Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Retinale pigmentepitheelcellen (RPE) zijn van cruciaal belang voor de goede werking van het netvlies. RPE-disfunctie is betrokken bij de pathogenese van belangrijke netvliesaandoeningen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie. We presenteren een gestroomlijnde aanpak voor de isolatie van RPE uit de ogen van volwassen muizen. In tegenstelling tot eerder gerapporteerde methoden, maakt deze aanpak het mogelijk om zeer zuivere RPE uit volwassen muizen te isoleren en te kweken. Deze eenvoudige en snelle methode vereist geen uitgebreide technische vaardigheid en is haalbaar met wetenschappelijke basisinstrumenten en reagentia. Primaire RPE worden geïsoleerd uit C57BL/6-achtergrondmuizen in de leeftijd van 3 tot 14 weken door enucleatie van het oog, gevolgd door de verwijdering van het voorste segment. Enzymatische trypsinisatie en centrifugatie worden gebruikt om de RPE te dissociëren en te isoleren van de oogschelp. Concluderend biedt deze benadering een snel en effectief protocol voor het gebruik van RPE bij de studie van de netvliesfunctie en -ziekte.
Inleiding
Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een gespecialiseerde celmonolaag die het membraan van Bruch bekleedt, gelegen tussen fotoreceptoren en het vaatvlies1. RPE-cellen spelen een cruciale rol bij de goede werking van het netvlies. RPE-cellen transporteren glucose en vitamine A naar fotoreceptoren, bevorderen het gezichtsvermogen door re-isomerisatie van all-trans retinaal naar 11-cis retinaal en onderhouden de buitenste segmenten van de fotoreceptor door fagocytose van afgestoten buitenste segmenten, verwijderen water uit de subretinale ruimte, vormen de buitenste bloed-retinale barrière door de aanwezigheid van tight junctions en scheiden neurotrope groeifactoren af (zoals Pigment Epitheel Derived Factor, en Basic Fibroblast Growth Factor) die fotoreceptoren ondersteunen2. Disfunctie van RPE-cellen is betrokken bij de pathogenese van verschillende retinopathieën, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie 3,4,5. In vitro studies met RPE-cellen zijn van cruciaal belang voor het verbeteren van ons begrip van de pathogenese van deze ziekten. Primaire RPE-cellen hebben veel de voorkeur voor deze onderzoeken, aangezien RPE-cellijnen, hoewel direct beschikbaar, de belangrijkste kenmerken van primaire RPE-cellen missen.
Terwijl verschillende soorten zijn gebruikt als bronnen van primaire RPE-cellen, hebben muizen het voordeel dat ze genetische modificaties kunnen gebruiken om de pathogenese van retinopathieën te helpen begrijpen. Eerder beschreven protocollen om RPE-cellen van knaagdieren te isoleren vereisen ofwel het gebruik van neonatale dieren, zijn langdurig, vereisen technische vaardigheid of zijn niet geschikt voor kweek 6,7,8,9,10,11,12. We beschrijven een eenvoudige en snelle methode om RPE-cellen van volwassen muizen te isoleren die zeer zuivere culturen van deze cellen opleveren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het gebruik van proefdieren in deze studie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Case Western Reserve University.
1. Bereiding van reagentia
- Bereid wasbuffermedium voor door Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS), geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood aan te vullen met 10 mM HEPES-bufferoplossing. Houd de oplossing tot gebruik op 4 °C.
- Bereid RPE-medium voor door Dulbecco's Modified Eagle's Medium aan te vullen met 4,5 g/L glucose, 1,25x GlutaMAX-supplement (voorraadconcentratie 100x of 200 mM; eindconcentratie van 2,5 mM L-glutamine), met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline/streptomycine en 1x MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x). Verwarm de media voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.
2. Extractie van het muizenoog
- Euthanaseer de muis, bij voorkeur in een leeftijd van 3 tot 14 weken, met behulp van een door de IACUC goedgekeurde euthanasiemethode (cervicale dislocatie onder narcose met behulp van een ketamine/xylazine-cocktail van 0,1 ml per 20 g muis [87,5 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine] was de methode die in deze studie werd gebruikt).
OPMERKING: Ogen verzameld van jongere muizen zullen in de loop van de tijd een verhoogde opbrengst van retinale pigmentepitheelcellen vergemakkelijken en de capaciteit voor opeenvolgende passages vergroten. - Leg de muis plat op zijn zij met het oog naar boven gericht.
- Plaats de wijsvinger en duim respectievelijk boven en onder het oog. Oefen voorzichtig druk uit op de botstructuur rond het oog om het uitsteeksel van de oogbol te induceren.
- Steek de punt van een licht geopende schaar onder het oog en draai de pols voorzichtig 90° weg van het oog totdat het oog loskomt van de oogkas.
NOTITIE: Sluit de schaar niet om het oog of de oogzenuw te knippen, omdat dit het dissectien van de oogschelp bemoeilijkt. - Plaats en rol het oog onmiddellijk in 70% ethanol gedurende niet langer dan 5 s voordat u het overbrengt naar een wasbuffermedium dat op ijs wordt bewaard.
- Breng onder een ontleedmicroscoop één oog tegelijk over op een petrischaal gevuld met wasbuffer en stroken gedrenkt gaas.
- Stabiliseer het oog door de oogzenuw met een pincet vast te houden. Maak voorzichtig een incisie ter hoogte van de ora serrata met een 3,00 mm 45° chirurgisch mes of 0,009" scheermesje.
- Steek met een Vannas-schaar de schaar voorzichtig in de incisie en knip rond de omtrek van de ora serrata totdat het voorste segment en het glasvocht kunnen worden verwijderd en weggegooid.
- Trek het netvlies voorzichtig weg van de oogschelp met behulp van een vastgebonden tang, zorg ervoor dat u de RPE-laag niet verstoort.
OPMERKING: Om het netvlies gemakkelijker te kunnen verwijderen, vult u een transferpipet met wasbuffermedium en brengt u deze voorzichtig aan op de randen van de oogschelp om het netvlies voorzichtig op te tillen. - Verwijder ten slotte de oogzenuw en overtollig bindweefsel van de oogschelp met een schaar. Pas op dat u de oogschelp niet doorboort.
3. Isolatie van primaire RPE
- Breng de oogschelp over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met 1 ml 0,25% trypsine + 0,02% EDTA.
OPMERKING: Twee oogschelpen kunnen worden toegevoegd aan één aliquot trypsine-EDTA om de opbrengst van kweekbare RPE te verhogen. - Breng de microcentrifugebuisjes over in een waterbad bij 37 °C en incubeer gedurende 10 minuten. Haal elke 2 minuten de buizen uit het waterbad en tik 40 keer stevig met de onderkant van de buis op het aanrecht.
- Verbreek na 10 minuten de oogschelp voorzichtig mechanisch met behulp van een P1000 of een serologische pipet van 2 ml door niet vaker dan 3 keer op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Fragmentatie van de RPE-platen is essentieel omdat grote vellen niet goed hechten. - Neutraliseer de trypsine onmiddellijk door de losgemaakte RPE-vellen, maar niet de oogschelp, op 0,5 ml foetaal runderserum (FBS) in een kegelvormige buis van 15 ml aan te brengen.
- Verdun verder de trypsine door 3 ml RPE-media druppelsgewijs op de lagen FBS- en RPE-vellen aan te brengen.
- Centrifugeer de RPE op 340 x g gedurende 3 minuten.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid RPE-media voor een plaat met 24 putjes (1,9cm2/putje) of een plaat met 48 putjes (0,75cm2/putje).
OPMERKING: RPE kan worden geplateerd op putplaten die zijn gecoat met extracellulaire matrixeiwitten, met name laminine, collageen IV of fibronectine, om de therapietrouw te vergroten11. RPE kan ook worden geresuspendeerd in 1 ml RPE-media en gelaagd op een dichtheidsscheidingsgradiënt van 40% om pure RPE-cellen verder te isoleren. Bovendien kan het draaien van de plaat op 340 x g gedurende 3-5 minuten de celadhesie verhogen13. - Incubeer bij 37 °C bij 5% CO2 .
4. RPE cultiveren
- Verstoor de geïsoleerde RPE niet gedurende ten minste 3 dagen. Verwijder na 72 uur voorzichtig het oude medium en vervang het door vers, voorverwarmd medium.
- Vervang het medium elke 48 uur na de eerste 3 dagen.
- Zodra cellen confluentie bereiken, passeer je de cellen met 0,25% trypsine + 0,02% EDTA en verminder je de FBS in de RPE-media tot 2%.
OPMERKING: Van primaire RPE werd eerder gemeld dat ze na 5-7 passages beginnen met dedifferentiatie en hun zeshoekige vorm en pigmentatie beginnen te verliezen14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het beschreven protocol is gebruikt op C57BL/6 achtergrondmuizen. Geslacht lijkt het vermogen om RPE te kweken niet te veranderen. Muizen jonger dan 6 weken leveren beperkte RPE-vellen op in vergelijking met oudere muizen, en er kunnen meer ogen nodig zijn om een optimale samenvloeiing te bereiken. Na isolatie hebben RPE-cellen ongeveer 3 dagen nodig om te stabiliseren en zich aan de celkweekplaat te hechten. Ongeveer 24 uur na isolatie beginnen ronde, gepigmenteerde cellen die anucleaat lijken, zich te vestigen, maar he...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel hebben we een vereenvoudigd protocol geschetst voor de isolatie en kweek van retinaal pigmentepitheel van muizen. RPE-cellen geïsoleerd uit de ogen van volwassen muizen brachten een RPE-specifieke marker, RPE65, en een intercellulaire junctiemarker, ZO-1, tot expressie. Bovendien ontwikkelden de gekweekte cellen zich in cultuur tot gepigmenteerde, zeshoekige vellen.
Verschillende methoden voor isolatie van RPE bij knaagdieren zijn eerder gepubliceerd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen relevante financiële of niet-financiële openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) en P30 EY011373. De subsidieverstrekker had geen rol bij de opzet of uitvoering van dit onderzoek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.009 RD Single-Edge Blades | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | met 4,5 g/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat |
| Fetaal bovien serum | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | geen calcium, geen magnesium, geen fenol rood |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Micro-Unitome Knife | BVI Beaver | 377546 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyreen Microplates | Falcon | 08-772-1 | 24-well of 48-well |
| Regular Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | met fenol rood |
| Vannas schaar | Fine Science Tools | 10091-12 |
Referenties
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
- Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
- Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
- Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
- Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
- Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
- Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
- Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
- Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
- Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
- Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
- Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
