Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Samenvatting

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Samenvatting

Mycobacterium abscessus (Mab)-infecties zijn moeilijk te behandelen vanwege een hoge intrinsieke resistentie tegen geneesmiddelen, vergelijkbaar met multiresistente tuberculose. Behandelingen zijn uiterst ineffectief en gebaseerd op een regime met meerdere geneesmiddelen, wat resulteert in een lage therapietrouw van de patiënt. Daarom wordt de wetenschappelijke gemeenschap aangespoord om nieuwe en effectieve geneesmiddelen te identificeren om deze infecties te behandelen. Een van de strategieën die hiervoor worden gebruikt, is het herbestemmen van geneesmiddelen - het proces van het identificeren van nieuwe therapeutische mogelijkheden voor bestaande geneesmiddelen op de markt, waarbij de tijd wordt omzeild die nodig is om farmacokinetische en veiligheidsprofielen van nieuwe geneesmiddelen op te stellen. Omdat de meeste onderzoeken naar de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen Mab gebaseerd zijn op traditionele en tijdrovende methoden, werd een test voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën ontwikkeld met behulp van een in eigen huis ontwikkelde double-reporter-stam van Mab. Met behulp van robotica voor vloeistofbehandeling, geautomatiseerde microscopie en analyse, naast in eigen huis ontwikkelde dubbele reporterstammen, kan de levensvatbaarheid van bacteriën snel worden gemeten met behulp van twee verschillende uitlezingen, luminescentie en fluorescentie, zonder reagentia toe te voegen of extra stappen uit te voeren. Dit vermindert de tijd en de variabiliteit tussen tests, een groot voordeel voor screenings met een hoge doorvoer. Het beschreven protocol werd gevalideerd door een bibliotheek van 1280 verbindingen te screenen. De verkregen resultaten werden bevestigd door de literatuur, met efficiënte detectie van actieve verbindingen. Dit werk vervulde dus het doel om het veld te voorzien van een nieuw hulpmiddel om deze uiterst resistente bacterie te helpen bestrijden.

Inleiding

Mycobacterium abscessus (Mab) is een opportunistische ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor longinfecties, vooral bij mensen met cystische fibrose en andere longaandoeningen. Infecties veroorzaakt door Mab zijn berucht moeilijk te behandelen vanwege uitstekende intrinsieke resistentie tegen geneesmiddelen, vergelijkbaar met multiresistente tuberculose¹. De beschikbare geneesmiddelen zijn grotendeels ineffectief vanwege de zeer ondoorlaatbare mycobacteriële celenvelop en een genoom dat codeert voor verschillende enzymen die antibiotica deactiveren^. De behandeling omvat dus de combinatie van verschillende geneesmiddelen die maanden tot jaren in beslag neemt. Dit uitdagende multi-drug regime in combinatie met een lage therapietrouw van de patiënt resulteert in een gemiddeld genezingspercentage van 30% tot 50%³. Bovendien is de prevalentie van longinfecties veroorzaakt door niet-tuberculeuze mycobacteriën de afgelopen decennia toegenomen, inclusief die veroorzaakt door Mab ^1,4. Bijgevolg racet de wetenschappelijke gemeenschap om nieuwe verbindingen te ontwikkelen om Mab-infecties te behandelen.

Een van de strategieën die met dit doel worden gevolgd, is herbestemming van geneesmiddelen - het proces van het identificeren van nieuwe therapeutische mogelijkheden voor bestaande geneesmiddelen. Dit omzeilt de grootste uitdaging die gepaard gaat met de ontdekkings- en ontwikkelingspijplijn van een nieuw medicijn - tijd⁵. Dit eenvoudige concept maakt gebruik van de reeds vastgestelde farmacokinetische en veiligheidsprofielen van verschillende geneesmiddelen om de ontwikkelingskosten te verlagen en de tijdschaal te verkorten die nodig is om een geneesmiddel van de bank naar het bed te krijgen⁶. Zo zijn er bibliotheken samengesteld die honderden tot duizenden van dergelijke verbindingen combineren, waardoor onderzoekers snel de mogelijkheid kunnen testen om medicijnen te herbestemmen tegen hun ziekteverwekker van belang.

De meeste onderzoeken naar de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen Mab zijn gebaseerd op een gouden standaard, maar traditionele test die de in vitro activiteit van een verbinding tegen mycobacteriën evalueert - kolonievormende^{eenheden die 7} tellen. Ondanks de nauwkeurigheid is deze procedure uiterst tijdrovend en wordt het al snel onhaalbaar wanneer iemand bibliotheken met duizenden verbindingen wil testen. Daartoe zijn high-throughput screenings (HTS) geïntegreerd in de ontwikkeling van geneesmiddelen - robuuste assays die gebruik maken van robotica en vloeistofbehandelingsapparatuur, waardoor duizenden verbindingen snel parallel kunnen worden gescreend⁸. Dit wordt meestal gedaan door in eerste instantie een enkele concentratie te testen, met behulp van microtiterplaten van 96-, 384-, 1536- of 3456-putformaten, die als startpunt dienen om treffers te identificeren en deze verder te optimaliseren in de pijplijn om klinisch te worden gebruikt.

Op reporters gebaseerde assays bieden een aanzienlijk voordeel voor de robuustheid van HTS vanwege hun eenvoud en gevoeligheid in vergelijking met andere op kleurstof en absorptie gebaseerde assays ^7,9. Voor zover wij weten, hebben echter slechts enkele onderzoeken een high-throughput screening tegen Mab⁹ geoptimaliseerd.

Onlangs heeft ons laboratorium dubbele reporterstammen ontwikkeld die in staat zijn om gelijktijdig luminescentie en fluorescentie¹⁰ uit te zenden. Mab operon_mScarlet is een van die soorten. Het is auto-luminescent door de expressie van het LuxABCDE-operon , dat een bacterieel luciferase (door expressie van de luxAB-genen ) en een aldehydesubstraat met lange ketens (door expressie van de luxCDE-genen ) omvat. Aan de andere kant wordt de fluorescerende uitlezing verkregen door de expressie van een recent ontwikkeld rood fluorescerend eiwit, mScarlet, dat beter presteert dan de meer typisch gebruikte eGFP- en mCherry-eiwitten, waardoor een krachtiger signaal wordt afgegeven¹¹. Met behulp van deze stam kunnen we de bacteriële levensvatbaarheid in vloeibare cultuur beoordelen door het luminescerende signaal in een microplaatlezer te meten zonder reagentia toe te voegen of extra stappen uit te voeren. Wat de detectie betreft, maakt intrinsieke fluorescentie microscoopvisualisatie in levende of vaste cellen mogelijk zonder kleurstoffen of antilichamen te gebruiken. Het hebben van één enkele stam met beide uitlezingen biedt onderzoekers een aanzienlijk voordeel bij het gebruik ervan in HTS-assays - de verminderde variabiliteit tussen assays met verschillende uitlezingen, omdat het niet nodig is om stammen uit te wisselen op basis van de aard van de test.

Daarom ontwikkelde dit werk een high-throughput assay tegen Mab met behulp van een in eigen huis ontworpen dubbele reporterstam (Figuur 1). Dit maakte een snelle beoordeling mogelijk van de in vitro activiteit 1280 geneesmiddelen die bedoeld waren voor herbestemming met behulp van een commerciële bibliotheek (zie Materiaaltabel). Ten eerste werden de activiteiten beoordeeld in een bouilloncultuurtest met behulp van luminescentie, en ten tweede door Mab-geïnfecteerde macrofagen te gebruiken die gebruik maakten van het fluorescerende signaal, waardoor het infectieproces dat in vivo werd waargenomen beter werd nagebootst ¹².

Figuur 1: Grafische samenvatting van het vastgestelde protocol. De belangrijkste speler in deze screening is een in eigen huis ontwikkelde mycobacteriële stam met dubbele reporter, die in alle experimenten wordt gebruikt. Ten eerste wordt met behulp van een reagensdispenser en planktonische bacteriën een eerste screening uitgevoerd door de verbindingen in één concentratie te testen. De geïdentificeerde treffers gaan door naar de validatietest, waar drie verschillende concentraties worden getest. Beide experimenten worden gedaan met behulp van de lichtgevende uitlezing. De gevalideerde treffers gaan door naar de infectietest, waar ook drie verschillende concentraties worden getest, en van beenmerg afgeleide macrofagen worden geïnfecteerd bij MOI 1. Een beeldvormingssysteem met een hoge inhoud verwerft het bacteriële fluorescerende signaal en analysesoftware wordt gebruikt om de intracellulaire belasting te beoordelen via de Mycoload-formule. Het aantal verbindingen neemt af naarmate de complexiteit van de test toeneemt. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale dierethische commissie van i3S en gelicentieerd door de Portugese Autoriteit-generaal Directoraat voor Voedsel en Dierenarts (DGAV), in navolging van de Richtlijn van de Europese Raad (2010/63/EU) en de Portugese wet (DL 113/2013) voor dierenwelzijn bij experimenten.

1. Beoordeling van de Z'-factor

OPMERKING: Om de prestaties van een HTS-test te beoordelen, kunnen verschillende parameters worden bepaald. De meest gebruikte parameter is de Z-priemfactor (Z'-factor). Deze metriek meet de statistische effectgrootte van een bepaald experiment en geeft aan hoe goed gescheiden positieve en negatieve controles zijn. Als een Z'-factor tussen 0,5 en 1 ligt, is de scheiding tussen beide populaties uitstekend en kunnen deze voorwaarden worden gebruikt in de HTS-test. Als Z' < 0,5, is de scheiding slechts marginaal en wordt het niet aanbevolen om de screening¹³ uit te voeren. Als zodanig werd een experiment opgezet met een halve plaat met niet-behandelde bacteriën en de andere helft met een positieve controle om de Z'-factor te berekenen (aanvullende figuur 1).

1. Bereid 2-3 dagen voor de test voorculturen van Mab voor door bacteriën te inoculeren in een vloeibaar groeimedium (ongeveer 1 x 10⁷ kve/ml) in een erlenmeyer. Laat de bacteriën groeien bij 37 °C in een incubator met agitatie (90 rpm).
   LET OP: Een bioveiligheidskast is vereist bij het werken met Mab-culturen.
2. Volg de groei van de Mab-voorcultuur door optische dichtheidsmeting bij 600 nm met behulp van een spectrofotometer. Wanneer de cultuur de exponentiële groeifase bereikt, ga je verder met stap 1.3.
3. Bereid met behulp van de exponentiële voorcultuur een bacteriële suspensie van ongeveer 5 x^{10 5} kve's/ml (gecorreleerd met optische dichtheidswaarden)¹⁴ in vloeibaar groeimedium.
4. Bereid een oplossing voor positieve controle van bacteriële groeiremming in een vloeibaar groeimedium. Voor deze test was de positieve controle claritromycine (10 mg/ml in DMSO) bij 4 μg/ml. Claritromycine moet 2x de gewenste eindconcentratie worden bereid.
5. Gebruik een reagensdispenser met microtiellaat die is uitgerust met een kleine cassette en doseer 15 μl vloeibaar groeimedium op de lege en onbehandelde kolommen van een zwarte polypropyleen plaat met 384 putjes. Doseer voor de lege kolommen een extra 15 μl vloeibaar groeimedium.
   OPMERKING: De lege kolommen voorkomen verdamping van de binnenste putten bij 37 °C.
6. Met de dispenser voor reagens met microtiterplaten die is uitgerust met een kleine cassette, doseert u 15 μl van de in stap 1.4 bereide positieve controlevloeistof op de kolommen voor positieve controle.
7. Met een dispenser voor reagens met microtiterplaten die is uitgerust met een grote cassette, doseert u 15 μl van de in stap 1.3 bereide bacteriële suspensie in alle kolommen behalve de blanco's, waarbij u alles 1:2 verdunt. Het uiteindelijke volume van alle 384 putjes is 30 μL.
   OPMERKING: De reagensdispenser voor microtiterplaten kan worden uitgerust met een grote of kleine cassette, afhankelijk van de slanggrootte (respectievelijk 0,5 en 0,22 mm). Het verdient de voorkeur om een grotere cassette te gebruiken om bacteriële ophoping in het slangsysteem te voorkomen, ook al leidt dit tot meer vloeistofverspilling. Desalniettemin kan dezelfde cassette gedurende de hele test worden gebruikt.
8. Verzegel elke plaat met een plaatafdichter die een continue gasuitwisseling mogelijk maakt. Incubeer bij 37 °C in een incubator zonder te roeren in een vochtige kamer gedurende 48 uur.
9. Lees na 48 uur de luminescentie af die door de bacteriën in elke plaat wordt uitgezonden met behulp van een plaatlezer met een integratietijd van 1 s.
10. Om de Z'-factor te bepalen, gebruikt u de waarden die in stap 1.9 zijn verkregen en berekent u het gemiddelde en de standaarddeviatie van de positieve (AVG_P en SD_P) en negatieve (AVG_N en SD_N) controles. Pas daarna de volgende formule toe:
    OPMERKING: 3 x SD is een veelgebruikte drempel; Het kan echter worden aangepast om beter bij de screening te passen - door de factor waarmee de standaarddeviatie moet worden vermenigvuldigd, te verhogen of te verlagen.

2. Bibliotheekscreening op hits

OPMERKING: De eerste screenings werden uitgevoerd tegen bacteriën die in vloeibare cultuur groeien. De opstelling is ontworpen voor platen met 384 putjes en een eindvolume van 30 μl. Elke plaat bevatte blanco putjes (alleen vloeibaar groeimedium), negatieve controles (niet-behandelde bacteriën) en oplosmiddelcontrole (bacteriën plus oplosmiddel van de verbinding - in dit geval DMSO; Aanvullende figuur 2). De verbindingen of het oplosmiddel werden aan de plaat toegevoegd in 2x de gewenste eindconcentratie, en bacteriën werden 1:1 toegevoegd (alles tot de helft verdunnen).

1. Bereid de bacteriële suspensie voor zoals beschreven in de stappen 1.1 tot en met 1.3.
   LET OP: Een bioveiligheidskast is vereist bij het werken met Mab-culturen.
2. Bereid een oplossing van oplosmiddel voor in een vloeibaar groeimedium. De hoeveelheid oplosmiddel moet 2x de gewenste eindconcentratie zijn.
3. Gebruik een reagensdispenser met microplaten die is uitgerust met een kleine cassette en doseer 15 μl vloeibaar groeimedium in elke kolom zwarte polypropyleen platen met 384 putjes, behalve de controlekolom voor oplosmiddelen. Doseer voor lege kolommen een extra 15 μL vloeibaar groeimedium.
4. Met de microplaatreagensdispenser die is uitgerust met een kleine cassette, doseert u 15 μl van de eerder bereide oplosmiddeloplossing op de oplosmiddelcontrolekolom.
5. Breng met behulp van een vloeistofverwerker 200 nL van de verbindingen over van de standaard 96-wells platen (1 mM in DMSO) naar de 384-wells platen, met uitzondering van de blanco's, oplosmiddelcontrole en onbehandelde kolommen. De verbindingen hebben nu een concentratie van 13,3 μM.
6. Met een dispenser voor reagens met microtiterplaten die is uitgerust met een grote cassette, doseert u 15 μL van de in stap 2.1 bereide bacteriële suspensie in alle kolommen behalve de blanco's, en verdunt u alles 1:2. Het uiteindelijke volume van alle 384 putjes is 30 μL en elke verbinding bevindt zich op 6.66 μM.
7. Verzegel elke plaat met een plaatafdichter die een continue gasuitwisseling mogelijk maakt.
   OPMERKING: De test kan worden gedaan met gewone deksels; Er is echter een grotere kans op sterkere randeffecten.
8. Incubeer bij 37 °C in een incubator zonder te roeren in een vochtige kamer gedurende 48 uur.
9. Lees na 48 uur de luminescentie af die door de bacteriën in elke plaat wordt uitgezonden met behulp van een plaatlezer met een integratietijd van 1 s.

3. Analyse van hitscreeningsgegevens

OPMERKING: Om treffers te identificeren met de verkregen luminescentiegegevens, moeten de waarden worden genormaliseerd naar het oplosmiddel waarin de verbindingen zijn opgelost en, als dit optreedt, naar het randeffect dat is geverifieerd op de 384-microtiterplaten.

1. Voor de oplosmiddelnormalisatie van de in stap 2.9 verkregen gegevens, deelt u de relatieve lichteenheden (RLU) van elke put door de gemiddelde RLU van de oplosmiddelcontroleputjes (in de overeenkomstige plaat). In deze test werd een sterk randeffect geverifieerd in de richting van het midden van de zeefplaten; Daarom werd besloten om alle gegevens ervoor te normaliseren. Om dit te bereiken, werd het proces in twee stappen uitgevoerd, zoals hieronder beschreven.
   1. Maak een randeffectmasker door de waarden die in stap 3.1 zijn verkregen voor de overeenkomstige posities, exclusief treffers, te verdelen over alle platen (plaat 1 - P1, plaat 2 - P2, plaat 3 - P3, plaat 4 - P4). Voor A1- en A2-posities geldt bijvoorbeeld Mask_A1 = Gemiddeld (P1_A1; P2_A1; P3_A1; P4_A1); Mask_A2 = Gemiddeld (P1_A2; P2_A2; P4_A2) [P3_A2 werd uitgesloten omdat het een schot in de roos was].
   2. Deel de waarden die in stap 3.1 zijn verkregen. door het in stap 3.1.1 verkregen randeffectmasker. Bijvoorbeeld, . Bereken vervolgens de AVG en SD van elke plaat om een drempel (AVG ± 3SD) voor elke plaat vast te stellen. Elke verbinding buiten deze drempel wordt als een treffer beschouwd en gaat door naar de treffervalidatietest.

4. Druk op validatietest

OPMERKING: Na het identificeren van treffers, moeten deze worden gevalideerd met behulp van verschillende concentraties. De validatietest maakt gebruik van een vergelijkbare opstelling met dezelfde controles, maar elke treffer wordt onderworpen aan 1:2 seriële verdunningen. Voor deze test werden drie concentraties gebruikt: 13,3 μM, 6,66 μM en 3,3 μM. Oplosmiddelcontroles bevatten hetzelfde oplosmiddelpercentage als elk samengesteld putje (aanvullende figuur 3).

1. Bereid de bacteriële suspensie voor zoals beschreven in de stappen 1.1 tot en met 1.3.
   LET OP: Een bioveiligheidskast is vereist bij het werken met Mab-culturen.
2. Gebruik een reagensdispenser met microtiterplaten die is uitgerust met een kleine cassette en doseer 15 μl vloeibaar groeimedium in elke kolom van een zwarte polypropyleen plaat met 384 putjes. Voor lege putjes doseert u een extra 15 μl vloeibaar groeimedium in de eerste en laatste kolom.
3. Doseer met de microplaatreagensdispenser een extra 15 μL vloeibaar groeimedium in de kolommen met het hoogste [μM] van elke verbinding.
4. Pipetteer handmatig 0,8 μl van elke treffer (1 mM in DMSO) in hun respectievelijke putjes uit stap 4.3, in tweevoud. De verbindingen hebben nu een concentratie van 26,6 μM.
5. Pipetteer handmatig 0,8 μl oplosmiddel in tweevoud in de controleputjes (zelfde als stap 4.4).
6. Voer met behulp van een meerkanaals micropipet twee seriële verdunningen van 1:2 uit voor elke verbinding en oplosmiddelcontrole. Gooi de overschrijding van 15 μl na de laatste seriële verdunning weg. Alle putten hebben nu 15 μL en de concentraties van de verbindingen zijn 26,6 μM, 13,3 μM en 6,66 μM.
7. Doseer met behulp van een dispenser voor reagens met een grote cassette 15 μl van de in 4.1 bereide bacteriële suspensie in alle kolommen (behalve lege putjes) en verdun de verbindingen 1:2. Alle putjes hebben een eindvolume van 30 μL en elke verbinding is 13.3 μM, 6.66 μM en 3.3 μM.
8. Sluit de plaat af met een plaatafdichter die een continue gasuitwisseling mogelijk maakt. Incubeer bij 37 °C in een incubator zonder te roeren in een vochtige kamer gedurende 48 uur.
9. Lees na 48 uur de luminescentie die door de bacteriën in elke plaat wordt uitgezonden met een integratietijd van 1 s af met behulp van een plaatlezer.

5. Infectie test

OPMERKING: Mab is een intracellulaire facultatieve ziekteverwekker, dus de antimicrobiële activiteit en gastheertoxiciteit van de hits moeten worden bepaald in infectietests. Daarvoor werden van beenmerg afgeleide macrofagen (BMM) geïnfecteerd met Mab en behandeld met de in stap 4 gevalideerde treffers in verschillende concentraties. Elke test omvatte blanco (alleen water), negatieve controles (niet-behandelde geïnfecteerde macrofagen), positieve controles (geïnfecteerde macrofagen behandeld met een effectief antibioticum), oplosmiddelcontroles (in dit geval DMSO) en de te testen verbindingen in drie concentraties - 13,3 μM, 6,66 μM en 3,3 μM (aanvullende figuur 4).

1. Leid macrofagen af uit het muizenbeenmerg van volwassen muizen van het wildtype (BALB/c of C57BL/6), zoals eerder beschreven¹⁵. Plaat de cellen op een 96-wells, zwarte, optisch heldere vlakke bodemplaat op 2 x 10⁵ cellen/ml, 200 μL per putje. Na 10 dagen differentiatie bij 37 °C, 7% CO₂¹⁵, zijn de cellen klaar om te infecteren en door te gaan met de behandeling.
   OPMERKING: Het protocol voor het verkrijgen van van beenmerg afgeleide macrofagen is goed ingeburgerd¹⁵; dit screeningsprotocol kan echter worden aangepast aan andere cellen, zoals RAW 264.7, THP-1 en PBMC-afgeleide macrofagen.
2. Bereid de bacteriële suspensie voor zoals beschreven in de stappen 1.1 tot en met 1.3, waarbij de bacteriële suspensie in het celkweekmedium wordt aangepast voor een infectie met een multipliciteit van infectie (MOI) van 1.
   LET OP: Een bioveiligheidskast is vereist bij het werken met Mab-culturen.
3. Zuig het gesupplementeerde celkweekmedium van de putjes voorzichtig op met behulp van een vacuümpomp die aan een glazen pipet is bevestigd. Deze stap moet langzaam en gemakkelijk worden uitgevoerd om celloslating te voorkomen.
4. Pipetteer handmatig 75 μl van de in stap 5.2 bereide bacteriële suspensie op elk putje. Incubeer de plaat bij 37 °C met 7% CO₂ gedurende 4 uur in een celincubator.
5. Bereid de verbindingen voor op celbehandeling. Gebruik een dispenser voor reagens met microplaten die is uitgerust met een kleine cassette, doseer 110 μl gesupplementeerd celcultuurmedium met een ronde bodem en 96 putjes en doseer in de kolommen waar de verbindingen of oplosmiddelcontrole zullen plaatsvinden (aanvullende figuur 4).
6. Gebruik een reagensdispenser met microplaten en doseer een extra 104 μl gesupplementeerd celkweekmedium in de kolommen waar de hoogste concentratie verbinding of oplosmiddel zich zal bevinden.
7. Pipetteer handmatig 5,9 μl van de verbindingen (1 mM in DMSO) of oplosmiddel in de daarvoor bestemde putjes (kolommen in stap 5.6). De verbindingen hebben nu een concentratie van 26,6 μM.
8. Voer met behulp van een meerkanaals micropipet twee seriële verdunningen 1:2 uit voor elke verbinding en elk oplosmiddel. Gooi de overschrijding van 110 μl na de laatste seriële verdunning weg. Alle putten hebben nu 110 μL en de verbindingen hebben een concentratie van 26,6 μM, 13,3 μM en 6,66 μM.
9. Doseer met behulp van een dispenser voor reagens met microplaten 110 μl gesupplementeerd celkweekmedium in alle kolommen (met uitzondering van lege putjes). Alle putten hebben nu 220 μL en de verbindingen hebben een concentratie van 13.3 μM, 6.66 μM en 3.3 μM.
10. Bereid een oplossing van claritromycine (positieve controle) in een dosis van 2 μg/ml in een aangevuld celkweekmedium.
11. Was 4 uur na stap 5.4 met behulp van een platenwasser 3x met 200 μL infectiewasoplossing de geïnfecteerde plaat met 96 putjes. Houd de aspiratie- en afgiftesnelheden zo laag mogelijk om celloslating te voorkomen.
12. Breng na de laatste aspiratie 200 μl van de in stap 5.5-5.9 bereide verbindingen over naar de plaat met 96 putjes die de geïnfecteerde macrofagen bevat.
13. Breng 200 μL gesupplementeerd celkweekmedium over naar de niet-behandelde putjes. Breng 200 μl van de in stap 5.10 bereide claritromycineoplossing over naar de respectieve putjes.
14. Incubeer de plaat in een celincubator bij 37 °C, met 7% CO₂ , gedurende 48 uur.
15. Was na 48 uur de geïnfecteerde plaat met 96 putjes met behulp van een platenwasser met de wasoplossing van het mengsel (3x met 200 μL per putje).
16. Doseer met behulp van een meerkanaals micropipet 200 μl van de fixatieoplossing op alle putjes en laat het 10 minuten inwerken.
17. Was de cellen na fixatie met behulp van een platenwasser met de wasoplossing van de verbindingen (3x met 200 μL per putje).
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De cellen kunnen enkele dagen of weken in de wasoplossing van de verbindingen bij 4 °C worden bewaard als contaminatie en uitdroging van de cellen worden voorkomen. De wasoplossing van de verbindingen moet vóór stap 5.18 worden aangezogen.
18. Doseer met behulp van een meerkanaals micropipet 200 μl van de permeabiliserende oplossing in alle putjes en laat het 15 minuten inwerken. Zuig met behulp van een platenwasser de permeabiliserende oplossing op.
19. Doseer met behulp van een meerkanaals micropipet handmatig 100 μl van de kleuroplossing en incubeer de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
20. Was de platen met behulp van een bordenwasser met de wasoplossing van de verbindingen (3x met 200 μL per putje). Laat de gekleurde cellen uiteindelijk in de wasoplossing van de verbindingen.
21. Zeef de platen in een beeldvormingssysteem met hoge inhoud met de volgende instellingen:
    Objectief: 20x Air/0.4NA (één putje van een 96-microtiterplaat, 57 gezichtsvelden (FOV)
    Modus: Confocaal
    Laser 405 nm voor DAPI (kernen)
    Laser 561 nm voor mScarlet (bacteriën)
    Laser 640 nm voor HCS-celmasker dieprood (cytoplasma)
    Geen z-stack
    OPMERKING: De cellen kunnen worden afgebeeld met een breedveldbeeldvormingssysteem, waardoor de definitie wordt verminderd.
22. Zet 's nachts een robot voor het hanteren van apparatuur op voor beeldacquisitie. Deze robotarm verwisselt de platen in het high-content beeldvormingssysteem zonder menselijke tussenkomst.
    LET OP: Dit is niet verplicht; Platen kunnen handmatig worden verwisseld.

6. Analyse van het beeld

OPMERKING: De beeldanalyse wordt uitgevoerd met de analysesoftware, die hetzelfde is als het beeldvormingssysteem met hoge inhoud dat wordt gebruikt om de beelden te verkrijgen. Er moet een analysepijplijn worden gemaakt met behulp van voorbeeldafbeeldingen (aanvullende afbeelding 5). Daarna wordt het toegepast op de hele put (57 FOV) en dataset (alle platen). De analysesoftware volgt een logische opeenvolging van stappen, te beginnen met de segmentatie van de verschillende interessegebieden (kernen, cytoplasma, cellen en bacteriën), het relateren ervan (bijv. bacteriën in cellen) en vervolgens het extraheren van morfologische en intensiteitseigenschappen (bijv. oppervlakte, intensiteit). De essentiële stappen van de beeldanalyse worden hieronder beschreven. Het volledige gebruikte protocol is te vinden in aanvullende figuur 5.

1. Segmenteer de kernen met behulp van het DAPI-signaal, het cytoplasma met behulp van het DeepRed-signaal en de bacteriën met behulp van het mScarlet-signaal.
2. Relateer de segmentatie van de kernen en het cytoplasma om een masker voor cellen te creëren.
3. Verwijder alle randobjecten. Alleen cellen die op het gezichtsveld als vol worden weergegeven, worden in aanmerking genomen (hele cellen).
4. Definieer de outputpopulatie Bacteriën in hele cellen door hele cellen en bacteriën met elkaar in verband te brengen.
5. Definieer geïnfecteerde hele cellen als cellen met meer dan één bacteriegebied en niet-geïnfecteerde hele cellen als cellen met minder dan één bacteriegebied.
6. Nadat alle interessegebieden zijn gesegmenteerd en de populaties zijn gemaakt, berekent en extraheert u hun eigenschappen. Voor elke put worden de volgende eigenschappen geëxtraheerd.
   1. Voor hele cellen / geïnfecteerde hele cellen / niet-geïnfecteerde hele cellen, extract
      Aantal cellen (som per putje)
      Oppervlakte [μm²] (gemiddelde + standaarddeviatie per put)
      Breedte-tot-lengte celverhouding (gemiddelde + standaarddeviatie per put)
   2. Voor bacteriën in hele cellen, extract
      Aantal geïdentificeerde bacteriële regio's (som per putje)
      Intensiteit (som per put van de gemiddelde intensiteit van elke regio)
      Oppervlakte van de regio (som per put)
7. Nadat u de gegevens hebt geëxporteerd en in een spreadsheet hebt samengesteld, kwantificeert u de intracellulaire belasting (Mycoload) volgens de volgende formule:
   

Resultaten

Beoordeling van de Z'-factor
Figuur 2 toont de gegevens van een van de twee experimenten die zijn uitgevoerd om de Z'-factor te berekenen. De positieve controle was claritromycine bij 4 μg/ml. Beide experimenten leverden Z'-factoren van 0,64 en 0,62 op, wat betekent dat de voorwaarden en uitlezing die voor deze test zijn gebruikt, kunnen worden toegepast op de screeningstest die volgde (Z' > 0,5). Desalniettemin werd de Z'-factor berekend voor alle resterende experimenten (infectietest) om de prestaties van elk experiment te controleren.

Als proof of concept van de ontworpen HTS-test werd een bibliotheek van verbindingen getest die bedoeld waren voor herbestemming van geneesmiddelen. Het bestaat uit 1280 diverse en kleine moleculen, waarvan 95% zowel door de FDA als door het EMA goedgekeurde geneesmiddelen zijn. Deze moleculen bieden een hoge chemische en farmacologische diversiteit.

Figuur 2: Resultaten van de beoordeling van de Z'-factor. Mab van 2,5 x 10⁵ kve's/ml werd geïncubeerd met en zonder claritromycine in een dosis van 4 μg/ml gedurende 48 uur bij 37 °C. Na de incubatieperiode werd de luminescentie gemeten om de mycobacteriële levensvatbaarheid te evalueren. De grafiek toont de individuele luminescentiewaarden van behandelde en niet-behandelde levensvatbare mycobacteriën in één onafhankelijk experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bibliotheekscreening op hits
Alle verbindingen werden getest op 6,66 μM tegen Mab. Vanwege de grootte van de bibliotheek werden de verbindingen verdeeld in vier verschillende microtiterplaten met 384 putjes (Figuur 3A-D). De resultaten werden genormaliseerd voor zowel oplosmiddel als het geverifieerde randeffect.

In deze screeningstest werden drieëndertig treffers geïdentificeerd, waarvan er dertig de luminescentie-emissie aanzienlijk verminderden, waardoor de mycobacteriële levensvatbaarheid afnam (Figuur 3). Interessant is dat drie verbindingen leidden tot een hogere luminescentie-emissie, mogelijk gerelateerd aan een verhoogd bacterieel metabolisme of proliferatie (Figuur 3). Alle 33 treffers werden meegenomen naar de validatietest, inclusief de drie verbindingen die de luminescentie verhoogden, om te testen of dit profiel zou worden behouden.

Figuur 3: Resultaten van bibliotheekscreening. (A-D) Mab bij 2,5 x 10⁵ kve's/ml werd geïncubeerd met 1280 verbindingen bij 6,66 μM gedurende 48 uur bij 37 °C. Na incubatie werd de luminescentie gemeten om de mycobacteriële levensvatbaarheid te evalueren. De grafieken tonen de RLU van één onafhankelijk experiment, gepresenteerd als willekeurige eenheden na normalisatie van het oplosmiddel en het randeffect. De AVG RLU en de bijbehorende SD werden voor elke plaat berekend om een drempel te bepalen (in grijs; AVG ± 3SD). Ronde symbolen vertegenwoordigen een geteste verbinding. In blauw wordt elke verbinding buiten die drempel als een treffer beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Treffervalidatietest
De concentraties die voor deze test werden gebruikt, waren 13,3 μM, 6,66 μM en 3,3 μM. Elke verbinding werd in tweevoud getest om de robuustheid te vergroten.

Belangrijk is dat verbindingen 30, 31 en 32, die eerder in verband werden gebracht met een hogere RLU (Figuur 3A,C), dit profiel behielden, met meer dan 200% van de mycobacteriële levensvatbaarheid die werd bereikt in putten die met verbinding 32 werden behandeld (Figuur 4).

Verbindingen 20 en 33 werden als inactief beschouwd, aangezien de mycobacteriële levensvatbaarheid in alle geteste concentraties bijna 100% bedraagt (figuur 4).

Verbindingen 9 en 21 vertoonden vergelijkbare inactiviteit bij de twee laagste concentraties; in tegenstelling tot 20 blijven ze echter actief op het hoogste, 13,3 μM, waarbij verbinding 21 een hogere potentie vertoont (figuur 4).

Verbinding 3 vertoont ook inactiviteit bij de laagste concentratie en een activiteitsverlies bij 6,66 μM, zij het minder dan verbinding 21 (figuur 4). Alleen in de laagste concentratie vertoonden de verbindingen 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 en 28 een lager therapeutisch potentieel. 2, 10 en 28 leiden echter nog steeds tot <50% van de mycobacteriële levensvatbaarheid.

Wereldwijd waren de overige veertien verbindingen actief in alle geteste concentraties.

Figuur 4: Resultaten van de hitvalidatietest. Mab bij 2,5 x 10⁵ kve's/ml werd geïncubeerd, waarbij elke eerder geïdentificeerde treffer op 13,3 μM, 6,66 μm en 3,3 μm (respectievelijk 1,3%, 0,7% en 0,3% van DMSO) gedurende 48 uur bij 37 °C werd geïncubeerd. Na de incubatieperiode werd de luminescentie gemeten om de mycobacteriële levensvatbaarheid te evalueren. De grafiek toont de percentages behandelde levensvatbare mycobacteriën ten opzichte van de niet-behandelde mycobacteriën van één onafhankelijk experiment, waarbij elke verbinding in tweevoud wordt getest. Ronde symbolen vertegenwoordigen de duplicaten voor elke verbinding. Balken geven het gemiddelde van die duplicaten weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Infectie test
Van de drieëndertig geteste verbindingen werden er achtentwintig geselecteerd voor de infectietest (figuur 4). Verbindingen 7, 8, 9, 20 en 33 werden niet geselecteerd voor deze test. Terwijl 9, 20 en 33 werden weggelaten vanwege hun inactiviteit bij validatie (Figuur 4), werden de eerste twee weggelaten vanwege technische redenen. Desalniettemin werden deze verbindingen geïdentificeerd als rifampicine en linezolid, antibiotica die al worden gebruikt om Mab-infecties te behandelen¹². Alle verbindingen die in de infectietest zijn getest, zijn geïdentificeerd en staan vermeld in tabel 1. De antimicrobiële activiteit van de verbindingen tegen Mab-geïnfecteerde macrofagen werd beoordeeld door de intrinsieke fluorescentie van de bacteriën als uitlezing te gebruiken.

Verbinding	Naam	Verbinding	Naam
1	Sulfathiazol	18	Cefuroxim
2	Ciprofloxacine	19	Rifaximin
3	Cefotaxime	21	Cefdinir
4	Daunorubicine	22	Claritromycine
5	Doxorubicine	23	Besifloxacine
6	Thiostrepton	24	Levofloxacine
10	Amikacine	25	Rifabutine
11	Moxalactam	26	Gatifloxacine
12	Sulfamethizol	27	Epirubicine
13	Sulfamonomethoxine	28	Pyrvinium pamoaat
14	Cefoxitine	29	Moxifloxacine
15	Novobiocine	30	Troleandomycine
16	Cefmetazol	31	Lincomycine
17	Roxitromycine	32	Spiramycine

Tabel 1: Lijst van de verbindingen die in de infectietest zijn getest. De verbindingen die in stap 4 werden gevalideerd, werden getest in de infectietest (stap 5).

De toxiciteit van de verbindingen voor Mab-geïnfecteerde macrofagen was de eerste parameter die werd beoordeeld. De drempel die werd vastgesteld om een verbinding als giftig of niet-toxisch te beschouwen, was 85% van de levensvatbare macrofagen (figuur 5). Van de achtentwintig geteste verbindingen werden 4, 5, 6, 27 en 28 als giftig beschouwd. (Figuur 5). Deze vijf verbindingen werden dus uitgesloten van de volgende beoordeling van de intramacrofagische activiteit.

Figuur 5: Toxiciteit van treffers voor Mab-geïnfecteerde macrofagen. BMM's van BALB/c-muizen werden geïnfecteerd met Mab (MOI=1) en geïncubeerd met elke eerder geïdentificeerde treffer op 13,3 μM, 6,66 μM en 3,3 μM (respectievelijk 1,3%, 0,7% en 0,3% van DMSO) gedurende 48 uur bij 37 °C met 7% CO₂. De cellen werden afgebeeld in een screeningfluorescentiemicroscoop met een hoog gehalte, waarbij het aantal kernen (gekleurd met DAPI) werd gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te meten. De grafiek toont de percentages levensvatbare behandelde geïnfecteerde macrofagen ten opzichte van de levensvatbare niet-behandelde geïnfecteerde macrofagen van twee onafhankelijke experimenten. Ronde symbolen geven de levensvatbaarheid van de cel voor elke test weer. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde van twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de intramacrofagische activiteit van de overige drieëntwintig verbindingen af te leiden tegen intracellulair Mab (figuur 6), werd de Mycoload-formule (eerder uitgelegd in stap 6) gebruikt om het percentage mycobacteriële levensvatbaarheid te verkrijgen dat genormaliseerd was voor niet-behandelde geïnfecteerde macrofagen. De meeste verbindingen verloren hun therapeutisch potentieel tegen geïnternaliseerde mycobacteriën (Figuur 6) in vergelijking met de treffervalidatietest (Figuur 4), aangezien het aantal treffers daalde van vijfentwintig naar zes bij de hoogste geteste concentratie. Opvallend is dat alle drie de verbindingen die de levensvatbaarheid van planktonische Mab verhoogden in vergelijking met niet-behandelde bacteriën (30, 31 en 32; Figuur 3 en Figuur 4) toonden antimycobacteriële activiteit tegen intracellulair Mab, waarbij verbindingen 30 en 32 een significant statistisch verschil vertoonden in vergelijking met DMSO, zelfs bij 3,3 μM in het geval van verbinding 32 (Figuur 6). Mycobacteriën behandeld met verbindingen 11 en 23 vertoonden een levensvatbaarheid <50% bij 13,3 μM; dit verschilde echter niet significant van de DMSO-controle (figuur 6). Verbindingen 21, 26 en 29 waren krachtig genoeg met 13,3 μM om een significant statistisch verschil te rechtvaardigen, waarbij 29 het meest actief was (figuur 6). Ten slotte waren verbindingen 17, 22 en 25 extreem krachtig in alle geteste concentraties tegen geïnternaliseerde mycobacteriën. Deze werden geïdentificeerd als respectievelijk roxitromycine, claritromycine en rifabutine (tabel 1). Van de drie verbindingen was claritromycine het meest actief tegen Mab, waarbij de mycobacteriële levensvatbaarheid nooit meer dan 10% bedroeg, met een p-waarde <0,0001 in alle geteste concentraties in vergelijking met DMSO (Figuur 6).

Figuur 6: Intramacrofagische activiteit van hits tegen Mab-geïnfecteerde macrofagen. BMM's van BALB/c-muizen werden geïnfecteerd met Mab (MOI=1) en geïncubeerd met elke eerder geïdentificeerde treffer op 13,3, 6,66 en 3,3 μM (respectievelijk 1,3, 0,7 en 0,3% van DMSO) gedurende 48 uur bij 37 °C met 7% CO₂. De cellen werden afgebeeld in een screeningsfluorescentiemicroscoop met een hoge inhoud en het fluorescerende signaal werd gebruikt om de Mycoload te berekenen (zie stap 6). De grafiek toont de percentages Mycoload gevonden in behandelde geïnfecteerde macrofagen ten opzichte van niet-behandelde geïnfecteerde macrofagen in twee onafhankelijke experimenten. Statistieken werden uitgevoerd met behulp van tweerichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnet; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 vergeleken met DMSO (solventcontrole). Sterretjes volgen voor elke concentratie dezelfde kleurcode als de legenda van de grafiek. Ronde symbolen vertegenwoordigen de Mycoload voor elke test. Balken vertegenwoordigen het gemiddelde van twee onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Voorbeeld van een plaatlay-out met 384 putjes die wordt gebruikt in de beoordeling van de Z'-factor. Wit - lege putjes (alleen vloeibaar groeimedium); geel - positieve controle (bacteriën behandeld met een antibioticum); Rood - negatieve controle (niet-behandelde bacteriën). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Voorbeeld van een plaatlay-out met 384 putjes die wordt gebruikt bij de screening van de bibliotheek. Wit - lege putjes (alleen vloeibaar groeimedium); groen - controle van oplosmiddelen; rood - negatieve controle (niet-behandelde bacteriën); blauw - verbindingen die moeten worden gescreend. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 3: Voorbeeld van een plaatlay-out met 384 putjes die wordt gebruikt voor de validatie van treffers. Wit - lege putjes (alleen vloeibaar groeimedium); groen - oplosmiddelcontrole (in duplicaten); rood - negatieve controle (niet-behandelde bacteriën); Blauw - verbindingen die moeten worden gescreend (in duplicaten). Vervaagde kleuren vertegenwoordigen 1:2 seriële verdunningen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Voorbeeld van een plaatlay-out met 96 putjes die wordt gebruikt voor een infectietest. Wit - lege putten (water om verdamping te voorkomen); rood - negatieve controle (niet-behandelde macrofagen); geel - positieve controle (macrofagen behandeld met een antibioticum); groen - controle van oplosmiddelen; Blauw - te testen verbindingen. Vervaagde kleuren vertegenwoordigen 1:2 seriële verdunningen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Protocol voor beeldanalyse. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol van beeldanalyse gebruikt, dat kan worden aangepast aan open-source software. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft een pijplijn voor het screenen van geneesmiddelen tegen Mab met behulp van in eigen huis ontwikkelde stammen¹⁰. Met behulp van robotica voor vloeistofbehandeling, geautomatiseerde microscopie en analyse en dubbele reporterstammen wordt de levensvatbaarheid van bacteriën snel beoordeeld met behulp van luminescentie of fluorescentie zonder reagentia toe te voegen of extra stappen uit te voeren. Deze aanpak vermindert de tijd en de variabiliteit tussen tests, wat een aanzienlijk voordeel is bij het overwegen van het doel van HTS-tests.

Bij het screenen van duizenden verbindingen moet een effectief medicijn gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Daartoe wordt de Z'-factor vaak gebruikt om de statistische effectgrootte te meten, waarbij de prestaties van de test worden afgeleid. Als de Z'-factor 0,5 >, zijn de geteste omstandigheden optimaal om onderscheid te maken tussen behandelde en niet-behandelde populaties¹³. De geteste omstandigheden leverden Z'-factoren > 0,6 op (figuur 2), wat statistisch bewijst dat ze kunnen worden toegepast op een screeningcampagne. Deze stap is cruciaal om de effectiviteit van de screening te waarborgen.

Daarom werd een HTS-protocol ontwikkeld om de antimicrobiële activiteit van duizenden verbindingen tegen Mab planktonisch te detecteren. Aangezien Mab een intracellulaire facultatieve ziekteverwekker is, screent het ontworpen protocol ook de intracellulaire antimicrobiële activiteit tegen dezelfde bacteriestam - een cruciaal voordeel. Bovendien kan ook de toxiciteit voor de gastheercellen worden beoordeeld. Daarom wordt een meerstapsbenadering van het screenen van geneesmiddelen tegen Mab beschreven, waarbij gebruik wordt gemaakt van verschillende experimentele opstellingen om de antimicrobiële activiteit samen met cytotoxiciteit te beoordelen, waardoor de kans op succes toeneemt. Als proof of concept werd een chemische bibliotheek van 1280 verbindingen gescreend.

In totaal werden drieëndertig treffers geïdentificeerd (figuur 3). Daarvan verhoogden er drie de mycobacteriële levensvatbaarheid in vloeibare culturen (verbindingen 30, 31 en 32; Figuur 3 en Figuur 4). Opgemerkt moet worden dat deze verbindingen de luminescentie-emissie kunnen verstoren zonder de levensvatbaarheid van bacteriën te beïnvloeden. Bij het testen tegen geïnternaliseerde mycobacteriën vertoonden deze verbindingen antimicrobiële activiteit (Figuur 6), wat een hogere werkzaamheid tegen Mab aantoonde na internalisatie van de gastheercel. Deze verbindingen werden geïdentificeerd als troleandomycine (30), spiramycine (32) en lincomycine (31; Tabel 1). De eerste twee zijn macroliden, een klasse antibiotica die wordt gebruikt voor de behandeling van mycobacteriële infecties¹⁶, en de laatste is een lincosamide, een antibioticum met een werkingsmechanisme dat vergelijkbaar is met macroliden¹⁷. Er is gemeld dat Mab bijzonder resistent is tegen een andere lincosamide, clindamycine, in zowel vloeibare als vaste culturen¹⁸. Desalniettemin zijn immunomodulerende en ontstekingsremmende eigenschappen in verband gebracht met macroliden^19,20 en lincosamiden²¹, wat de verhoogde antimicrobiële activiteit tegen geïnternaliseerde mycobacteriën zou kunnen verklaren (Figuur 6).

Van de overige dertig treffers verminderen er elf de mycobacteriële levensvatbaarheid in alle concentraties met >90% (figuur 4). Gezien het feit dat een typische HTS-test een verwacht trefferpercentage van ~1%²² heeft, is het ontwikkelde protocol in overeenstemming met wat gewoonlijk wordt waargenomen. Desalniettemin waren verschillende andere verbindingen nog steeds actief en gingen achtentwintig door naar de infectietest.

Van de geïdentificeerde verbindingen werden vijf verbindingen als toxisch beschouwd (figuur 5) - daunorubicine (4), doxorubicine (5), epirubicine (27), thiostrepton (6) en pyrviniumpamoaat (28; Tabel 1). De eerste drie zijn antineoplastische middelen 23,24,25, dus het is niet verwonderlijk dat ze giftig zijn voor de zoogdiercellen die in deze test worden gebruikt. Pyrvinium pamoaat werd jarenlang gebruikt als een effectief anthelminthicum; Sinds 2004 wordt het echter ook in verband gebracht met antineoplastische activiteiten²⁶. Ten slotte is thiostrepton een oligopeptide die vaak wordt gebruikt in de diergeneeskunde, maar nooit is goedgekeurd voor gebruik bij mensen²⁷. De activiteit van dit medicijn tegen borstkankercellen is gerapporteerd²⁸. De intramacrofagische activiteit van thiostrepton werd niet beoordeeld vanwege de toxiciteit ervan op van beenmerg afgeleide macrofagen (figuur 5). Het is echter aangetoond dat thiostrepton effectief is bij 5 μM op Mab-geïnfecteerde THP-1-cellen²⁹. De gerapporteerde resultaten tegen planktonbacteriën²⁹ zijn vergelijkbaar met die verkregen in deze screening, waarbij thiostrepton extreem krachtig is (Figuur 4).

De meeste verbindingen die op intramacrofagische activiteit werden gescreend, vertoonden geen therapeutisch potentieel (figuur 6). Bacteriële intracellulaire groei verschilt aanzienlijk van planktonculturen. In het laatste geval is direct contact tussen bacteriën en medicijnen altijd mogelijk. In het eerste geval, als gevolg van internalisatie door gastheercellen, fungeren verschillende gastheermembranen als fysieke barrières die geneesmiddelen moeten transponeren om het doel te bereiken, wat kan helpen bij het verklaren van de verminderde antimicrobiële activiteit van de meeste treffers. Bij de hoogste concentratie, 13,3 μM, vertoonden drie verbindingen voldoende potentie om statistisch te verschillen van de DMSO-controle (figuur 6) - cefdinir (21), gatifloxacine (26) en moxifloxacine (29; Tabel 1). Hoewel moxifloxacine al wordt gebruikt als tweedelijns geneesmiddel tegen tuberculose¹⁶, wordt cefdinir vaak gebruikt voor de behandeling van verschillende bacteriële infecties van de luchtwegen, zoals longontsteking³⁰. Er is echter melding gemaakt van de activiteit tegen M. tuberculosis³¹ en Mab, die een krachtig synergetisch effect vertonen met een carbapenem tegen de laatste³². Gatifloxacine is een fluorchinolon en de activiteit ervan is in het verleden gerapporteerd tegen verschillende mycobacteriën^33,34. De drie meest actieve verbindingen in deze test (figuur 6) waren roxitromycine (17), claritromycine (22) en rifabutine (25; Tabel 1), die in alle concentraties extreem krachtig zijn. De eerste twee zijn macroliden, terwijl rifabutine een rifamycine is, waarbij beide klassen als basis dienen voor de behandeling tegen veel mycobacteriële infecties¹⁶.

Deze screening is gebaseerd op specifieke en dure vloeistofbehandelingsapparatuur om de variabiliteit tussen tests te verminderen. Ondanks dat de vloeistofverwerker uiterst reproduceerbaar is, heeft hij geen contactloze overdracht van verbindingen, zoals een akoestische. Zo kunnen bepaalde aanhangende verbindingen tussen overdrachten aan de metalen pinnen blijven zitten en worden overgedragen naar volgende putten, wat resulteert in valse positieven tijdens de screeningfase - dit was wat er gebeurde met verbinding 33. Dit is de reden waarom het valideren van de screening zo cruciaal is voor het succes ervan, om ervoor te zorgen dat er geen valse positieven worden doorgevoerd naar de volgende stappen van de pijplijn voor het screenen van geneesmiddelen. De infectietest maakt gebruik van een beeldvormingssysteem met een hoog gehalte en een confocale modus om de best mogelijke definitie van de bacteriële regio's te verkrijgen. Desalniettemin is het nog steeds mogelijk om het te gebruiken zonder een confocale modus, zij het met een definitieverlies en mogelijk de identificatie van bacteriële regio's belemmeren. Dit protocol maakt gebruik van de eenvoudige en gebruiksvriendelijke analysesoftware die is geïntegreerd met het beeldvormingssysteem; open-source software kan echter worden gebruikt volgens het protocol (aanvullende figuur 5). Uiteindelijk, ondanks het feit dat er geen geneesmiddelen worden hergebruikt om Mab-infecties te behandelen, zijn deze resultaten uiterst belangrijk omdat ze het gevestigde protocol valideren, dat kan worden uitgebreid naar grotere bibliotheken. Belangrijk is dat we geloven dat dit protocol kan worden aangepast aan alle bacteriën, op voorwaarde dat fluorescerende of lichtgevende uitlezingen beschikbaar zijn. Dit werk levert dus een belangrijke bijdrage aan het ontdekken van geneesmiddelen en levert de nodige hulpmiddelen om een van de grootste volksgezondheidsproblemen te helpen bestrijden - antibioticaresistente bacteriën - en in het bijzonder een bijna hardnekkige ziekteverwekker - Mycobacterium abscessus.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Neutral buffered formalin	Bio Optica	05-01005Q	fixatieoplossing
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate	Corning	3658	Witte microplates kunnen worden gebruikt; polystyreen kan worden gebruikt
50 TS Washer	BioTek
Breathe-Easy sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z380059-1PAK
cell::explorer	Revvity		apparatuur-afhandelingsrobot
Clarithromycin	Sigma-Aldrich	A3487-100MG	Opgelost in DMSO tot de gewenste concentratie
DMSO	Fisher Scientific	D/4121/PB15	Verdunnen in vloeibaar groeimedium tot de gewenste concentratie
Harmony 5.1	Revvity		analysesoftware
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific		celincubator
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm	Revvity		vloeistofbewaarsysteem
KB 8182	Termaks		incubator met roeren
Libra S4+	Biochrom
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Opera Phenix Plus	Revvity		beeldvormingssysteem
PhenoPlate	Revvity	6055302	Noodzakelijk voor hoge-inhoud microscoop
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x	NA	NA	wasoplossing
Prestwick Chemical libraries			Commerciële chemische bibliotheek bedoeld voor geneesmiddelhergebruik
Shaking incubator 3031	GFL
VICTOR Nivo	Revvity
Cell cultuur medium:			Wanneer nodig, voeg 10% van het supplement toe
DMEM	Gibco	10938-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S1810
HEPES Buffer Solution (1 M)	Gibco	15630-056
LCCM	NA	NA	Geconditioneerd medium van L929-cellijn die Macrophage colony stimulerende factor (M-CSF) afgeeft; celcultuurmedium supplement
L-glutamin (200 mM)	Thermo Scientific	25030024
Sodium Pyruvate 100 mM (100X)	Gibco	11360-039
Infectinwasoplossing
Apirogene water			Meerdere leveranciers beschikbaar
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Gibco	14060-040	Verdunnen tot 1x met apirogene water
Permeabiliseringsoplossing			PBS met 0,1% Triton X100
PBS 1x	NA	NA
Triton X100	Sigma-Aldrich	T8787	Andere leveranciers beschikbaar
Kleuroplossing			PBS met DAPI (500 ng/mL) en HCS Far Red (10 ng/mL)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
HCS Far Red	Invitrogen	H32721
PBS 1x	NA	NA	Meerdere leveranciers beschikbaar
Vloeibaar groeimedium			Wanneer nodig, voeg 10% supplement toe
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310
Tween80	Sigma-Aldrich	P4780	0,05% eindconcentratie. Andere leveranciers beschikbaar
Vloeibaar groeimediumsupplement:
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9702-100
D-Glucose anhydrous	Fisher Scientific	G/0450/60