Methodenartikel

Bereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en kleuring van intracellulaire moleculen voor analyse met flowcytometrie

DOI:

10.3791/66945

⸱

26 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven protocollen voor de voorbereiding van een enkele cel suspensie van epitheliale cellen uit de thymus van muizen en de kleuring van intracellulaire moleculen voor flowcytometrische analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thymische epitheliale cellen (TEC's) spelen een essentiële rol bij het bevorderen van de ontwikkeling en repertoireselectie van T-cellen. Corticale TEC's (cTEC's) in de thymische cortex induceren vroege T-cel ontwikkeling en positieve selectie van corticale thymocyten. In tegenstelling daarmee trekken medullaire TEC's (mTEC's) in de thymische medulla positief geselecteerde thymocyten uit de cortex aan en vestigen zelftolerantie in T-cellen. Een verscheidenheid aan moleculen, waaronder DLL4 en beta5t geëxpreseerd in cTEC's, evenals Aire en CCL21 geëxpreseerd in mTEC's, dragen bij aan de thymusfunctie die de ontwikkeling en selectie van T-cellen ondersteunt. Flowcytometrische analyse van functioneel relevante moleculen in cTEC's en mTEC's is nuttig om ons begrip van de biologie van TEC's te verbeteren, hoewel huidige methoden voor de bereiding van single-cell suspensies van TEC's slechts een klein deel van de TEC's (ongeveer 1% voor cTEC's en ongeveer 10% voor mTEC's) uit de thymus van jonge volwassen muizen kunnen terughalen. Omdat veel van deze functioneel relevante moleculen in TEC's in de cellen gelokaliseerd zijn, beschrijven we onze protocollen voor de bereiding van single-cell suspensies van muis TEC's en de kleuring van intracellulaire moleculen voor flowcytometrische analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De thymus is een epitheel-mesenchymaal orgaan dat de ontwikkeling en repertoireselectie van T-lymfocyten bevordert. In de corticale en medullaire micro-omgevingen in de thymus spelen thymische epitheelcellen (TEC's) een cruciale rol bij het richten van T-celontwikkeling en selectie. Het is algemeen aanvaard dat corticale TEC's (cTEC's) in de thymische cortex voornamelijk bijdragen aan de inductie van vroege T-celontwikkeling en positieve selectie van nieuw gegenereerde T-celreceptor (TCR)-expresserende thymocyten. In tegenstelling hiermee zijn medullaire TEC's (mTEC's) in de thymische medulla essentieel voor de aantrekking van positief geselecteerde thymocyten uit de cortex en de totstandbrenging van centrale zelftolerantie door het elimineren van zelfreactieve T-cellen en door het genereren van regulatorische T-cellen1,2. Deze functies van TEC's bij het ondersteunen van T-celontwikkeling en selectie worden gemedieerd door een verscheidenheid aan moleculen die tot expressie worden gebracht in cTEC's en mTEC's.

Deze omvatten Delta-like ligand 4 (DLL4), belangrijk voor T-cel-lineagespecificatie van lymfoïde voorlopercellen)3,4, beta5t (ook bekend als Psmb11, belangrijk voor positieve selectie van CD8 T-cellen)5,6, en Prss16 (ook bekend als thymus-specifiek serine protease, of TSSP, belangrijk voor positieve selectie van CD4 T-cellen)7,8 tot expressie gebracht in cTEC's, en Auto-immuunregulator (Aire, belangrijk voor promiscue expressie van zelfgenen)9,10, Fez-familie zinkvingerachtige 2 (Fezf2, belangrijk voor promiscue expressie van Aire-onafhankelijke zelfgenen en de generatie van thymische tuft-cellen)11,12,13,14, en C-C-motief chemokine-ligand 21 (CCL21, belangrijk voor medullaire migratie en accumulatie van positief geselecteerde thymocyten)14,15,16 tot expressie gebracht in mTEC's. Flow cytometry biedt een middel voor het kwantitatief detecteren van deze functioneel significante moleculen in TEC's, waardoor de beoordeling van zowel de ontwikkeling als de functie van cTEC's en mTEC's wordt vergemakkelijkt. Aangezien veel van de moleculen in TEC's voornamelijk binnen de cellen tot expressie worden gebracht, zoals in het cytoplasma (bijv. proteasoomcomponent beta5t) en de kern (bijv. transcriptionele regulator Aire), is het voordelig om intracellulaire moleculen in cTEC's en mTEC's kwantitatief te analyseren met behulp van flow cytometry.

TEC's zijn zeldzaam in de thymus. Een vrouwelijke muis van 5 weken oud heeft ongeveer 1 × 106 cTEC's en ongeveer 2,5 × 106 mTEC's, terwijl de thymische cortex ongeveer 3 × 108 CD4+CD8+ thymocyten en de thymische medulla ongeveer 5 × 107 CD4+CD8- en CD4-CD8+ thymocyten bevat17. Daarom is de overgrote meerderheid (>99%) van de cellen in de thymus hematopoëtische cellen, inclusief thymocyten, in plaats van TEC's, bij jonge volwassen muizen. Bovendien zijn TEC's nauw verbonden met naburige cellen (bijv. thymocyten) en architecturale extracellulaire componenten (bijv. collageen) binnen de thymus, zodat de bevrijding van TEC's in celsuspensie vereist dat de thymus met proteasen wordt verteerd. Conventionele methoden voor enzymatische vertering leveren slechts een klein deel van TEC's op; ongeveer 1% (1 × 104) en 10% (2 × 105) voor cTEC's en mTEC's, respectievelijk, van 5-weken-oude muis thymus17,18,19. De lage efficiëntie van TEC-bevrijding uit de thymus is waarschijnlijk te wijten aan de gevoeligheid van TEC's voor proteolytische enzymen en mechanische stress en de strakke associatie van TEC's met naburige cellen, met name tussen cTEC's en CD4+CD8+ thymocyten20. In dit opzicht zijn de resultaten van single-cell-analyse van muis TEC's, inclusief flow cytometrische analyse en single-cell RNA-sequencing-analyse, gebaseerd op huidige enzymatisch vertering-gemedieerde celbereidingsmethoden representatief voor slechts een klein deel van TEC's en dus verre van alomvattend. Niettemin, ondanks dergelijke beperkingen in de enzymatische opname van TEC's, is flow cytometrische analyse van muis TEC's in single-cell-suspensie nog steeds nuttig voor de kwantitatieve analyse van functioneel relevante moleculen in cTEC's en mTEC's. In celsuspensie zijn TEC's gedefinieerd als cellen die positief zijn voor epitheeloppervlaktemolecuul EpCAM (CD326) en negatief voor hematopoëtische oppervlaktemolecuul CD45. Binnen EpCAM+CD45- TEC's zijn celoppervlakte-expressieniveaus van Ly51-moleculen (ook bekend als BP-1 en CD249) en Ulex Europaeus agglutinine I (UEA1) bindingscapaciteit (primair binden aan glycoproteïnen en glycolipiden die α-gekoppelde fucose bevatten) gebruikt om cTEC's (Ly51highUEA1low) en mTEC's (Ly51lowUEA1high) fenotypisch te markeren. Hier beschrijven we

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muizenexperimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van het Animal Care and Use Committee van het National Cancer Institute (ASP21-431, ASP21-432, en EIB-076-3).

1. Bereiding van thymuscelsuspensie

OPMERKING: De ontwikkeling van muizen heeft invloed op de efficiëntie van enzymatische bevrijding van TEC's uit de thymus. Er worden drie methoden beschreven, afhankelijk van de leeftijd van de muis, als volgt.

  1. Voor postnatale muizen ouder dan 3 weken
    1. Verzamel de thymus (twee thymuslobben) van één muis. Plaats de thymus in 5 mL RPMI1640 met 10 mM HEPES in een 60 mm plastic schaal op ijs.
    2. Verwijder bloed, niet-thymusweefsels en vet met gebogen fijne pincetten onder een dissectiemicroscoop. Snijd de thymus in kleine stukjes (ongeveer 1-2 mm groot) met dissectie schaar.
    3. Breng de thymusstukken over naar een 15 mL conische buis met 3 mL van 1 mg/mL Collagenase/Dispase, en 1 U/mL DNase oplossing in RPMI1640 met 2% foetaal runderserum (FBS). Incubeer in een waterbad of een heatblock bij 37 °C gedurende 20 minuten.
    4. Meng voorzichtig met een 3 mL plastic transferpipet. Incubeer nogmaals gedurende 20 minuten indien de weefselfragmenten nog zichtbaar zijn.
    5. Meng voorzichtig met een 3 mL plastic transferpipet. Incubeer nogmaals gedurende 10 minuten indien de weefselfragmenten nog zichtbaar zijn.
    6. Meng voorzichtig met een 3 mL plastic transferpipet. Voeg 5 mL van 5 mM EDTA in 1x HBSS met 1% FBS toe.
    7. Filter de celsuspensie door een 60 µm nylon gaas en in een nieuwe 50 mL conische buis. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
    8. Resuspendeer het celpellet in 10 mL FACS buffer (1x HBSS met 1% bovien serumalbumine [BSA] en 0,1% NaN3).
    9. Bewaar de cellen op ijs en bepaal het aantal cellen met behulp van een celteller.
  2. Voor neonatale muizen tussen 1 en 2 weken oud
    1. Voer stap 1.1.1 uit.
    2. Verwijder bloed en niet-thymusweefsels met dissectiepincetten onder een dissectiemicroscoop. Breng de thymus over naar een 1,5 mL plastic buis met 200 µL RPMI1640 met 10 mM HEPES en snijd de thymus in kleine stukjes (ongeveer 1-2 mm groot) met dissectie schaar.
    3. Laat de thymusfragmenten naar de bodem van de buis zakken en verwijder vervolgens voorzichtig de suspensie met een 200 µL micropipet.
    4. Breng de thymusstukken over naar een 5 mL polypropyleen ronde bodembuis met 2 mL van 0,5 mg/mL Collagenase/Dispase en 1 U/mL DNase oplossing in RPMI1640 met 2% FBS. Incubeer in een waterbad of een heatblock bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    5. Meng voorzichtig met een 3 mL plastic transferpipet en vervolgens met een 1 mL micropipet met een plastic tip voor verdere homogenisatie.
    6. Voeg 2 mL van 5 mM EDTA in 1x HBSS met 1% FBS toe. Filter de celsuspensie door een 60 µm nylon gaas en in een 50 mL conische buis. Voeg 16 mL RPMI1640 met 10 mM HEPES toe.
    7. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Resuspendeer het celpellet in 10 mL FACS buffer.
    8. Bewaar cellen op ijs en bepaal het aantal cellen met behulp van een celteller.
  3. Voor embryonale muizen en neonatale muizen tot 1 week oud
    1. Verzamel de thymus (twee thymuslobben) van één muis. Plaats de thymus in een 60 mm plastic schaal en verwijder bloed, niet-thymusweefsels en vet met gebogen fijne pincetten onder een dissectiemicroscoop.
    2. Plaats de thymus in 0,2 mL RPMI1640 met 10 mM HEPES in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Gooi de vloeistof weg met een 200 µL micropipet.
    3. Voeg 0,5 mL van 0,5 mg/mL Collagenase/Dispase en 1 U/mL DNase oplossing in RPMI1640 met 2% FBS toe. Incubeer in een waterbad of een heatblock bij 37 °C gedurende 10 minuten. Meng voorzichtig met een 1 mL micropipet met een plastic tip.
    4. Voeg 0,5 mL van 5 mM EDTA in 1x HBSS met 1% FBS toe. Filter de celsuspensie door een 60 µm nylon gaas en in een nieuwe 15 mL conische buis. Voeg 9 mL RPMI1640 met 10 mM HEPES toe.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Resuspendeer het celpellet in 1-3 mL FACS buffer.
    6. Bewaar cellen op ijs en bepaal het aantal cellen met behulp van een celteller.
  4. Alternatieve methode: Liberase digestie
    1. Voer stappen 1.1.1 en 1.1.2 uit.
    2. Laat de thymusfragmenten naar de bodem van de buis zakken; verwijder vervolgens voorzichtig de suspensie met een 200 µL micropipet. Breng de thymusstukken over naar een 5 mL buis met 1 mL van 0,5 U/mL Liberase en 1 U/mL DNase in RPMI1640 met 10 mM HEPES. Incubeer in een waterbad of een heatblock bij 37 °C gedurende 15 minuten.
    3. Meng voorzichtig met een 1 mL micropipet met een plastic tip. Incubeer nogmaals gedurende 1

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De analyse vereist een flowcytometer die de detectie van ten minste zes fluorescentiekanalen mogelijk maakt (voor CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye, en beta5t, CCL21, en/of Aire), evenals voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters. Representatieve flowcytometrische profielen van door Collagenase/Dispase verteerde thymuscellen van 0-dagen oude muizen en 2 weken oude muizen worden getoond in Figuur 1 en Figuur 2, respectievelijk. In beide figuren toont het dotplot in paneel A de voorwaartse verstrooiing (FSC) intensiteit en Ghost Dye Violet 510 fluorescentie intensiteit van totale particulaire signalen. Meer dan 90% van de particulaire signalen vertegenwoordigen levensvatbare cellen, zoals beoordeeld door negatieve kleuring door de Ghost Dye reagent en door voorwaartse verstrooiing die de celgrootte weergeeft. Paneel B toont celoppervlakte fluorescentie signalen van levensvatbare thymuscellen voor CD45, een molecuul dat wordt uitgedrukt door hematopoëtische cellen, en EpCAM, een molecuul dat wordt uitgedrukt door epitheliale cellen. Een kleine maar onderscheidende celpopulatie is CD45- EpCAM+, en vertegenwoordigt daarom TECs.

Flow cytometry analyse, celdifferentiatiegrafiek; CD markers, TEC populaties, histogrammen die mTECs/cTECs laten zien.
Figuur 1: Representatieve flowcytometrische profielen van door Collagenase/Dispase verteerde thymuscellen van 0-dagen oude wild-type C57BL/6-achtergrond muizen. (A) Voorwaartse verstrooiing intensiteit en Ghost Dye Violet 510 fluorescentie intensiteit van totale particulaire signalen. Rode vak geeft de signalen van levensvatbare cellen aan. (B) Fluorescentie signalen van levensvatbare cellen (rood vak in paneel A) voor CD45 en EpCAM. Rood vak geeft CD45- EpCAM+ TECs aan. (C) Ly51 en UEA1 celoppervlakte kleuring signalen in TECs (rood vak in paneel B) onthullen twee grote populaties: Ly51high UEA1low cellen verrijkt met cTECs en Ly51low UEA1high cellen verrijkt met mTECs. (D-F) Detectie van (D) beta5t, (E) CCL21, en (F) Aire in cTECs (bovenste panelen) en mTECs (onderste panelen) zoals gedefinieerd in paneel C. Grijze histogrammen tonen controle profielen gekleurd met (D,E) alleen secundaire antilichaam en (F) gekleurd met cellen van Aire-deficiënte muizen. Afkortingen: FSC = voorwaartse verstrooiing; TECs = Thymische epitheliale cellen; cTECs = corticale TECs; mTECs = medullaire TECs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Flow cytometry analyse van TECs met behulp van Ghost Dye-BV510 en EpCAM marker. Diagram benadrukt mTEC en cTEC populaties met specifieke markers Beta5t, CCL21, en Aire expressiedata.
Figuur 2: Representatieve flowcytometrische profielen van door Collagenase/Dispase verteerde thymuscellen van 2 weken oude wild-type C57BL/6-achtergrond muizen. (A) Voorwaartse verstrooiing intensiteit en Ghost Dye Violet 510 fluorescentie intensiteit van totale particulaire signalen. Rood vak geeft de signalen van levensvatbare cellen aan. (B) Fluorescentie signalen van levensvatbare cellen (rood vak in paneel A) voor CD45 en EpCAM. Rood vak geeft CD45- EpCAM+ TECs aan. (C) Ly51 en UEA1 celoppervlakte kleuring signalen in TECs (rood vak in paneel B) onthullen twee grote populaties: Ly51high UEA1low cellen verrijkt met cTECs en Ly51low UEA1high cellen verrijkt met mTECs. (D-F) Detectie van (D) beta5t, (E) CCL21, en (F) Aire in cTECs (bovenste panelen) en mTECs (onderste panelen) zoals gedefinieerd in paneel C. Grijze histogrammen tonen controle profielen gekleurd met (D,E) alleen secundaire antilichaam en gekleurd met (F) FITC-gelabeld isotype-gematcht IgG. Afkortingen: FSC = voorwaartse verstrooiing; TECs = Thymische epitheliale cellen; cTECs = corticale TECs; mTECs = medullaire TECs; FITC = fluoresceïne isothiocyanate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ly51 en UEA1 celoppervlakte kleuring signalen zoals getoond in paneel C onthullen twee grote populaties in TECs; een populatie relatief hoog in Ly51 en laag in UEA1 verrijkt met cTECs, en een andere relatief laag in Ly51 en hoog in UEA1 verrijkt met mTECs21,22,23,24,25.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collagenase, met of zonder Dispase, wordt veel gebruikt om de muizenthymus te verteren om TEC's voor te bereiden4,5,9,18,21. Liberase, dat een mix van proteasen bevat, waaronder collagenase, wordt ook gebruikt om de thymus te verteren om TEC's te bereiden17,22. Het gebruik van Collagenase en Liberase geeft in wezen equivalente opbrengsten en kwaliteit van cTEC's en mTEC's uit de muizenthymus, hoewel er kleine verschillen kunnen optreden, afhankelijk van de productbatch van de enzymen. Trypsine wordt ook gebruikt voor efficiënte vertering van de thymus21,23, hoewel is aangetoond dat veel celoppervlaktemoleculen, inclusief EpCAM en CD80 die door TEC's worden geëxpresseerd, gevoelig zijn voor trypsine-vertering21. Voor enzymatische vertering van de thymus wordt vaak DNase toegevoegd om de viscositeit te verminderen als gevolg van DNA-afgifte uit beschadigde cellen17,21.

Enzymatische vertering van de thymus is essentieel voor het vrijmaken van TEC's uit de thymus. De thymus moet voldoende worden verteerd totdat weefselfragmenten onzichtbaar worden en de celsuspensie homogeen lijkt. De vertering mag echter niet te lang worden gelaten omdat overmatig enzymatisch behandelen de cellen beschadigt en de cellevensvatbaarheid vermindert. In elk experiment is het belangrijk om zorgvuldig aandacht te besteden aan de incubatieperiode en de pipetteringssterkte tijdens de vertering van de thymus. Het is ook belangrijk om zich ervan bewust te zijn dat de huidige enzymatische verteringstechnologie slechts een kleine fractie van TEC's kan vrijmaken, zoals beschreven in de Inleiding en zoals eerder gerapporteerd17,18,19.

Omdat TEC's zeldzaam zijn in de totale thymuscelsuspensie, vereist flowcytometrische analyse van TEC's met behulp van totale thymuscelsuspensie het kleuren van veel cellen, typisch 8 x 106 tot 16 x 106 cellen per meting.

TEC's afgeleid van enzym-verteerde thymuscellen kunnen worden verrijkt met behulp van anti-CD45 magnetische kralen22 en/of Percoll dichtheidsgradiënt centrifugatie31. Deze verrijkingsprocedures besparen tijd, vooral wanneer TEC's vervolgens worden gezuiverd over een flowcytometrische celsorteerder. Het moet ook worden opgemerkt dat de anti-CD45 verrijking een subpopulatie van TEC's zou verwijderen die nauw verbonden zijn met CD45-expresserende thymocyten20 en dat de Percoll centrifugatie een onverwacht dichte subpopulatie van TEC's zou kunnen verwijderen.

Wat betreft de fixatie van TEC's, is bekend dat PFA-behandeling cellen verkleinen en de forward scatter intensiteit in flowcytometrische analyse vermindert. Zacht pipetten van cellen onmiddellijk na de toevoeging van 2% PFA en de daaropvolgende toevoeging van PBS kan helpen om overmatige celkrimp te voorkomen.

Voor flowcytometrische analyse, gezien het niet zo vaak voorkomen van TEC's in de thymus, vereist hun afbakening een aparte aanpak in vergelijking met thymocyten of splenocyten. De initiële classificatie is gebaseerd op het gebruik van CD45, een hematopoietisch pan-merkteken dat alomtegenwoordig is op thymocyten en andere hematopoietische cellen, inclusief dendritische cellen en macrofagen. Daarentegen ontbreekt TEC's, die van niet-hematopoietische oorsprong zijn, de expressie van CD45. In plaats daarvan, TEC's tonen EpCAM op hun oppervlak, waardoor een eenvoudige gating strategie van CD45-negatief en EpCAM-positief mogelijk is om TEC's te onderscheiden. In onze flowcytometrische analyse, beginnen we door deze populatie te definiëren en vervolgens zorgen we voor een geschikte schaling van voorwaartse en zijwaartse scatter parameters, gezien het aanzienlijke grootteverschil tussen TEC's en thymocyten, en gezien de grote omvang en hoge autofluorescentie van TEC's.

Vervolgens wordt de aandacht gericht op de evaluatie van cTEC- en mTEC-markers binnen de CD45-negatieve EPCAM-positieve populatie. Vanwege de kleine omvang van deze populatie, is deze stap noodzakelijk voor het compenseren van cTEC's en mTEC's. Onderzoek van een volledig gekleurd paneel (bijv. cTEC-marker Ly51 en mTEC-marker UEA-1 samen met TEC-definierende CD45 en EpCAM) zorgt verder voor de adequaatheid van scatter schaling. Tijdens de flowcytometrische setup, draait ons primaire doel om positieve en negatieve populaties voor elke antistof te onderscheiden.

Bij de co-kleuring van Aire, beta5t en CCL21, worden verschillende populaties binnen TEC-subsets geïdentificeerd. Gezien de selectieve expressie van Aire door mTEC's, concentreren we ons op de vierkleurige kleuring van CD45-negatief/EPCAM-positief/UEA-1-positief/Ly51-negatief cellen. Hier worden UEA-1-positieve cellen gebruikt om de negatieve controle voor Aire vast te stellen, waardoor duidelijke identificatie van Aire-positieve cellen mogelijk is. Een vergelijkbare aanpak wordt gevolgd voor CCL21, dat binnen mTEC's wordt geëxpresseerd. Daarentegen, voor beta5t, dat uitsluitend door cTEC's wordt geëxpresseerd, wordt een vergelijkbare gating strategie toegepast, met nadruk op Ly51-positieve cellen binnen de vierkleurige kleuring, om achtergrondniveaus voor beta5t te bepalen. Vervolgens analyse van monsters gekleurd met anti-beta5t vergemakkelijkt de identificatie van een positieve populatie.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Izumi Ohigashi voor het lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma ZIA BC 011806 van de National Institutes of Health, het National Cancer Institute en het Center for Cancer Research.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase/Dispase Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anti-mouse CD45 monoklonaal antilichaam, Clone 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly51 monoklonaal antilichaam, Clone 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 anti-muis EpCAM/CD326 monoklonaal antilichaam, Clone G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector LaboratoriesDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anti-muis Aire monoklonaal antilichaam, Clone 5H12eBioscience53-5934-82
Anti-muis Psmb11/beta5t konijn monoklonaal antilichaam, Clone CPTC-PSMB11(muis)-1NIH NCICPTC-PSMB11(muis)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anti-muis CCL21/exodus 2 konijn polyklonaal antilichaamBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-konijn IgG zwaar ketting geproduceerd in geiten antilichaamInvitrogenA27039
Anti-Muis CD32/CD16 – Gezuiverd (Fc Blok Antilichaam)Leinco TechnologiesC247
Nylon Mesh 60 MicronComponent SupplyW31436
Equipment
ThermomixerEppendorfHeat block
Cellometer Auto 2000 Celviabiliteit tellerNexcelomViable celtelling
LSRFortessa Cel AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometerVijf lasers (355, 408, 488, 595, en 637 nm)
FACSDiva software versie 9.0.1BD BiosciencesFlow cytometrische analyse
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesFlow cytometrische data-analyse
AntilichaamVerdunningssnelheid (werkende concentratie)Verdunningsbuffer
Anti-Muis CD32/CD16 – Gezuiverd (Fc Blok Antilichaam)1:40FACS Buffer
BV421 anti-muis CD45 monoklonaal antilichaam1:25FACS Buffer
PE/Cy7 anti-muis EpCAM/CD326 monoklonaal antilichaam1:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 anti-muis Ly51 monoklonaal antilichaam1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS Buffer
Anti-muis CCL21/exodus 2 konijn polyklonaal antilichaam1:2001x Permeabilisatie Buffer
Anti-muis Psmb11/beta5t konijn monoklonaal antilichaam, Clone CPTC-PSMB11(muis)-11:10001x Permeabilisatie Buffer
Alexa Fluor 555 anti-konijn IgG zwaar ketting geproduceerd in geiten recombinant antilichaam1:4001x Permeabilisatie Buffer
BufferDoel
RPMI1640 bevattend 10 mM HEPES Voor celvoorbereiding
RPMI1640 bevattend 2% FBSVoor celvoorbereiding
FACS buffer (1x HBSS bevattend 1% BSA en 0.1% natriumaziet)Voor celvoorbereiding en antilichaamkleuring
1 mg/ml Collagenase/Dispase en 1U/ml DNase oplossing in RPMI1640 bevattend 2% FBSVoor enzymdigestie
2% PFA in PBSVoor celfixatie
Fixatie/Permeabilisatie Buffer (1 deel van Fixatie/Permeabilisatie Concentraat met 3 delen van Fixatie/Permeabilisatie Diluent)Voor celfixatie
1x Permeabilisatie Buffer (1 deel 10X concentraat met 9 delen gedistilleerd water)Voor intercellulaire antilichaamkleuring 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrieintracellulaire kleuringmuizentymuscelisolatiecorticale TEC smedullaire TEC sBeta5t expressieCCL21 detectie

Gerelateerde artikelen