Histologiebeelden met hoge parameters genereren en analyseren met histoflowcytometrie

Samenvatting

Hier wordt een methode beschreven die kan worden gebruikt om vijf of meer fluorescerende parameters af te beelden door middel van immunofluorescerende microscopie. Er wordt een analysepijplijn geschetst voor het extraheren van afzonderlijke cellen uit deze beelden en het uitvoeren van analyse van één cel door middel van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën, die celsubsets in weefselsecties kunnen identificeren.

Samenvatting

Het gebruik van histologie om de diversiteit van immuuncellen te onderzoeken in weefselsecties zoals die afkomstig zijn van het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt kritisch beperkt door het aantal fluorescerende parameters dat op één moment kan worden afgebeeld. De meeste subsets van immuuncellen zijn gedefinieerd met behulp van flowcytometrie met behulp van complexe combinaties van eiwitmarkers, waarvoor vaak vier of meer parameters nodig zijn om definitief te identificeren, wat de mogelijkheden van de meeste conventionele microscopen te boven gaat. Omdat flowcytometrie weefsels dissocieert en ruimtelijke informatie verliest, is er behoefte aan technieken die ruimtelijke informatie kunnen behouden terwijl de rollen van complexe celtypen worden ondervraagd. Deze problemen worden hier aangepakt door een methode te creëren voor het uitbreiden van het aantal fluorescerende parameters dat kan worden afgebeeld door de signalen van spectraal overlappende fluoroforen te verzamelen en spectrale ontmenging te gebruiken om de signalen van elke individuele fluorofoor te scheiden. Deze beelden worden vervolgens verwerkt met behulp van een analysepijplijn om histologiebeelden met hoge parameters te maken en afzonderlijke cellen uit deze beelden te extraheren, zodat de unieke fluorescerende eigenschappen van elke cel op celniveau kunnen worden geanalyseerd. Met behulp van flowcytometrie-achtige gating-strategieën kunnen cellen vervolgens worden geprofileerd in subsets en weer in kaart worden gebracht op de histologiesecties om niet alleen hun overvloed te kwantificeren, maar ook vast te stellen hoe ze interageren met de weefselomgeving. Over het algemeen wordt de eenvoud en het potentieel aangetoond van het gebruik van histoflowcytometrie om complexe immuunpopulaties in histologiesecties te bestuderen.

Inleiding

Ontsteking veroorzaakt door cellen van het immuunsysteem en gliacellen kan bijdragen aan chronische aandoeningen van het CZS, waarbij elke populatie de activiteit van de andere^{kan bevorderen 1,2,3}. Begrijpen hoe het immuunsysteem interageert met deze elementen van het CZS om CZS-ontsteking te bevorderen, is momenteel een belangrijk onderwerp van interesse en is enorm vergemakkelijkt door technieken met hoge parameters, zoals single-cell RNA-sequencing. Door middel van single-cell RNA-sequencing hebben we ontdekt dat er uitgebreide communicatie plaatsvindt tussen gliacellen en het immuunsysteem bij verschillende CZS-aandoeningen ^4,5,6. Begrijpen hoe deze interacties deze aandoeningen beïnvloeden, zal cruciaal zijn om de biologie van deze ziekten op te helderen.

Een probleem met single-cell sequencing-analyses is dat deze technieken vereisen dat het weefsel wordt verstoord om enkele cellen of kernen te verkrijgen, wat resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke informatie. Weten waar een cel zich in een weefsel bevindt, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de rol van de cel bij het veroorzaken van ontstekingen. Immuuncellen zoals B-cellen kunnen zich bijvoorbeeld concentreren in het CZS tijdens neuro-inflammatie; ze komen echter zelden in het CZS-parenchym terecht en concentreren zich in plaats daarvan in CZS-barrières⁷. Gezien hun lokalisatie is het onwaarschijnlijk dat deze cellen bijdragen aan CZS-ontsteking door fysieke interactie met gliacellen in het CZS-parenchym, wat suggereert dat eventuele interacties die ze mogelijk hebben met gliacellen zouden plaatsvinden via uitgescheiden factoren. Bovendien heeft de pathologie die optreedt bij CZS-aandoeningen vaak structuur ^8,9 zodat de lokalisatie van een cel in het weefsel kritisch kan bepalen of deze actief bijdraagt aan de aandoening of een omstander is. Het gebruik van ruimtelijke oriëntatie om de rol van een cel in de pathologie te evalueren is dus essentieel.

Het bestuderen van cellen in weefsel is meestal bereikt met behulp van immunohistochemie of immuunfluorescentiemicroscopie. Een probleem met deze technieken is dat ze doorgaans slechts maximaal vier parameters tegelijk kunnen weergeven. Dit is een belangrijke beperking van deze technieken, aangezien we weten uit flowcytometrie en single-cell RNA-sequencinganalyses dat veel celpopulaties twee of meer parameters nodig hebben voor hun identificatie; Ook neemt het aantal vereiste parameters doorgaans toe bij het zoeken naar specifieke subsets van een celtype¹⁰. Het is dus onpraktisch om standaard beeldvormingstechnieken te gebruiken om te bestuderen hoe subsets van cellen in een weefsel op elkaar kunnen inwerken.

Dit probleem is gedeeltelijk verholpen door nieuwere methoden met hoge parameters die ruimtelijke informatie kunnen behouden, zoals ruimtelijke RNA-sequencing¹¹ en beeldvorming massacytometrie¹². Hoewel deze technieken waardevol zijn, hebben ze verschillende problemen, zoals het feit dat ze niet algemeen beschikbaar zijn, driedimensionale gegevens in twee dimensies reduceren en aanzienlijke expertise vereisen om uit te voeren. Een andere techniek die bekend staat als sequentiële kleuring, waarbij weefsels worden gekleurd met een set antilichamen gevolgd door inactivering van de vorige set antilichamen voordat ze worden gekleurd met een andere set antilichamen, kan histologie met hoge parameters bereiken zonder dat er gespecialiseerde apparatuur of expertise nodig is 13,14,15. Sequentiële kleuring kan echter extreem arbeidsintensief zijn en vereist een grote hoeveelheid microscopietijd, wat onpraktisch kan zijn voor laboratoria die geen persoonlijke microscoop bezitten. Er is dus behoefte aan technieken die het aantal fluorescerende parameters kunnen uitbreiden dat in één keer kan worden afgebeeld op microscopen die algemeen en tijdig beschikbaar zijn.

Zodra de gegevens met hoge parameters zijn verkregen, doet zich een ander probleem voor: het is onwaarschijnlijk dat conventionele beeldanalysemethoden de gegevens met succes zullen analyseren. Technieken zoals handmatig tellen of drempelwaarden zijn alleen levensvatbaar als de analyse bestaat uit een enkele parameter of als meerdere markers dezelfde lokalisatie hebben waarbij alleen overlappende signalen worden geteld. Deze beperking maakt traditionele analyse ontoereikend om te werken met datasets met hoge parameters. Succesvolle analyse van deze datasets is bereikt door afzonderlijke cellen uit histologiebeelden te segmenteren en vervolgens flowcytometrie-achtige gatingstrategieën uit te voeren om celtypen te identificeren^16,17. Een ander probleem dat van invloed is op deze analyses is echter dat ze alleen werken voor datasets waarin alle cellen van belang fysiek van elkaar zijn gescheiden, aangezien deze technieken geen methoden gebruiken die cellen die fysiek contact maken nauwkeurig kunnen scheiden. Er is dus een nieuwere methode nodig die analyses van één cel kan uitvoeren op histologiesecties, zelfs als de cellen fysiek contact hebben.

In dit artikel wordt een eenvoudig protocol beschreven, histoflowcytometrie genaamd, dat eerder is geïntroduceerd¹⁸ en dat het aantal fluorescerende parameters uitbreidt dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld met behulp van algemeen beschikbare microscopen. Dit protocol werkt door weefsels te kleuren met spectraal overlappende kleurstoffen en vervolgens spectrale compensatie te gebruiken om doorbloedingen van overlappende kanalen te verwijderen om heldere enkelvoudige vlekken te verkrijgen. Om de analyse van histologiebeelden met hoge parameters te vergemakkelijken, wordt een gedetailleerde analysepijplijn beschreven die afzonderlijke cellen uit weefselsecties extraheert met het oog op het sorteren van cellen in verschillende populaties met behulp van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën. Dit protocol werkt in weefsels waar cellen diffuus aanwezig zijn en in weefsels waar cellen dicht op elkaar zijn verdicht, waardoor deze techniek veelzijdig is voor de studie van weefsels zoals het CZS bij zowel homeostase als neuro-inflammatie. Histoflowcytometrie is daarom een nuttige techniek voor het bestuderen van interacties tussen complexe celtypen die meerdere celmarkers nodig hebben om cellen te definiëren met behoud van ruimtelijke informatie.

Protocol

Dit protocol heeft geen betrekking op het doorsnijden van weefsels voor histologie; zie Jain et ^al.18 of¹⁹ voor beschrijvingen van het doorsnijden van weefsels voor histologie. Dit protocol kan worden gebruikt met alle in secties gesneden weefsels op glasplaatjes. Dit artikel maakt gebruik van lieslymfeklieren geïsoleerd uit een geïmmuniseerd dier, zoals eerder beschreven¹⁸. De procedure en tijdlijn voor dit protocol zijn samengevat in figuur 1. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Kleuring van weefselsecties

OPMERKING: Naast het kleuren van weefsels met alle antilichaamlabels waarin de onderzoeker geïnteresseerd is, moet de onderzoeker ook enkelkleurige controles voorbereiden (één voor elke fluorescerende parameter die bedoeld is om te worden gebruikt) op aangrenzende of anderszins identieke weefselglaasjes waarbij elke afzonderlijke kleurcontrole wordt gekleurd met de reagentia die nodig zijn om het signaal van één fluorescerende parameter te produceren.

1. Bereid Perm en blokkeerbuffer en Perm en kleuringsbuffer voor (zie Tabel 1 voor de samenstelling).
2. Ontdooi weefselsecties op glazen objectglaasjes bij kamertemperatuur en veeg de condens weg met een doekje. Gebruik een hydrofobe marker om de rand van de weefsels die gekleurd moeten worden af te bakenen en laat de markeringen drogen.
3. Hydrateer de weefsels door de weefselsecties gedurende 1 minuut te weken in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Schud de PBS af en gebruik een doekje om overtollige PBS te verwijderen zonder het weefsel direct aan te raken.
4. Fixeer de weefsels door voldoende 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen om het weefsel volledig te bedekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
   LET OP: PFA kan giftig zijn en moet in een zuurkast worden gehanteerd.
   OPMERKING: Deze stap is alleen vereist voor vers ingevroren tissues. Als het weefsel al gefixeerd is, negeer dan deze stap. PFA-fixatie wordt hier beschreven, maar het weefsel kan worden gefixeerd met behulp van andere methoden, afhankelijk van de behoeften van het experiment.
5. Was de tissues in een PBS-bad gedurende 1 minuut met zacht schommelen en verwijder vervolgens de glijbaan uit het bad. Vervang de PBS en herhaal de was nog 3 keer.
6. Schud overtollige PBS af en gebruik een doekje om overtollige PBS te verwijderen zonder het weefsel direct aan te raken.
7. Bepaal welke secundaire antilichamen in stap 1.12 van het protocol moeten worden gebruikt en van welke diersoort de secundaire antilichamen zijn afgeleid. Versterk de Perm en blokkeerbuffer door serum van deze dieren aan de Perm toe te voegen en de buffer te blokkeren tot een eindconcentratie van 5% voor elke soort.
   OPMERKING: Het gebruik van secundaire antilichamen helpt de signaalintensiteit te versterken. Daarom wordt aanbevolen dat primaire antilichamen die zwakke signalen produceren, worden gecombineerd met secundaire antilichamen om hun signalen te versterken. Als alle antilichaamdoelen die worden gekleurd helder genoeg zijn om geen secundaire antilichamen nodig te hebben, kunnen stap 1.7-1.12 en stap 1.15 worden overgeslagen.
8. Blokkeer niet-specifieke binding van antilichamen door voldoende versterkte Perm en blokkerende buffer toe te voegen om elk weefsel te bedekken. Incubeer de objectglaasjes gedurende 1-8 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer die beschermd is tegen licht.
9. Voeg ongeconjugeerde primaire antilichamen toe aan de permanent- en kleuringsbuffer bij experimenteel bepaalde verdunningen (de soort- of immunoglobuline-isotypen van de primaire antilichamen moeten allemaal verschillend zijn en te onderscheiden zijn door de secundaire antilichamen die de onderzoeker van plan is te gebruiken in stap 1.12).
10. Gooi de permanent en de blokkeerbuffer weg en gebruik een doekje om overtollige buffer te verwijderen zonder het weefsel direct aan te raken. Voeg voldoende permanent- en kleuringsbuffer met primaire antilichamen toe aan het weefsel om het te bedekken en incubeer het objectglaasje bij 4 °C gedurende 12-48 uur.
    OPMERKING: De onderzoeker moet de optimale tijd voor de incubatie van antilichamen bepalen.
11. Bereid de blokkeerbuffer en de kleuringsbuffer voor (tabel 1).
12. Voeg secundaire antilichamen toe aan de kleuringsbuffer die in stap 1.11 is bereid bij experimenteel bepaalde verdunningen. De gebruikte secundaire antilichamen moeten gericht zijn op dezelfde soort of antilichaamisotypen die in stap 1.9 zijn gebruikt.
13. Bereid de blusbuffer voor (zoals in tabel 1).
    OPMERKING: Deze stap helpt autofluorescentie uit het weefsel te verminderen. Als dit niet nodig is, kunnen de stappen 1.13 en 1.14 worden overgeslagen.
14. Was de tissues zoals beschreven in stap 1.5-1.6. Voeg vervolgens voldoende blusbuffer toe om de tissues op de objectglaasjes te bedekken en incubeer de objectglaasjes 1-2 minuten bij kamertemperatuur.
15. Was het weefsel zoals beschreven in stap 1.5-1.6. Voeg vervolgens de secundaire antilichamen verdund in de kleuringsbuffer die in stap 1.12 is bereid, toe aan de weefsels, zodat de weefsels volledig bedekt zijn met de kleuringsbuffer. Incubeer de objectglaasjes bij 4 °C gedurende 2-8 uur.
16. Bereid de blokkeringsoplossing voor door 50 μl normaal serum van welke soort antilichamen dan ook die in stap 1.18 zullen worden gebruikt (5% van elke soort) toe te voegen aan de in stap 1.11 bereide blokkeringsbuffer.
17. Was de tissues zoals beschreven in stap 1.5-1.6. Voeg vervolgens de blokkerende oplossing met normaal serum bereid in stap 1.16 toe aan de weefsels zodat ze volledig bedekt zijn met kleuringsbuffer. Incubeer de objectglaasjes bij kamertemperatuur gedurende 1-8 uur.
18. Bereid de kleuringsoplossing voor door fluorofoorgeconjugeerde primaire antilichamen in experimenteel bepaalde verdunningen toe te voegen aan de kleuringsbuffer die in stap 1.11 is bereid. Voeg ook een nucleaire kleuring, zoals nucleair geel, toe aan de kleuringsoplossing in een experimenteel bepaalde verdunning.
    OPMERKING: Stappen 1.18-1.19 zijn alleen vereist als de onderzoeker aanvullende antilichaamlabels moet gebruiken waarvoor geen secundaire antilichamen nodig zijn voor signaalversterking. Als er geen primaire geconjugeerde antilichamen worden gebruikt, kunnen kernkleuringen worden toegevoegd bij stap 1.12.
19. Schud de blokkeerbuffer af en gebruik een doekje om overtollige buffer te verwijderen zonder het weefsel direct aan te raken. Voeg voldoende in stap 1.18 bereide kleuroplossing toe aan het weefsel om het te bedekken en incubeer bij 4 °C gedurende 12-48 uur.
20. Was de tissues zoals beschreven in stap 1.5-1.6. Voeg 5 druppels montproduct toe aan elk objectglaasje zonder belletjes te introduceren, en kantel voorzichtig en langzaam een glazen dekglaasje over het weefsel om het weefsel volledig met montant te bedekken en alle luchtbellen buiten te sluiten. Bewaar de objectglaasjes bij 4 °C in het donker tot ze klaar zijn om te worden afgebeeld.

2. Beeldvorming van de weefselsecties

OPMERKING: In dit stadium worden de weefselsecties gekleurd met alle antilichamen die van belang zijn voor alle aandoeningen die bedoeld zijn om te worden afgebeeld, en eenkleurige controles worden gekleurd met één fluorescerende parameter op elke sectie. Beeldvorming moet worden gedaan op een microscoop met meerdere detectoren die kunnen worden afgestemd om specifieke lichtbereiken te detecteren, en idealiter zou deze toegang moeten hebben tot zoveel mogelijk laserlijnen voor excitatie.

1. Plaats een van de volledig gekleurde objectglaasjes in de microscoop en stel de microscoop in om het gedeelte af te beelden met behulp van het objectief dat bedoeld is om te worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens.
2. Op basis van de fluoroforen waarmee het weefsel is gekleurd, identificeert u de excitatielaserlijnen die nodig zijn om die fluoroforen te stimuleren en identificeert u de emissiebereiken voor elke fluorofoor die de grootste hoeveelheid signaal bevatten.
   OPMERKING: Online hulpmiddelen voor het bekijken van fluorescentiespectra (zie bijvoorbeeld de Tabel met materialen) kunnen nuttig zijn voor het identificeren van de optimale excitatiegolflengten van fluoroforen en het identificeren van de optimale bereiken voor fluorofoordetectie. Fluoroforen die worden gebruikt voor histoflowcytometrie moeten zo worden gekozen dat elke fluorofoor verschilt in de optimale laserlijn waardoor de fluorofoor wordt gestimuleerd of verschilt door het optimale bereik van emissiegolflengten. Fluoroforen die nauwere excitatie-/emissiegolflengten hebben, zullen moeilijker te scheiden zijn. De fluoroforen die voor dit onderzoek zijn gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de resultatensectie.
3. Open Software 1 (zie Materiaaltabel) in een confocale microscoop en selecteer het configuratietabblad bovenaan. Selecteer vervolgens de hardwareknop aan de linkerkant en wijzig de bitdiepte in 16-bits.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hogere bitdieptes te gebruiken, zoals 16-bits gegevens, voor het verzamelen van gegevens, omdat dit de nauwkeurigheid van de spectrale compensatie verbetert. Bovendien zullen hogere pixeldichtheden, grotere getallen voor lijngemiddelden en meer stappen in de z-stack de kwaliteit van de spectrale scheiding verbeteren.
4. Selecteer het tabblad Verwerven boven aan het scherm en voer de formaatinstelling in om de pixeldichtheid van de afbeelding op te nemen (doorgaans leveren hogere resoluties betere resultaten op).
5. Indien beschikbaar, selecteer bidirectionele X-acquisitie om de beeldvormingstijd te versnellen, op voorwaarde dat deze functie voldoende is gekalibreerd.
6. Kies een gaatjewaarde voor de confocale microscoop (meestal tussen 400-600 nm) waarbij kleinere waarden doorgaans histoflowcytometrieresultaten van hogere kwaliteit opleveren, hoewel kleinere gaatjeswaarden het moeilijker maken om beelden te verkrijgen en mogelijk extra beeldvormingstijd of hogere excitatie-intensiteiten vereisen om beelden te produceren.
7. Selecteer het deelvenster Sequentiële scan weergeven boven aan het linkermenu om de optie voor sequentiële scans te openen. Gebruik het '+'- teken om extra sequenties in te stellen, waarbij elke sequentie één excitatiegolflengte bevat die in stap 2.2 is besloten.
8. Schakel alle lasers in die nodig zijn door op de AAN-knoppen te klikken die zijn gekoppeld aan lasers die van belang zijn in het midden van het scherm om ze in een AAN-stand te zetten. Ga naar elke specifieke sequentie en verhoog het laservermogen in het midden van het scherm tot elke gewenste waarde, waarbij elke sequentie één excitatiegolflengte heeft.
9. Schakel zoveel detectoren in als nodig is in het onderste gedeelte van het scherm in elke reeks om alle fluoroforen af te beelden die op die laserlijn worden afgebeeld. Pas het bereik van de detectoren aan door te dubbelklikken op hun bereik en het bovenste en onderste bereik van golflengten in te voeren die moeten worden verzameld.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om waar mogelijk detectoren met een hoge gevoeligheid te gebruiken, en idealiter moeten alle kanalen op dezelfde typen detectoren worden verzameld, hoewel dit niet vereist is.
10. Druk op de live-knop en stel vervolgens scherp op het monster. Gebruik de Auto Scale-knop links van de afbeelding in de software om te beoordelen of kanalen voldoende verzadigd zijn met signaal. De gebruiker moet de versterkingswaarden en laserintensiteiten in elke sequentie aanpassen totdat de automatische schaling niet de maximale waarde bereikt (65535 voor 16-bits gegevens), maar zeer dicht bij de verzadiging voor alle kanalen ligt.
    OPMERKING: Aangezien verschillende fluoroforen kunnen verschillen in hun helderheid en verschillende antilichaamdoelen kunnen verschillen in hun overvloed, moet de gevoeligheid van de detectoren worden aangepast om een lage gevoeligheid te hebben voor heldere signalen en een hoge gevoeligheid voor zwakke signalen als beide fluoroforen worden gestimuleerd door dezelfde laser (de laserintensiteit kan in dit scenario niet veranderen omdat beide fluoroforen zouden worden beïnvloed). Voor de beste resultaten moet het fluorescentiesignaal van elk kanaal in het experiment zo worden gebalanceerd dat elk kanaal ongeveer gelijke hoeveelheden signaal heeft, wat het spectraal doorbloeden naar andere kanalen zal verminderen en zal resulteren in sterkere signalen. Aangezien verschillende monsters kunnen verschillen in de overvloed van de markers die van belang zijn voor de kleuring, wordt aanbevolen om de microscoopinstellingen onder meerdere experimentele omstandigheden te testen om te bevestigen dat bleken onder geen van de experimentele omstandigheden optreedt.
11. Zodra de microscoopinstellingen zijn voltooid, laadt u de microscoop met de enkele kleurcontroleglaasjes en zoekt u representatieve kleuring voor elke fluorofoor. Stel een Z-stack in door onder de sample scherp te stellen en op de startknop in het z-stack-menu te drukken, vervolgens boven de sample scherp te stellen en op de eindknop te drukken.
12. Kies het aantal stappen en de afstand tussen de stappen (en gebruik hetzelfde aantal stappen en parameters zoals pixeldichtheden en bitdiepte die worden gebruikt om de volledig bevlekte dia's af te beelden) en druk vervolgens op de startknop.
    OPMERKING: Idealiter zouden deze afbeeldingen de helderste signalen van echte kleuring moeten bevatten die op de dia te vinden zijn.
13. Nadat de besturingselementen in één kleur zijn afgebeeld, gaat u verder met het gebruik van dezelfde microscoopinstellingen om alle volledig gekleurde monsters af te beelden.

3. Fluorescentie compensatie

1. Open .lif-bestanden in Software 1 en klik op het tabblad Proces.
2. Kies de module Kleurstofscheiding en kies vervolgens de optie Automatische kleurstofscheiding . Selecteer de handmatige methode voor kleurstofscheiding en kies geen herschikken.
3. Open een van de eenkleurige besturingsafbeeldingen. Inspecteer de besturingselementen met één kleur handmatig op spectrale doorbloeding van het ene kanaal naar het andere door grijswaardenvensters voor elk kanaal te observeren als bewijs van een signaal in ongepaste kanalen. Gebruik indien nodig de knop Automatisch schalen om zwakke doorloop te zien.
4. Begin met het verwijderen van doorbloedingen door handmatig getallen (meestal 0-1, waarbij 0 staat voor geen doorbloeding en 1 staat voor 100% doorbloeding) in de matrix op het scherm in te voeren en druk vervolgens op toepassen om te testen of de doorbloeding voldoende is verwijderd. Dit moet worden herhaald totdat de signalen in alle andere kanalen, behalve het kanaal van belang, zijn teruggebracht tot achtergrondniveaus.
   OPMERKING: Overcompensatie leidt tot onnauwkeurige resultaten, dus de fluorescentie moet worden teruggebracht tot achtergrondniveaus, maar niet daaronder. Overgecompenseerde gegevens worden weergegeven als een kanaal met een signaal en andere kanalen die zwarte gaten lijken te hebben waar het signaal van belang is (Figuur 2).
5. Zodra een van de besturingselementen met één kleur is voltooid, noteert u de waarden in de matrix en stelt u de matrix opnieuw in en gaat u naar het volgende besturingselement met één kleur. Herhaal dit proces voor elke afzonderlijke kleurregeling.
   OPMERKING: De eerste kleurstof bevindt zich in de rij Kleurstof 1 en de hoeveelheid fluorescentie die uit kleurstof 1 moet worden verwijderd, bevindt zich in de aangrenzende kolommen.
6. Verzamel alle waarden die uit elke controle zijn verkregen in één matrix en pas deze matrix toe op een volledig gekleurd monster. Als de scheiding er nauwkeurig uitziet, past u de instellingen toe op alle afbeeldingen in het experiment, anders evalueert u de besturingselementen voor één kleur opnieuw.
   OPMERKING: Effectieve compensatie zou het grootste deel van de doorbloeding via kanalen moeten verwijderen, zoals samengevat en weergegeven in afbeelding 3.
7. Sla alle gecompenseerde bestanden op in een apart .lif-bestand.

4. Kernen en cellen identificeren met behulp van ilastik

1. Open de gecompenseerde .lif-bestanden in FIJI²⁰. Schakel het weergeven van stapels in een hyperstack in en selecteer een afbeelding.
2. (Optioneel) Gebruik een selectiegereedschap, zoals het rechthoekgereedschap, om de delen van de afbeelding op te nemen die worden geanalyseerd en gebieden uit te sluiten die niet worden geanalyseerd. Snijd de afbeelding bij met behulp van de functie voor het bijsnijden van afbeeldingen >.
   OPMERKING: Het verkleinen van de afbeelding is handig in de volgende stappen om het RAM-verbruik (Random Access Memory) te verminderen en de verwerkingssnelheid te verhogen.
3. Sla de afbeelding op als een .tif bestand. Sla de afbeelding ook op als een hdf5-bestand met behulp van de ilastik-plug-in voor FIJI door op Plugins > ilastik > Export hdf5 te klikken. Sla het bestand op als "naam naar keuze".h5 met 0-compressie.
4. Open Ilastik²¹ en maak een pixelclassificatieproject. Gebruik de functie Nieuwe afbeeldingen toevoegen > Afzonderlijke afbeeldingen toevoegen om ten minste 3 representatieve afbeeldingen toe te voegen door naar Nieuwe invoergegevens toe te voegen.
5. Klik met de rechtermuisknop op een van de afbeeldingen, selecteer Eigenschappen bewerken en wijzig de weergavemodus in grijstinten.
6. Selecteer aan de linkerkant van het scherm het tabblad voor het selecteren van functies. Klik op Objecten selecteren en selecteer alle functies tot de hoogste sigma-waarde die u volgens het programma kunt gebruiken en druk vervolgens op OK.
7. Selecteer nu het tabblad Training. Gebruik het penseel (terwijl label één is geselecteerd) om afzonderlijke cellen (Figuur 4) van belang te markeren, zodat het inwendige (cytoplasma en kern) en het celmembraan worden opgenomen in de markering.
8. Herhaal dit voor alle trainingsmonsters waarbij alle celtypen van belang zijn geselecteerd, en uit elk monster moeten meerdere cellen met verschillende intensiteiten, morfologieën en lokalisaties in het weefsel worden geselecteerd.
   OPMERKING: Afhankelijk van de markers die zijn gekozen voor een individuele set vlekken, kunnen er al dan niet intracellulaire kleuringen of celmembraankleuringen zijn voor de cellen van belang. Welke markeringen ook worden gebruikt, zorg ervoor dat de markering de buitenste vlek op de cellen van belang omvat en het celinterieur omvat, ongeacht of er een intracellulaire kleuring wordt gebruikt.
9. Gebruik vervolgens label twee om alles te markeren dat niet de cellen van belang is (Figuur 4). Dit kan lege ruimte zijn, niet-gelabelde kernen of weefsel dat geen markers van belang heeft. Zorg ervoor dat u de ruimte direct naast interessante cellen opneemt om het leren van exacte celgrenzen te bevorderen.
10. Gebruik de Live Update-functie om de kwaliteit van de training op interessante afbeeldingen te evalueren. Als de training onvoldoende is, ga dan verder met de training in de stappen 4.7 tot en met 4.9. Anders, indien bevredigend, klikt u op het tabblad Voorspelling exporteren .
11. Stel de bron in op waarschijnlijkheden. Klik op de knop Kies Afbeeldingsinstellingen exporteren en stel vervolgens de c-parameter in op exporteren 0-1 (ervan uitgaande dat label 1 interessante parameters markeert).
12. Converteer het gegevenstype naar een 16-bits geheel getal en exporteer het als een hdf5-bestand naar de map waarin u geïnteresseerd bent met de naam van interesse (we raden aan om {nickname} mask.h5 te gebruiken) en druk vervolgens op OK.
13. Klik op het tabblad Batchverwerking . Druk op de knop Onbewerkte gegevensbestanden selecteren, selecteer alle interessante .h5-bestanden die moeten worden verwerkt en druk vervolgens op Openen. Klik op Alle bestanden verwerken.
14. Herhaal stap 4.4 tot en met 4.13, maar in plaats van cellen te identificeren, identificeer je nu de kernen en sluit je al het andere uit (Figuur 4). Exporteer dit als een afzonderlijke voorspelling voor het identificeren van celkernen.
15. Open Ilastik en maak een nieuw Data Conversion-project. Voeg een representatief hdf5-bestand toe aan het tabblad Invoergegevens met behulp van de functie Nieuwe toevoegen > Afzonderlijke afbeelding toevoegen .
16. Klik op het tabblad Gegevensexport en kies de knop Afbeeldingsinstellingen exporteren kiezen met de bron ingesteld op invoer. Verander het formaat in multipage tiff, kies een opslaglocatie met de selectiefunctie en stel de naam van het bestand in op {nickname}. Druk op OK.
17. Klik op het tabblad Batchverwerking en selecteer al uw hdf5-bestanden met behulp van de knop Invoergegevensbestanden selecteren en druk op de knop Alle bestanden verwerken .
18. Open Software 2 (zie Materiaaltabel) en voeg alle tif/tiff-bestanden toe die in stap 4.3 en 4.17 zijn gegenereerd met behulp van de knop Bestanden toevoegen . Kies een locatie voor bestandsuitvoer en druk op de knop Alles starten om alle bestanden naar IMS-bestanden te converteren. De bestanden zijn nu klaar voor analyse in Software 3 (zie Tabel met materialen).

5. Analyse in Software 3

1. Open een van de afbeeldingen met alle fluorescerende vlekken. Selecteer Edit-> Add Channels (Kanalen toevoegen) en voeg de .ims-bestanden toe die overeenkomen met de maskers die over kernen en cellichamen zijn gemaakt. Herhaal dit voor alle monsters.
2. Selecteer de knop Nieuwe cellen toevoegen . Selecteer de optie voor het detecteren van kern en cel en ga verder.
3. Selecteer het masker over kernen om het bronkanaal te zijn voor het detecteren van kernen en selecteer de geavanceerde optie voor het splitsen van kernen op basis van zaadpunten. Kies een waarde voor de diameter van de kern) en ga verder.
   OPMERKING: De optimale waarde voor de kern diameter moet worden getest door de simulatie uit te voeren en handmatig te evalueren of het programma niet genoeg kernen splitst (meerdere kernen worden gegroepeerd) of dat er sprake is van oversplitsing (één kern wordt gesplitst in meer dan één).
4. Kies een waarde voor de kwaliteitsevaluatie en ga verder. Meestal is het het beste om alle kernen op te nemen, omdat het weglaten van kernen ertoe kan leiden dat meerdere cellen worden samengevoegd tot één.
5. Kies een drempelwaarde voor het maken van nucleaire oppervlakken en ga verder. Zorg ervoor dat alle kernen, zelfs die zwakker zijn, nog steeds in de drempel zijn opgenomen. Maak de drempel niet te laag, omdat dit de grootte van kernen kan overschatten of mogelijk puin als nucleaire kleuring kan bevatten.
6. Selecteer een waarde voor het aantal minimale Voxels per kern en ga verder. Meestal is het het beste om alles te bewaren, tenzij puin of niet-kernen kunnen worden uitgesloten met behulp van deze parameter.
7. Kies de optie Celgrens en cytoplasma , selecteer het masker over cellen om het bronkanaal te zijn voor het detecteren van cellichamen en ga verder.
8. Kies een celdrempel die alle cellen van belang nauwkeurig vastlegt, maar niet zo laag is dat deze achtergrond- of niet-specifieke detectie van cellen omvat. Selecteer de optie om aanrakende cellen zo te splitsen dat er één kern per cel is en ze worden gescheiden door de afstand tot de kernen. Kies er ook voor om cellen op kernen uit te breiden en ga dan verder.
9. Selecteer een waarde voor het minimum aantal voxels per cel en ga verder. Meestal is het het beste om alles te bewaren, tenzij puin of niet-cellen kunnen worden uitgesloten met behulp van deze parameter.
10. Evalueer of de gemaakte oppervlakken over de cellen nauwkeurig zijn door te kijken of meerdere cellen zijn samengesmolten of dat er cellen ontbreken. Als de oppervlakken ontoereikend zijn, ga dan terug naar stap 5.2 en probeer nieuwe parameters totdat de optimale instellingen zijn bepaald.
11. Zodra de beste instellingen zijn ingesteld, klikt u op het aangemaakte cellenobject in het linkermenu, klikt u op het tabblad Maken en klikt u op de knop Parameters voor batch opslaan om de gebruikte instellingen op te slaan.
12. Open meerdere vensters van Software 3 en open afzonderlijke afbeeldingen in elk venster. Druk op de knop Nieuwe cellen in elk venster, kies de opgeslagen instellingen in het menu Parameters voor favoriete aanmaak en geef elk venster de opdracht om tot voltooiing te draaien. Herhaal dit zo vaak als nodig is totdat alle monsters zijn geanalyseerd.
    OPMERKING: Als u meerdere exemplaren van Software 3 uitvoert, wordt deze analyse sneller uitgevoerd, maar het aantal vensters dat parallel kan worden uitgevoerd, is afhankelijk van de verwerkingssnelheid van de CPU (Central Processing Unit) en de hoeveelheid RAM waarop de computer waarop de analyse wordt uitgevoerd.
13. Zodra alle voorbeelden zijn voltooid, klikt u op het aangemaakte cellenobject in het linkermenu in elke afbeelding en klikt u op het tabblad Statistieken. Klik op de knop Lijst met zichtbare statistische waarden configureren, deselecteer alle statistieken behalve de waarde 'Celintensiteitsgemiddelde' en druk vervolgens op OK.
14. Voor elke afbeelding die moet worden geanalyseerd, klikt u op de knop Alle statistieken exporteren naar bestand op het tabblad statistieken en slaat u de bestanden op een locatie op.

6. Histoflowcytometrie-analyse en het in kaart brengen van populaties op weefselsecties

1. Open Anaconda en JupyterLab binnen Anaconda. Open vervolgens het script in aanvullend coderingsbestand 1. Voer de code uit met behulp van het menu Uitvoeren en selecteer Alle cellen uitvoeren, of voer de cellen afzonderlijk uit in volgorde door Geselecteerde cellen uitvoeren te selecteren.
2. Wanneer u wordt gevraagd om het bronbestand in te voeren, voert u de bestandsmap in voor de geëxporteerde fluorescerende waarden die in stap 5.14 zijn gegenereerd. De bestandsmap kan worden verkregen door naar de eigenschappen van een van de geëxporteerde .csv bestanden te kijken en het bestandspad naar de prompt te kopiëren.
3. Vervolgens vraagt het programma om een uitvoerlocatie voor de verwerkte bestanden. Voer de bestandsmap in voor elke locatie die geschikt is voor het opslaan van de verwerkte bestanden. Het programma detecteert automatisch het aantal fluorescerende kanalen in de map.
4. Voer het volgende gedeelte van de code uit om de gegevens te annoteren met de namen van elk kanaal. Deze code kan indien nodig worden gewijzigd om de parameter "numberOfChannels" te wijzigen zodat deze overeenkomt met het aantal kanalen dat in stap 6.3 is gedetecteerd. Bovendien kunnen de namen van de kanalen voor zoveel kanalen worden gewijzigd als nodig is door de regel 'ChX':'Marker' zo vaak als nodig te herhalen en door de namen van de markeringen te wijzigen.
5. Als u de volgende regel code uitvoert, wordt er een .csv bestand gemaakt op de opgegeven locatie dat is geannoteerd en alle fluorescerende parameters in de dataset bevat. Herhaal stap 6.1-6.5 voor elke set Software 3-exports om .csv bestanden voor alle gegevens te maken.
6. Converteer de .csv bestanden naar .fcs-bestanden door Software 4 te openen (zie Materiaaltabel) en de .csv bestanden naar het programmavenster te slepen. Software 4 begint automatisch met het converteren van de bestanden naar .fcs-bestanden.
7. Dubbelklik op een van de voorbeelden in Software 4 om een venster op dat voorbeeld te openen. Gebruik de gating-tools in Software 4 om een gating-strategie te maken. Het wordt aanbevolen om te beginnen met het afrasteren van een afstammingsbepalende marker die alle cellen van belang bevat, vervolgens door te gaan naar poorten die eerst zeldzamere subsets verwijderen en vervolgens te eindigen met de meer voorkomende celtypen.
8. Zodra een poortstrategie is vastgesteld, test u de nauwkeurigheid van de poortindeling door met de rechtermuisknop op die populatie in het menu te klikken en exporteren te kiezen. Exporteer alle parameters als een .csv bestand met headers inbegrepen.
9. Open JupyterLab in Anaconda. Open vervolgens het script in Supplementary Coding File 2 en voer de code uit. Wanneer u wordt gevraagd om de locatie van het Software 4-bestand in te voeren, voert u de bestandsmap in voor het geëxporteerde .csv bestand dat in de vorige stap is gegenereerd. De bestandsmap kan worden verkregen door naar de eigenschappen van het geëxporteerde .csv-bestand te kijken en het bestandspad naar de prompt te kopiëren.
10. Wanneer u wordt gevraagd om de uitvoerlocatie toe te voegen, kiest u een bestandsmap naar keuze en zorgt u ervoor dat de bestandsmap de bestandsnaam aan het einde bevat ('bestandsmap'\filename.txt). Voer de rest van de code uit.
11. Kopieer de tekst in het .txt bestand en open het bijbehorende IMS-bestand in Software 3 voor hetzelfde voorbeeld waarop de geëxporteerde gegevens zijn gebaseerd. Klik op het celobject in het bestand, ga naar het tabblad statistieken, plak de tekst in de zoekbalk en start het zoeken. Alle cellen die van belang zijn, worden gemarkeerd.
12. Inspecteer handmatig of alle cellen van belang zijn vastgelegd met behulp van de gating-strategie. Als het aantal cellen wordt onderschat of overschat (voorbeelden weergegeven in figuur 5), ga dan terug naar stap 6.7, pas de poort aan en evalueer opnieuw of de cellen nauwkeurig zijn vastgelegd met de nieuwe poort. Herhaal dit met alle poorten in de poortstrategie en evalueer de poort op meerdere monsters.
13. Wanneer alle poorten zijn gevalideerd, exporteert u gegevens uit Software 4 met behulp van de tabeleditorfunctie en analyseert u de gegevens met behulp van de voorkeursanalysemethode.
    OPMERKING: Celpopulaties kunnen worden teruggebracht naar de weefselsecties in Software 3 door de gated populatie te identificeren zoals in stappen 6.8-6.11 en vervolgens een oppervlak te creëren op basis van de geselecteerde cellen. Dit kan worden gedaan voor elke gated populatie, zoals weergegeven in figuur 6 en figuur 7.

Resultaten

Figuur 1: Histoflow-cytometrie workflow. Weefselsecties worden gekleurd met spectraal overlappende kleurstoffen (stap 1). Beelden worden verzameld met behulp van individuele excitatielasers in combinatie met afstembare banddoorlaatfilters om spectrale doorbloeding tussen fluoroforen te minimaliseren (stap 2). Spectrale doorbloeding tussen kanalen wordt gecorrigeerd op basis van een compensatiematrix die wordt gegenereerd met behulp van weefselcontroles met één kleur (stap 3). Kernen en cellen in afbeeldingen worden vervolgens geïdentificeerd met behulp van ilastik (stap 4) en gesplitst in afzonderlijke cellen in Software 3 (stap 5). Aanvullende parameters worden opgenomen voordat alle gegevens van Software 3 naar Software 4 worden geëxporteerd om flowcytometrie-analyse uit te voeren. Celidentiteiten worden vervolgens geëxporteerd vanuit Software 4 en teruggekoppeld naar de cel-ID's in het oorspronkelijke weefsel om de ruimtelijke lokalisatie van cellen in weefselsecties op te lossen (stap 6). Geldtekens vertegenwoordigen commerciële software die moet worden gekocht, en computertekens vertegenwoordigen gratis software. De geschatte tijd voor elke stap wordt aangegeven naast de zandloper. Commerciële software staat vermeld in de Tabel met Materialen. Deze figuur is een bewerking van Jain et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In figuur 3 werden lymfeklierweefsels gekleurd met een rat anti-muis CD138 antilichaam in combinatie met een donkey anti-rat Dylight 405 secundair antilichaam, Nuclear Yellow, een rat anti-muis CD4 antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488, een rat anti-muis IgD antilichaam geconjugeerd aan PerCP-eF710, een konijn anti-muis Iba1 antilichaam gecombineerd met een Donkey anti-konijn Alexa Fluor 546 secundair antilichaam, een anti-muis CD3ε-antilichaam tegen ratten geconjugeerd aan PE-eF610, een anti-muis B220-antilichaam tegen ratten geconjugeerd met Alexa Fluor 647 en een anti-muis CD45-antilichaam tegen ratten geconjugeerd aan APC-R700. Een violette laser van 405 nm werd gebruikt om de Dylight 405- en Nuclear gele kleurstoffen te stimuleren, en hun emissies werden gedetecteerd in het bereik van respectievelijk 408-438 nm en 460-530 nm. Een groene laser van 488 nm werd gebruikt om de kleurstoffen Alexa Fluor 488 en PerCP-eF710 te stimuleren, en hun emissies werden gedetecteerd in het bereik van respectievelijk 495-545 nm en 682-750 nm. Een geelgroene laser van 552 nm werd gebruikt om de kleurstoffen Alexa Fluor 546 en PE-eF610 te stimuleren, en hun emissies werden gedetecteerd in het bereik van respectievelijk 557-600 nm en 615-652 nm. Een rode laser van 640 nm werd gebruikt om de kleurstoffen Alexa Fluor 647 en APC-R700 te stimuleren, en hun emissies werden gedetecteerd in respectievelijk het bereik van 647-682 nm en 700-750 nm.

Figuur 2: Voorbeelden van slechte en kwalitatieve compensatie. Parels werden gekleurd met een antilichaam geconjugeerd aan PE-eFluor 610 en afgebeeld in de kanalen die overeenkomen met de kanalen PE-eFluor 610 (PE-eF610) en Alexa Fluor 546 (A546). Er werden verschillende gradaties van compensatie toegepast op hetzelfde beeld in het A546-kanaal (10% reductie voor ondercompensatie, 28% reductie voor correcte compensatie en 60% reductie voor overcompensatie) om de doorbloeding van de PE-eF610-fluorofoor te verwijderen, wat resulteerde in verschillende gradaties van scheiding. Om de mate van compensatie beter te visualiseren, wordt een helderdere versie van de doorbloedingsafbeeldingen verstrekt. De gele pijl wijst naar hetzelfde gebied in elke afbeelding dat overeenkomt met een gebied waar er echte kleuring is in het PE-eF610-kanaal. Schaal balken: 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fluorescentiecompensatie met behulp van gekleurde weefselcoupes. (A-C) Lymfeklierweefselsecties werden gekleurd met enkele Abs geconjugeerd aan de vermelde fluoroforen. Niet-gecompenseerde enkelvoudige kleurmonsters werden vervolgens afgebeeld over alle kanalen (A, boven) en compensatie werd toegepast op de enkelkleurige bedieningselementen (A, onder). (B) Het doorbloeden tussen kanalen in (A) werd gekwantificeerd (gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het huidige beeld gedeeld door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het kanaal van de huidige fluorofoor) en gepresenteerd in heatmaps. Witte vierkanten vertegenwoordigen waarden die hoger zijn dan 100% doorbloeding. (C) Spectrale overlap wordt beoordeeld in de niet-gecompenseerde en celgebaseerde compensatieomstandigheden door de spectrale scheiding van Iba1-A546 en CD3-PEeF610 in volledig gekleurde monsters te vergelijken. Schaal balken: 30 μm. Deze figuur is een bewerking van Jain et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door dit protocol te volgen (samengevat in figuur 1) zouden spectraal overlappende fluorescerende kleurstoffen effectief moeten worden gescheiden, zoals weergegeven in figuur 3A,B. Hoewel volledige scheiding van de kleurstoffen misschien niet mogelijk is, zou de scheiding voldoende moeten zijn om verschillende celtypen duidelijk te onderscheiden (figuur 3C). Als er nog steeds schaduwen van spectraal overlappende cellen in een ander kanaal zijn, kan dit erop wijzen dat er nog steeds doorbloeding plaatsvindt en dat de beelden mogelijk opnieuw moeten worden verwerkt (Figuur 2). Bovendien zal overcompensatie duidelijk zijn als het gecompenseerde gebied onder de fluorescentieniveaus daalt die verband houden met achtergrondkleuring en zal verschijnen als zwarte gebieden waar de doorbloeding ooit was (Figuur 2). Overcompensatie kan leiden tot het verlies van het echte signaal in het kanaal waarop compensatie is toegepast en moet worden vermeden. Desalniettemin, als dit protocol correct is gevolgd, zouden er geen problemen moeten zijn met compensatie, en dus zou de onderzoeker moeten overwegen of een schijnbare doorbloeding kunstmatig is of deel uitmaakt van de biologie.

Figuur 4: Voorbeeld van een op ilastik gebaseerde kern en celdetectie. De nucleaire gele kleuring (linksboven) werd gebruikt om kernen te identificeren (rechtsboven in geel) en wat geen kern is (in blauw). Representatieve CD45-kleuring (weergegeven in linksonder) wordt gebruikt om cellen te identificeren (rechtsonder in geel) en wat geen cel is (in blauw). Deze figuur is een bewerking van Jain et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zodra kleurstoffen nauwkeurig zijn gescheiden, is het splitsen van het weefsel in individuele cellen essentieel voor het uitvoeren van analyses van afzonderlijke cellen. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van door de gebruiker gedefinieerde machine learning (Figuur 4) om cellen te scheiden, zelfs als ze dicht op elkaar zijn verdicht, zoals te zien is in de lymfeklieren die worden weergegeven in Figuur 6.

Figuur 5: Beoordelen of een hek correct is afgesteld. Representatieve CD138-kleuring (gekleurd in cyaan) in een lymfeklier wordt getoond en er zijn drie afzonderlijke poorten (de stiplijn aan de linkerkant) gemaakt om CD138^+- cellen in het weefsel te identificeren. Een te conservatieve schatting van CD138^+- cellen wordt weergegeven als de blauwe poort en in het blauw in kaart gebracht op het weefsel. Een evenwichtige schatting van CD138^+- cellen wordt weergegeven als de groene poort en in kaart gebracht op het weefsel in groen. Een overdreven toegeeflijke schatting van CD138^+- cellen wordt weergegeven als de rode poort en in het rood in kaart gebracht op het weefsel. De gele cirkel identificeert een gebied waar CD138^+- cellen niet worden geïdentificeerd door de overdreven conservatieve poort, en de magenta cirkel identificeert een gebied zonder CD138+-cellen, waarvan wordt beweerd dat het CD138^+- cellen bevat door de overdreven toegeeflijke poort. Schaalbalken: 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bij het bepalen van de precieze posities van poorten in de flowcytometrieanalyse (weergegeven in figuur 5) moet ervoor worden gezorgd dat deze poorten de overvloed aan cellen niet overschatten of onderschatten. Dit moet worden bepaald door de cellen terug op het weefsel in kaart te brengen, zoals in figuur 5, om te zien of de cellen die uw markers van interesse uitdrukken, in de analyse worden vastgelegd. Als er te veel cellen worden geselecteerd (bijvoorbeeld cellen die geen CD138 tot expressie brengen, worden geselecteerd als CD138⁺), dan moeten de poorten worden verschoven om minder tolerant te zijn, en als er te weinig cellen worden geselecteerd, moeten de poorten meer toegeeflijk worden gemaakt. Poorten moeten worden geoptimaliseerd voor selectiviteit, zodat de stroomopwaartse poorten eerst worden geoptimaliseerd en vervolgens elke volgende poort in de keten wordt geoptimaliseerd. Uiteindelijk zou een effectieve optimalisatie van een gating-strategie in staat moeten zijn om interessante celsubsets op te lossen (Figuur 6 en Figuur 7).

Figuur 6: Identificatie op basis van flowcytometrie van cellen in weefselsecties. (A) Fluorescerende waarden geëxporteerd van afzonderlijke cellen uit Software 3 in lymfekliersecties werden geanalyseerd in Software 4 om de vermelde celpopulaties te identificeren op basis van de getoonde poortstrategie. (B) Populaties die in Software 4 werden geïdentificeerd, werden teruggebracht naar dezelfde weefselsectie en voor elke populatie werden oppervlakken gegenereerd. De CD45-vlek wordt niet weergegeven. Schaal balk: 30 μm. Deze figuur is een bewerking van Jain et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Uitsplitsing van individuele kleuringen en populaties in lymfeklieren van muizen. Individuele kleuringen voor immuuncelmarkers worden weergegeven in de bovenste panelen en de bijbehorende gated populatie die in figuur 6A is geïdentificeerd, wordt onder elke afzonderlijke kleuring weergegeven. Schaalbalk: 30 μm, weergegeven in het paneel linksboven. Deze figuur is een bewerking van Jain et ^al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze techniek is eerder^{gebruikt 18} om infiltraten van immuuncellen in ruggenmerg te karakteriseren tijdens neuro-inflammatie en gevalideerd dat equivalente hoeveelheden infiltrerende immuuncellen worden gevonden met behulp van histoflowcytometrie en flowcytometrie. De techniek is ook gevalideerd, wat aantoont dat het werkt in milten en hersenen van muizen en verschillen kan identificeren tussen behandelingsomstandigheden, die werden gereproduceerd in identieke flowcytometrie-experimenten (niet gepubliceerd). Deze techniek is ook gebruikt om het ruggenmerg te analyseren van muizen die stereotactische injecties van de CZS-modellen kregen.

Figuur 8: Scheiding van 8 kleurstoffen in een menselijke amandelsectie. Menselijke amandelsecties werden gekleurd met CD20 om B-cellen te identificeren en IgM, IgA en IgG om plasmacellen te identificeren. Blimp1- en CD38-kleuringen werden opgenomen om de identiteit van plasmacellen verder te valideren, en Ki67 om prolifererende cellen te identificeren. De nucleaire gele vlek wordt niet weergegeven in de gecombineerde afbeelding. Schaalbalk: 22 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze techniek kan ook worden toegepast om secties van menselijk weefsel te analyseren. Als voorbeeld van kleuring in menselijke weefsels werden menselijke amandelsecties gekleurd met een selectie van 8 markers: een geit anti-humaan IgM-antilichaam geconjugeerd aan Dylight 405, Nuclear Yellow, een geit anti-humaan IgA-antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488, een muis anti-humaan CD20-antilichaam gecombineerd met een geit anti-muis F(ab')2-fragment geconjugeerd aan PerCP-eFluor 710, een anti-humaan IgG van geiten geconjugeerd aan Cy3, een anti-humaan Ki67-antilichaam van een konijn geconjugeerd aan een anti-konijnantilichaam van geiten geconjugeerd aan PE-Alexa Fluor 610, een anti-humaan Blimp1-antilichaam van ratten gecombineerd met een anti-ratantilichaam van een ezel geconjugeerd aan Alexa Fluor 647, en een anti-humaan CD38-antilichaam van muizen geconjugeerd aan APC-R700. Na compensatie is de scheiding van deze markers in het amandelgedeelte te zien (figuur 8). Dit toont het nut van deze techniek aan in verschillende weefsels en soorten.

Naam van de oplossing	Compositie		Hoe te maken
Buffer blokkeren	10% paardenserum, 1% BSA en 0.1% koude viskleurgelatine in PBS		Voeg 5 ml paardenserum, 0,5 g BSA, 50 μl koude viskleurgelatine toe aan 45 ml PBS. Doe deze oplossing in buisjes van 15 ml en bewaar ze bij -20 °C tot ze nodig zijn.
Permanent en blokkeerbuffer	10% Paardenserum, 1% BSA, 0,1% koude visvlekgelatine, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween-20 in PBS		Voeg 5 ml paardenserum, 0,5 g BSA, 50 μl koude viskleurgelatine, 50 μl Triton X-100 en 25 μl Tween-20 tot 45 ml PBS toe. Doe deze oplossing in buisjes van 15 ml en bewaar ze bij -20 °C tot ze nodig zijn.
Permanent en vlekkenbuffer	1% BSA, 0,1% koude gelatine van visvlekken, 0,5% Triton X-100 in PBS		Voeg 0,5 g BSA, 50 μL koude viskleurgelatine en 250 μL Triton X-100 toe aan 50 ml PBS. Doe deze oplossing in buisjes van 15 ml en bewaar ze bij -20 °C tot ze nodig zijn.
Buffer voor blussen	5% Trueblack, 66,5% ethanol, 28,5% water		Verwarm de Trueblack-oplossing voor op 70 °C gedurende 5 min. Voeg vervolgens 50 μL Trueblack toe aan 950 μL 70% ethanol om de Trueblack-buffer te maken. Maak dit elke keer vers. U heeft ~500 μL per glaasje nodig, hoewel de specifieke hoeveelheden afhangen van de aard van uw weefsels.
Buffer voor vlekken	1% BSA en 0,1% koude vis vlekken gelatine in PBS		Voeg 0,5 g BSA en 50 μL koude viskleurgelatine toe aan 50 ml PBS. Doe deze oplossing in buisjes van 15 ml en bewaar ze bij -20 °C tot ze nodig zijn.

Tabel 1: Een lijst van de oplossingen en hun samenstellingen die nodig zijn voor het kleuren van weefselcoupes.

Aanvullend coderingsbestand 1: Een Python-script dat de fluorescentiewaarden van elk kanaal verzamelt en één overzichtsbestand maakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: Een Python-script dat een lijst maakt van alle ID-nummers van gated cells in een tekstbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier wordt het gebruik van histoflowcytometrie beschreven, een techniek die eerder is gevalideerd¹⁸. Het is aangetoond dat bij het kleuren van weefselsecties met spectraal overlappende kleurstoffen, die doorbloeding over kanalen kan worden verwijderd met behulp van spectrale compensatie, wat resulteert in een groter aantal fluorescerende parameters die duidelijk worden opgelost dan normaal mogelijk zou zijn met conventionele methoden. Omdat histologiebeelden met een hoge parameter moeilijk te analyseren zijn met conventionele methoden, wordt een analysepijplijn geleverd om individuele cellen uit deze beelden te segmenteren. Door de fluorescerende handtekeningen van deze individuele cellen te exporteren, wordt aangetoond dat eencellige analyses zoals die worden uitgevoerd in flowcytometrie op dezelfde manier kunnen worden toegepast op histologiebeelden. Terwijl flowcytometrie geen ruimtelijke analyse omvat, is aangetoond dat histoflowcytometrie populaties die zijn geïdentificeerd door poortstrategieën terug te brengen naar weefselsecties om hun ruimtelijke lokalisatie te evalueren. Over het algemeen is aangetoond dat histoflowcytometrie de sterke punten van flowcytometrie en histologie combineert.

Hoewel histoflowcytometrie het voordeel heeft dat ruimtelijke informatie behouden blijft, heeft het ook veel van dezelfde beperkingen als conventionele histologie. Hoewel flowcytometrie geweldig is voor het kwantificeren van cellen in een heel weefsel, wordt histologie meestal uitgevoerd door een klein monster van weefselsecties te analyseren die als representatief voor het weefsel worden beschouwd. Om histologie het aantal cellen in een weefsel nauwkeurig te kwantificeren, zou men elk weefselplakje uit het weefsel moeten afbeelden en het aantal cellen in elk moeten kwantificeren, wat onpraktisch zou zijn. Een ander probleem is dat sommige cellen in tweeën worden gesplitst tijdens het doorsnijden van het weefsel, en er is geen manier om deze cellen te reconstrueren. Een beperking van het hier genoemde protocol is inderdaad dat het geen methoden bevat om cellen aan de randen van het weefsel uit te sluiten. Ondanks deze beperkingen is een voordeel van histoflowcytometrie ten opzichte van flowcytometrie dat het niet nodig is om weefsels te dissociëren in eencellige suspensies, wat vooroordelen kan introduceren in de populaties die geïsoleerd zijn of onvoldoende worden vastgelegd²². Hoewel histoflowcytometrie dus verschillende voordelen heeft ten opzichte van conventionele flowcytometrie, zal het verkrijgen van metingen over het hele weefsel een uitdaging blijven.

Hier wordt aangetoond dat acht spectraal overlappende fluorescerende parameters kunnen worden gescheiden; Anderen hebben echter met succes 13 fluorescerende kleurstoffen gescheiden¹⁷. Het aantal kleurstoffen dat kan worden gescheiden, is afhankelijk van de eigenschappen van de microscoop waarin de gegevens worden verzameld. Fluorescerende kleurstoffen verschillen wat betreft hun optimale excitatiegolflengten en in hun meest voorkomende emissiegolflengten. Microscopen die gebruik maken van deze eigenschappen door een breed scala aan excitatiegolflengten te gebruiken om nauwkeuriger overeen te komen met de optimale excitatiegolflengten van fluoroforen en door de emissiedetectoren af te stemmen op de meest uitgezonden golflengten, zullen de scheiding van fluorescerende kleurstoffen maximaliseren. Het minimaliseren van spectrale overlap is essentieel voor het genereren van gegevens van hoge kwaliteit, aangezien het compenseren van doorbloeding over kanalen mogelijk het dynamische detectiebereik van de fluoroforen die met elkaar interageren kan beïnvloeden, en daarom is scheiding op basis van emissie en excitatie een cruciale eerste stap bij het scheiden van fluoroforen. Afhankelijk van de eigenschappen van uw microscoop en het aantal fluorescerende parameters dat moet worden afgebeeld, kan het nodig zijn om meerdere fluoroforen die dezelfde excitatiegolflengten delen, maar verschillen in hun emissiegolflengten, op dezelfde laserlijnen te plaatsen. Dit wordt meestal bereikt door het gebruik van basisfluorescerende kleurstoffen in combinatie met geconjugeerde fluorescerende kleurstoffen, waarbij de geconjugeerde kleurstoffen op langere golflengten uitzenden en dus kunnen worden onderscheiden op basis van hun emissiegolflengten. Over het algemeen moeten kleurstoffen worden onderscheiden door hun excitatie- of emissiefrequenties voor een effectieve scheiding.

Het verkrijgen van een perfecte vergoeding wordt bemoeilijkt door verschillende factoren, waaronder het ruimtelijke aspect van de compensatie. Ten eerste, of een fluorofoor een foton uitzendt, is gedeeltelijk gebaseerd op toeval²³, waarbij de verzamelde fotonen in elk beeld zijn vertekend in de richting van locaties met dichte kleuring. Minder dicht gekleurde gebieden kunnen echter bij toeval een foton uitzenden dat in een van de overlappende kanalen verschijnt, maar niet in het hoofdkanaal. Aangezien compensatie per voxel wordt toegepast, wordt de spectrale overlap tijdens de compensatie niet verwijderd vanwege een gebrek aan ruimtelijke colokalisatie. Dit is te zien in figuur 2, waar compensatie ertoe leidt dat de locaties van dichte kleuring worden verminderd (de randen van de kralen), maar niet het midden van de kralen, waar er minimale kleuring is en een slechte overlap met de kanalen met doorbloeding. Deze kleuring in het midden van de kralen is waarschijnlijk te wijten aan een ander probleem dat de compensatie kan beïnvloeden, namelijk dat fotonen die buiten het brandpuntsvlak worden geproduceerd, kunnen verschijnen in voxels in het brandpuntsvlak die waarschijnlijk niet worden gereproduceerd in zowel het hoofdkanaal als het kanaal dat moet worden gecompenseerd²⁴. Als gevolg hiervan zal deze 'ruis' niet effectief worden verwijderd door compensatie zonder overcompensatie te introduceren. Deze problemen kunnen gedeeltelijk worden aangepakt door een lijngemiddelde te gebruiken, de fluorescerende waarden van een enkele voxel meerdere keren te meten en het gemiddelde te gebruiken om de impact van willekeurige toevallige gebeurtenissen te beperken. Bij gebruik van een confocale microscoop kan de grootte van de gaatjes ook worden verkleind om te voorkomen dat onscherpe fotonen in de beelden worden opgenomen^25,26. Het gebruik van deze oplossingen gaat ten koste van extra beeldvormingsverwervingstijden, die uitgebreid kunnen worden.

Hoewel deze techniek is ontwikkeld met behulp van beelden van een confocale microscoop, werkt deze met andere soorten microscopen. Anderen die soortgelijke methoden gebruiken, hebben deze methoden met groot succes toegepast op beelden die zijn genomen met twee-fotonmicroscopen¹⁷ . Hoewel deze techniek kan worden toegepast op beelden die zijn gemaakt met breedveldmicroscopen, zijn er verschillende voordelen verbonden aan confocale microscopen die beter kunnen bepalen of een foton afkomstig is van het brandpuntsvlak. Aangezien een nauwkeurige resolutie van de locatie van fotonen (d.w.z. optische doorsnede) de kwaliteit van de compensatie verbetert, wordt verwacht dat de kwaliteit van de compensatie relatief slecht zal zijn. Dit kan mogelijk worden aangepakt door deconvolutie te gebruiken om onscherpe fotonen te verwijderen om de resolutie van de breedveldbeelden te verbeteren²⁷. Een belangrijk voorbehoud dat zal bepalen of deconvolutie compatibel is met dit protocol, is of de fluorescentiewaarden in elk kanaal evenredig blijven met elkaar over alle geanalyseerde beelden. Als de fluorescentiewaarden na deconvolutie willekeurig worden, is het onwaarschijnlijk dat dezelfde compensatiematrix die op het ene beeld is gegenereerd, met succes op andere afbeeldingen kan worden toegepast. Over het algemeen is de belangrijkste factor die bepaalt of een microscoop deze workflow kan gebruiken, of die microscoop detectoren heeft waarvan het detectiebereik flexibel kan worden afgestemd. Als dit beschikbaar is, kunnen meerdere fluoroforen die door dezelfde excitatie worden gestimuleerd, worden opgelost door de detectie van hun emissiespectra binnen verschillende detectievensters.

Het aantal fluorescerende parameters kan nog verder worden verhoogd in combinatie met technieken om hetzelfde weefsel meerdere keren¹³ keer serieel te kleuren, zoals IBEX^14,15. Met behulp van seriële kleuring kan een effectief onbeperkt aantal parameters worden gemeten; Dit kan echter erg tijdrovend zijn. Door gebruik te maken van een combinatie van de hier besproken compensatiemethoden en seriële kleuring kan de tijd die nodig is om deze foto's te maken aanzienlijk worden verkort, omdat er voor elke kleuringsronde meer kanalen tegelijk kunnen worden afgebeeld. De hier beschreven analysepijplijn zal worden geschaald voor zoveel markers als gewenst en compatibel zijn met serieel gekleurde weefselsecties.

Een cruciale stap in deze analysepijplijn is de segmentatie van afzonderlijke cellen uit histologiebeelden. Het vinden van effectieve strategieën om cellen uit histologiebeelden nauwkeurig te segmenteren is een veelvoorkomend probleem²⁸, en er worden voortdurend nieuwere methoden ontwikkeld. Hoewel deze methode afzonderlijke cellen effectief kan scheiden van dicht opeengepakte cellen, zijn de exacte grenzen van de cellen vaak onvolmaakt. Het wordt daarom aanbevolen dat gebruikers de analyse beperken tot alleen de populaties cellen waarin ze geïnteresseerd zijn, want hoe minder cellen moeten worden gescheiden, hoe nauwkeuriger de celgrenzen zullen zijn. Gebruikers kunnen ook een betere scheiding van cellen bereiken door meerdere populaties in ilastik te definiëren, waardoor het programma verschillende celpopulaties kan segmenteren. Een probleem met deze benadering is echter dat cellen die op deze manier zijn gedefinieerd, niet kunnen worden gecombineerd tot hetzelfde 'cel'-object in Software 3 en mogelijk kunnen leiden tot dubbeltelling van cellen. Desalniettemin, als nauwkeurigere celgrenzen van cruciaal belang zijn voor een experiment, kan deze benadering worden gebruikt. Het wordt aangemoedigd dat gebruikers experimenteren met nieuwere segmentatiealgoritmen naarmate ze worden ontwikkeld en deze in deze pijplijn opnemen voor nog betere resultaten.

Er kunnen zich verschillende problemen voordoen bij het ontwikkelen van een nieuw histoflowcytometriepaneel. Ten eerste is het van cruciaal belang dat verschillende fluorescerende markers ongeveer dezelfde hoeveelheden fluorescentie produceren. Als de ene fluorofoor veel helderder is dan de andere, kan dit problematisch zijn als deze fluorofoor in een andere fluorofoor bloedt, omdat de doorbloeding de echte kleuring in dat kanaal kan inhalen. Dit is te zien in figuur 3, waar Alexa Fluor 546 ernstig overgaat in PE-eFluor 610. Hoewel compensatie deze doorbloeding nog steeds kan verwijderen, zal er vaak nog steeds wat aanhoudende fluorescentie zijn omdat onscherp licht niet wordt verwijderd, waardoor de compensatie onvolledig kan worden. Bovendien hebben de meeste detectoren die op microscopen worden gebruikt geen uitgebreid dynamisch bereik zoals die op flowcytometers. Als gevolg hiervan, naarmate de doorbloeding in een kanaal toeneemt, zal een groter deel van het dynamische bereik in die detector verzadigd zijn met signalen van andere fluoroforen en minder van de fluorofoor van belang. Wanneer de compensatie van zo'n kanaal met uitgebreide bleed-through wordt verwijderd, kan het echte signaal worden opgelost; Het verschil tussen cellen die positief zijn voor die marker en cellen die negatief zijn voor die marker zal echter kleiner worden en kan resulteren in een onvermogen om tussenliggende toestanden op te lossen of mogelijk zelfs positieven van negatieven op te lossen. Overlap tussen kanalen moet dus worden vermeden. Ten tweede kan de helderheid van markers veranderen tussen verschillende weefsels. Een paneel met markers dat bijvoorbeeld op lymfeklieren werkt, werkt mogelijk niet meer wanneer het op de milt of het centrale zenuwstelsel wordt gebruikt, omdat een marker te helder of te zwak kan worden, waardoor dat kanaal te veel in andere kanalen bloedt of overweldigd raakt door het doorbloeden van andere kanalen. In een dergelijk geval kan het nodig zijn om de fluoroforen op markers te schakelen of het gebruik van primaire geconjugeerde antilichamen over te schakelen op het gebruik van secundaire antilichamen. Ten slotte kan het waardevol zijn om te profiteren van verschillen in de lokalisatie van markers wanneer er te veel overlap is tussen kanalen. Als twee kanalen elkaar zwaar overlappen, maar de ene is een nucleaire marker en de andere is een celoppervlaktemarker, dan zal de spectrale overlap elkaar minimaal beïnvloeden omdat compensatie geen invloed heeft op dezelfde voxels. Indien mogelijk moeten panelen zo worden ontworpen dat overlappende kanalen verschillen in hun lokalisatie of dat de markers op afzonderlijke cellen tot uitdrukking komen.

Over het algemeen is aangetoond dat histoflowcytometrie een veelzijdige techniek is om histologiebeelden op celniveau te analyseren. Terwijl oudere technieken kunnen worden beperkt tot de analyse van cellen die niet in direct contact staan met cellen, kan deze analysepijplijn cellen in contact scheiden, waardoor het geschikt is voor de studie van cellen in weefsels in homeostase of tijdens ontsteking wanneer immuuncellen clusteren op plaatsen van schade.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100% Ethanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Electron Microscopy Sciences	157-4
Anaconda	N/A	N/A	https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4503-50G
Cold fish stain gelatin	Sigma	G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	1:300 concentratie
Donkey anti-rat DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	1:200 concentratie
Donkey Serum	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	1:25 concentratie
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Fluorescence spectraviewer			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Fresh frozen human tonsil sections	amsbio	HF-707
Glass coverslip	VWR	48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	1:400 concentratie
Goat anti-human IgG Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	1:400 concentratie
Goat anti-human IgM Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	1:300 concentratie
Goat anti-rabbit A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	1:250 concentratie
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	1:250 concentratie
Horse Serum	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A	https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter	Oxford Instruments		Software 2
Imaris with cell module	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX Life Science software	Leica		Software 1
Mouse anti-human CD20	VWR	CA95024-322	1:40 concentratie
Mouse anti-human CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20 concentratie
Normal Goat Serum	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Normal Mouse Serum	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Normal Rabbit Serum	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Normal Rat Serum	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Oplossen in DMSO bij een concentratie van 2 mg/ml en bewaar bij 4°C in het donker
PAP pen	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Rabbit anti-human Ki67	Abcam	ab15580	1:500 concentratie
Rabbit anti-mouse Iba1	Wako	019-19741	1:500 concentratie
Rat anti-human Blimp1	Thermofisher	14-5963-82	1:40 concentratie
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	1:250 concentratie
Rat anti-mouse CD138	Biolegend	142502	1:200 concentratie
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40 concentratie
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	1:200 concentratie
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700	BD Biosciences	565478	1:50 concentratie
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	1:50 concentratie
SP8 Confocal microscope	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42