Methodenartikel

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 juli 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De identificatie en karakterisering van antigeenspecifieke T-cellen tijdens gezondheid en ziekte blijft een sleutel tot het verbeteren van ons begrip van immuunpathofysiologie. De technische uitdagingen van het volgen van antigeenspecifieke T-celpopulaties binnen het endogene T-celrepertoire zijn enorm verbeterd door de ontwikkeling van peptide:MHC-tetrameerreagentia. Deze fluorescerend gelabelde oplosbare multimeren van MHC klasse I- of klasse II-moleculen gecomplexeerd tot antigene peptide-epitopen binden rechtstreeks aan T-cellen met overeenkomstige T-celreceptor (TCR) specificiteit en kunnen daarom antigeenspecifieke T-celpopulaties in hun oorspronkelijke staat identificeren zonder dat een functionele respons vereist is die wordt geïnduceerd door ex vivo stimulatie. Voor uiterst zeldzame populaties kunnen tetrameergebonden T-cellen magnetisch worden verrijkt om de gevoeligheid en betrouwbaarheid van de detectie te vergroten.

Naarmate het onderzoek naar de immuniteit van weefselresidente T-cellen zich verdiept, is er een dringende behoefte om antigeenspecifieke T-cellen te identificeren die naar niet-lymfoïde weefsels reizen en zich daarin bevinden. In dit protocol presenteren we een gedetailleerde reeks instructies voor de isolatie en karakterisering van antigeenspecifieke T-cellen die aanwezig zijn in de longen van muizen. Dit omvat de isolatie van T-cellen uit verteerd longweefsel, gevolgd door een algemene magnetische verrijkingsstap van T-cellen en tetrameerkleuring voor flowcytometrie, analyse en sortering. De stappen die in dit protocol worden benadrukt, maken gebruik van gangbare technieken en gemakkelijk verkrijgbare reagentia, waardoor het toegankelijk is voor bijna elke onderzoeker die zich bezighoudt met immunologie van T-cellen van muizen, en zijn zeer aanpasbaar voor een verscheidenheid aan stroomafwaartse analyses van elke laagfrequente antigeenspecifieke T-celpopulatie die zich in de longen bevindt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kern van het adaptieve immuunsysteem ligt in het vermogen van een T-cel om een specifiek antigeen te herkennen en erop te reageren. Wanneer en waar een T-cel reageert op zijn verwante antigeen bepaalt de balans tussen infectie en auto-immuniteit, homeostase en kanker, gezondheid en ziekte1. Hieruit volgt dat de studie van T-cellen in een specifieke context van immuniteit zich moet richten op de cellen met specificiteit voor een relevant antigeen van belang. Onder de technologische vooruitgang die het vermogen om antigeenspecifieke T-celpopulaties te karakteriseren aanzienlijk heeft verbeterd, zijn fluorescerend gelabelde oplosbare multimeren (meestal tetrameren) van major histocompatibility complex (MHC) klasse I- of klasse II-moleculen gecomplexeerd tot antigene peptide-epitopen, beter bekend als "peptide:MHC-tetrameren"2,3,4,5 . Door de natuurlijke liganden van T-celantigeenreceptoren (TCR's) weer te geven, bieden peptide:MHC klasse I- en klasse II-tetrameren een middel om respectievelijk antigeenspecifieke CD8+- en CD4+-T-cellen direct te identificeren binnen het endogene repertoire van T-cellen in het immuunsysteem zonder dat een reactie op antigeenstimulatie in een test vereist is. Tetrameren vertegenwoordigen een elegantere benadering van de studie van antigeenspecifieke T-cellen dan TCR transgene T-cel adoptieve transfermodellen6, en worden in toenemende mate gebruikt om vreemde en zelfantigeenspecifieke T-celpopulaties te identificeren in zowel experimentele muismodellen als menselijke ziekten 4,5.

Hoewel tetrameren gemakkelijk hoogfrequente populaties van T-cellen kunnen identificeren die zijn uitgebreid als reactie op antigeenstimulatie, wordt hun gebruik voor naïeve, zelf-antigeenspecifieke of geheugen-T-cellen beperkt door de zeer lage frequenties van deze populaties7. Onze groep en anderen hebben op tetrameren gebaseerde magnetische verrijkingsstrategieën ontwikkeld en gepopulariseerd die de detectiegevoeligheid verhogen om studies van deze celpopulaties in lymfoïde weefsels van muizen mogelijk te maken 8,9,10,11.

De opkomst van weefsel-residente T-cellen in het veld heeft een verhoogde nadruk gelegd op het ontwikkelen van nieuwe manieren om T-cellen in de niet-lymfoïde ruimte te onderzoeken. Net als veel andere slijmvliesoppervlakken komen T-cellen in de longen een reeks zelf- en vreemde antigenen tegen die zijn afgeleid van gastheerepitheel, commensale en infectieuze microben en omgevingsentiteiten, waaronder allergenen. Transcriptionele analyse van T-cellen geoogst uit niet-lymfoïde weefsel (NLT) toont een geheugenachtig fenotype aan dat een uniek weefselspecifiek lot en functie heeft, vaak gericht op trafficking en weefselhomeostase12. Bovendien zijn weefsel-residente geheugen-T-cellen (Trms) meestal meer klonaal beperkt dan die in omloop13. Bepalen hoe en waarom antigenen de verblijfplaats van T-cellen in NLT aansturen, is van cruciaal belang om te begrijpen hoe het immuunsysteem beschermt tegen infectie, weefselhomeostase handhaaft en soms overgaat in auto-immuniteit. Er lijkt echter een grotere slijtage te zijn tussen weefsel-residente T-cellen uit de longen in vergelijking met andere NLT14. Dienovereenkomstig wordt het vermogen om endogene T-cellen van de long met een bepaalde antigeenspecificiteit te identificeren en te karakteriseren beperkt door hun inherente zeldzaamheid.

Door het gebruik van celverrijkingstechnieken op basis van magnetische kralen en peptide:MHC-tetrameerkleuring te combineren, zijn we erin geslaagd om uitgebreide maar zeldzame zelfantigeenspecifieke T-cellen in muizenlongen te detecteren15,16. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een protocol dat we hebben geoptimaliseerd om elke zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulatie die aanwezig is in muizenlongen betrouwbaar te isoleren en te karakteriseren (Figuur 1). Dit protocol omvat een in vivo antilichaamkleuringsstap om weefselresidente van vasculaire T-cellente onderscheiden 17, gevolgd door twee verschillende methoden voor de verwerking van longweefsel om tegemoet te komen aan de beschikbaarheid van hulpbronnen. Dit wordt dan gevolgd door een algemene stap van magnetische verrijking van T-cellen, tetrameerkleuring en analyse door middel van flowcytometrie. De levensvatbaarheid van de cellen en de tetrameerkleuring worden in dit protocol verder verbeterd door de toevoeging van aminoguanidine, dat induceerbare stikstofmonoxidesynthase (iNOS)-gemedieerde T-celactiveringsgeïnduceerde apoptose18 blokkeert en Dasatinib, dat de TCR-downregulatie19 beperkt. De stappen die in dit protocol worden benadrukt, maken gebruik van gangbare technieken en direct beschikbare reagentia, waardoor het toegankelijk is voor bijna elke onderzoeker die zich bezighoudt met muizen-T-celimmunologie en zeer aanpasbaar is voor een verscheidenheid aan stroomafwaartse analyses. Hoewel naïeve T-cellen waarschijnlijk niet in de longen worden gevonden, geloven we dat dit protocol bijzonder nuttig zal zijn voor de studie van zelf-antigeenspecifieke T-cellen en Trm's in de longen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de protocolworkflow. Longen worden geoogst van muizen en gedissocieerd in enkele cellen. Monsters worden vervolgens verrijkt voor T-cellen voordat ze worden gekleurd met peptide:MHC-tetrameren en fluorescerend gelabelde antilichamen voor flowcytometrische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd en ontwikkeld in overeenstemming met de richtlijnen die zijn uiteengezet door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Massachusetts General Hospital, een door de American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) geaccrediteerd dierbeheerprogramma. Experimenten werden uitgevoerd op 8-12 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen met een C57BL/6 genetische achtergrond, gefokt en onderhouden in de MGH-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden.

1. Voorbereiden van voorraadoplossingen

  1. Bereid de HEPES-buffer voor door 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 150 mM NaCl en 1 mM MgCl2 op te lossen en aan te passen aan pH 7.4.
  2. Bereid 10x Liberase bouillonoplossing door 700 μg/ml Liberase Thermolysin Medium (TM) (zie Materiaaltabel) op te lossen in Hank's Balanced Salt Solution met Ca++ en Mg++ (zie Materiaaltabel).
  3. Bereid 10x aminoguanidine bouillonoplossing door 100 mM Aminoguanidine Hemisulfaat Zout (zie Materiaaltabel) op te lossen in Hank's Gebalanceerde Zoutoplossing met Ca++ en Mg++ (zie Tabel met Materialen).
  4. Bereid het volledige Eagle's Ham's Amino Acids (EHAA) medium door EHAA-medium (zie Materiaaltabel) te mengen met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline/streptomycine, 50 μg/ml gentamycine, 2 mM L-glutamine en 55 μM 2-mercaptoethanol.
    OPMERKING: Andere veelgebruikte T-celmedia, zoals RPMI of DMEM, kunnen ook worden gebruikt.
  5. Bereid de sorteerbuffer voor door 1x PBS te mengen met 2% FBS en 0,05% natriumazide.
  6. Bereid het Fc-blok voor door gezuiverd anti-muis CD16/32-antilichaam (zie materiaaltabel) te verdunnen bij 1:100 v/v in de sorteerbuffer.
  7. Bereid Liberase TM/DNase-digestieoplossing door 100 μg/ml Liberase TM en 50 μg/ml DNase I (zie materiaaltabel) toe te voegen aan RPMI 1640-medium zonder L-glutamine (zie materiaaltabel).
  8. Bereid het mengsel van ketamine en xylazine voor door 10 mg/ml ketamine (zie de materiaaltabel) en 1 mg/ml xylazine (zie de materiaaltabel) toe te voegen in een normale zoutoplossing (0,9% NaCl) (zie de materiaaltabel).

2. Het genereren van eencellige suspensie uit longweefsel via geautomatiseerde weefseldissociator

  1. Bereid voor elke muis 4 ml ijskoude HEPES-buffer in een speciale weefseldissociatorbuis (zie Materiaaltabel) en bewaar deze op ijs.
  2. Verdoof muizen door intraperitoneale injectie van 150-200 μL ketamine/xylazine-mengsel. Injecteer 1-3 μg fluorofoor-geconjugeerd anti-muis CD45-antilichaam (zie materiaaltabel) verdund in 100 μL normale zoutoplossing intraveneus in elke verdoofde muis. Euthanaseer de muis 3 minuten na toediening van antilichamen met een intraperitoneale injectie van 500-600 μL ketamine/xylazine-mengsel.
  3. Reseceer de longen en plaats ze in hun respectievelijke weefseldissociatorbuis, gekoeld op ijs. Plaats de buisjes op de geautomatiseerde weefseldissociator (zie Materiaaltabel) en voer het eerste programma (vooraf ingesteld programma) voor longweefsel uit.
  4. Voeg 500 μL Libasase-bouillonoplossing en 500 μL aminoguanidine-bouillonoplossing toe aan elk buisje met het gedissocieerde longweefsel. Incubeer op een notenmenger gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  5. Plaats de buisjes terug op de dissociator en voer het tweede programma (vooraf ingesteld programma) voor longweefsel uit.
  6. Giet de eencellige suspensie uit de weefseldissociatorbuis door een celzeef van 100 μm (zie Materiaaltabel) in een conische buis van 50 ml. Spoel de weefseldissociatorbuis met 5 ml volledige EHAA (of een gelijkwaardig T-celmedium) en passeer deze door de zeef in de buis van 50 ml.
  7. Verwijder de zeef en verhoog het volume van de celsuspensie tot 50 ml met volledige EHAA. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en laat ongeveer 100 μl supernatans en celkorrel achter.
  8. Voeg ongeveer 100 μL Fc Block-oplossing toe om het totale volume op 200 μL te brengen en draai krachtig om de pellet te resuspenderen.

3. Alternatief protocol: het genereren van eencellige suspensie uit longweefsel via handmatige dissociatie

  1. Bereid voor elke muis 1 ml volledige EHAA in een buisje van 1,5 ml microfuge en bewaar op ijs.
  2. Verdoof muizen door intraperitoneale injectie van 150-200 μL ketamine/xylazine-mengsel. Injecteer 1-3 μg fluorofoor-geconjugeerd anti-muis CD45-antilichaam verdund in 100 μL normale zoutoplossing intraveneus in elke verdoofde muis. Euthanaseer de muis 3 minuten na toediening van antilichamen met een intraperitoneale injectie van 500-600 μL ketamine/xylazine-mengsel.
  3. Reseceer de longen en plaats ze in hun respectievelijke 1,5 ml microfuge-buisje gekoeld op ijs.
  4. Zodra alle longen zijn geoogst, brengt u elke long over in een verse microfuge-buis zonder celmedia.
  5. Snijd de longen in kleine fragmenten (brokken van ~2-3 mm) met een schaar in de microfuge-buis.
  6. Voeg 1 ml Liberase TM/DNase I digestiecocktail toe aan elke tube.
  7. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een waterbad. Leg de monsters daarna terug in het ijs om oververtering te voorkomen.
  8. Giet het monster over een celzeef van 100 μm die op een conische buis van 50 ml is geplaatst. Stamp het weefsel tegen het gaas met het rubberen uiteinde van de zuiger van een steriele spuit van 1 ml.
  9. Spoel de zeef af met een koudesorteerbuffer en verzamel een uiteindelijk volume van 7 ml in de buis. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op, zodat er ongeveer 100 μl supernatans en celkorrel overblijft.
  10. Voeg 100 μL Fc Block-oplossing toe om het totale volume op 200 μL te brengen en draai krachtig om de pellet te resuspenderen.

4. Verrijking van het longmonster voor T-cellen via magnetische parelverrijking

  1. Voeg 50 μL anti-muis CD90.2 microbeads toe (zie Materiaaltabel). Draai en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: CD90.2 komt overeen met het allel dat tot expressie wordt gebracht door T-cellen in C57BL/6-muizen. Controleer het allelgenotype als er andere muizenstammen worden gebruikt.
  2. Plaats intussen een paramagnetische celscheidingskolom (zie Materiaaltabel) op een celscheidingsmagneet met één of vier standen (zie Materiaaltabel). Plaats een open conische buis van 15 ml onder elke kolom om de doorstroming op te vangen. Vul de kolom met 3 ml koudesorteerbuffer, zodat de kolom door de zwaartekracht in de conische buis eronder kan wegvloeien.
  3. Zodra de cellen gedurende 10 minuten met de microbeads zijn geïncubeerd, voegt u de koudesorteerbuffer toe tot een volume van 1 ml en brengt u deze over door een celzeef van 100 μm die bovenop de kolom is geplaatst. Vang de kolomstroom op in een verse conische buis van 15 ml die onder de kolom wordt geplaatst.
  4. Zodra de celsuspensie door de zwaartekracht volledig door de kolom is afgevoerd, wast u de kolom door de originele buis te spoelen met een extra 3 ml koudesorteerbuffer en deze door het gaas op de kolom aan te brengen, waardoor de zeef wordt gespoeld. Verwijder de zeef.
  5. Wanneer het monster weer volledig in de kolom is weggevloeid en er geen verdere doorstroming uit de kolom komt, verwijdert u de kolom van de magneet en plaatst u deze op een verse conische buis van 15 ml.
  6. Voeg 5 ml koudesorteerbuffer toe aan de kolom.
  7. Elueer onmiddellijk de cellen die aan de kolom zijn gebonden door de kolomzuiger in één continue beweging naar boven te duwen en de sorteerbuffer uit de onderkant van de kolom in de nieuwe buis te duwen.
  8. Centrifugeer de geëlueerde monsters bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en laat ongeveer 100 μl supernatans en celkorrel achter.
  9. Voeg 100 μL koudesorteerbuffer toe om het totale volume op 200 μL te brengen en draai krachtig om de pellet te resuspenderen.
  10. Analyseer desgewenst het doorstroommonster met de ongebonden celfractie.

5. Kleuring van de antigeenspecifieke T-cellen met peptide:MHC-tetrameren

  1. Voeg 1 μL 10 μM Dasatinib (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster, vortex, en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
  2. Voeg PE- of APC-geconjugeerd peptide:MHC-tetrameer toe tot een eindconcentratie van 10 nM (of empirisch geoptimaliseerde concentratie voor een bepaald tetrameer).
  3. Vortex en incubeer in het donker gedurende 1 uur bij RT (of empirisch geoptimaliseerde tijd en temperatuur).

6. Analyse van de tetrameer-gelabelde T-cellen door middel van flowcytometrie

  1. Terwijl het monster wordt gekleurd met peptide:MHC-tetrameren, bereidt u een mastermix van antilichamen voor om de oppervlaktemarkers van de cellen te kleuren (tabel 1).
    OPMERKING: Vermijd fluoroforen die in conflict zijn met het intraveneus toegediende CD45-antilichaam of de tetrameren.
  2. Met nog 15 minuten over in de incubatietijd voor tetrameerkleuring, voegt u oppervlakte-antilichaam-mastermix van 1:100 (of empirisch geoptimaliseerde concentratie) toe aan elk monster.
  3. Blijf in het donker bij RT broeden gedurende de rest van de incubatietijd van 1 uur.
  4. Voeg 50.000 flowcytometrie telparels toe (zie Materiaaltabel) en voeg een koudesorteerbuffer toe tot een eindvolume van ongeveer 5 ml. Centrifugeer het gekleurde monster bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en laat ongeveer 100 μl supernatans en cel-/kraalpellet achter.
  5. Resuspendeer het monster met een extra sorteerbuffer van 200 μl en breng het monster over naar een 5 ml fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buis.
  6. Analyseer het monster op een flowcytometer. Verzamel zoveel mogelijk cellen, tot een maximum van 2.500.000 gebeurtenissen in totaal. Zorg ervoor dat er ten minste 20.000 count bead-events zijn verzameld. Houd het acquisitiepercentage op of onder de 5.000 gebeurtenissen per seconde.
  7. Sla alle gegevens op als FCS-bestanden.

  

FluorochroomAntistof
BUV395 zei:CD90.2
Pacifisch blauwCD45 (eerder toegevoegd door i.v. injectie)
Pacifische OranjeCD8
Briljant Violet 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Stortplaats (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEpMHC-tetrameer of fenotypische marker
PE-Cy7Fenotypische marker (bijv. CD44, PD-1, CD69, enz.)
APCpMHC-tetrameer of fenotypische marker
AlexaFluor 700Fenotypische marker (bijv. CD44, PD-1, CD69, enz.)
APC-Cy7Levende/dode vlek

Tabel 1: Voorbeeld kleuringsmatrix. Een typisch panel van fluorofoor-geconjugeerde flowcytometrie-antilichamen die worden gebruikt voor het identificeren en karakteriseren van antigeenspecifieke T-cellen.

7. Analyseren van gegevens

  1. Analyseer de FCS-gegevensbestanden met behulp van de juiste flowcytometriesoftware.
    1. Stel een sequentie van opeenvolgende inclusiepoorten in om 1) lymfocytachtige, 2) enkelvoudige, 3) levende, 4) extravasculaire, 5) dump-negatieve en 6) CD90.2-positieve gebeurtenissen te identificeren die CD4- of CD8-positief zijn (Figuur 2).
    2. Identificeer de tetrameer-positieve T-cellen binnen deze populaties.
  2. Bepaal het absolute tetrameer-positieve celgetal door de verhouding van het aantal toegevoegde parels (50.000) te berekenen tot het aantal kralen dat tijdens de monsterrun is verzameld en de waarde te vermenigvuldigen met het totale aantal verzamelde tetrameer-positieve cellen.
    figure-protocol-1

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 toont de representatieve poortstrategie die wordt gebruikt bij de identificatie van zeldzame antigeenspecifieke CD4+ T-cellen in de longen met peptide:MHC klasse II-tetrameren. Hetzelfde proces kan worden toegepast voor antigeenspecifieke CD8+ T-cellen met peptide:MHC klasse I-tetrameren (gegevens niet getoond).

Vanwege het hoge aantal niet-lymfoïde cellen in de longen, vereist de betrouwbare detectie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen door tetrameer een vorm van voorafgaande verrijking voor de T-cellen van belang om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Figuur 3 illustreert de werkzaamheid van de CD90.2-antilichaam-gebaseerde magnetische verrijking van totale T-cellen uit longweefsel die we in dit protocol hebben beschreven. Gemiddeld herstellen we via dit verrijkingsproces meer dan 99% van alle CD90.2+ T-cellen uit de longen met een zuiverheid van meer dan 90%. Figuur 4 illustreert de verbeterde detectie van zeldzame tetrameer-positieve CD4+ T-cellen als gevolg van deze verrijking versus geen verrijking of een directe tetrameer-gebaseerde celverrijkingsstrategie.

Figuur 5 illustreert de verbeterde tetrameer-labeling van antigeenspecifieke T-cellen die met Dasatinib worden behandeld, met name in zeldzame populaties.

figure-results-1
Figuur 2: Gatingstrategie voor flowcytometrieanalyse. Sequentiële in- en exclusiepoorten die worden gebruikt om zeldzame zelfantigeenspecifieke CD4+ T-cellen te identificeren die zich ophopen in de longen na acuut weefselletsel. Tel kralen kunnen direct worden geïdentificeerd op basis van hun fluorescentie langs het FITC-kanaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: CD90.2 antilichaam-gebaseerde magnetische verrijking van totale T-cellen in de longen. Representatieve flowcytometriegrafieken worden weergegeven voor de ongebonden (links) en gebonden (rechts) fracties van een longmonster na verrijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4: Vergelijking van celverrijkingsstrategieën om de detectie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen in de longen te vergemakkelijken. Drie muizen die een model-zelfantigeen in longepitheel tot expressie brachten, werden subcutaan geïmmuniseerd met een peptide-epitoop van het zelfantigeen geëmulgeerd in Complete Freund's Adjuvans (CFA). Na 7 dagen werden de longen van muizen geoogst, gecombineerd en gesplitst in drie gelijke monsters voor tetrameerkleuring zonder celverrijking (links), CD90.2-celverrijking op basis van antilichamen (midden) of op tetrameer gebaseerde celverrijking (rechts). Monsters werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie voor niet meer dan 1.500.000 totale gebeurtenissen (CD4+ gated events getoond). Het aantal tetrameer-positieve voorvallen wordt in het zwart genoteerd, terwijl het berekende totale aantal antigeenspecifieke T-cellen in de longmonsters in het rood wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 5: Behandeling met Dasatinib verbetert de tetrameerkleuring. Wildtype muizen (links) of muizen die een model-zelfantigeen tot expressie brachten in longepitheel (rechts) werden subcutaan geïmmuniseerd met een peptide-epitoop van het zelf-antigeen dat in CFA werd geëmulgeerd. De milten en lymfoïde organen van de muizen werden geoogst, gecombineerd en gesplitst in twee gelijke monsters voor labeling met peptide:MHC klasse II-tetrameren met of zonder voorbehandeling met dasatinib. Histogrammen van tetrameerkleuring worden over elkaar heen gelegd, waarbij monsters worden vergeleken die zijn behandeld met (rood) en zonder (blauw) dasatinib. De mediane fluorescentie-intensiteit van elk monster wordt aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerdere karakteriseringen van antigeenspecifieke T-cellen uit de longen hebben geprofiteerd van het robuuste aantal antigeenspecifieke T-cellen dat zich uitbreidt na een acute priming-gebeurtenis zoals intranasale immunisatie of infectie 20,21,22. Zeldzamere T-celpopulaties in de longen, zoals zelf-antigeenspecifieke T-cellen of weefsel-residente geheugen-T-cellen, zijn echter moeilijk te detecteren zonder enige vorm van monsterverrijking voor de T-cellen van belang 15,16,23. We hebben dit doel bereikt door longweefseldissociatietechnieken die eerder zijn beschreven om een hoog percentage levensvatbare lymfocyten24,25 op te leveren, te combineren met een strategie om intravasculair onderscheid te maken tussen parenchymale T-cellen en een algemeen op T-cellen gebaseerd verrijkingsproces gevolgd door tetrameerkleuring17. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat we in staat zijn om zeldzame T-cellen te identificeren en te karakteriseren die specifiek zijn tegen zelfantigenen in de longen die ontstaan als reactie op directe immunisatie met exogeen peptide of indirecte activering door antigeenafgifte tijdens weefselbeschadiging15,16. Bij de ontwikkeling van dit protocol zijn verschillende overwegingen gemaakt.

We hebben twee verschillende protocollen voor de verwerking van longweefsel beschreven die goed hebben gewerkt. De ene omvat het gebruik van een geautomatiseerd weefseldissociatie-instrument, terwijl de andere vertrouwt op een handmatig proces. Belangrijk is dat beide methoden gebruik maken van Liberase TM, een mengsel van collagenase I en II dat ook een metalloprotease thermolysine bevat. Van deze enzymmix is aangetoond dat het de spijsverteringsactiviteit verhoogt ten opzichte van een enkele collagenasecocktail en het is aangetoond dat het goed werkt bij het herstel van leukocyten uit longweefsel26.

Het geautomatiseerde weefseldissociatieprotocol vereist hoge initiële kosten voor de machine en gespecialiseerde weefseldissociatiebuizen, maar de buizen kunnen worden gewassen en hergebruikt, samen met celzeven, die over het algemeen ook herbruikbaar zijn. Het handmatige dissociatieprotocol brengt niet de initiële kosten van gespecialiseerde apparatuur met zich mee, maar het is arbeidsintensief en verlengt de oogst omdat elk monster afzonderlijk wordt gehakt. Er zijn andere verschillen tussen de protocollen met betrekking tot het gebruik van aminoguanidine of DNase I om celdood en celklontering te beperken, maar we hebben de impact van deze additieven niet zorgvuldig vergeleken. De beslissing om een van beide protocollen te gebruiken, moet afhangen van persoonlijke ervaring met het type onderzoek dat wordt uitgevoerd, evenals de beschikbaarheid van een geautomatiseerd weefseldissociatie-instrument, dat de grootste kostenfactor zou zijn. Elementen van de twee protocollen kunnen inderdaad worden gemengd en afgestemd om de beste prestaties te leveren voor de specifieke behoeften van het onderzoek.

Het bovengenoemde protocol sluit met name het gebruik uit van een dichtheidsgradiënt om lymfocyten te isoleren uit de eencellige suspensie die is bereid uit weefseldissociatie. We hebben ontdekt dat de magnetische T-celverrijkingsstap die nodig is voor de identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen deze stap overbodig maakt. In gevallen waarin antigeenspecifieke T-celfrequenties hoog genoeg zijn om de noodzaak van een T-celverrijkingsstap helemaal te elimineren, wordt echter een dichtheidsgradiënt aanbevolen, omdat deze een aanzienlijke hoeveelheid doelcelverrijking zal bieden door een groot aantal niet-lymfoïde cellen te verwijderen. Bovendien, als de eencellige preparaten in de long bijzonder groot en/of rommelig zijn, kan voorafgaand aan magnetische verrijking een dichtheidsgradiëntstap worden gebruikt om overtollig celresten te verwijderen die later de kolommen zouden kunnen verstoppen (stappen 4.4-4.7).

We kozen voor een algemene verrijking van alle T-cellen op basis van de CD90 pan T-celmarker (CD90.2 voor het allel dat tot expressie komt in C57BL/6-muizen) in plaats van een meer directe tetrameer-gebaseerde celverrijkingsstrategie. Dit biedt verschillende voordelen. (1) Verrijking op basis van CD90 resulteert in een hoger aantal antigeenspecifieke voorvallen gedetecteerd bij flowcytometrie dan niet-verrijkte of tetrameergebaseerde verrijkingsmonsters (Figuur 4). Dit draagt bij aan betere schattingen van zeldzame antigeenspecifieke T-celfrequenties zonder dat er buitensporige aantallen totale gebeurtenissen (>2.500.000) hoeven te worden verzameld, wat de verzameltijden van monsters verlengt en de signaal-ruisresolutie verslechtert. (2) In tegenstelling tot verrijking op basis van tetrameer, maakt verrijking op basis van CD90 evaluatie mogelijk van het volledige T-celcompartiment van de long, inclusief CD4+ en CD8+ T-cellen, intravasculaire vs. extravasculaire T-cellen en antigeen-specifieke vs. antigeen-niet-specifieke, allemaal in één monster (Figuur 2). (3) Omdat de op CD90 gebaseerde verrijkingsstap plaatsvindt voorafgaand aan tetrameerkleuring, minimaliseert het de tijd voordat tetrameer-gelabelde cellen worden geanalyseerd op de flowcytometer, waardoor het potentiële signaalverlies door tetrameerloslating wordt beperkt.

Het T-celverrijkingsproces in dit protocol is gebaseerd op positieve selectie met CD90.2 magnetische kralen, maar vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt met negatieve selectiestrategieën die worden geboden door CD4-, CD8- of pan-T-celisolatiekits. We beschrijven het gebruik van een specifiek merk microbeads, kolommen en magneten, maar andere magnetische verrijkingssystemen zouden ook moeten werken. Nogmaals, beslissingen moeten worden genomen op basis van de prestaties in het specifieke onderzoek dat wordt uitgevoerd en op de totale kosten, die aanzienlijk kunnen zijn. In onze ervaring met verrijkingsprotocollen is er een algemene afweging tussen de opbrengst van doelcellen en de zuiverheid, en voor het detecteren van uiterst beperkte aantallen antigeenspecifieke T-cellen heeft de opbrengst voorrang.

Hoewel de representatieve resultaten experimenten weergeven met CD4+ T-cellen en peptide:MHC klasse II-tetrameren, is dit protocol net zo effectief voor CD8+ T-cellen en peptide:MHC klasse I-tetrameren. In dergelijke gevallen moet rekening worden gehouden met de mogelijk verschillende omstandigheden die vereist zijn voor tetrameerkleuring van klasse I (concentratie, tijd, temperatuur). Bovendien zien we geen redenen die het gebruik ervan voor antigeenspecifieke B-celstudies met geschikte fluorochroom-gelabelde B-celantigeenreagentia uitsluiten27.

Ten slotte omvat het hier beschreven protocol de toevoeging van de proteïnekinaseremmer Dasatinib aan het monster voorafgaand aan de tetrameerkleuring. Dasatinib blokkeert TCR-signalering en internalisatie, wat de tetrameer-labeling van T-cellen verbetert en mogelijk ook de tetrameer-geïnduceerde T-celdood vermindert19. We vonden het voordeel van behandeling met Dasatinib het meest prominent in de detectie van de zeldzamere zelfantigeenspecifieke populatie. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat zelf-antigeenspecifieke T-cellen TCR met een lagere affiniteit tot expressie brengen als gevolg van de effecten van negatieve selectie tijdens centrale tolerantie 28,29,30,31.

Het hier gebruikte protocol is met succes gecombineerd met intracellulaire kleuringsprotocollen om transcriptiefactor en cytokine-expressie te analyseren in zeldzame long-residente antigeen-specifieke T-cellen. We hebben deze zeldzame populaties ook met succes gesorteerd voor stroomafwaartse analyses, waaronder single-cell transcriptomics en TCR-sequencing. Het voortdurende gebruik en de ontwikkeling van dit protocol zou studies naar adaptieve immuniteit in de pathofysiologie van de longen enorm ten goede moeten komen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken L. Kuhn voor de technische ondersteuning bij de weefselverwerking en de productie van tetrameren. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 AI107020 en P01 AI165072 aan J.J.M., T32 AI007512 aan D.S.S.), het Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M.) en het Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm cell strainerFisher Scientific22-363-549
10x PBS zonder Ca++ of Mg++Corning46-013-CM
1x PBS zonder Ca++ of Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Aminoguanidine HemisulfaatzoutSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbeads, muisMiltenyi130-121-278
Celscheidingsmagneet (MidiMACS scheider)Miltenyi130-042-302Houdt een LS-kolom vast
Celscheidingsmagneet (QuadroMACS scheider)Miltenyi130-090-976Houdt 4 LS-kolommen vast
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s aminozuurmediumSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235Geautomatiseerde weefseldissocieerder
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237Automatische weefseldissocieerbuizen
Hank's gebalanceerde zoutoplossing met Ca++ of Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anti-muis CD45-antilichaam (Clone: 30-F11)Biolegend103126
Paramagnetische celscheidingskolommen (LS-kolommen)Miltenyi130-042-401Komt met plunjer
Gezuiverd anti-muis CD16/32-antilichaam (Clone: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 medium zonder L-glutamineCorning15-040-CM
Natriumchloride 0,9% (Normale zoutoplossing)CytivaZ1376
XylazinPivetalNDC 466066-750-02

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Peptide MHC tetramerenimmunologie van de muizenlongweefselresidente T cellenmagnetische verrijkingflowcytometriedissociatie van longweefselgeheugen T cellenceloppervlaktemarkersT celisolatie

Gerelateerde artikelen