Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66954

⸱

31 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Samenvatting

Angiogenese speelt een cruciale rol in zowel fysiologische als pathologische processen in het lichaam, waaronder tumorgroei of neovasculaire oogziekte. Een gedetailleerd begrip van de onderliggende moleculaire mechanismen en betrouwbare screeningsmodellen zijn essentieel om ziekten effectief aan te pakken en nieuwe therapeutische opties te ontwikkelen. Er zijn verschillende in-vitrotests ontwikkeld om angiogenese te modelleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de mogelijkheden die een gecontroleerde omgeving biedt om angiogene drijfveren op moleculair niveau op te helderen en te screenen op therapeutische doelen.

Deze studie presenteert workflows voor het onderzoeken van angiogenese in vitro met behulp van endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's). We beschrijven een kraswondmigratietest met behulp van een live celbeeldvormingssysteem dat de migratie van endotheelcellen meet in een 2D-omgeving en de sferoïde kiemtest die het ontkiemen van endotheelcellen beoordeelt in een 3D-omgeving die wordt geleverd door een collageenmatrix. Daarnaast schetsen we strategieën voor monstervoorbereiding om verdere moleculaire analyses mogelijk te maken, zoals transcriptomics, met name in de 3D-setting, inclusief RNA-extractie en immunocytochemie. Al met al biedt dit raamwerk wetenschappers een betrouwbare en veelzijdige toolset om hun wetenschappelijk onderzoek naar in vitro angiogenese-assays voort te zetten.

Inleiding

Angiogenese, die verwijst naar de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande1, is een cruciaal proces tijdens fysiologische ontwikkeling en pathologische omstandigheden. Het is onmisbaar voor het leveren van energie aan zeer metabolisch actieve weefsels zoals het netvlies2 of het zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel3 en tijdens de genezing van beschadigd weefsel4. Abnormale angiogenese daarentegen is de basis voor tal van ziekten. Solide tumoren, zoals colorectale kanker of niet-kleincellige longkanker, vergemakkelijken hun groei en de noodzakelijke energievoorziening door angiogenese te bevorderen5. Afgezien van kanker zijn neovasculaire aandoeningen van het oog zoals diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, die de belangrijkste oorzaken van blindheid in de ontwikkelde wereld zijn, het gevolg van afwijkende vaatgroei 6,7. Een gedetailleerd begrip van het onderliggende pathomechanisme is cruciaal om te begrijpen hoe fysiologische angiogenese kan worden verbeterd, bijvoorbeeld bij wondgenezing, terwijl pathologische aandoeningen zoals vasoproliferatieve oogziekten beter worden beheerst.

Op cellulair niveau worden vasculaire endotheelcellen geactiveerd door verschillende signaalmoleculen bij angiogenese, waardoor celproliferatie en -migratie worden geïnitieerd8. De cellen organiseren zich vervolgens in een hiërarchie, waarbij niet-prolifererende tipcellen filopodia vormen aan de voorrand van de zich ontwikkelende vaattak8. Daarnaast volgen snel prolifererende stengelcellen de tipcellen, wat bijdraagt aan de vorming van het opkomende vat. Vervolgens worden andere celtypen, zoals pericyten of gladde spiercellen, gerekruteerd om de ontluikende tak9 verder te stabiliseren.

Om moleculaire processen op het niveau van vasculaire endotheelcellen te onderzoeken, zijn tal van in vitro-protocollen ontwikkeld en onlangs herzien10. Deze tests vallen doorgaans in twee categorieën: meer simplistische maar schaalbare 2D-benaderingen en meer uitgebreide 3D-protocollen. In een recent project hebben we een uitgebreide vergelijkende analyse uitgevoerd tussen de 2D-kraswondmigratietest en de 3D-sferoïde kiemtest11 om de omvang van hun verschillen en hun vermogen om verschillende aspecten van angiogenese12 te modelleren te beoordelen.

Hoewel beide de voordelen bieden dat ze betrouwbaar en gemakkelijk te implementeren zijn, was de 3D-sferoïde kiemtest op moleculair niveau gunstig voor het aanpakken van belangrijke aspecten van angiogenese in vergelijking met in vivo gegevens, zoals metabole schakelaars of cel-matrixinteracties. Aangezien in-vitro-angiogenesetests worden gebruikt om het angiomodulerende potentieel van signaalrouteste evalueren 13 en om te screenen op therapeutische middelen, is de overdraagbaarheid van in-vitroresultaten naar in vivo omgevingen essentieel. Bovendien blijft de mogelijkheid voor op omics gebaseerde analyses van de RNA- en eiwitniveaus om de moleculaire veranderingen te karakteriseren als reactie op gerichte modulatie van angiogene processen onder gecontroleerde omstandigheden een belangrijk voordeel in vergelijking met in vivo settings14,15.

In deze publicatie presenteren we belangrijke testen voor het verkennen van angiogenese-gerelateerde vragen door het gebruik van een live-cell imaging-migratietest en een sferoïde kiemtest, inclusief daaropvolgende moleculaire analyses zoals RNA-sequencing voor transcriptomische analyse en immunohistochemie op eiwitniveau.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. HUVEC-celcultuur

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder steriele werkomstandigheden (steriele werkbank).

  1. Uitbreiding van HUVEC's
    1. Gebruik voor beide angiogenesetests gepoolde humane navelstrengader-endotheelcellen (HUVEC's) of menselijke microvasculaire endotheelcellen (HMVEC's).
    2. Kweek de cellen totdat ze 90% samenvloeiing bereiken in een ongecoate T75-kolf met endotheelcelgroeimedium (EGM) voordat u een splitsing uitvoert. Voer 3 keer per week een gemiddelde verandering uit.
      OPMERKING: Om de groei te versnellen, kan het medium dagelijks worden vervangen. Gebruik HUVEC's niet na de zesde passage. De studie ontving de meest consistente resultaten bij het uitvoeren van alle experimenten met HUVEC's van dezelfde passage.
  2. HUVEC's splitsen
    1. Wanneer HUVEC's de gewenste samenvloeiing in de T75-kolf bereiken, spoelt u ze eenmaal af met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door het incuberen van de cellen met 0,5% trypsine gedurende 2 minuten in de incubator.
      OPMERKING: Langdurige blootstelling aan trypsine kan de HUVEC-functie beschadigen.
    2. Maak de cellen voorzichtig los door op de kolf te tikken. Bevestig succesvolle loslating onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.
    3. Voeg 8 ml EGM toe, breng de oplossing over in een buisje en pelleteer de cellen door centrifugeren bij 250 x g gedurende 3 minuten.
    4. Als het tellen van cellen nodig is, resuspendeer de cellen dan in 5 ml EGM en gebruik een Neubauer-kamer. Voeg anders 40 ml EGM toe en verdeel het over 4 verse T75-celkweekkolven.

2. Kraswond migratie test

OPMERKING: De kraswondmigratietest vereist een duur van 3 dagen voor voltooiing (Figuur 1). Voer alle volgende stappen uit onder steriele werkomstandigheden (steriele werkbank).

  1. Uitserveren en uithongeren van cellen (dag 1)
    1. Gebruik een gespecialiseerde plaat met 96 putjes voor beeldvorming van levende cellen, zaai 20.000 HUVEC's in 100 μL EGM per putje. Laat de cellen 6 uur bezinken in de couveuse.
      OPMERKING: Het is raadzaam om het aantal cellen te optimaliseren, rekening houdend met de variërende snelheid van de groei van vasculaire endotheelcellen tussen leveranciers en laboratoria. Het doel is om de volgende dag een perfecte monolaag te bereiken voordat met de scratch wordt begonnen. Overbevolkte putten kunnen het gedrag van endotheelcellen veranderen, bijvoorbeeld door contactremming16, terwijl een onvolledige monolaag de analyse drastisch belemmert.
    2. Verhonger alle putten 's nachts met 100 μL EBM per put aangevuld met 2% FBS.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de monolaag van de cel niet beschadigt, vooral niet bij gebruik van een meerkanaalspipet.
  2. Bereiding van stimulatieoplossingen (dag 2)
    1. Verdun gewenste stoffen en controles in endotheelcelgroei basaal medium (EBM) aangevuld met 2% FBS. Gebruik voor elk putje 100 μL oplossing.
      OPMERKING: EBM aangevuld met 2% FBS dient als negatieve controle, terwijl recombinante humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) bij 25 ng/ml als positieve controle kan worden gebruikt. Met behulp van platen met 96 putjes wordt aanbevolen om de experimenten te ontwerpen met een minimum aan technische replicaten (4 putjes met identieke omstandigheden), hoewel wordt voorgesteld om er 8 te gebruiken voor optimale resultaten. Streef ernaar om mogelijke rand- of hoekeffecten te minimaliseren bij het plannen van de lay-out.
  3. Het maken van de kras (dag 2)
    1. Controleer cellen onder een microscoop om een confluente celmonolaag en de levensvatbaarheid van de cel te verifiëren. Plaats de plaat met 96 putjes in een 96-wells gewikkeld makergereedschap en genereer de kras door de hendel van het apparaat naar beneden te drukken. Til voorzichtig het deksel van het wondmakergereedschap op voordat u de hendel loslaat om dubbel krassen te voorkomen.
    2. Was alle putjes twee keer met 200 μL EBM per putje aangevuld met 2% FBS. Controleer onder een microscoop of het puin met succes is verwijderd.
  4. Celstimulatie (dag 2)
    1. Voeg 100 μL van de bereide stimulatie- of controleoplossingen per putje toe.
  5. Beeldvorming (dag 2-3)
    1. Maak eenmaal per uur beelden gedurende een periode van maximaal 24 uur met behulp van een geautomatiseerd schema dat wordt geleverd door de live-cell beeldvormingsmicroscoop.
      OPMERKING: Om een goede beeldkwaliteit te garanderen, scant u elke put onmiddellijk nadat u deze in de incubator met het live-cell beeldvormingssysteem hebt geplaatst. Een acclimatisatietijd van 30 minuten in de couveuse helpt om een betere beeldkwaliteit te krijgen. De microscoopsoftware is geprogrammeerd om één beeld per uur te verkrijgen voor elk putje op de middellijn van de gedefinieerde kras.
  6. Als u niet beschikt over een wondmaker en een live cell imager, volgt u de onderstaande stappen.
    1. Gebruik een pipetpunt in een plaat met 24 putjes om een kras op te wekken. Maak foto's met een klassieke celcultuurmicroscoop met specifieke tussenpozen. Gebruik hiervoor een gemotoriseerde microscoop die is uitgerust met nauwkeurige x- en y-trackingmogelijkheden. Dit maakt automatische positionering mogelijk, waardoor een consistente beeldopname op vooraf gedefinieerde locaties wordt gegarandeerd.
      OPMERKING: Wanneer handmatige beeldvorming nodig is, is het een haalbare optie om alleen T0 en één tijdstip 'x' uur na de behandeling af te beelden. In het beschreven protocol met HUVEC's was het tijdstip T12 (12 uur na stimulatie) een aantrekkelijk tijdstip met een duidelijke scheiding tussen negatieve en VEGF-gestimuleerde positieve controle. Het wordt echter aanbevolen om elke 2 uur of 1 uur experimenten met een eerste tijdsverloop uit te voeren met beeldvorming om het optimale tijdstip voor de specifieke experimentele instellingen in elk laboratorium te bepalen.
  7. Analyse (dag 3)
    1. De microscoopsoftware voor live-cell beeldvorming kan directe analyse van de verkregen beelden mogelijk maken. Definieer maskers die het celgazon, de eerste kras en de relatieve wonddichtheidsgebieden afbakenen. Bepaal celgrenzen op basis van contrastverschillen.
      OPMERKING: Een segmentatie-aanpassing van 1,6, een gatenbestand van 500 μm2, een aangepaste grootte van 1 pixel, een gebied >500 μm en een excentriciteit >0,6 werden gebruikt voor experimenten die met HUVEC's werden uitgevoerd. Een grondige visuele controle van de celdetectieparameters ten opzichte van de werkelijke beelden is essentieel. Met geoptimaliseerde configuraties berekent de software automatisch de relatieve wonddichtheid (RWD) in de loop van de tijd en genereert overeenkomstige temporele grafieken met de standaarddeviatie (SD) van de technische replicaten. Deze gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt voor statistische analyse.

3. RNA-extractie met 2D gekweekte cellen

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit tot en met stap 3.3 onder steriele werkomstandigheden (steriele werkbank).

  1. Cellen plateren (dag 1)
    1. Maak HUVEC's los volgens stap 1.2 van het HUVEC-celcultuurprotocol.
    2. Zaai 50.000 cellen per putje in een plaat met 12 putjes met 2 ml EGM per putje.
    3. Verander het medium na 6 uur in EBM met 2% FBS (uitgehongerde media) om 's nachts uit te hongeren.
  2. Behandeling van de cellen (dag 2)
    1. Verdunde middelen die van belang zijn voor EBM aangevuld met 2% FBS. Vervang uitgehongerde media door de voorbereide verdunning en incubeer de cellen gedurende de gewenste tijd in een incubator.
  3. RNA-extractie (dag 2-3)
    1. Lyseer de cellen met 750 μL Trizol per putje en incubeer gedurende 10 minuten op een orbitale shaker.
    2. Resuspendeer de monsters een paar keer met een pipet van 1000 μl en bewaar ze vervolgens in specifieke laagbindende RNA-buisjes (volume 1,5 ml). Bewaren bij -80 °C.

4. Immunocytochemie met 2D gekweekte cellen

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit tot stap 4.4 onder steriele werkomstandigheden (steriele werkbank).

  1. Voorbereiding van dekglaasjes
    1. Incubeer 100 dekglaasjes met een diameter van 12 mm in 5% kaliumhydroxide in methanol in een tube van 50 ml gedurende 30 minuten terwijl u de aangebrachte oplossing schudt.
      OPMERKING: Dit is een zeer belangrijke stap in het deprotoneren van het oppervlak van de dekglaasjes en het verbeteren van de omstandigheden voor coating en cultuur. Op dit punt is het ten zeerste aan te raden om ervoor te zorgen dat de dekglaasjes goed verdeeld zijn over het medium en niet droog worden en aan elkaar worden gelijmd.
    2. Was de dekglaasjes 4 keer 30 minuten met gedemineraliseerd water.
    3. Breng ze na het wassen over in een 70% isopropyloplossing voor opslag.
  2. Coaten van dekglaasjes
    1. Leun de dekglaasjes afzonderlijk tegen de wand van een vierkante petrischaal om de verdamping van isopropylalcohol mogelijk te maken.
    2. Breng de dekglaasjes na 5 minuten over in een plaat met 24 putjes (één dekglaasje per putje). Breng 1 ml van een oplossing van 10 mg/ml collageen I in PBS aan op elk putje en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C.
    3. Was de dekglaasjes vervolgens 4-5 keer gedurende 5 minuten met PBS.
  3. Cellen kweken
    1. Maak HUVEC's los volgens de procedures die worden beschreven in stap 1.2 van het HUVEC-celcultuurprotocol.
    2. Zaai 50.000 cellen per putje in een plaat met 24 putjes met 2 ml EGM per putje.
    3. Verander na 6 uur het medium in EBM met 2% FBS om de cellen aan de put te laten hechten en de cellen 's nachts uit te hongeren.
    4. De volgende dag verdunde middelen die van belang zijn voor EBM aangevuld met 2% FBS. Vervang de uitgehongerde oplossing in putjes door de bereide verdunning en incubeer de cellen gedurende de gewenste tijd in een incubator.
  4. Fixatie en blokkering
    1. Kweek de cellen gedurende de gewenste tijd en was de cellen vervolgens gedurende 5 minuten met PBS.
    2. Fixeer de cellen met 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Was 3-4 keer met PBS gedurende 5 minuten.
    4. Incubeer monsters met een blokkeerbuffer die 5% normaal geitenserum (NGS), 0,1% Triton-X-100 bevat in PBS gedurende 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Bij deze stap is het belangrijk om de monsters te wassen om te garanderen dat PFA volledig wordt verwijderd. Kies de soort serum op basis van de oorsprong van het secundaire antilichaam.
  5. Kleuring
    1. Incubeer de monsters een nacht bij 4 °C in de blokkeerbuffer met het primaire antilichaam.
    2. Om de volgende dag ongebonden primaire antilichamen te verwijderen, wast u de monsters 3-4 keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    3. Incubeer de monsters vervolgens gedurende 1 uur bij RT met het bijbehorende secundaire antilichaam en phalloidine-FITC, samen verdund in de blokkeerbuffer.
    4. Was nog 3-4 keer.
    5. Keer de dekglaasjes om op de glaasjes met een druppeltje DAPI-bevattend montagemedium, laat ze in het donker drogen en sluit ze af met nagellak. Bewaar monsters in het donker bij 4 °C.

5. Sferoïde kiemtest

OPMERKING: De sferoïde kiemtest heeft 3 dagen nodig voor voltooiing (Figuur 2). Voer alle volgende stappen tot en met stap 5.7 uit onder steriele werkomstandigheden (steriele werkbank).

  1. Sferoïden opwekken in hangende druppels (dag 1)
    1. Maak HUVEC's los volgens de procedures die worden beschreven in stap 1.2 van het HUVEC-celcultuurprotocol.
    2. Combineer 200.000 cellen met 8 ml EGM en 2 ml methocel-bouillonoplossing en zorg voor een grondige menging. Raadpleeg aanvullend bestand 1 voor instructies over het bereiden van de methocel-bouillonoplossing.
    3. Doseer druppeltjes van 25 μl van de oplossing op het omgekeerde binnenoppervlak van een grote, vierkante petrischaal. Draai het deksel voorzichtig 180° en plaats het op de bodem van het celkweekvat zodat de druppels hangen. Plaats het vat een nacht in een celcultuurincubator.
  2. Bereid de collageengel voor (dag 2)
    1. Meng grondig 2,3 ml rattenstaartcollageen type I met 0,280 ml 10x Medium 199 tot het mengsel een consistent egale gele tint heeft. Bewaar dit mengsel gedurende het hele proces op ijs.
  3. Titreren van de collageengel (dag 2)
    1. Titreer het mengsel om een fysiologische pH te bereiken, aangegeven door een oranje kleur, met behulp van NaOH (2 N).
    2. Voeg 50 μL HEPES-buffer toe aan het eindproduct.
      OPMERKING: Om een optimaal dynamisch bereik voor de test te garanderen, is het absoluut noodzakelijk om een fysiologische pH zo dicht mogelijk te benaderen. Verschillende partijen collageen kunnen verschillende hoeveelheden NaOH vereisen. Houd het mengsel gedurende het hele proces strikt op ijs en homogeen gemengd.
  4. Sferoïden oogsten (dag 2)
    1. Spoel hangende druppels van de celcultuurdeksels af met 20 ml PBS.
    2. Centrifugeer de oplossing gedurende 7 minuten op 250 x g. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de sferoïden in 0,1 ml FBS en 0,4 ml EGM door zachtjes op de buis te tikken.
    3. Voeg 2 ml methocel-bouillonoplossing toe en meng grondig. Gebruik een pipet met een minimale capaciteit van 5 ml om beschadiging van de sferoïden te voorkomen.
  5. Sferoïden toevoegen aan de 3D-collageenmatrix (dag 2)
    1. Voeg 2 ml van het bereide collageenmengsel toe aan de geresuspendeerde sferoïden en meng grondig.
    2. Doseer 0,5 ml van het resulterende mengsel in de putjes van een plaat met 24 putjes en incubeer gedurende 30 minuten in een celincubator.
  6. Stimuleren van sferoïden in een 3D collageenmatrix (dag 2)
    1. Bereid een verdunning van de gewenste stoffen voor in EBM. Gebruik voor elk putje 100 μL oplossing.
      OPMERKING: EBM dient als een negatieve controle, terwijl vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) bij 25 ng/ml (eindconcentratie in 500 μL collageenmatrix en 100 μL EBM-laag) kan worden gebruikt als positieve controle.
    2. Incubeer voor de gewenste tijd.
      OPMERKING: In een standaardtest wordt 18-24 uur aanbevolen, maar de timing moet in elk laboratorium zorgvuldig worden geoptimaliseerd.
  7. Beeldvorming van sferoïden (dag 3)
    1. Gebruik een omgekeerde microscoop en een beeldvormingsplatform om beelden vast te leggen van alle sferoïden die niet in contact komen met de putrand, met elkaar of tekenen van schade vertonen. Zorg voor consistente instellingen en zoomniveaus onder alle omstandigheden.
  8. Analyse (dag 3)
    1. Gebruik het meetinstrument in ImageJ Fiji om de lengte van alle spruiten van elke sferoïde in elke afbeelding vast te stellen.
      OPMERKING: Gebruik de plug-in in Supplementary File 2, die de analyse efficiënter maakt en een uitvoer .txt bestand genereert.
    2. Importeer de gegevens in een spreadsheet, R of een andere voorkeurssoftware en gebruik de gemiddelde cumulatieve lengte van alle spruiten per sferoïde als uitlezing voor elke aandoening.
      OPMERKING: Resultaten van verschillende gels kunnen niet worden gecombineerd in de vorm van absolute kiemlengtes. Gegevens van elke behandelingsgroep moeten worden genormaliseerd naar de EBM- of VEGF-controlegroep (relatieve kiemlengte) voordat gegevens kunnen worden samengevoegd.

6. RNA-extractie met 3D gekweekte cellen

  1. Sferoïde kiemtest
    1. Voer de sferoïde kiemtest uit zoals beschreven in rubriek 5.
  2. Lysis van collageengel
    1. Was sferoïde gels met warme PBS gedurende 5 min.
    2. Snijd de sferoïde gels in vieren en doe alle 4 de kwarten in een buisje van 50 ml. Gebruik een scalpel voor de mechanische dissectie van de gels.
    3. Behandel gelmonsters met lysisoplossing (met 2 mg/ml collagenase D in PBS) en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C op een shaker.
    4. Was gels voorzichtig met PBS aangevuld met 2 mM EDTA om de reactie van de lysisbuffer te stoppen.
  3. RNA-extractie
    1. Resuspendeer de gelyseerde gels in 750 μl Trizol en incubeer gedurende 10 minuten om voldoende RNA-extractie te garanderen zoals beschreven in stap 3.3.
    2. Resuspendeer de monsters een paar keer met een pipet van 1000 μL en breng de monsters over naar specifieke laagbindende RNA-buisjes (volume 1,5 ml). Bewaar monsters bij -80 °C.

7. Immunocytochemie van sferoïden in een 3D collageenmatrix

  1. Sferoïde kiemtest
    1. Voer de sferoïde kiemtest uit zoals beschreven in rubriek 5.
  2. Fixatie en blokkering
    1. Fixeer de gels met 4% PFA gedurende 1 uur in PBS.
      OPMERKING: Om een goede fixatie van de cellen in de gel te garanderen, moeten de gels voorzichtig aan de zijkanten van de putjes worden losgemaakt met een scalpel en een pincet na het spoelen met PBS.
    2. Was de gels 3-4 keer voorzichtig met PBS en maak ze vervolgens volledig los van het oppervlak van de putjes en breng ze over in nieuwe platen met 24 putjes.
    3. Incubeer gels gedurende 1 uur bij RT met de blokkerende oplossing (met 5% NGS en 0,1% Triton-X-100 in PBS) op een orbitale shaker.
  3. Kleuring
    1. Incubeer de monsters een nacht bij 4 °C op een orbitale shaker met het primaire antilichaam verdund in een blokkeerbuffer.
      OPMERKING: Het draaien van de gels tijdens deze incubatie heeft de kleurkwaliteit niet verbeterd.
    2. Was de gels de volgende dag 4-5 keer voorzichtig met PBS gedurende 5 minuten elk.
    3. Incubeer het overeenkomstige secundaire antilichaam, verdund met phalloidine-FITC in de blokkeerbuffer 's nachts bij 4 °C op een orbitale shaker.
    4. Voer 4-5 extra wasstappen uit met PBS.
    5. Breng de gels over op microscoopglaasjes en monteer ze met twee druppels DAPI-bevattend montagemedium op een dekglaasje dat op elke gel wordt geplaatst. Laat de monsters drogen voordat u ze met nagellak verzegelt en bewaar ze in het donker bij 4 °C.
  4. Microscopie
    1. Bekijk alle monsters op een confocale microscoop. Gebruik de 20x doelstelling en focus op de regio van interesse. Verkrijg afbeeldingen als Z-stapels, evenals individuele beelden van het brandpuntsvlak.
      OPMERKING: Het verkrijgen van Z-stack- en brandpuntsvlakbeelden op meerdere secties in de 3D-sample is essentieel om de volledige weergave vast te leggen, vooral voor dikke 3D-samples.

8. Menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMVEC's)

OPMERKING: Alle beschreven stappen kunnen ook worden uitgevoerd met microvasculaire endotheelcellen, bijv. menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMVEC's). In dat geval moet het medium worden omgeschakeld naar een specifiek microvasculair endotheelcelmedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat voor de teelt, evenals specifieke stappen in elke test. HRMVEC-specifieke verschillen met de testprotocollen worden hieronder beschreven:

  1. Kraswond test
    1. Kweek cellen in 10% FBS microvasculair endotheelcelmedium in plaats van EGM.
    2. Zaad 20.000 cellen/put.
    3. Verhonger de cellen niet 's nachts.
    4. Verander na het uitvoeren van de scratch het medium in basale endotheelcelmedium met 5% FBS in plaats van EBM met 2% FBS.
  2. Immunocytochemie van 2D gekweekte HRMVEC's
    1. Kweek de cellen in 10% microvasculair endotheelcelmedium in plaats van EGM.
    2. Verhonger de cellen niet 's nachts.
    3. Verander het medium vlak voor de behandeling naar EBM + 5% FBS in plaats van EBM+2% FBS.
  3. Sferoïde kiemtest
    1. Zaai de cellen als hangende druppels met microvasculair endotheelcelmedium dat 10% FBS bevat in plaats van EGM.
  4. Immunocytochemie van sferoïden in een 3D collageenmatrix
    1. Zaai de cellen als hangende druppels met microvasculair endotheelcelmedium dat 10% FBS bevat in plaats van EGM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor de migratietest is het van cruciaal belang om de beelden die zijn vastgelegd op het t = 0 h-tijdstip grondig te onderzoeken om ervoor te zorgen dat de aanwezigheid van een volledig gevormde celmonolaag nauwkeurig wordt gedetecteerd door het systeem (Figuur 1B). Bovendien moet de helderheid en rechtheid van de krasrand worden bevestigd (Figuur 1B). Het celvrije gebied moet grotendeels vrij zijn van puin. Aan het einde van de test zou een groep die is gestimu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit rapport presenteerden we een spectrum van technieken met functionele en moleculaire uitlezingen om angiogenese in vitro te bestuderen.

De migratietest vertegenwoordigt een gevestigde techniek die wordt gebruikt op alle gebieden van nat laboratoriumwerk. We kozen voor de in de handel verkrijgbare live-cell imaging-benadering om te profiteren van het 96-well-formaat dat geschikt is voor screening en dosis-responsexperimenten, de gestandaardiseerde en reproduceerbare wondgrootte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict in dit project.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Sophie Krüger en Gabriele Prinz voor hun uitstekende technische ondersteuning. We danken Sebastian Maier voor het ontwikkelen van de ImageJ-plug-in voor het kwantificeren van sferoïde spruiten en de Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Department of Medicine I, University Hospital Freiburg voor het gebruik van het IncuCyte-systeem. De graphics zijn gemaakt met biorender.com. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 naar F.B.], de Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-programma voor klinische wetenschappers en geavanceerde klinische wetenschappers naar F.B.], de Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 naar F.B.] het Duitse kankerconsortium [CORTEX-fellowship voor klinische wetenschappers naar J.R.] en de Volker Homann Stiftung [naar J.N.+F.B.] en de "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg e.V." [tegen P.L.]

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-FragmentJackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tailCorning354236
Collagenase DRoche 11088858001
Endothelial Cell Basal MediumLonzaCC-3156EBM
Endothelial Cell Growth MediumLonzaCC-3162EGM
Ethyleendiaminetetraazijnzuur Serva11290.02EDTA
Fetaal bovien serumBio&SELLS 0615FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, gepooldLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates Sartorius4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis SystemSartorius
MethocelSigmam-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium met 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Phalloidin-Fluoresceïne-Isothiocyanate gelabeld (0,5 mg/mL Methanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Fosfaat-gebufferd zoutoplossingThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial CellsCell SystemsACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant met NucBlueInvitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
recombinant human Vascular Endotheel GroeifactorPeproTech100-20VEGF
Vierkante petrischaalGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsinePAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoklonaal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493

Referenties

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
  4. Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
  5. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).
  6. Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
  7. Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
  8. Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).
  9. Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  11. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).
  12. Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).
  13. Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).
  14. Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
  15. Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).
  16. Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
  17. Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
  18. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  19. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337(2017).
  20. Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  21. Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
  22. Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
  23. Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
  24. Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
  25. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
  26. Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
  27. Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Angiogenese-assaysEndotheelcelmigratieMenselijke NavelstrengendotheelcellenCollageenmatrixLive Cell ImagingImmunocytochemieRNA-extractieVasculaire Endotheelgroeifactor
Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.