Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Profilering van luminale pH in driedimensionale gastro-intestinale organoïden met behulp van micro-elektroden

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66900

⸱

5 juli 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology & Cell Biology, Montana State University, 2Department of Physics, Boston University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft pH-metingen in van menselijk weefsel afgeleide maagorganoïden met behulp van micro-elektroden voor spatiotemporele karakterisering van intraluminale fysiologie.

Samenvatting

De optimalisatie en gedetailleerde karakterisering van gastro-intestinale organoïdemodellen vereisen geavanceerde methoden voor het analyseren van hun luminale omgevingen. Dit artikel presenteert een zeer reproduceerbare methode voor de nauwkeurige meting van de pH in het lumina van 3D menselijke maagorganoïden via micromanipulatorgestuurde micro-elektroden. De pH-micro-elektroden zijn in de handel verkrijgbaar en bestaan uit afgeschuinde glazen punten met een diameter van 25 μm. Voor metingen wordt de pH-micro-elektrode naar voren geschoven in het lumen van een organoïde (>200 μm) die in Matrigel is gesuspendeerd, terwijl een referentie-elektrode ondergedompeld is in het omringende medium in de kweekplaat.

Met behulp van dergelijke micro-elektroden om organoïden afkomstig van het menselijk maaglichaam te profileren, tonen we aan dat de luminale pH relatief consistent is binnen elke kweekput van ~7,7 ± 0,037 en dat continue metingen kunnen worden verkregen gedurende minimaal 15 minuten. Bij sommige grotere organoïden toonden de metingen een pH-gradiënt tussen het epitheeloppervlak en het lumen, wat suggereert dat pH-metingen in organoïden kunnen worden bereikt met een hoge ruimtelijke resolutie. In een eerdere studie werden micro-elektroden met succes gebruikt om luminale zuurstofconcentraties in organoïden te meten, wat de veelzijdigheid van deze methode voor organoïde-analyses aantoont. Samenvattend beschrijft dit protocol een belangrijk hulpmiddel voor de functionele karakterisering van de complexe luminale ruimte binnen 3D-organoïden.

Inleiding

Organoïden - miniatuur meercellige structuren afgeleid van stamcellen - hebben een revolutie teweeggebracht in ons vermogen om de menselijke fysiologie te bestuderen en beginnen diermodellen te vervangen, zelfs inregelgevende omgevingen. Sinds de eerste beschrijving van darmorganoïden door Sato et al. in 2009 is organoïdetechnologie immens populair geworden2. Een groot aantal studies heeft de cellulaire samenstelling en functie van organoïdemodellen tot in detail gekarakteriseerd 3,4,5,6. De luminale ruimte van deze 3D meercellige structuren blijft echter grotendeels ongedefinieerd 7,8. Het lumen is de centrale holte van organoïden afkomstig van slijmvliesweefsels die wordt omgeven door de apicale delen van gepolariseerde epitheelcellen. Aangezien cellulaire secretie en absorptie voornamelijk plaatsvinden aan het apicale epitheeloppervlak, wordt de luminale micro-omgeving van organoïden gecontroleerd door deze belangrijke fysiologische processen. De momenteel gebruikte organoïdemodellen tonen variaties in celsignaleringspatronen, algehele stamheid, metabolietconcentratiegradiënten en omgevingsomstandigheden9. Het begrijpen van de organoïde luminale fysiologie is daarom noodzakelijk voor de nauwkeurige modellering van orgaanfunctie en pathologie. Helaas belemmert de relatieve ontoegankelijkheid van het lumen de functionele analyses van de luminale fysiologie in 3D-organoïdenaanzienlijk 10.

Het vermogen om pH-profielen te onderzoeken is vooral belangrijk in de maag, die berucht is vanwege de steilste protongradiënt in het lichaam, variërend van ongeveer 1-3 in het lumen tot bijna neutraal bij het epitheel 11,12,13. Er blijft een aanzienlijke kloof in ons begrip van het behoud van de pH-gradiënt van de maag op microschaal, en de relevantie van organoïde modellen bij het recapituleren van dit dynamische milieu over de maagslijmlaag. Traditionele benaderingen voor de analyse van de pH van organoïden omvatten het gebruik van pH-gevoelige kleurstoffen, die fluorescerende of colorimetrische indicatoren kunnen zijn. McCracken et al. gebruikten een luminale injectie van SNARF-5F-een ratiometrische pH-indicator in organoïden om een daling van de luminale pH te analyseren als reactie op histaminebehandeling. Dergelijke kleurstoffen kunnen worden opgenomen in de kweekmedia, waardoor real-time, niet-invasieve monitoring van de pH mogelijk is. Niet alleen vereisen pH-gevoelige kleurstoffen complexe kalibratiestappen die bijdragen aan een slechte betrouwbaarheid en nauwkeurigheid bij metingen, maar dergelijke kleurstoffen hebben ook de neiging om binnen specifieke detectiebereiken te werken die mogelijk niet representatief zijn voor het volledige pH-bereik binnen de micro-omgeving van belang14,15. Het kan echter als redelijk worden beschouwd om indicatorkleurstoffen te gebruiken voor bevestigende experimenten. Er zijn ook optische nanosensoren ontwikkeld die gebruik maken van op fluorescerende optode gebaseerde, pH-gevoelige benaderingen; Dergelijke detectietechnieken vereisen echter microscopische beeldvorming en zijn ook vatbaar voor fotobleken, fototoxiciteit en beeldvormingsbias16,17. Daarnaast hebben Brooks et al. 3D-geprinte multiwell-platen met micro-elektroden waarop organoïden kunnen worden geplateerd18. Deze benadering maakt het echter niet mogelijk om metingen direct in het organoïde lumen te doen.

Op elektroden gebaseerde pH-metingen kunnen een verbeterde nauwkeurigheid bereiken in vergelijking met andere methoden, en bieden ook real-time pH-monitoring. Bovendien zorgen pH-elektroden die op micromanipulatoren zijn gemonteerd voor een superieure ruimtelijke resolutie van pH-metingen, omdat de precieze locatie van de elektrodepunt nauwkeurig kan worden geregeld. Dit maakt de hoogst mogelijke flexibiliteit en reproduceerbaarheid mogelijk bij de analyses van organoïde modellen. De hier gebruikte elektroden zijn geminiaturiseerde pH-micro-elektroden die werken op basis van de diffusie van protonen door selectief pH-glas dat een dunne platinadraad omringt. De micro-elektrode wordt aangesloten op een externe Ag-AgCl-referentie-elektrode en vervolgens op een millivoltmeter met hoge impedantie. De elektrische potentiaal tussen de twee elektrodepunten wanneer ze in dezelfde oplossing worden ondergedompeld, weerspiegelt de pH van de oplossing19. Dergelijke microprofileringssystemen zijn gebruikt in de metabole analyse van biofilms20,21, planktonalgen22, menselijke sputummonsters23 en zelfs in mesenchymale stamcelsferoïden24. Zowel ons laboratorium als Murphy et al. hebben eerder micromanipulator-gestuurde O 2-micro-elektroden gebruikt om de zuurstofconcentraties in de luminale ruimtes van organoïden te evalueren. Murphy et al. combineerden deze methode met wiskundige modellering om een zuurstofgradiënt in hun sferoïden te onthullen. Onze groep was in staat om verlaagde luminale zuurstofniveaus te vinden in van weefsel afgeleide maagorganoïden in vergelijking met de omringende extracellulaire matrix25.

Hier bieden we een gedetailleerde methode voor de handmatige micro-elektrodeprofilering van de luminale pH in organoïden van het sferische maagdarmkanaal die een beter fysiologisch begrip van hun complexe luminale micro-omgeving mogelijk zal maken. We verwachten dat deze techniek een nieuwe dimensie zal toevoegen aan de exploratie van organoïde fysiologie door middel van real-time, hoge-resolutie metingen van pH-waarden op microschaal. Bovendien kan het volgende protocol gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van O2, N2O, H2, NO, H2S, redox en temperatuur in verschillende soorten organoïde modellen. Fysiologische profilering dient als een waardevol hulpmiddel voor het optimaliseren van organoïde kweekomstandigheden om in vivo omgevingen beter na te bootsen, waardoor de relevantie en bruikbaarheid van organoïde modellen in biomedisch onderzoek wordt vergroot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol vereist 3D-organoïden met een diameter van ten minste 200 μm die een duidelijk lumen hebben en die zijn ingebed in een kunstmatige extracellulaire matrix (ECM, bijv. Matrigel). Menselijk maagweefsel voor organoïde-afleiding werd verkregen met goedkeuring van de Institutional Review Board van de Montana State University en geïnformeerde toestemming van patiënten die een bovenste endoscopie ondergingen bij Bozeman Health (protocol # 2023-48-FCR, naar DB) of als vrijgestelde gastrectomiemonsters van de hele maag of mouw van de National Disease Research Interchange (protocol #DB062615-EX). Informatie over de organoïde lijnen en passagenummers die voor dit onderzoek zijn gebruikt, is te vinden in Tabel 1 en de samenstelling van de media is vermeld in Tabel 2. Raadpleeg eerder gepubliceerde protocollen voor het genereren en onderhouden van gastro-intestinale organoïdelijnen 6,26,27.

1. Bereiding van menselijke maagorganoïden voor pH-profilering

  1. Initiëren en onderhouden van maagorganoïdeculturen met behulp van standaardprotocollen. Bewaar organoïden op platen met 24 putjes in 500 μl expansiemedia per putje (tabel 2). Passage vestigde elke 5-7 dagen organoïdelijnen en werd overgebracht naar een schaal met glazen bodem van 35 mm ter voorbereiding op pH-profileringsexperimenten.
    OPMERKING: Organoïde culturen voor onze experimenten zijn afgeleid van maagklierpreparaten, die worden verkregen uit volwassen weefsel zoals hierboven beschreven. We gebruiken een collagenaseweefselvergistingsmethode om deze klieren te isoleren voordat ze in ECM worden gesuspendeerd, zoals eerder beschreven 25,28,29.
  2. Selecteer uit actief groeiende organoïdeculturen in de passages 1-15 putjes die ten minste 100 organoïden (ongeveer 2 miljoen cellen) bevatten met een diameter tussen 200 en 700 μm voor overdracht en expansie op petrischalen van 3,5 mm.
  3. Terwijl u organoïden klaarmaakt voor het uitplateren (stappen 1.4-1.8), laat u de extracellulaire matrix (ECM) aliquot(s) gedurende ten minste 45 minuten op ijs ontdooien. Houd ECM gedurende dit protocol op ijs om gelatie te voorkomen. Verwarm de celkweekplaten voor door ze in een incubator van 37 °C, 5% CO2 te plaatsen.
  4. Verwijder het medium uit de putjes en oogst de maagorganoïdeculturen door ijskoud PBS op elke ECM-druppel te pipetteren en de gel te krabben met de punt van een P1000-pipet. Pipeteer de PBS met de ECM-fragmenten die organoïden bevatten in een conisch buisje van 15 ml.
  5. Centrifugeer de buis bij 200 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten. ECM-fragmenten die de organoïden bevatten, zullen zichtbaar zijn als een laag op de bodem van de buis. Zuig het supernatans en pipetteer voorzichtig 350 μl 0,25% trypsine-EDTA in elk buisje en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer de buizen in een waterbad van 37 °C gedurende 2-5 minuten.
  6. Voeg na incubatie met trypsine-EDTA 600 μL ijskoude DMEM met penicilline/streptomycine toe aan elk buisje en pipetteer krachtig op en neer ten minste 40x. Centrifugeer bij 200 × g bij 4 °C gedurende 5 min. Aspireer de supernatant. Om culturen voor pH-metingen op te zetten, resuspendeert u de celpellet in ijskoude, vloeibare ECM in een verhouding van 1:4 v/v van organoïde pellet tot ECM voor plating.
  7. Plak voor elk monster 40 μl vloeibare ECM met organoïden/organoïdefragmenten in een dunne horizontale lijn langs de diameter van een schaaltje met glazen bodem van 35 mm.
    OPMERKING: Door de gel in een lijn in plaats van een ronde druppel op de plaat te doseren, kunnen de individuele organoïden gemakkelijker worden bereikt door de cultuur uit te dunnen.
  8. Laat de gel 15-30 minuten polymeriseren; Voeg vervolgens voorzichtig 2 ml organoïde expansiemedia toe aan de plaat door langs de rand van het putje te pipetteren om te voorkomen dat de gel wordt verstoord.
  9. Vervang de media om de dag. Geef 4-8 dagen de tijd om minimaal 10 organoïden uit te laten groeien tot een minimale diameter van 400 μm.
  10. Om door te gaan met een pH-profileringsexperiment, moet u ervoor zorgen dat elke cultuur ten minste 10 organoïden bevat die aan de volgende criteria voldoen: >200 μm diameter, gezond uiterlijk (weinig tot geen donker materiaal zichtbaar in organoïden waargenomen met een helderveldmicroscoop) en niet overvol met andere organoïden.

2. Uitpakken en kalibreren van micro-elektroden

OPMERKING: Om metingen op microschaal mogelijk te maken, wordt naast de micro-elektrode van de pH-sensor een aparte referentie-elektrode gebruikt in plaats van een geïntegreerd (en dus omvangrijker) ontwerp. Zowel de pH-micro-elektrode als de referentie-elektrode moeten nat worden bewaard. Stel niet langer dan 10 minuten per keer bloot aan lucht. Bepaal de juiste tipmaat voor de toepassing. Hier gebruikten we een potentiometrische pH-micro-elektrode met een afgeschuinde tipdiameter van 25 μm.

  1. Met de micro-elektrode nog in de beschermbuis, inspecteert u de punt visueel op eventuele schade.
  2. Sluit de referentie-elektrode via de connector aan op de pH-elektrodekabel. Sluit vervolgens de micro-elektrode aan op de amplifier en de amplifier op een geaarde pc met de software via een USB-kabel (Figuur 1A).
  3. Vul twee conische buizen van 50 ml 2/3 met 70% ethanol en gedeïoniseerd H2O (diH2O). Plaats de micro-elektrode en de referentie-elektrode in de diH2O-buis en zorg ervoor dat beide uiteinden ten minste 1 cm in de vloeistof zijn ondergedompeld.
    OPMERKING: Hoge bekers kunnen ook voor deze en soortgelijke stappen worden gebruikt.
  4. Laat de elektroden ~10 minuten in evenwicht zijn.
    OPMERKING: De procedure kan bij deze stap ook worden onderbroken en later worden hervat, aangezien de elektroden in diH2O kunnen worden bewaard.
  5. Terwijl de elektroden in evenwicht zijn, opent u de software (rood pictogram) op het computerwerkstation. Zorg er op het tabblad Instellingen voor dat het vakje naast de micro-elektrode is aangevinkt om aan te geven dat deze correct is aangesloten en wordt herkend door de software. Klik op Experiment starten in de linkerbovenhoek van het venster en voer de gewenste bestandsnaam en bestemming in. Klik in het venster Instellingen voor sensorkalibratie en experiment op Alle punten wissen om de software voor te bereiden op een nieuwe kalibratie.
  6. Vul twee conische buisjes van 50 ml 2/3 met kalibratiebuffers van pH 4,01 en pH 9,21. Dep de beschermende slang en de referentie-elektrode voorzichtig droog met een delicaat laboratoriumdoekje.
  7. Begin met de elektroden in de pH 4.01-buffer en voer 4.01 in als de bekende pH-waarde. Zodra de mV-meting is gestabiliseerd, selecteert u punt toevoegen. Controleer of het signaal stabiel is op ~380 mV. Nadat de punt is toegevoegd, plaatst u beide elektroden terug in diH2O om af te spoelen en dept u ze vervolgens weer droog.
  8. Herhaal de vorige stap met de 9.21 buffer en klik op punt toevoegen als het signaal stabiel is (~83 mV). Controleer of de micro-elektroden lineair reageren tussen pH 4,01 en 9,21; Daarom is alleen een tweepunts kalibratiecurve nodig. Zorg ervoor dat de resulterende lijn tussen deze punten een negatieve helling heeft van 50-70 mV/pH-eenheid. Klik op Opslaan en kalibratie gebruiken.
    NOTITIE: U bent nu klaar om te beginnen met het opnemen van metingen30.

3. pH-profilering van menselijke maagorganoïden

OPMERKING: Het volgende protocol wordt beschreven voor een rechtshandige gebruiker. LET OP: Schakel alle energiebesparende opties op uw pc uit, aangezien lopende metingen worden onderbroken als de pc in de slaapstand gaat.

  1. Monteer een ringstandaard met een klem aan de linkerkant van een stereomicroscoop om de referentie-elektrode vast te houden. Plaats een micromanipulator die aan een zware laboratoriumstandaard is bevestigd aan de rechterkant van de microscoop (Figuur 1A).
  2. Verwijder de micro-elektrode voorzichtig uit de beschermhoes door deze plat op de bank te leggen en de behuizing er in een snelle, snelle beweging af te trekken.
    LET OP: De micro-elektroden zijn ongelooflijk kwetsbaar en er moet voor worden gezorgd dat de punt niet in contact komt met stijf, vast materiaal. Voor de beste resultaten voert u metingen uit op een stevige werkblad dat vrij is van apparatuur die trillingen van de werkbank of ongewenste beweging van de elektroden kan veroorzaken.
  3. Monteer de micro-elektrode op een micromanipulator en plaats de stereoscoop en micromanipulator zo dat de micro-elektrode naar het kweekschaaltje kan bewegen zonder het objectief of andere delen van de microscoop te raken.
  4. Plaats het kweekschaaltje met de organoïden zo dat u een adequate visualisatie heeft van de eerste organoïde die moet worden geprofileerd (Figuur 1B).
  5. Bevestig de referentie-elektrode lichtjes aan de clamp op de ringstandaard links van de stereoscoop. Plaats de referentie-elektrode zo dat deze in het medium rond de ECM rust. Zorg ervoor dat de organoïden niet worden verstoord als de tafel tussen de metingen wordt verplaatst.
  6. Kijk rechtstreeks naar de kweekplaat (niet in de microscoop) en schuif de punt van de micro-elektrode naar voren totdat deze voldoende is ondergedompeld in de media. Klik onder het tabblad Datalogger in de software op de Start-knop (enkele driehoek die naar rechts wijst) om de opname te starten. Zorg ervoor dat het selectievakje Gekalibreerd aan de rechterkant van het scherm is ingeschakeld.
    NOTITIE: Wacht ~10 s om elke meting te stabiliseren voordat u naar het volgende gebied gaat.
  7. Voordat u de ECM invoert, moet u ervoor zorgen dat de punt van de elektrode zichtbaar is onder de microscoop en dat deze zo is gepositioneerd dat deze lineair naar de eerste organoïde van belang beweegt. Schuif de elektrode langzaam in de gel, zonder in contact te komen met organoïden. Noteer ten minste drie pH-metingen en bereken het gemiddelde.
  8. Plaats de micro-elektrode zo dat deze is voorbereid om naar de eerste organoïde van belang te bewegen langs de as loodrecht op het oppervlak. Laat de elektrode een kleine inkeping maken op het epitheeloppervlak zonder door te dringen (Figuur 1C).
    LET OP: Deze stap geeft ook inzicht of de organoïde op zijn plaats blijft of dat deze vrijer kan bewegen in de ECM.
  9. Met één snelle beweging duwt u de micro-elektrode in de organoïde. Als de organoïde rond de micro-elektrode beweegt of weg beweegt, probeer dan een iets andere hoek, of maak een back-up tegen een andere organoïde of de plastic rand rond de glazen bodem van de schaal. Meet de luminale pH (drie afzonderlijke keer) van 10 verschillende organoïden voor elke experimentele toestand. Wanneer u klaar bent met het opnemen van metingen, klikt u op de vierkante stopknop.
    LET OP: Schat de diameter van de organoïde om te beslissen hoe ver de elektrode in het lumen van de organoïde moet worden gebracht, en zorg ervoor dat u er niet doorheen prikt. Voor een grotere nauwkeurigheid meet u de diameter met de camerasoftware van uw microscoop, indien beschikbaar. NOTITIE: Als de punt van de micro-elektrode na een of meerdere metingen merkbaar bedekt raakt met vuil, was de micro-elektrode dan in celdissociatieoplossing, PBS, EtOH en vervolgens diH2O voordat u verder gaat.

4. Gemotoriseerde profilering (optioneel)

OPMERKING: Deze optie vereist een micromanipulator die is gemonteerd op een mechanische motortafel, die uiteindelijk wordt bestuurd door computersoftware via een motorcontroller31.

  1. Open de profileringssoftware (bruin pictogram) en start een nieuw experiment onder het tabblad Profilering .
  2. De instellingen voor de z-as herkennen de motor automatisch wanneer een motorapparaat correct is aangesloten.
    OPMERKING: Beweging in de x- en y-richtingen wordt met deze instelling nog steeds handmatig geregeld.
  3. Zoek het tabblad Profielinteractie30. Voordat u op start drukt, moet u ervoor zorgen dat het mogelijk is om snel over te schakelen naar het kijken naar het microscoopoculair om ervoor te zorgen dat de organoïde op de gewenste afstand binnenkomt. Ga naar Profielinstellingen en doe het volgende:
    1. Geef aan dat de startafstand 0 μm is.
      LET OP: Als de epitheelschaal bijzonder hard is voor een bepaalde organoïde, kan de organoïde worden weggeduwd of vervormd in plaats van gepenetreerd. Als duwen het geval is, ga dan door met het verplaatsen van de elektrode, maar noteer het punt waarop de invoer plaatsvindt, aangezien de software dit niet automatisch kan registreren.
    2. Aan de hand van de grootte van de organoïde die wordt geprofileerd, geeft u een eindafstand aan die niet meer is dan 3/4 van de geschatte diameter van een organoïde.
      NOTITIE: Deze specifieke stap is bedoeld om schade aan de elektrodepunt te voorkomen.
    3. Geef de gewenste stapgrootte aan: 100 μm zoals weergegeven in figuur 2E. Zorg ervoor dat de minimale stapgrootte overeenkomt met de grootte van de elektrodepunt (bijv. 25 μm voor een 25 μm pH-25 elektrodetip).
    4. Geef een veilige positie aan waarin de motor de elektrodepunt tussen de profielen terugbrengt.
      OPMERKING: Dit moet een comfortabele hoogte boven het monster zijn (buiten de organoïde) waar de sensor veilig zijwaarts in de x- en y-richting kan worden bewogen met de handmatige micromanipulator. Laat de sensorhoek op de standaardinstelling staan.
    5. Om de elektrode in evenwicht te laten komen, geeft u ten minste 3 s aan onder Wachten voordat de maatregel(en) worden gemeten.
    6. Stel de meetperiode(s) in op minimaal 1 s. De metingen over deze periode worden gemiddeld.
      OPMERKING: Als u metingen uitvoert in een omgeving met veel elektrische ruis, kan het nuttig zijn om een langere periode aan te geven.
    7. Stel de vertraging tussen(en) in op minimaal 1 s.
    8. Stel het gewenste aantal replicaten in dat op elke diepte moet worden gemeten.
    9. Begin met het registreren van metingen door op de Start-knop te drukken.

5. Reinigen van elektroden

  1. Plaats de te reinigen elektrode terug in de beschermbuis.
  2. Spoel de elektroden na metingen door met diH2O.
  3. Spoel de elektroden een paar minuten met 70% ethanol.
  4. Spoel de elektroden af met een buffer van pH 4.01.
  5. Spoel de elektroden nog een keer af met diH2O voordat u verder gaat met meten.

6. Opslag van elektroden

NOTITIE: Beide elektroden moeten bij kamertemperatuur worden bewaard op een plaats met weinig activiteit, veilig voor onopzettelijke schade.

  1. Schuif de pH-micro-elektrode na gebruik voorzichtig horizontaal terug in de beschermbuis (schuif langs de laboratoriumtafel voor horizontale ondersteuning).
  2. Houd de micro-elektrode rechtop (punt naar boven gericht) en vul de beschermbuis voorzichtig met steriel water. Sluit de beschermbuis aan op de stop waarmee de elektrode is geleverd. Zorg ervoor dat eventuele gaten in de beschermbuis zijn afgedicht met isolatietape. Bewaar in een onbreekbare doos tot het volgende gebruik.
    NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de originele doos te gebruiken waarin de elektroden zijn geleverd, omdat deze beschermende inzetstukken bevat die zijn ontworpen om de elektroden op hun plaats te houden wanneer ze worden opgeborgen.
  3. Bewaar de referentie-elektrode in een bekerglas of maatcilinder gevuld met een 3M KCl-oplossing. Bedek het bekerglas/de maatcilinder met parafilm om verdamping van de oplossing te voorkomen.
    NOTITIE: Als u een maatcilinder gebruikt, wordt aanbevolen om deze met tape aan de laboratoriumtafel te bevestigen om onbedoelde beweging te voorkomen.

7. Methylrode injectie (optioneel)

OPMERKING: Methylrood is een colorimetrische indicatorkleurstof die kan worden gebruikt om de metingen van de micro-elektrode te valideren.

  1. Vul een glazen capillair van 2 μl met steriele minerale olie, laad het op een micromanipulatorgestuurde nL-autoinjector en vul het vervolgens met een oplossing die 0,02% methylrood en 150 mM HCl bevat.
    OPMERKING: De oplossing moet rood/roze lijken terwijl deze zich in het capillair bevindt vanwege de zuurgraad van de HCl.
  2. Injecteer organoïden met een diameter van ten minste 300 μm met 9,2 μl van de oplossing25.
  3. Maak foto's of video's met een camera die is aangepast aan de stereomicroscoop (Figuur 2G).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De afscheiding van zuur is een cruciale functie van de menselijke maag. In hoeverre zuursecretie in organoïden kan worden gemodelleerd, is echter nog een punt van discussie 6,32,33,34. Daarom hebben we het hierboven beschreven protocol ontwikkeld om de zuurproductie in maagorganoïden nauwkeurig te meten. We gebruikten met name niet-gestimuleerde, van volwassen stamcellen afgeleide organoïden di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Beperkte toegang tot de luminale ruimte van organoïden heeft ons begrip van de fysiologische dynamiek van deze micro-omgeving ernstig beperkt. Een betrouwbaar hulpmiddel voor functionele analyses van luminale fysiologie zal ons vermogen vergroten om organoïden te gebruiken als in vitro modellen voor fysiologie, farmacologie en ziekteonderzoek. Organoïden zijn zeer afstembare, fysiologisch relevante modellen met het extra potentieel om genetische variabiliteit binnen de menselijke populatie te repliceren. Bestaan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart en Bengisu Kilic bedanken voor hun eerdere werk en hulp bij de O2 microsensoren; Andy Sebrell voor zijn opleiding in organoïdecultuur en micromanipulatie; Lexi Burcham voor hulp bij organoïdecultuur, mediavoorbereiding, gegevensregistratie en organisatie; en Dr. Susy Kohout voor algemeen advies in de elektrofysiologie. We willen Dr. Heidi Smith bedanken voor haar hulp bij het maken van beeldvorming en erkennen het Center for Biofilm Engineering Bioimaging Facility aan de Montana State University, dat wordt ondersteund door financiering van het National Science Foundation MRI Program (2018562), de MJ Murdock Charitable Trust (202016116), het Amerikaanse ministerie van Defensie (77369LSRIP & W911NF1910288) en door de Montana Nanotechnology Facility (een NNCI-lid dat wordt ondersteund door NSF Grant ECCS-2025391).

Speciale dank aan het hele Unisense-team dat dit werk mogelijk heeft gemaakt, in het bijzonder Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard en Mette Gammelgaard. Financiering voor onze studie werd verstrekt door de National Institutes of Health-beurzen R01 GM13140801 (D.B., R.B.) en UL1 TR002319 (K.N.L), en een Research Expansion Award van het Montana State University Office for Research and Economic Development (D.B.). Figuur 1A is gemaakt met BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3 M KClUnisense
5 mL Wobble-not Serologische Pipet, individueel verpakt, papier/plastic, zak, sterielCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serologische Pipet, individueel verpakt, papier/plastic, zak, sterielCellTreat229092B
15 mL Centrifugeerbuis - Schuimrek, sterielCellTreat229412
24 Well Tissue Cultuurplaat, sterieleCellTreat229124
25 mL Wobble-not Serologische Pipet, individueel verpakt, papier/plastic, zak, sterielCellTreat229093B
35 mm Schaaltje | Nr. 1,5 Dekglas | 20 mm glazen diameter | OngecoatMatTekP35G-1.5-20-C
50 mL Centrifugeerbuis - Schuimrek, sterielCellTreat229422
70% EthanolBP82031GALBP82031GAL
70 µm Celzeef, individueel verpakt, sterielCellTreat229483 
1.000 µL Verlengde lengte lage retentie pipettentips, gestald, sterielCellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) OplossingHyClone Laboratories, IncSV30078.01
BioveiligheidskastNuaire NU-425-600Klasse II Type A/B3
Bovien Serum AlbumineFisher BioreagentsBP1605-100
Celherstel oplossingCorning354253Cel dissociatie oplossing
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Aanpassing van Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
Foetaal bovien serumHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 SulfaatCorning30-234-CR
Gentamycin sulfaatIBI ScientificIB02030
HEPES, Vrije ZuurCytivaSH30237.01
HP Pavilion 2-in-1 14" Laptop Intel Core i3HPM03840-001
ZoutzuurFisher ScientificA144C-212
IncubatorFisher Scientific11676604
iPhone 12 cameraApple
L-glutamineCytivaSH3003401
Grote Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-PlyFisher Scientific34133
M 205 FA StereomicroscoopLeica
Matrigel Membraan Matrix 354234CorningCB-40234
MC-1 UniMotor ControllerUnisense
Methyl rood
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000Rechtshandig
MS-15 Gemotoriseerde StageUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204Nanoliter auto-injector
Penicilline/Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15-140-148
pH MicroelektrodenUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace software is niet compatibel met Apple computers
Referentie ElektrodeUnisenseREF-RM-001652SensorTrace software is niet compatibel met Apple computers
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
Smartphone Camera AdapterGosky
Specificaties Laboratorium Stand LSUnisenseLS-009238
Trypsine-EDTA 0,025%, fenolroodGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µSensor Kalibratie KitUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4,01 en 9,21, 20 mL verpakkingen

Referenties

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188(2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A. Organoids and Mini-organs. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801(2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023).
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353(2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219(2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023).
  31. Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023).
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. Unisense. , Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024).
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Profilering van de luminale pHpH-microelektrodenkalibratie van microelektrodenhumane gastrische organoïdenmicromanipulatorbesturingluminale omgeving van organoïdenmeting van pH-gradiënteninjectie van methylroodfunctionele karakterisering van organoïden
Profilering van luminale pH in driedimensionale gastro-intestinale organoïden met behulp van micro-elektroden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.