Methodenartikel

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

DOI:

10.3791/66921

⸱

24 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale pigmentepitheelcellen (RPE) zijn van cruciaal belang voor de goede werking van het netvlies. RPE-disfunctie is betrokken bij de pathogenese van belangrijke netvliesaandoeningen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie. We presenteren een gestroomlijnde aanpak voor de isolatie van RPE uit de ogen van volwassen muizen. In tegenstelling tot eerder gerapporteerde methoden, maakt deze aanpak het mogelijk om zeer zuivere RPE uit volwassen muizen te isoleren en te kweken. Deze eenvoudige en snelle methode vereist geen uitgebreide technische vaardigheid en is haalbaar met wetenschappelijke basisinstrumenten en reagentia. Primaire RPE worden geïsoleerd uit C57BL/6-achtergrondmuizen in de leeftijd van 3 tot 14 weken door enucleatie van het oog, gevolgd door de verwijdering van het voorste segment. Enzymatische trypsinisatie en centrifugatie worden gebruikt om de RPE te dissociëren en te isoleren van de oogschelp. Concluderend biedt deze benadering een snel en effectief protocol voor het gebruik van RPE bij de studie van de netvliesfunctie en -ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een gespecialiseerde celmonolaag die het membraan van Bruch bekleedt, gelegen tussen fotoreceptoren en het vaatvlies1. RPE-cellen spelen een cruciale rol bij de goede werking van het netvlies. RPE-cellen transporteren glucose en vitamine A naar fotoreceptoren, bevorderen het gezichtsvermogen door re-isomerisatie van all-trans retinaal naar 11-cis retinaal en onderhouden de buitenste segmenten van de fotoreceptor door fagocytose van afgestoten buitenste segmenten, verwijderen water uit de subretinale ruimte, vormen de buitenste bloed-retinale barrière door de aanwezigheid van tight junctions en scheiden neurotrope groeifactoren af (zoals Pigment Epitheel Derived Factor, en Basic Fibroblast Growth Factor) die fotoreceptoren ondersteunen2. Disfunctie van RPE-cellen is betrokken bij de pathogenese van verschillende retinopathieën, waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie 3,4,5. In vitro studies met RPE-cellen zijn van cruciaal belang voor het verbeteren van ons begrip van de pathogenese van deze ziekten. Primaire RPE-cellen hebben veel de voorkeur voor deze onderzoeken, aangezien RPE-cellijnen, hoewel direct beschikbaar, de belangrijkste kenmerken van primaire RPE-cellen missen.

Terwijl verschillende soorten zijn gebruikt als bronnen van primaire RPE-cellen, hebben muizen het voordeel dat ze genetische modificaties kunnen gebruiken om de pathogenese van retinopathieën te helpen begrijpen. Eerder beschreven protocollen om RPE-cellen van knaagdieren te isoleren vereisen ofwel het gebruik van neonatale dieren, zijn langdurig, vereisen technische vaardigheid of zijn niet geschikt voor kweek 6,7,8,9,10,11,12. We beschrijven een eenvoudige en snelle methode om RPE-cellen van volwassen muizen te isoleren die zeer zuivere culturen van deze cellen opleveren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van proefdieren in deze studie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Case Western Reserve University.

1. Bereiding van reagentia

  1. Bereid wasbuffermedium voor door Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS), geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood aan te vullen met 10 mM HEPES-bufferoplossing. Houd de oplossing tot gebruik op 4 °C.
  2. Bereid RPE-medium voor door Dulbecco's Modified Eagle's Medium aan te vullen met 4,5 g/L glucose, 1,25x GlutaMAX-supplement (voorraadconcentratie 100x of 200 mM; eindconcentratie van 2,5 mM L-glutamine), met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline/streptomycine en 1x MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x). Verwarm de media voor gebruik voor op 37 °C in een waterbad.

2. Extractie van het muizenoog

  1. Euthanaseer de muis, bij voorkeur in een leeftijd van 3 tot 14 weken, met behulp van een door de IACUC goedgekeurde euthanasiemethode (cervicale dislocatie onder narcose met behulp van een ketamine/xylazine-cocktail van 0,1 ml per 20 g muis [87,5 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine] was de methode die in deze studie werd gebruikt).
    OPMERKING: Ogen verzameld van jongere muizen zullen in de loop van de tijd een verhoogde opbrengst van retinale pigmentepitheelcellen vergemakkelijken en de capaciteit voor opeenvolgende passages vergroten.
  2. Leg de muis plat op zijn zij met het oog naar boven gericht.
  3. Plaats de wijsvinger en duim respectievelijk boven en onder het oog. Oefen voorzichtig druk uit op de botstructuur rond het oog om het uitsteeksel van de oogbol te induceren.
  4. Steek de punt van een licht geopende schaar onder het oog en draai de pols voorzichtig 90° weg van het oog totdat het oog loskomt van de oogkas.
    NOTITIE: Sluit de schaar niet om het oog of de oogzenuw te knippen, omdat dit het dissectien van de oogschelp bemoeilijkt.
  5. Plaats en rol het oog onmiddellijk in 70% ethanol gedurende niet langer dan 5 s voordat u het overbrengt naar een wasbuffermedium dat op ijs wordt bewaard.
  6. Breng onder een ontleedmicroscoop één oog tegelijk over op een petrischaal gevuld met wasbuffer en stroken gedrenkt gaas.
  7. Stabiliseer het oog door de oogzenuw met een pincet vast te houden. Maak voorzichtig een incisie ter hoogte van de ora serrata met een 3,00 mm 45° chirurgisch mes of 0,009" scheermesje.
  8. Steek met een Vannas-schaar de schaar voorzichtig in de incisie en knip rond de omtrek van de ora serrata totdat het voorste segment en het glasvocht kunnen worden verwijderd en weggegooid.
  9. Trek het netvlies voorzichtig weg van de oogschelp met behulp van een vastgebonden tang, zorg ervoor dat u de RPE-laag niet verstoort.
    OPMERKING: Om het netvlies gemakkelijker te kunnen verwijderen, vult u een transferpipet met wasbuffermedium en brengt u deze voorzichtig aan op de randen van de oogschelp om het netvlies voorzichtig op te tillen.
  10. Verwijder ten slotte de oogzenuw en overtollig bindweefsel van de oogschelp met een schaar. Pas op dat u de oogschelp niet doorboort.

3. Isolatie van primaire RPE

  1. Breng de oogschelp over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met 1 ml 0,25% trypsine + 0,02% EDTA.
    OPMERKING: Twee oogschelpen kunnen worden toegevoegd aan één aliquot trypsine-EDTA om de opbrengst van kweekbare RPE te verhogen.
  2. Breng de microcentrifugebuisjes over in een waterbad bij 37 °C en incubeer gedurende 10 minuten. Haal elke 2 minuten de buizen uit het waterbad en tik 40 keer stevig met de onderkant van de buis op het aanrecht.
  3. Verbreek na 10 minuten de oogschelp voorzichtig mechanisch met behulp van een P1000 of een serologische pipet van 2 ml door niet vaker dan 3 keer op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Fragmentatie van de RPE-platen is essentieel omdat grote vellen niet goed hechten.
  4. Neutraliseer de trypsine onmiddellijk door de losgemaakte RPE-vellen, maar niet de oogschelp, op 0,5 ml foetaal runderserum (FBS) in een kegelvormige buis van 15 ml aan te brengen.
  5. Verdun verder de trypsine door 3 ml RPE-media druppelsgewijs op de lagen FBS- en RPE-vellen aan te brengen.
  6. Centrifugeer de RPE op 340 x g gedurende 3 minuten.
  7. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid RPE-media voor een plaat met 24 putjes (1,9cm2/putje) of een plaat met 48 putjes (0,75cm2/putje).
    OPMERKING: RPE kan worden geplateerd op putplaten die zijn gecoat met extracellulaire matrixeiwitten, met name laminine, collageen IV of fibronectine, om de therapietrouw te vergroten11. RPE kan ook worden geresuspendeerd in 1 ml RPE-media en gelaagd op een dichtheidsscheidingsgradiënt van 40% om pure RPE-cellen verder te isoleren. Bovendien kan het draaien van de plaat op 340 x g gedurende 3-5 minuten de celadhesie verhogen13.
  8. Incubeer bij 37 °C bij 5% CO2 .

4. RPE cultiveren

  1. Verstoor de geïsoleerde RPE niet gedurende ten minste 3 dagen. Verwijder na 72 uur voorzichtig het oude medium en vervang het door vers, voorverwarmd medium.
  2. Vervang het medium elke 48 uur na de eerste 3 dagen.
  3. Zodra cellen confluentie bereiken, passeer je de cellen met 0,25% trypsine + 0,02% EDTA en verminder je de FBS in de RPE-media tot 2%.
    OPMERKING: Van primaire RPE werd eerder gemeld dat ze na 5-7 passages beginnen met dedifferentiatie en hun zeshoekige vorm en pigmentatie beginnen te verliezen14.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol is gebruikt op C57BL/6 achtergrondmuizen. Geslacht lijkt het vermogen om RPE te kweken niet te veranderen. Muizen jonger dan 6 weken leveren beperkte RPE-vellen op in vergelijking met oudere muizen, en er kunnen meer ogen nodig zijn om een optimale samenvloeiing te bereiken. Na isolatie hebben RPE-cellen ongeveer 3 dagen nodig om te stabiliseren en zich aan de celkweekplaat te hechten. Ongeveer 24 uur na isolatie beginnen ronde, gepigmenteerde cellen die anucleaat lijken, zich te vestigen, maar hebben ze zich niet volledig aan de plaat gehecht (Figuur 1A). In de loop van de volgende 48-72 uur beginnen de cellen zich te hechten en te verspreiden met behoud van hun donkere pigmentatie en transparante kern (Figuur 1B,C). Na 5 dagen is de samenvloeiing van RPE toegenomen en beginnen ze cel-tot-celcontacten te vormen die doen denken aan een gepolariseerde monolaag met een zeshoekige vorm (Figuur 1D).

Geïsoleerde RPE werden na 6 dagen in cultuur beoordeeld op zuiverheid en tight-junction-integriteit. RPE werden eerst beoordeeld op de aanwezigheid van retinoïde isomerohydrolase of retinaal pigmentepitheel 65 kDA-eiwit (RPE65), een marker die specifiek is voor RPE (Figuur 2, groen). Om RPE een enkele laag gepigmenteerde en zeshoekige cellen te laten vormen, moeten de cel-tot-cel-juncties intact blijven. Tight junction protein-1 of zonula occludens-1 (ZO-1) zijn steigereiwitten die van vitaal belang zijn voor het behoud en de integriteit van de tight junctions tussen individuele RPE-cellen14. Confluente geïsoleerde RPE-culturen behielden hun intercellulaire junctie-eiwitten, aangetoond door de kleuring van ZO-1 aan de periferie van de cel (Figuur 2, rood). Zodra deze cellen samenvloeiing bereiken in grote vellen, onderhouden ze tot 2 weken lang cel-tot-celcontacten zonder te overgroeien. Eerdere studies hebben aangetoond dat ZO-1 tot 9 dagen lang sterk tot expressie komt in cultuur15. Aanvullende markers die worden gebruikt in culturen van primaire RPE zijn collageen IV, CRALBP en OTX211.

figure-results-1
Figuur 1. Morfologie van primaire RPE van muizen gekweekt op standaard polystyreen 24-well plaat. (A) Primaire RPE geïsoleerd uit beide ogen van een C57BL/6-muis en gekweekt in een enkel putje van een niet-gecoate weefselkweekplaat van polystyreen met 24 putjes direct na isolatie. (B,C) Na 48 uur en 72 uur begint primaire RPE zich aan de plaat te hechten en gepigmenteerde, tweekernige cellen te vormen. (D) Na 5 dagen toont helderveldmicroscopie aan dat de hypergepigmenteerde, zeshoekige cellen de samenvloeiing vergroten en cel-tot-celcontacten beginnen te vormen. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. RPE-specifieke marker, RPE-65, en intercellulaire junctiemarker, ZO-1, worden geconserveerd in geïsoleerde primaire muizen RPE. Primaire RPE van drie C57BL/6-muizen werd gedurende 6 dagen voorafgaand aan fixatie gekweekt met 4% paraformaldehyde. Cellen werden gedurende 5 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X in PBS, geblokkeerd met 5% normaal geitenserum en geïncubeerd met antilichamen tegen RPE-65 (groen) of ZO-1 (rood). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Vereenvoudigde schematische weergave van het isolatieprotocol voor het pigmentepitheel van het netvlies. Nadat u de oogbol van de muis hebt verwijderd, steriliseert u het oog door het kort in 70% ethanol te dompelen voordat u het naar de wasbuffer verplaatst. Snijd in de wasbuffer langs de ora serrata en verwijder het voorste segment. Verwijder het netvlies en plaats de oogschelp in een buisje met Trypsine/EDTA. Tik zachtjes met de buis op het aanrecht om de 2 minuten gedurende 10 minuten in totaal, breng het supernatans over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer de pellet RPE. Resuspendeer de cellen en de plaat op een plaat met 24 of 48 putjes. Afbeeldingen gegenereerd met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel hebben we een vereenvoudigd protocol geschetst voor de isolatie en kweek van retinaal pigmentepitheel van muizen. RPE-cellen geïsoleerd uit de ogen van volwassen muizen brachten een RPE-specifieke marker, RPE65, en een intercellulaire junctiemarker, ZO-1, tot expressie. Bovendien ontwikkelden de gekweekte cellen zich in cultuur tot gepigmenteerde, zeshoekige vellen.

Verschillende methoden voor isolatie van RPE bij knaagdieren zijn eerder gepubliceerd 6,7,8,9,10,11,12. Veel protocollen pellen de RPE-lagen van het membraan van Bruch, wat technische vaardigheid vereist en het risico op RPE-schade of celdood verhoogt 6,7,9,11,12,16. Dit protocol maakt dus gebruik van enzymatische onthechting van de RPE-laag, in plaats van mechanische dissociatie, om de overleving te bevorderen en de integriteit van de RPE-vellen in cultuur te behouden. Deze methode levert RPE van muizen op in een cultuur die RPE-morfologie behoudt met sterk gepigmenteerde en zeshoekige cellen die de expressie van tight junction-eiwitten behouden. Bovendien mist dit protocol het gebruik van complexe reagentia of materialen die in andere protocollen worden gebruikt, zoals permeabele membraaninzetstukken, extra extracellulaire matrixcoatingeiwitten of gespecialiseerde weefseldissociatiereagentia. In plaats daarvan maakt dit protocol gebruik van eenvoudige enzymatische vertering met behulp van 0,25% trypsine-EDTA in combinatie met weefselagitatie om de RPE-laag te dissociëren van het membraan van Bruch. Dit protocol is met succes uitgevoerd bij muizen van 3 tot 14 weken oud; Er kunnen echter meer ogen nodig zijn om met succes een confluente cultuur bij jonge muizen te krijgen.

Tijdens de uitvoering van dit protocol kunnen zich verschillende uitdagingen voordoen. Technische vaardigheid is vereist om precies rond de ora serrata te snijden en het netvlies voorzichtig te verwijderen zonder de RPE-laag te verstoren. Het netvlies kan worden verstoord tijdens het snijden van de omtrek van de sclera, wat de levensvatbaarheid van RPE kan veranderen. Verfijning van deze techniek kan alleen worden bereikt door repetitieve, continue oefening. Bovendien kunnen RPE-vellen na verwijdering aan de netvlieslaag blijven zitten. Om overmatig verlies van RPE te voorkomen, stimuleert u de netvliesloslating door een spuit of transferpipet gevuld met wasbuffermedium te gebruiken om de randen van het netvlies voorzichtig van de oogschelp te tillen. Hyaluronidase-incubatie kan ook de onthechting vergemakkelijken16. In het geval dat RPE niet goed loskomen van het membraan en het vaatvlies van Bruch, verhoog dan de incubatietijd met trypsine in het waterbad. Vries bovendien aliquots van vers trypsine in bij -20 °C en ontdooi direct voor gebruik om een optimale enzymatische activiteit te behouden. Het falen van de RPE om zich na isolatie aan de putplaat te hechten, kan optreden als cellen met een te lage dichtheid worden gezaaid of als de RPE tijdens het isolatieproces is beschadigd. Bovendien vereist ons protocol geen coating van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten voor kweek. Van ECM-eiwitten, zoals fibronectine, collageen IV, laminine of collageen I, is echter aangetoond dat ze de celhechting verhogen en moeten worden overwogen als de therapietrouw slecht is11.

Om de opbrengst van RPE-gekweekte monolagen te verhogen, verzamelt u ten minste 2-3 ogen van muizen van dezelfde leeftijd met dezelfde genetische achtergrond; Cellen kunnen na verloop van tijd hun zeshoekige vorm en pigment verliezen als ze niet met een voldoende hoge dichtheid worden gezaaid. Voor muizen die ouder zijn dan 8 weken zou 2 ogen per plaat met 24 putjes voldoende moeten zijn voor een optimale samenvloeiing. Als muizen jonger zijn dan 8 weken, zullen 3-4 ogen resulteren in een betere hechting en samenvloeiing. Na verloop van tijd kunnen cellen vatbaar zijn voor epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) met verlies van pigmentatie en het aannemen van een langwerpige vorm. De toevoeging van Rho-Kinase- en TGFβR-1/ALK5-remmers, zoals respectievelijk Y27632 en Repsox, kan EMT van de gekweekte RPE-cellen voorkomen12. Hoewel het isolatieprotocol kort is en slechts 1 uur nodig heeft voor isolatie van 2-4 ogen, kan het tot 7-10 dagen duren voordat de primaire cultuur volledige samenvloeiing bereikt. Bovendien is passaging RPE beperkt, met een verhoogd risico op EMT bij elke volgende passage.

Retinale pigmentepitheelcellen zijn cruciale cellen voor het handhaven van de homeostase in het oog. RPE fungeren als fagocyten om te helpen bij het onderhoud van fotoreceptoren, neurale lagen door lichtschade te voorkomen en te fungeren als een strakke epitheliale barrière om transport te reguleren17. Ziekten die rechtstreeks van invloed zijn op RPE, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa en diabetische retinopathie, kunnen ontstekingen verergeren, apoptose verhogen en cellulaire verbindingen verstoren, wat leidt tot een verhoogde kans op netvliesdegeneratie en blindheid. Teelt van primaire RPE vergemakkelijkt de studie van de pathogenese van oogziekten die RPE beïnvloeden. Concluderend verkort ons protocol de duur van de isolatie en vereenvoudigt het de nodige technieken en reagentia met behoud van een zeer zuivere celcultuur.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen relevante financiële of niet-financiële openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) en P30 EY011373. De subsidieverstrekker had geen rol bij de opzet of uitvoering van dit onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.009 RD Single-Edge BladesPersonna941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVmet 4,5 g/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat
Fetaal bovien serumCorning35010CV
GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095geen calcium, geen magnesium, geen fenol rood
HEPES Buffer Solution (1M)Gibco15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100xGibco11140050
Micro-Unitome KnifeBVI Beaver377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xCorning30-002-CI
Polystyreen MicroplatesFalcon08-772-124-well of 48-well
Regular Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056met fenol rood
Vannas schaarFine Science Tools10091-12

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res. 100846, (2020).
  3. Lambros, M. L., Plafker, S. M. Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration. Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).
  4. Ferrari, S., et al. Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
  5. Xia, T., Rizzolo, L. J. Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Vision Res. 139, 72-81 (2017).
  6. Edwards, R. B. Culture of rat retinal pigment epithelium. In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).
  7. Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).
  8. Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina. Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).
  9. Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).
  10. Sakagami, K., et al. A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs. Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).
  11. Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).
  12. Shen, J., He, J., Wang, F. Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor. Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).
  13. Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).
  14. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight Junctions of the outer blood retina barrier. Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).
  15. Ban, B., Rizzolo, L. J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions. Mol Vis. 3, 18(1997).
  16. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  17. Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Front Pharmacol. 12, 727870(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinaal pigmentepitheelRPE isolatievolwassen muis RPERPE kweekretinaire ziektentrypsinisatiemethodecel dissociatieprimaire RPE cellenintegriteit van tight junctionsenucleatietechniek

Gerelateerde artikelen