuur), zwakke zuren (bijv. mierenzuur) en chelaatvormers (bijv. ethyleendiaminettracetinezuur of EDTA)⁵. Sterke zuren kunnen bot zeer snel ontkalken, maar ze kunnen de weefsels beschadigen; zwakke zuren komen veel voor en zijn geschikt voor diagnostische procedures; Chelaatvormers worden verreweg het meest gebruikt en zijn geschikt voor onderzoekstoepassingen, aangezien het demineralisatieproces in dit geval langzaam en zacht is, waardoor de morfologie van hoge kwaliteit behouden blijft en de informatie over genen en eiwitten behouden blijft, zoals vereist door veel procedures (bijv. In situ hybridisatie, immunokleuring). Wanneer echter het hele transcriptoom moet worden bewaard, zoals voor genexpressie-analyses, kan zelfs een langzame en zachte demineralisatie schadelijk zijn. Daarom zijn betere benaderingen en methoden nodig wanneer de morfologische analyse van de weefsels moet worden gecombineerd met genexpressieanalyses van de cellen.

Dankzij recente verbeteringen in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) en ruimtelijke transcriptomics, is het nu mogelijk om de genexpressie van een weefselmonster te bestuderen, zelfs wanneer formalinefixatie paraffine-inbedding (FFPE) werd gebruikt om de weefselmonsters op te slaan ^6,7,8. Deze mogelijkheid heeft toegang ontsloten tot een groter aantal monsters, zoals die zijn opgeslagen in weefselbanken over de hele wereld. Als scRNA-seq moet worden gebruikt, is RNA-integriteit de belangrijkste vereiste; in het geval van ruimtelijke transcriptomics van FFPE-monsters zijn echter zowel hoogwaardige weefselsecties als hoogwaardig RNA nodig om de genexpressie binnen de histologische context van elke weefselsectie te visualiseren. Hoewel dit gemakkelijk is bereikt met zachte weefsels, kan hetzelfde niet gezegd worden van harde weefsels zoals bot. Voor zover wij weten, is er zelfs nooit een onderzoek met ruimtelijke transcriptomics uitgevoerd op FFPE-botmonsters. Dit komt door het ontbreken van protocollen die FFPE-botweefsel effectief kunnen verwerken met behoud van hun RNA-inhoud. Hier wordt eerst een methode aangereikt om vers verkregen botweefselmonsters te verwerken en te ontkalken en tegelijkertijd RNA-afbraak te voorkomen. Vervolgens, in het besef van de noodzaak van transcriptomics-analyse van de FFPE-monsters die wereldwijd in weefselbanken zijn verzameld, worden ook ontwikkelde richtlijnen gepresenteerd om FFPE-monsters van niet-gedemineraliseerde botten op de juiste manier te behandelen.

Protocol

Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren aan de University of Pittsburgh School of Dental Medicine.

1. Methode om FFPE-blokken botweefselmonsters te bereiden die demineralisatie vereisen

1. Bereiding van reagentia en materialen
   1. Bereid EDTA 20% pH 8.0 voor. Los voor 1 L 200 g EDTA op in 800 ml ultrapuur water, pas de pH aan tot 8,0 met natriumhydroxide 10 N en breng het volume ten slotte op 1 L met ultrapuur water. Bewaren bij kamertemperatuur.
      LET OP: Gebruik altijd vers bereide EDTA 20% pH 8.0. Natriumhydroxide (NaOH) 10 N wordt bereid door 400 g NaOH op te lossen in 1 L ultrapuur water.
   2. Bereid paraformaldehyde (PFA) 4% in een zuurkast met 1x PBS zonder calcium en magnesium.
      OPMERKING: Wijs een gebied in een zuurkast aan voor het werken met geconcentreerde paraformaldehyde-oplossingen of paraformaldehyde-vaste stoffen, en label het als zodanig. Houd containers zoveel mogelijk gesloten om blootstelling te voorkomen. Gebruik in de kleinste praktische hoeveelheden die nodig zijn voor het experiment dat wordt uitgevoerd. Als het wegen van paraformaldehydepoeder en de weegschaal niet in een zuurkast kan worden gebruikt, neem dan eerst een container, voeg vervolgens PFA-poeder toe aan de kap en dek af voordat u terugkeert naar de weegschaal om het poeder te wegen. Gebruik altijd vers bereide 4% PFA.
   3. Gebruik voor elk exemplaar een geschikte container.
      OPMERKING: Gebruik bijvoorbeeld voor 1 mg botweefsel een container die ervoor zorgt dat ten minste 1 ml van een oplossing in contact komt met het bot.
   4. Steriliseer alle chirurgische apparatuur die nodig is voor dissectie.
   5. Reinig alle gebieden met een ontsmettingsoplossing om RNases te verwijderen.
   6. Verzamel de resterende experimentele materialen, waaronder ijscontainers, 70% ethanolspray en krijg toegang tot een orbitale shaker.
2. Isolatie van botweefselmonsters van muizen
   1. Euthanaseer de muis door blootstelling aan CO_{2 ,} voer vervolgens cervicale dislocatie uit en leg hem op zijn rug. Spuit de muizenhuid in met 70% ethanol.
   2. Open met een steriele ontleedschaar de huid en leg de beenspier bloot. Snijd de spier langs het been door om een duidelijk zicht te krijgen op de positie van het bot en ontarticuleer het bot voorzichtig om het zonder schade te verwijderen.
      OPMERKING: Het is niet nodig om alle spieren die aan het bot vastzitten volledig te verwijderen. Probeer zo snel mogelijk te zijn om de afbraak van RNA te beperken.
   3. Plaats het botmonster onmiddellijk in een buisje met 4% PFA en plaats het buisje op ijs.
   4. Herhaal de procedure om naar wens andere botmonsters te verzamelen.
   5. Breng monsters met 4% PFA in agitatie op een orbitale schudder bij 140 tpm bij 4 °C gedurende ten minste 24 uur om een goede fixatie mogelijk te maken.
3. Ontkalking van botweefselmonsters
   1. Haal na fixatie het botweefsel uit de orbitale schudder.
   2. Was het botweefsel 2 keer met 1x PBS gedurende 3 minuten op een orbitale shaker op 140 tpm om eventuele achtergebleven PFA te verwijderen.
   3. Verwijder met een steriele ontleedschaar alle resterende spieren die nog aan het bot vastzitten.
   4. Was het botweefsel nog een keer met 1x PBS gedurende 3 min.
   5. Plaats het botweefsel in een nieuwe container met 20% EDTA pH 8.0. Plaats de container vervolgens op een orbitale schudder bij 140 tpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   6. Gooi de oplossing weg, voeg verse 20% EDTA pH 8.0 toe aan de container en plaats deze op een orbitale schudder bij 140 tpm gedurende 30 minuten bij RT.
   7. Herhaal stap 1.3.6 10 keer.
   8. Gooi de oplossing weg, voeg verse 20% EDTA pH 8.0 toe aan de container en plaats deze een nacht bij 4 °C in een koude kamer op een orbitale schudder bij 140 tpm.
4. Uitdroging van botweefselmonsters
   1. Haal het botweefselmonster uit de container.
   2. Inspecteer het weefsel en controleer de efficiëntie van de ontkalking door het bot voorzichtig te draaien en te draaien. U kunt ook een röntgenfoto van het bot maken met behulp van een röntgenapparaat.
      OPMERKING: Als het monster gemakkelijk buigt, is een goede ontkalkingsgraad bereikt. Als dit niet het geval is, moeten de ontkalkingsparameters (tijd, snelheid van roeren, volume van 20% EDTA pH 8,0. gebruikt, enz.) worden verhoogd.
   3. Was het botweefsel 2 keer met 1x PBS gedurende 3 minuten om resten van EDTA te verwijderen.
   4. Plaats het botweefsel in een nieuwe container en start de uitdroging met 70% ethanol. Incubeer gedurende 15 minuten bij 140 tpm.
   5. Gooi de 70% ethanoloplossing weg, doe het monster in 90% ethanoloplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 140 tpm.
   6. Gooi de 90% ethanoloplossing weg, doe het monster in 100% ethanol en incubeer gedurende 15 minuten bij 140 tpm.
   7. Gooi de 100% ethanol weg, doe het monster in nieuwe 100% ethanol en incubeer gedurende 15 minuten bij 140 tpm.
   8. Gooi de 100% ethanol weg, doe het monster in nieuwe 100% ethanol en incubeer gedurende 15 minuten bij 140 tpm.
   9. Gooi de 100% ethanol weg, doe het monster in nieuwe 100% ethanol en incubeer gedurende 30 minuten bij 140 tpm.
   10. Gooi de 100% ethanol weg, doe het monster in nieuwe 100% ethanol en incubeer gedurende 45 minuten bij 140 tpm.
       OPMERKING: Uitdroging kan ook worden uitgevoerd met behulp van een automatische processor. Stel in dit geval het programma in met dezelfde omstandigheden die zijn gerapporteerd voor de handmatige uitdroging. De gerapporteerde omstandigheden zijn voor monsters die niet dikker zijn dan 4 mm (d.w.z. botweefselmonsters verkregen van muizen). Voor monsters dikker dan 4 mm moet de uitdrogingstiming experimenteel worden bepaald.
5. Opruimen van botweefselmonsters
   1. Plaats het botweefselmonster in een nieuwe container en start het opruimingsproces met xyleen. Incubeer gedurende 20 minuten op 140 tpm.
   2. Gooi het gebruikte xyleen weg, voeg nieuw xyleen toe en incubeer nog 20 minuten bij 140 tpm.
   3. Gooi het gebruikte xyleen weg, voeg nieuw xyleen toe en incubeer gedurende 45 minuten op 140 tpm.
      OPMERKING: Het wissen kan ook worden uitgevoerd met behulp van een automatische processor. Stel in dit geval het programma in met dezelfde voorwaarden die zijn gerapporteerd voor het handmatig wissen. De gerapporteerde omstandigheden zijn voor monsters die niet dikker zijn dan 4 mm (d.w.z. botweefselmonsters verkregen van muizen). Voor preparaten dikker dan 4 mm moet de timing experimenteel worden bepaald.
6. Infiltratie en inbedding van botweefselmonsters
   1. Haal het botweefselmonster na het wissen op uit de orbitale shaker/automatische processor.
   2. Plaats het botweefselmonster in een inbeddingscassette en start de infiltratie met was (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 30 minuten bij 60 °C.
   3. Gooi de gebruikte was weg, voeg nieuwe was toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 60 °C.
   4. Gooi de gebruikte was weg, voeg nieuwe was toe en incubeer gedurende 45 minuten bij 60 °C.
   5. Plaats het botweefselmonster voorzichtig in een mal met de gewenste oriëntatie.
   6. Laat het sampleblok stollen op een koude ondergrond.
   7. Bewaar de verkregen FFPE bij 4 °C tot u klaar bent om te beginnen met sectieren.
      OPMERKING: FFPE-blok kan vele jaren worden opgeslagen voordat het secties wordt uitgevoerd.

2. Richtlijnen voor het in secties verdelen van niet-gedemineraliseerde FFPE-monsters

OPMERKING: De volgende richtlijnen bieden waardevolle tips en instructies die nuttig zijn om de kwaliteit van de weefselsecties aanzienlijk te verbeteren en tegelijkertijd RNA-degradatie te voorkomen, vooral in gevallen van kleine niet-ontkalkte botmonsters. Deze richtlijnen kunnen ook worden toegepast op ontkalkte botmonsters, indien beschikbaar. Voor grotere botweefselmonsters moet demineralisatie worden uitgevoerd om secties van betere kwaliteit te verkrijgen; In dergelijke gevallen moet de hierboven beschreven methode worden gevolgd en moeten de parameters (timing, hoeveelheden oplossingen, enz.) dienovereenkomstig worden aangepast. De volgende richtlijnen zijn geschikt wanneer FFPE-botweefsel al is verwerkt (bijv. FFPE-blok verzameld bij weefselbanken of andere laboratoria) of wanneer de verzamelde secties zullen worden gebruikt om elk type analyse uit te voeren waarvoor RNA van goede kwaliteit, weefselsecties van hoge kwaliteit of beide vereist zijn.

1. Voorbereiding van de apparatuur
   1. Spuit alle werkoppervlakken en instrumenten in met ontsmettingsoplossingen om RNases te verwijderen.
   2. Bereid een waterbad voor met dubbel gedestilleerd water en stel de temperatuur in op 42 °C.
   3. Neem een microtoommes, spuit het in met 70% ethanol om olieresten te verwijderen en spuit het vervolgens in met ontsmettingsoplossingen om RNases te verwijderen.
   4. Zet het mes vast op de microtoom. Zorg ervoor dat de vrijloophoek is ingesteld op 10°.
      NOTITIE: Gebruik altijd nieuwe zaagbladen voor het doorsnijden.
   5. Zet twee emmers ijs klaar.
   6. Pak een pincet, borstels en sondes, spuit ze in met ontsmettingsoplossingen om RNases te verwijderen en plaats ze in een van de twee ijsemmers.
   7. Bereid een ijsbad voor door dubbel gedestilleerd water toe te voegen aan de andere ijsemmer.
      OPMERKING: het FFPE-blok mag niet drijven in het toegevoegde water; Daarom moet de hoeveelheid toegevoegd water aan de ijsemmer net genoeg zijn om het monster nat te laten zijn zonder te drijven.
2. Indeling
   1. Haal het FFPE-blok uit de opslag bij 4 °C en plaats het op de microtoom. Stel de opdracht in op Trimmen of op 14 μm roldikte en begin met het bijsnijden van het monster totdat het weefsel zichtbaar is.
      OPMERKING: Als het FFPE-blok al is bijgesneden en het weefsel al is blootgesteld, sla dan stap 2.2.1 over. Controleer of het blok geen gaten en scheuren heeft. Zo ja, ga dan direct door naar stap 2.2.2. Als dit niet het geval is, snijdt u een paar secties om het oppervlak af te vlakken en de gaten en scheuren te vermijden, en gaat u verder met stap 2.2.2.
   2. Plaats het FFPE-blok op het ijsbad om het monster te hydrateren. De tijd van hydratatie moet experimenteel worden bepaald.
      1. Begin met 2 minuten en verleng de tijd als hydratatie niet genoeg is. Niet langer dan 10 minuten duren. De hydratatie zal het weefsel uitbreiden en de vorming van "jaloezieën" en lijnen verminderen. Langere hydratatietijden kunnen scheuren in het paraffineblok veroorzaken en mogelijk weefselloslating.
      2. Als 10 minuten onvoldoende is om het monster te hydrateren, voer dan hydratatiecycli uit die niet langer zijn dan 10 minuten en probeer opnieuw te snijden.
      3. Als het oppervlak van het blok niet glad en schoon is als gevolg van scheuren of snijwonden, overweeg dan om het monster opnieuw in te bedden. De RNA-kwaliteit wordt niet beïnvloed door het herinbeddingsproces.
   3. Plaats het monster in de sampleklem van de microtoom, lijn het uit met het mes en begin met snijden. Stel de scrolldikte in op 5 μm.
   4. Verzamel het gedeelte en plaats het in het waterbad bij 42 °C met een koud pincet en borstels.
      OPMERKING: Als RNA-isolatie van weefselsecties zal worden uitgevoerd, verzamelt u de secties in een centrifugebuis en volgt u de fabricagespecificaties voor RNA-bereiding (zie Materiaaltabel).
   5. Incubeer de sectie in het waterbad om het weefsel uit te rekken en eventuele resterende rimpels en plooien te verwijderen.
      OPMERKING: De tijd van het drijven in het waterbad voor elke sectie moet experimenteel worden bepaald. Overweeg om de botsecties een extra minuut te laten staan als er problemen met weefselloslating optreden. Laat het gedeelte niet te lang drijven, omdat lange zweeftijden het weefsel kunnen beschadigen.
   6. Leg het gedeelte op een objectglaasje en laat het vervolgens 3 uur bij 42 °C incuberen.
   7. Plaats het glasplaatje een nacht in een exsiccator of een oven bij RT voor een goede droging.
   8. Bewaar het glasplaatje met het bijgevoegde gedeelte bij RT in een glaasjesdoosje.
      OPMERKING: Dia's kunnen vele jaren worden bewaard bij RT. Als er ruimtelijke transcriptomiek wordt uitgevoerd, in plaats van een objectglaasje, plaats dan het gedeelte op het door de fabrikant geleverde objectglaasje voor ruimtelijke genexpressie en volg de gerapporteerde aanbevelingen (zie de materiaaltabel).

Results

De hier gepresenteerde methode beschrijft hoe vers geïsoleerde botten moeten worden verwerkt om gedemineraliseerde FFPE-monsters te verkrijgen die gemakkelijk kunnen worden doorgesneden met een microtoom met behoud van de RNA-integriteit (Figuur 1). De methode is met succes toegepast op het dijbeen van muizen, maar kan worden gevolgd voor andere botweefselmonsters van vergelijkbare afmetingen, of kan worden aangepast voor grotere botmonsters (bijv. menselijke monsters) door alle parameters (timing, volumes van oplossingen, enz.) te verhogen.

Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Schematisch diagram van de methode om FFPE-blokken ontkalkt botweefsel te verkrijgen met behoud van RNA-integriteit (punten 1 en 2). Schematisch diagram van de richtsnoeren voor de doorsnede van FFPE-blokken (punt 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de juiste timing van ontkalking te valideren, werd een tijdsverloop uitgevoerd waarin niet-ontkalkte dijbenen, dijbenen die gedurende 3 uur werden ontkalkt (waarvoor EDTA in totaal 6 keer om de 30 minuten werd vervangen) en dijbenen die gedurende 24 uur werden ontkalkt (waarvoor EDTA in totaal 10 keer om de 30 minuten werd vervangen en vervolgens een nacht in EDTA werd gelaten) werden vergeleken (Figuur 2). De verkregen FFPE-blokken werden vervolgens gesegmenteerd volgens de bovenstaande richtlijnen en de histologische kwaliteit en RNA-integriteit van de verkregen secties werden geverifieerd. Om dit te doen, werden de structurele integriteit en de morfologie van weefselsecties geëvalueerd door middel van hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring, gevolgd door microscopische inspectie (Figuur 2A,C,E), terwijl de RNA-kwaliteit werd beoordeeld door de RNA-fragmentdistributiewaarde te evalueren met een grootte hoger dan 200 nucleotiden (200 nt) (bekend als DV200-score)⁴ (Figuur 2B, D,F). H&E-beelden toonden aan dat niet-ontkalkte en 3 uur ontkalkte dijbeensecties verschillende breuken, gaten en beschadigingen vertoonden (Figuur 2A,C,), terwijl secties van dijbenen die gedurende 24 uur waren ontkalkt een goede histologische kwaliteit vertoonden (Figuur 2E). Alle monsters presenteerden DV200-scores hoger dan 50%, wat wordt beschouwd als de minimumwaarde om scRNA-seq- of ruimtelijke transcriptomische analyses uit te voeren⁴. Langere incubatietijden met dagelijkse veranderingen van EDTA, bij 4 °C, met mildere agitatie in kleinere containers, werden ook getest en worden niet aanbevolen omdat onder deze omstandigheden de RNA-integriteit van de monsters dramatisch afneemt (figuur 2H). Daarom werd de incubatietijd verkort tot 24 uur, terwijl de frequentie, agitatie en volumes van ontkalking werden verhoogd om de ontkalking te stimuleren.

Figuur 2. Secties en kwaliteitscontrole van de RNA-integriteit (QC) van 8 weken oude dijbenen van muizen na ontkalking. Dijbeen van muizen van 8 weken werd vers ontleed, gefixeerd en ontkalkt met 20% EDTA pH 8.0. op verschillende tijdstippen, ingebed in paraffine met behulp van de beschreven methode, en onderverdeeld volgens de gerapporteerde richtlijnen. Histologische QC van verkregen secties werd vervolgens uitgevoerd door middel van H&E-kleuring, terwijl de RNA-integriteit werd beoordeeld door de RNA-fragmentdistributiewaarde te evalueren met een grootte groter dan 200 nucleotiden (200 nt) (DV200). (A) H&E-kleuring met 8 weken oude dijbeensecties van muizen zonder ontkalking. De rechterafbeelding toont een hogere vergroting van het omkaderde gebied. (B) RNA QC van 8 weken oude dijbeensecties van muizen na geen ontkalking. (C) H&E-kleuring met 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 3 uur ontkalking. De rechterafbeelding toont een hogere vergroting van het omkaderde gebied. (D) RNA QC van 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 3 uur ontkalking. (E) H&E-kleuring met 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 24 uur ontkalking. De rechterafbeelding toont een hogere vergroting van het omkaderde gebied. (F) RNA QC van 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 24 uur ontkalking. (G) H&E-kleuring met 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 72 uur ontkalking. De rechterafbeelding toont een hogere vergroting van het omkaderde gebied. (H) RNA QC van 8 weken oude dijbeensecties van muizen na 72 uur ontkalking. Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; DV200 (%) = % van de waarde van de fragmentverdeling > 200 nt; nt = nucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de werkzaamheid te testen van de gerapporteerde richtlijnen voor het behandelen van niet-gedemineraliseerde FFPE-monsters, werden FFPE-blokken van niet-gedemineraliseerd humaan primair osteosarcoom en longosteosarcoommetastasen verkregen uit ons Musculoskeletal Oncology Tumor Registry and tissue Bank (MOTOR) verzameld en werd ruimtelijke transcriptomische analyse uitgevoerd (Figuur 3). Voordat werd overgegaan tot ruimtelijke transcriptomische analyse, werden FFPE-blokken opnieuw ingebed in paraffine om een glad startoppervlak te verkrijgen. Vervolgens werden het RNA en de histologische kwaliteit van de secties geëvalueerd (gegevens niet getoond). Hydratatiestappen waren doorslaggevend, aangezien primaire osteosarcoommonsters niet konden worden doorgesneden zonder de juiste hydratatie. Daarentegen hadden longmetastasen geen hydratatiestappen nodig. Na het doorsnijden werden de weefsels op een ruimtelijke transcriptomische objectglaasje geplaatst (Figuur 3A), gekleurd met H&E (Figuur 3D) en werd de ruimtelijke transcriptomische analyse uitgevoerd volgens de specificaties van de fabrikant (zie Materiaaltabel). De verkregen cDNA-bibliotheken werden gesequenced en de verwerkte gegevens werden gevisualiseerd met Space Ranger voor kwaliteitscontrole⁵ (Figuur 3B). De output van Space Ranger vertoonde zeer hoge scores (bijna 100%) voor geldige barcodes, geldige unieke moleculaire identificaties (UMI's), Q30-basen en mediaan van gedetecteerde genen per plek (tussen 1700 en 5000), wat de robuustheid en soliditeit van de verkregen gegevens aantoont (Figuur 3B). Door middel van onbevooroordeelde, op grafieken gebaseerde clusteranalyse werden 12 grote clusters geïdentificeerd, waaronder clusters van osteogene, immuun-, epitheel- en endotheelcellen, evenals adipocyten (Figuur 3E). Merk op dat de grenzen van de clusters overlapten met de randen van de histologische regio's die door de patholoog waren geïdentificeerd (Figuur 3D). Extra delen van dezelfde monsters werden ook gekleurd met Goldner's Trichrome om gemineraliseerde gebieden te visualiseren (Figuur 3C).

Figuur 3. Ruimtelijke transcriptomische analyse van twee paren niet-ontkalkt primair osteosarcoom (OS) en longmetastasen. FFPE-blokken van twee overeenkomende paren van niet-gedemineraliseerd humaan primair osteosarcoom en longmetastase werden verzameld uit onze MOTOR-weefselbank. Monsters werden doorgesneden met behulp van de gerapporteerde richtlijnen en werden op een Visium Spatial Gene Expression-objectglaasje voor FFPE-monsters geplaatst om ruimtelijke transcriptomische analyse uit te voeren. (A) Visium Spatial Gene Expression objectglaasje voor FFPE-monsters met de bijgevoegde secties. (B) Space Ranger-output met gemeenschappelijke parameters die zijn gebruikt om de kwaliteit van de verkregen gegevens voor alle monsters te beoordelen. (C) Goldner's Trichrome kleuring die lokalisatie van gemineraliseerd botweefsel en osteoïde vertoont. (D) H&E-kleuring met de annotatie van de patholoog. (E) Clusteranalyse die de lokalisatie van de weefselverblijvende celpopulaties aantoont. Afkortingen: FFPE = formaline-gefixeerd en paraffine-embedded; MOC's = kwaadaardige osteogene cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Hier wordt een gedetailleerde methode geboden om FFPE-blokken van ontkalkte botten voor te bereiden en de RNA-integriteit te behouden voor sequencing (d.w.z. next-generation sequencing (NGS)) of voor andere RNA-gerelateerde technieken (d.w.z. in situ hybridisatie, kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR), enz.).

De methode maakt gebruik van EDTA om botweefselmonsters te ontkalken; de EDTA-incubatie zorgt voor een langzame maar fijne demineralisatie van de monsters, waardoor de histologische kenmerken van het weefsel op hun best behouden blijven. Gewoonlijk wordt botontkalking uitgevoerd met 10% EDTA pH 7.0 gedurende ten minste 2 weken door de oplossing om de dag te verversen⁴. Lange tijden van ontkalking dragen echter aanzienlijk bij aan de afbraak van RNA ^6,7,8. Om dit probleem op te lossen, werd de EDTA-concentratie verhoogd tot 20%, werd de pH verhoogd tot 8,0 en werd de frequentie van het vervangen van de oplossing verhoogd tot elke 30 minuten. Deze omstandigheden, in combinatie met de grote hoeveelheid oplossing waaraan het weefsel wordt blootgesteld, de krachtige agitatie en de hoge verhouding tussen container en weefselvolume, maximaliseerden de ontkalking en verkortten de behandelingstijden, waardoor een zachte maar snelle demineralisatie mogelijk was. Merk op dat het belangrijk is om te vermelden dat wanneer botweefselmonsters moeten worden gebruikt voor transcriptoomsequencing, het misschien niet nodig is om ze volledig te ontkalken. In dit geval moet de optimale verhouding tussen voldoende demineralisatie en goede RNA-conservering worden gevonden. Een ander belangrijk ding om te vermelden is dat het niet uitmaakt hoe monsters worden behandeld als ze zijn gefixeerd, hun RNA zal worden gefragmenteerd. De hier gerapporteerde methode maakt het mogelijk om de RNA-fragmenten met een grootte groter dan 200 nucleotiden (%DV200) te behouden (Figuur 2F), wat wijst op een hoge RNA-kwaliteit ^9,11.

Deze methode heeft bepaalde beperkingen. Ten eerste, aangezien muizen de enige bron van botweefselmonsters waren, is de methode alleen gevalideerd op muizenbotten, die relatief klein zijn. Bovendien is het niet bekend of deze methode kan worden gebruikt voor muizen ouder of jonger dan 8 weken, aangezien deze alleen is getest op muizen van 8 weken oud. We kozen voor muizen van 8 weken oud omdat ze skeletachtig volwassen zijn. Aangezien veroudering het mineraalgehalte van botten wijzigt, moeten mogelijk wijzigingen in deze aanpak worden doorgevoerd.

Bovendien worden richtlijnen gerapporteerd om de kwaliteit van de weefselsecties te helpen verbeteren wanneer FFPE-monsters van kleine niet-ontkalkte botmonsters worden gebruikt, zoals bijvoorbeeld wanneer ze rechtstreeks bij weefselbanken worden verzameld. In deze situaties kan er niets worden gedaan als RNA wordt afgebroken, maar de kwaliteit van de sectie kan worden verbeterd. Aan de andere kant is voor monsters met een goed RNA-gehalte, zoals die hier getoond, ruimtelijke transcriptomische analyse mogelijk als de verstrekte richtlijnen worden gevolgd. Merk op dat in primaire osteosarcoommonsters de botstructuur kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van de tumormassa, waardoor de eigenlijke monsters zwakker en broos worden, wat de doorsnede kan vergemakkelijken. Daarom werd Goldner's Trichrome-kleuring gebruikt om te beoordelen of dit het geval was, aangezien gemineraliseerde en niet-gemineraliseerde gebieden kunnen worden geïdentificeerd met deze kleuringstechniek (Figuur 3C).

Concluderend vertegenwoordigt de gerapporteerde methode een gemakkelijk toepasbare methode om botweefselmonsters te ontkalken en FFPE-secties te verkrijgen die effectief kunnen worden gebruikt voor NGS of andere technieken die RNA-integriteit vereisen. Daarnaast zijn er richtlijnen voor het verdelen van monsters die mogelijk niet zijn gedemineraliseerd voordat paraffine werd ingebed, zoals monsters verkregen van weefselbanken. Gezien de snelle ontwikkeling van ruimtelijke transcriptomics-analyses, kunnen de voorgestelde methode en richtlijnen zeer nuttig zijn in botonderzoek in het algemeen en ook in onderzoek naar botkanker.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Gebruik om weefsels onder agitatie te houden tijdens incubatie zoals vermeld in de methode-instructies.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Gebruik voor het hanteren van FFPE-secties zoals vermeld in de richtlijnen.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Gebruik voor het uitvoeren van ruimtelijke transcriptomie.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Gebruik voor het uitvoeren van weefseldrogering zoals vermeld in de methode-instructies.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Gebruik voor het bereiden van EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Gebruik voor het hanteren van FFPE-secties zoals vermeld in de richtlijnen.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Gebruik voor het hanteren van FFPE-secties zoals vermeld in de richtlijnen.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Gebruik voor het bevestigen van gesneden scrolls zoals vermeld in de richtlijnen.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Gebruik voor het sneden van FFPE-blokken zoals vermeld in de richtlijnen.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Verdun tot de uiteindelijke concentratie van 4% met 1x PBS  om weefselfixatie uit te voeren.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Klaar voor gebruik. Gebruik om PFA te verdunnen en om wasbeurten uit te voeren zoals vermeld in de methode-instructies.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Gebruik om rimpels uit FFPE-secties te verwijderen zoals vermeld in de richtlijnen.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Gebruik om alle oppervlakken schoon te maken zoals vermeld in de methode-instructies.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Gebruik om RNA te isoleren uit FFPE-secties zodra deze zijn gegenereerd zoals vermeld in de richtlijnen.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Gebruik voor het sneden van FFPE-blokken zoals vermeld in de richtlijnen.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Bereid 10 N oplossing door 400 g langzaam op te lossen in 1 liter Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Gebruik om sequencing data output te verwerken .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Gebruik om weefselinflitratie en inbedding uit te voeren zoals vermeld in de methode-instructies.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Gebruik om ruimtelijke transcriptomische experimenten uit te voeren.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Gebruik om ruimtelijke transcriptomische experimenten uit te voeren.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Gebruik om de secties te plaatsen als ruimtelijke transcriptomische experimenten worden uitgevoerd.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Gebruik om weefselclearing uit te voeren zoals vermeld in de methode-instructies.