Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Samenvatting

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Samenvatting

Het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) is cruciaal voor het behoud van de stabiliteit van het genoom en de levensvatbaarheid van de cel. DSB-reparatie (DSBR) in cellen wordt gemedieerd via verschillende mechanismen: homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA). Cellulaire assays zijn essentieel om de vaardigheid en modulatie van deze routes te meten als reactie op verschillende stimuli.

Hier presenteren we een reeks extrachromosomale reporter-assays die elk de reconstitutie van een nanoluciferase-reporter-gen meten door een van de vier belangrijkste DSBR-routes in cellen. Bij voorbijgaande transfectie in cellen van belang, kan reparatie van pathway-specifieke reportersubstraten in minder dan 24 uur worden gemeten door de detectie van Nanoluciferase (NanoLuc) luminescentie.

Deze robuuste testen zijn kwantitatief, gevoelig, titreerbaar en vatbaar voor een high-throughput screeningformaat. Deze eigenschappen bieden brede toepassingen in DNA-reparatieonderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen, als aanvulling op de momenteel beschikbare toolkit van cellulaire DSBR-assays.

Inleiding

DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) vertegenwoordigen een bijzonder toxische klasse van DNA-schade¹ waardoor cellen meerdere DSB-reparatieroutes (DSBR) hebben ontwikkeld om deze laesies te repareren. De vier belangrijkste DSBR-mechanismen zijn homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ), microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ) en enkelstrengs gloeien (SSA)^2,3. DSBR-routes dragen bij aan het behoud van de ontwikkeling en fysiologie van gezond weefsel en beschermen tegen ziekten zoals kanker. Bovendien hebben deze reparatiemechanismen therapeutisch potentieel voor de ontwikkeling van modulatoren van kleine moleculen in de precisie-oncologie. Bijvoorbeeld, het richten op DNA-polymerase θ (Polθ), een cruciaal enzym in de MMEJ-reparatieroute, heeft interesse gewekt vanwege zijn synthetische letaliteit met HR-deficiëntie bij kanker⁴.

Het begrijpen van DSBR heeft daarom brede klinische implicaties en functionele cellulaire assays die in staat zijn om de activiteit van alle belangrijke DSBR-routes te meten, zijn nodig⁵. Assays moeten geschikt zijn voor zowel genetische als farmacologische ondervraging en inzetbaar zijn in verschillende celmodellen die van belang zijn. Om de inspanningen op het gebied van de ontdekking van geneesmiddelen met kleine moleculen te ondersteunen, moeten assays zeer gevoelig en titreerbaar zijn, een snelle doorlooptijd hebben en schaalbaar zijn naar high-throughput-formaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen.

Over het algemeen is DSBR eerder gemeten met behulp van op fluorescentie gebaseerde reporter-assaysystemen die stabiel in het celgenoom^{zijn geïntegreerd 6}. Hoewel fysiologische recapitulatie van chromosomale DSBR een duidelijk voordeel is, zijn dergelijke analyses beperkt tot een gastheermodel waarin de verslaggever is geïntegreerd, maken ze gebruik van arbeidsintensieve monstervoorbereiding en -analyse door middel van flowcytometrie en hebben ze een beperkte doorvoer, doorlooptijd, robuustheid en gevoeligheid, allemaal essentiële kenmerken die nodig zijn voor inspanningen om geneesmiddelen te ontdekken.

Hier beschrijven we een reeks DSBR-reportertests die beoordeling van de vier belangrijkste DSBR-routes mogelijk maken. De reeks reporter-assaysubstraten wordt geschetst in figuur 1 en verder beschreven in een recente publicatie⁷. Ze zijn extrachromosoom, waardoor ze in cellen kunnen worden geïntroduceerd door eenvoudige voorbijgaande transfectie, en de opname van een nanoluciferase-reporter-gen⁸, dat moet worden gereconstitueerd door betrokkenheid bij specifieke DSBR-mechanismen, zorgt voor gevoeligheid, robuustheid en schaalbaarheid. De volgende DSBR reporter substraatvarianten zijn opgenomen in het protocol (Figuur 1):

Resectie-onafhankelijke MMEJ: Dit lineaire substraat bestaat uit een dubbelstrengs DNA-kerngebied (dsDNA) met enkelstrengs DNA (ssDNA) overhangen, die gereseceerde DNA-uiteinden nabootsen⁹. Vier nucleotide-microhomologieën aan de uiteinden van de ssDNA-regio's coderen voor het startcodon voor het reporter-gen. Reparatie van dit substraat door middel van MMEJ herstelt het open leesraam van het reportergen (ORF).

Resectie-afhankelijke MMEJ: Het N-terminale reporter-gen exon wordt onderbroken door een segment met een stopcodon, dat wordt geflankeerd door 8 basenpaar (bp) microhomologieën. Nucleolytische eindresectie is vereist voorafgaand aan MMEJ-gemedieerd herstel om het intacte reporter-gen te herstellen.

Botte NHEJ: Het reporter-gen is opgesplitst in N- en C-terminale secties, waarvan de laatste stroomopwaarts van de promotor wordt geplaatst. De DSB wordt geproduceerd met behulp van EcoRV en vereist directe ligatie (zonder eindverwerking) door NHEJ om beide delen van het reportergen opnieuw te verbinden en de reporter ORF te herstellen.

Niet-botte NHEJ: De DSB bevindt zich in een intron en zal cohesieve of niet-cohesieve uiteinden hebben, afhankelijk van de keuze van het restrictie-enzym. De reparatie van dit substraat door NHEJ vereist ligatie die wordt voorafgegaan door eindverwerking.

Lange sjabloon HR: Het N-terminale exon van het reporter-gen wordt onderbroken door een DNA-segment dat restrictieplaatsen bevat, die 22 bp van de oorspronkelijke reporter-gensequentie vervangen. Om deze sequentie te herstellen, maakt reparatie door HR gebruik van het homologiesjabloon van 2,5 kilobase (kb) dat stroomafwaarts van het C-terminale exon is geplaatst.

Kort sjabloon HR: De beperkingsplaats die nodig is om de DSB te genereren, vervangt een deel van de oorspronkelijke reporter-gensequentie en introduceert een in-frame stopcodon. Net als de versie met lange sjablonen, vereist dit HR-substraat de stroomafwaartse homologiesjabloon (360 bp) voor nauwkeurige reparatie en restauratie van de reporter ORF.

SSA: Dit substraat bevat een voortijdig stopcodon dat zich in het N-terminale exon van het reporter-gen bevindt. De verwijdering van dit stopcodon en het herstel van de intacte reporter-gensequentie vereist reparatie door SSA, wat bidirectionele resectie op lange afstand inhoudt voorafgaand aan de uitlijning van de homologieën.

Voor het genereren van de DSB kan een deel van de reportersubstraten worden vergist met I-SceI (Figuur 1). Dit genereert een lineair substraat met niet-samenhangende uiteinden in de resectie-afhankelijke MMEJ, niet-botte NHEJ, lange sjabloon HR- en SSA-reporters, die tandem I-Sce I-sitesin omgekeerde oriëntaties hebben. In het korte sjabloon HR-reportersubstraat zal de vergisting van de enkele I-Sce I-sitesamenhangende uiteinden genereren. De niet-botte NHEJ, resectie-afhankelijke MMEJ, lange sjabloon HR en SSA-plasmiden kunnen ook worden verteerd met HindIII, dat complementaire cohesieve uiteinden zal produceren.

We bieden protocollen voor het genereren van de reporter-assaysubstraten en beschrijven hoe de assays kunnen worden uitgevoerd, waarbij we details geven over hoe ze kunnen worden gebruikt om DSBR te kwantificeren, inclusief titreerbare reacties op kleine moleculen, het beoordelen van cellulaire potentie, activiteit op het doel en pathway-selectiviteit.

Protocol

1. Voorbereiding en kwaliteitscontrole (QC) van reportersubstraten

OPMERKING: De plasmiden die coderen voor de reportersubstraten kunnen worden vermeerderd in standaard Escherichia coli-stammen (bijv. DH5α en derivaten) en worden teruggewonnen door plasmide-isolatie. Plasmidedetails (grootte en antibioticaresistentie) worden beschreven in Tabel 1 en Figuur 1.

Figuur 1: Schema's van extrachromosomale NanoLuc-gebaseerde DSBR-reportertests. Schematische weergave van DSBR-reportersubstraten, inclusief hun locatie binnen elk bronplasmide, hoofdsequentiekenmerken en uiteindelijke lay-out na padspecifieke reparatie. De resectie-onafhankelijke MMEJ-substraatkern wordt uit het bronplasmide weggesneden door vergisting met XhoI/HindIII, waarna doppen aan beide uiteinden moeten worden geligeerd om het substraat voor MMEJ te produceren. Het stompe NHEJ-reportersubstraat wordt gegenereerd door excisie van het bronplasmide met EcoRV. De resectie-afhankelijke MMEJ-, niet-stompe NHEJ-, lange sjabloon-HR en SSA-reportersubstraten worden gegenereerd door linearisatie van de bronplasmiden met behulp van I-SceI (die niet-cohesieve uiteinden produceert) of HindIII (die cohesieve uiteinden produceert). Het korte sjabloon HR-reportersubstraat wordt gegenereerd door linearisatie van het bronplasmide met behulp van I-SceI (dat samenhangende uiteinden produceert). Reparatie van elk reportersubstraat door de doel-DSBR-route reconstrueert een intacte nanoluciferase ORF-codering voor functionele NanoLuc. Deze figuur is een bewerking van Rajendra et ^al.7. Afkortingen: DSBR = reparatie van dubbelstrengsbreuken; NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien; ORF = open leeskader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van resectie-onafhankelijk MMEJ-reportersubstraat (Figuur 1 en Figuur 2A-C)
   1. Bereiding van ssDNA/dsDNA-caps (Figuur 2A)
      1. Resuspendeer de vier oligonucleotiden die in tabel 2 worden vermeld afzonderlijk in een gloeibuffer (20 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl in water van moleculair-biologische kwaliteit) om een stockoplossing van 100 μM te genereren.
      2. Gloeien van ss/dsDNA caps
         1. Meng 50 μL van elk van de lange en korte oligonucleotiden (100 μM bouillonoplossing) voor de linker dop uit stap 1.1.1.1 in een buisje van 0,2 ml.
         2. Herhaal dit voor oligonucleotiden met de rechterkap.
         3. Gebruik een thermocycler om elk oligonucleotidemengsel gedurende 5 minuten bij 99 °C te incuberen en vervolgens af te bouwen tot 10 °C bij 1 °C/min.
            OPMERKING: Dit zal de gegloeide linker- en rechterdoppen produceren.
      3. (QC, optioneel) Verificatie van oligonucleotide gloeien door elektroforese
         1. Elektroforees 100 ng van elk product uit stap 1.1.1.2 naast individuele oligonucleotiden uit stap 1.1.1.1 en een DNA-ladder met een laag moleculair gewicht in een 20% acrylamide-Tris-Boraat-EDTA (TBE) gel bij 200 V gedurende 80 min.
         2. Kleur de gel met een TBE-lopende buffer die een geschikte fluorescerende DNA-kleurstof bevat voor visualisatie van zowel ssDNA als dsDNA gedurende ten minste 10-15 minuten.
         3. Visualiseer de fluorescentie op een geldocumentatiesysteem (Figuur 2A).
            OPMERKING: De stappen 1.1.1.3.1 tot en met 1.1.1.3.3 worden gebruikt om te controleren of de doppen correct zijn uitgegloeid. De schijnbare grootte voor de linker en rechter dop moet respectievelijk ~120 bp en ~175 bp zijn.
   2. Zuivering van de substraatkern van de reporter (Figuur 2B)
      1. Meng 100 μg van het reporter-kernplasmide met 4 μL HindIII en 4 μL XhoI (4 E/μg plasmide voor elk enzym) en 20 μL 10x buffer. Breng het totale volume op 200 μL met dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur tot een nacht om plasmide te verteren.
         OPMERKING: Voor vergisting van grotere of kleinere hoeveelheden, schaalt u de reactie proportioneel.
      2. Incubeer de spijsverteringsreactie bij 80 °C gedurende 20 minuten om restrictie-enzymen te verwarmen en te inactiveren.
      3. Voeg 40 μl alkalische fosfatase (2 E/μg plasmide) en 27 μl 10x buffer toe aan het reactiemengsel uit stap 1.1.2.2. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur om het plasmide te defosforyleren.
         OPMERKING: Schaal de reactie naar behoefte omhoog of omlaag.
      4. Voeg 60 μL 6x ladende kleurstof toe aan de reactie uit stap 1.1.2.3. Elektrofores naast een DNA-ladder met een hoog moleculair gewicht in een 1,5 % (m/v) agarose-Tris-Acetaat-EDTA (TAE)-gel die een fluorescerende dsDNA-kleuring bevat bij 120 V gedurende 2,5 uur of totdat de banden voldoende zijn opgelost.
      5. Visualiseer de fluorescentie op een geldocumentatiesysteem (Figuur 2B).
      6. Snijd het kernfragment van de reporter (~1,5 kb) uit de gel met een schoon scalpel en zorg ervoor dat het niet besmet raakt met de vectorruggengraat (~2,5 kb).
      7. Verwijder het kernfragment van de reporter met behulp van een gelextractieset, volgens de instructies van de fabrikant.
      8. Meet de DNA-concentratie en -kwaliteit (A_260/280) door middel van spectrofotometrie.
   3. Ligatie van de kern van het reportersubstraat met ssDNA/dsDNA-doppen en zuivering van het substraat van de uiteindelijke reporter (Figuur 2C)
      1. Meng 30 μg van het reporterkernfragment uit stap 1.1.2.7 met 3.85 μL van elke gegloeide linker- en rechterkap uit stap 1.1.2 (ca. 6:1 molaire verhouding van cap:core-DNA), 30 μL 10x ligasebuffer en 1.5 μL T4-DNA-ligase (20 E/μg DNA). Breng het totale volume van de reactie op 300 μL met ddH₂O en incubeer een nacht bij 16 °C om de doppen aan het kernfragment van de reporter te ligateren.
         NOTITIE: Schaal de reactie naar wens omhoog of omlaag.
      2. (QC, optioneel) Elektrofores 200 ng van het resulterende product uit stap 1.1.3.1 naast de kern van het reportersubstraat en een DNA-ladder met een hoog moleculair gewicht in een agarose-TAE-gel van 0,7% (m/v) met een fluorescerende dsDNA-kleuring bij 120 V gedurende ten minste 1,5 uur. Controleer of de band die overeenkomt met het geligeerde product iets langzamer migreert dan de niet-geligeerde reporter-substraatkern (Figuur 2C).
         OPMERKING: Deze QC-stap is om te controleren of de ligatie van doppen aan het kernfragment van de reporter correct heeft plaatsgevonden.
      3. Zuiveren van het DNA uit de verteringsreactie in stap 1.3.1. met behulp van de voorkeursmethode (bijv. een methode op basis van kralen of kolommen), volgens de instructies van de fabrikant.
         OPMERKING: De zuiveringsstap 1.1.3.3 vermindert de aanwezigheid van niet-gebonden doppen aanzienlijk.
   4. Meet de DNA-concentratie en -kwaliteit (A_260/280) door middel van spectrofotometrie.
2. Voorbereiding van stomp NHEJ-reportersubstraat (Figuur 1 en Figuur 2D,E)
   1. Meng 100 μg van het reporterkernplasmide met 5 μL EcoRV (5 E/μg plasmide) en 20 μL 10x buffer. Breng het totale volume op 200 μL met ddH₂O en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur tot een nacht om plasmide te verteren.
      OPMERKING: Voor vergisting van grotere of kleinere hoeveelheden, schaalt u de reactie proportioneel.
   2. Incubeer de verteringsreactie bij 65 °C gedurende 20 minuten om het restrictie-enzym te verwarmen en te inactiveren.
   3. Voeg 50 μL 6x ladende kleurstof toe aan de reactie uit stap 1.2.2. Elektrofore naast een DNA-ladder met een hoog moleculair gewicht in een agarose-TAE-gel van 1,5% (w/v) met een fluorescerende dsDNA-kleuring bij 120 V gedurende 2 uur of totdat de banden voldoende zijn opgelost.
   4. Visualiseer de fluorescentie op een geldocumentatiesysteem (Figuur 2D).
   5. Snijd het reportersubstraat (~1,7 kb) uit de gel met een schoon scalpel en zorg ervoor dat het niet besmet raakt met de vectorruggengraat (~2,6 kb).
   6. Extraheer het kernfragment van de reporter met behulp van een gelextractieset, volgens de instructies van de fabrikant (Figuur 2E).
   7. Meet de DNA-concentratie en -kwaliteit (A_260/280) door middel van spectrofotometrie.
3. Voorbereiding van op I-SceI gebaseerde reportersubstraten (Figuur 1)
   OPMERKING: Deze substraten omvatten resectie-afhankelijke MMEJ (Figuur 2F), niet-stompe NHEJ (Figuur 2G), lange sjabloon HR (Figuur 2H), korte sjabloon HR (Figuur 2I) en SSA (Figuur 2J).
   1. Meng 100 μg van het reporterkernplasmide met 50 μL I-SceI (5 E/μg plasmide) en 60 μL 10x buffer. Breng het totale volume op 600 μL met ddH₂O en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur tot een nacht om plasmide te verteren.
      OPMERKING: Voor vergisting van grotere of kleinere hoeveelheden, schaalt u de reactie proportioneel. Niet-botte NHEJ, resectie-afhankelijke MMEJ, lange sjabloon HR en SSA-plasmiden kunnen ook worden verteerd met HindIII, wat complementaire samenhangende uiteinden zal genereren.
   2. Incubeer de verteringsreactie bij 65 °C gedurende 20 minuten om I-SceI te verwarmen en te inactiveren. Stel de temperatuur tijdens deze stap in op 80 °C als HindIII in plaats daarvan voor de spijsvertering is gebruikt.
   3. Zuiver DNA uit de geïnactiveerde verteringsreactie in stap 1.3.2 met behulp van de voorkeursmethode (bijv. een methode op basis van kralen of kolommen), volgens de instructies van de fabrikant.
   4. Meet de DNA-concentratie en zuiverheid (_260/280) met behulp van spectrofotometrie.
4. Kwaliteitscontrole van reportersubstraten
   1. Elektroforees 200 ng van het reportersubstraat naast een DNA-ladder met een hoog moleculair gewicht in een agarose-TAE-gel van 0,7% (w/v) met een fluorescerende dsDNA-kleuring bij 120 V gedurende 2 uur of totdat de banden voldoende zijn opgelost. Laad het originele ongesneden reporter-plasmide ernaast als controle.
   2. Controleer of de gedefinieerde banden van de juiste grootte worden waargenomen voor elk substraat van de reporter (zie Tabel 1 en Figuur 2F-J).

Figuur 2: Gel elektroforetische analyses van DSBR reporter substraatgeneratie. (A-C) Representatieve beelden van gel-elektroforetische analyse van tussenproducten en het uiteindelijke construct dat nodig is voor het genereren van het resectie-onafhankelijke MMEJ-reportersubstraat. De aangrenzende afbeeldingen in panelen (A) en (C) zijn van dezelfde gels; irrelevante rijstroken zijn weggelaten. (D,E) Representatieve beelden van gelelektroforetische analyse voor bronplasmide, EcoRV-verteerde producten en gel-geëxtraheerde eindconstructie die nodig is voor het genereren van het stompe NHEJ-reportersubstraat. (F-J) Representatieve beelden van gel-elektroforetische analyse van bronplasmiden en gelineariseerde DSBR-constructen voor de I-SceI-verteerde reportersubstraten: resectie-afhankelijke MMEJ, niet-stompe NHEJ, lange sjabloon HR, korte sjabloon HR, SSA. Afkortingen: DSBR = reparatie van dubbelstrengsbreuken; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbijgaande transfectie van DSBR-reportersubstraten

OPMERKING: Een overzicht van de experimentele workflow van assays en enkele mogelijke permutaties worden geschetst in figuur 3. Het onderstaande protocol beschrijft een experiment met HEK-293-cellen, waarbij deze omgekeerd worden getransfecteerd met het reportersubstraat. Onderstaande getallen kunnen worden op- of afgeschaald afhankelijk van het aantal putjes dat per plaat moet worden gebruikt. De volgende stappen worden berekend voor een test die wordt uitgevoerd in één plaat met 96 putjes; zie Discussie voor aanvullende overwegingen.

Figuur 3: Experimentele workflow voor DSBR-reportertests. Cellen van belang worden getransfecteerd met het gelijniseerde DSBR-substraat (coderend voor een NanoLuc ORF die moet worden gerepareerd door middel van een specifieke DNA-reparatiegebeurtenis) en een Firefly-plasmide (transfectiecontrole). Vervolgens, 6-24 uur na transfectie, kunnen de Firefly-luminescentie en NanoLuc-luminescentie achtereenvolgens worden gelezen na de toevoeging van Nano-Glo Dual-Luciferase-reagentia. Voorbeeldpermutaties in de kernstappen (weergegeven in lichtblauwe vakken) kunnen worden gebruikt om te testen hoe genetische modulatie (knock-out, knockdown of overexpressie) of farmacologische behandeling de vaardigheid van de DSBR-route in cellen beïnvloedt. Afkortingen: DSBR = reparatie van dubbelstrengsbreuken; NanoLuc = Nanoluciferase; WT = wildsoort; KO = knock-out. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. (Optioneel) Als u de impact van verbindingen op de reporter-test beoordeelt, doseer dan verbindingen opgelost in het medium (bijv. dimethylsulfoxide [DMSO]) in putjes van een plaat met 96 putjes volgens een vooraf gedefinieerde experimentele lay-out. Normaliseer de concentratie van het voertuig in alle putten.
   OPMERKING: Technische replica's worden aanbevolen. Neem controleputten op (bijv. alleen voor voertuigen).
2. Verdun in een buisje van 1,5 ml Firefly-controleplasmide (controleluciferase) en NanoLuc DSBR-reportersubstraat (reporter-luciferase) gegenereerd in stappen 1.1, 1.2 of 1.3, in 500 μL transfectiebuffer. Gebruik 0,66 μg controleluciferaseplasmide per 1 × 10⁶ cellen. Zie Tabel 3 voor de te gebruiken hoeveelheden NanoLuc DSBR reporter substraat.
   OPMERKING: Een positief controleplasmide dat de luciferase van de reporter constitutief tot expressie brengt, kan worden gebruikt om de instellings- en transfectieomstandigheden van het instrument te valideren of om te controleren op niet-specifieke effecten op de luciferase van de reporter zelf. Als uitgangspunt adviseren wij 0,1 μg reporter luciferase plasmide en 0,66 μg controle luciferase plasmide per 1 × 10⁶ cellen.
3. Voeg een transfectiereagens op basis van lipiden toe aan het verdunde DNA uit stap 2.2 in een door de fabrikant aanbevolen verhouding (bijv. 1:2, μg DNA:μL reagens voor het reagens beschreven in de materiaaltabel), meng goed door kort te vortexen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
4. Oogst cellen door trypsinisatie, resuspendeer ze in vers medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en tel ze.
5. Breng 3 × 10⁶ cellen over in een buisje van 15 ml en resuspendeer in 8,5 ml medium.
6. Voeg de DNA-transfectiemix uit stap 2.3 toe aan de celsuspensie en meng meerdere keren door inversie.
7. Plaat 80 μL celsuspensie (ongeveer 2,7 × 10⁴ cellen) per putje.
   OPMERKING: De suspensie met cellen en het DNA-transfectiemengsel kan op de plaat worden gedoseerd door handmatig te pipetteren of met behulp van een geautomatiseerde vloeistofverwerker voor experimenten met een hogere doorvoer.
8. Incubeer bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 24 uur.

3. Detectie van luminescentie

1. Bereiding van reagentia
   1. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding en toevoeging van reporter (NanoLuc) en controle (Firefly) luciferase-reagentia, die de substraten leveren voor beide luciferasen (respectievelijk Furimazine en 5'-fluoroluciferine):
   2. Bereid controleluciferasereagens voor. Reconstitueer volgens de instructies van de fabrikant en meng door inversie totdat het luciferasesubstraat volledig is opgelost.
   3. Bereid vers luciferase-reagens voor volgens de instructies van de fabrikant. Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is om 80 μL/putje toe te voegen en voeg substraat toe aan een geschikt volume van de analysebuffer in een verhouding van 1:100 (luciferasesubstraat:buffer). Verdun voor één plaat met 96 putjes 88 μl luciferasesubstraat tot 8.800 μl buffer en meng door inversie.
      LET OP: Deze hoeveelheden zijn inclusief een eigen risico van ongeveer 10%. Eenmaal gereconstitueerd, kan het controleluciferasereagens worden opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant voor toekomstig gebruik. Het luciferase-reagens van de verslaggever moet voor elk gebruik vers worden bereid.
2. Seriële detectie van luminescentie van controle- en reporterluciferases (plaat met 96 putjes)
   1. Laat de plaat en de luciferase-reagentia op kamertemperatuur komen.
   2. Voeg 80 μL controleluciferasereagens per putje toe.
   3. Schud de plaat gedurende 3 minuten op een orbitale shaker op 450 tpm.
   4. Meet het controleluciferase-luminescentiesignaal met een luminescentieplaatlezer.
      OPMERKING: Lees de emissie af bij 580 nm (80 nm banddoorlaatfilter) of de totale luminescentie per putje. Deze luminescentie wordt gebruikt als een maat voor transfectie-efficiëntie en celdichtheid en kan ook informatie geven over cellulaire toxiciteit veroorzaakt door de testbehandelingen.
   5. Voeg 80 μL reporter luciferase reagens per putje toe.
      OPMERKING: Dit reagens remt de controle luciferase; Het bevat ook het substraat voor de reporter luciferase.
   6. Schud de plaat gedurende 3 minuten op een orbitale shaker op 450 tpm.
   7. Laat de plaat 7 minuten rusten op kamertemperatuur.
   8. Meet het luciferase-luminescentiesignaal van de reporter met een luminescentieplaatlezer.
      OPMERKING: Leesemissie af bij 470 nm (80 nm banddoorlaatfilter) of, als alternatief, totale luminescentie per putje. Deze luminescentie geeft informatie over de hoeveelheid reportersubstraat die is gerepareerd door de DSBR-route van belang.
   9. Exporteer luminescentiemetingen voor stroomafwaartse analyse.

4. Gegevensanalyse

1. Deel het luminescentiesignaal van de reporter luciferase (NanoLuc) door het luminescentiesignaal van de controleluciferase (Firefly) afkomstig van dezelfde put om het testsignaal te berekenen. Pas die berekening toe op alle putjes zoals weergegeven in vergelijking (1).
   (1)
2. Bereken het gemiddelde van de analysesignalen voor de controleputten (bijv. alleen voor voertuigen).
3. Normaliseer de analysesignalen voor testputten naar het gemiddelde van de controleput met behulp van vergelijking (2) om de reparatie (%) per put te berekenen.
   (2)
4. (Optioneel, bochtfitting) Als u meerdere samengestelde doses test, zet dan de berekende reparatie (%) af tegen de concentratie van de verbinding en past een dosis-responscurve in met behulp van een niet-lineair regressiemodel. Gebruik deze curve voor de daaropvolgende EC 50-interpolatie.

Resultaten

Reparatie van elk van de reporter-assays kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van dezelfde procedure. Correcte reparatie van een substraat door zijn verwante reparatieroute in cellen zal een intacte, functionele ORF-codering NanoLuc reconstrueren. Dit luminescentiesignaal kan worden gedetecteerd met behulp van een plaatlezer.

De co-transfectie met een intact plasmide dat codeert voor Firefly-luciferase dient als transfectiecontrole. Deze controle dient twee doelen. Ten eerste biedt het een standaard om het NanoLuc-signaal naar te normaliseren, aangezien het ongestoord moet zijn door modulatie van DSBR met genetische of farmacologische middelen. Ten tweede kan het een indicatie geven van off-target cellulaire verstoringen die het luciferasesignaal beïnvloeden, zoals modulatie van de celcyclus, effecten op transcriptie/translatie of algemene toxiciteit.

De verhouding tussen NanoLuc en Firefly dient als een surrogaatuitlezing van reparatie. Luminescentiewaarden kunnen worden geëxporteerd en geanalyseerd door de twee luciferasesignalen vanuit dezelfde put te normaliseren. In het geval van genetische verstoringsstudies (bijv. het vergelijken van wildtype en KO of niet-targeting- en doelsiRNA), wordt reparatie meestal genormaliseerd naar het ouderlijke monster (wildtypecellen of cellen behandeld met niet-targeting-controle-siRNA). In het geval van farmacologische modulatie worden de waarden van een met een verbinding behandeld monster genormaliseerd naar de waarde die wordt geproduceerd door de behandeling met het medium.

De volledige validatie van de beschreven reporter suite is onlangs gepubliceerd⁷. Gegevens die de karakterisering van de genetische en farmacologische modulatie van DSBR illustreren, worden weergegeven in figuur 4 (aangepast van ⁷). Polθ is de belangrijkste mediator van MMEJ en er wordt voorspeld dat verlies of remming van dit enzym specifiek cellulair MMEJ zal ablateren ^3,10. Met behulp van een cellijn waarin POLQ, het gen dat codeert voor Polθ, is uitgeschakeld¹¹, toont de resectie-onafhankelijke MMEJ-reportertest aan dat MMEJ inderdaad bijna volledig onderdrukt is. Evaluatie van de component NanoLuc- en Firefly-luminescentiesignalen toont aan dat het waargenomen reparatiedefect wordt aangedreven door een vermindering van het NanoLuc-signaal (gecodeerd door het reportersubstraat) terwijl het Firefly-signaal (controle) ongestoord is (Figuur 4A-C). Daarentegen toont de beoordeling van NHEJ-vaardigheid met behulp van de NHEJ-reporter met stomp uiteinde aan dat POLQ-knock-out de reparatie van het reportersubstraat niet belemmert (Figuur 4D-F). Samen ondersteunen deze genetische gegevens de specifieke rol van Polθ bij MMEJ-gemedieerd herstel. Deze waarnemingen zijn farmacologisch volledig gerecapituleerd met ART558 ^12,13, een recent gerapporteerde zeer krachtige en specifieke remmer van het polymerasedomein van Polθ (Figuur 4G), waar titreerbare remming van MMEJ wordt waargenomen, die voortkomt uit een specifieke afname van het NanoLuc-signaal en niet van het Firefly-signaal (Figuur 4H). Bovendien, en in overeenstemming met genetische gegevens, is er geen effect op NHEJ (Figuur 4I,J). Samen benadrukken deze gegevens hoe deze reporters kunnen worden gebruikt om de genetische modulatie van DSBR-routes te karakteriseren en cellulaire potentie en doel-/routespecificiteit van kleine moleculen aan te tonen.

Figuur 4: Effecten van genetische knock-out en farmacologische remming van Polθ op MMEJ- en NHEJ-reportersignalen. eHAP1 WT- en POLQ^(-)- cellen werden getransfecteerd met een Firefly-controleplasmide en met (A-C) de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter of (DF) blunt end NHEJ-reporter. Het percentage MMEJ- of NHEJ-reparatie is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de DMSO-behandelde controlegroep, 24 uur na transfectie. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van drie biologische replicaten, elk gemiddeld 8 technische replicaten. HEK-293-cellen werden getransfecteerd met een Firefly-controleplasmide en (G,H) de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter of de (I,J) blunt end NHEJ-reporter en behandeld met de Polθ-polymeraseremmer ART558. Het reparatiepercentage is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de met DMSO behandelde controle, 24 uur na transfectie. De procentuele remming van de individuele luminescentiesignalen in (G) en (I) werd berekend ten opzichte van de met DMSO behandelde controlegroep en weergegeven in respectievelijk (H) en (J). De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 2 biologische replicaten, elk gemiddeld 4 technische replicaten. Deze figuur is een bewerking van Rajendra et ^al.7. Afkortingen: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Remming van het HR-reportersignaal door de RAD51-remmer CAM833. (A) HEK-293-cellen werden getransfecteerd met het HR-reportersubstraat met lange sjabloon, een Firefly-luciferasecontroleplasmide en behandeld met de RAD51-remmer CAM833¹⁴. De luminescentie van NanoLuc en Firefly werd 16 uur na transfectie afgelezen. Het percentage HR-reparatie is de verhouding tussen NanoLuc-luminescentie en Firefly-luminescentie, genormaliseerd naar de met DMSO behandelde controlegroep. Stippellijnen markeren het percentage HR-remming en CAM833-concentratie bij de curve EC₅₀. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 2 biologische replicaten, elk gemiddeld 4 technische replicaten. (B) De procentuele remming van de individuele luminescentiesignalen in (A) werd berekend ten opzichte van de met DMSO behandelde controlegroep. Stippellijnen markeren het percentage NanoLuc- en Firefly-remming op 3,33 μM CAM833 (EC₅₀). De afname van het Firefly-signaal bij CAM833-concentraties ≥ 10 μM is een indicatie van samengestelde toxiciteit bij hoge doses; NanoLuc-signaalvermindering wordt echter waargenomen bij concentraties waarbij het Firefly-signaal niet wordt beïnvloed, wat suggereert dat CAM833 on-target HR-remming induceert. Deze figuur is een bewerking van Rajendra et ^al.7. Afkortingen: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = homologe recombinatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reporter substraat		Bron: plasmide (grootte in kb, weerstand)	DSB-generatie			Verwachte grootte van het substraat van de eindreporter (kb)
Resectie-onafhankelijke MMEJ		4.0, Kan	Weggesneden 3' staarten door ligatie van doppen			1.6
Resectie-afhankelijke MMEJ		6.5, Kan	I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)			6.5
Botte NHEJ		4.3, Kan	Blunt eindigt bij excisie van plasmide door EcoRV			1.7
Niet-botte NHEJ		6.7, Kan	I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)			6.5
Lange sjabloon HR		9.2, Kan	I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)			9.2
Kort sjabloon HR		9.3, Ampère	I-SceI (samenhangend)			9.3
SSA		9.5, Kan	I-SceI (niet-samenhangend), HindIII (samenhangend)			9.5

Tabel 1: Reporter substraat plasmiden. Afkortingen: DSB = double strand break; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien; Kan = kanamycine; Ampère = ampicilline.

Opeenvolging (5'-3')			Leverancier	Zuivering	Functie
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGAAGACCAT			Sigma	BLADZIJDE	Linker kap, lang oligonucleotide
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			Sigma	BLADZIJDE	Linker kap, kort oligonucleotide
5" AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			Sigma	BLADZIJDE	Rechterkap, lang oligonucleotide
5" [Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA			Sigma	BLADZIJDE	Rechterkap, korte oligonucleotide

Tabel 2: Oligonucleotiden voor caps voor het genereren van resectie-onafhankelijk MMEJ-reportersubstraat. Afkortingen: ssDNA = enkelstrengs DNA; dsDNA = dubbelstrengs DNA; MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; PAGE = elektroforese van polyacrylamidegel. Microhomologieën worden onderstreept.

Reporter test	NanoLuc reporter substraat DNA (μg DNA/1x106 cellen)	Firefly controle luciferase plasmide (μg DNA/1x106 cellen)
Resectie-onafhankelijke MMEJ	0.5	0.66
Resectie-afhankelijke MMEJ	1	0.66
Botte NHEJ	0.5	0.66
Niet-botte NHEJ	0.5	0.66
Lange sjabloon HR	1	0.66
Kort sjabloon HR	2	0.66
SSA	1	0.66

Tabel 3: DNA-hoeveelheden voor voorbijgaande transfectie van NanoLuc-reportersubstraten en Firefly-controleluciferaseplasmide (HEK-293, plaatformaat met 96 putjes). Afkortingen: MMEJ = microhomologie-gemedieerde eindverbinding; NHEJ = niet-homologe eindtoetreding; HR = homologe recombinatie; SSA = enkelstrengs gloeien.

Discussie

Hier hebben we protocollen beschreven voor het genereren en implementeren van een reeks extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporters voor het meten van de cellulaire vaardigheid van de vier belangrijkste DSBR-routes (HR, NHEJ, MMEJ en SSA)⁷. Reportersubstraten kunnen in cellen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie en worden gebruikt om DSBR-activiteit te beoordelen met behulp van een gevoelige en robuuste plaatgebaseerde uitlezing van NanoLuc-luminescentie, die wordt gereconstitueerd bij betrokkenheid bij betrokkenheid bij verwante cellulaire DSBR-routes.

Verschillende stadia van het genereren van reporter-substraten, transfectie van de substraten in cellen en gegevensinterpretatie zijn van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van deze tests. Hoewel standaard moleculair-biologische technieken worden gebruikt om de reportersubstraten te genereren, zorgt het visualiseren van het proces door middel van gelelektroforese voor de hoogste kwaliteit en zuiverheid van de substraten voorafgaand aan transfectie. Aangezien deze tests afhankelijk zijn van voorbijgaande transfectie, zijn gemeenschappelijke overwegingen voor deze methoden van toepassing. Deze omvatten het optimaliseren van de zaaidichtheid, transfectiecondities (inclusief reagentia en DNA-hoeveelheden) en het beoordelen van de geschiktheid in voorwaartse en achterwaartse transfectieformaten. Deze reporter-assays zijn met succes uitgevoerd met een reeks elektroporatie- en lipofectieprotocollen, en de opties moeten volledig worden onderzocht voordat deze tests worden uitgevoerd. Er moet ook voor worden gezorgd dat de componentsignalen NanoLuc en Firefly worden geïnspecteerd in plaats van alleen het samengestelde reparatiesignaal dat wordt afgeleid door het NanoLuc-signaal (reportersubstraat) te normaliseren naar het Firefly-signaal (controle). Artefacten kunnen ontstaan doordat de verhouding wordt bepaald door veranderingen in het Firefly-signaal. Bijvoorbeeld, het beoordelen van remming in dosis-responsmodus met behulp van een zeer specifieke verbinding zou het NanoLuc-signaal op een titreerbare manier moeten onderdrukken zonder het Firefly-signaal te verstoren, dat stabiel zou moeten blijven (Figuur 4G,H). In gevallen waarin Firefly-signalen worden verstoord, kunnen nuttige effecten op reparatie echter nog steeds worden bepaald door een dosisvenster te identificeren waarin het Firefly-signaal niet wordt beïnvloed (Figuur 5).

Vergeleken met de meest gebruikte DSBR-reporter-assays, hebben deze extrachromosomale luminescentie-gebaseerde reporter-assays enkele duidelijke voordelen. Aangezien DSBR-routes sterk geconserveerd zijn, zelfs als de cellulaire machinerie varieert tussen celmodellen, kunnen de assays nog steeds rapporteren over DSBR-vaardigheid en routekeuze. Dit stelt de beoordeling van DSBR open voor elk model dat van belang is voor de gebruiker, zolang er van tevoren optimale transiënte transfectievoorwaarden worden vastgesteld.

Het gebruik van nanoluciferase als het reporter-gen biedt ook voordelen ten opzichte van fluorescerende opties, die traditioneel zijn gebruikt in DSBR-reporter-assays. NanoLuc is snel aan het rijpen en luminescentie wordt met hoge gevoeligheid gedetecteerd met behulp van een plaatlezer⁸. In combinatie met de snelheid van substraatreparatie (aangezien de reportersubstraten worden getransfecteerd in cellen met kant-en-klare DSB-uiteinden), is dit formaat van DSBR-reporter-assay ideaal voor de snelle doorlooptijd en kwantitatieve robuustheid die nodig is voor het screenen van kleine moleculen als onderdeel van een industriële cascade voor het ontdekken van geneesmiddelen. Inderdaad, we hebben onlangs de implementatie beschreven van de resectie-onafhankelijke MMEJ-reporter-assay in de ontdekkingscascade die wordt gebruikt voor de identificatie van kleine molecuulremmers van het Polθ-polymerasedomein¹³.

Er is ook flexibiliteit in de implementatie van de reporter-assays om specifieke vragen over genetische en farmacologische verstoringen van DSBR te beantwoorden (Figuur 3). Voorafgaand aan de transfectie van de reportersubstraten kunnen cellen bijvoorbeeld gedurende 48-72 uur worden getransfecteerd met siRNA tegen een gen van belang. Als alternatief kunnen de effecten van genoverexpressie op DSBR-routes worden getest door 24-48 uur voorafgaand aan de transfectie van reportersubstraten plasmidetransfectie uit te voeren. Voor farmacologische studies beschrijft het huidige protocol al hoe het gebruik van kleine moleculen kan worden opgenomen in de standaardworkflow, maar alternatieve formaten kunnen wijzigingen in samengestelde behandelingsregimes omvatten, zoals pre-incubaties of uitspoelingen.

De schaalbaarheid van transiënte transfectie zou ook grootschalige screeningsbenaderingen kunnen ondersteunen waarbij batchtransfectie van reportersubstraten wordt uitgevoerd voorafgaand aan de screening. Bovendien kan ook de duur van de test van transfectie tot uitlezing worden gevarieerd. Hoewel de standaardduur 16-24 uur kan zijn, kunnen sommige tests in slechts^{6 uur 7} worden uitgelezen. Bij het bepalen van de testduur moet ook rekening worden gehouden met bezorgdheid over toxiciteit van kleine moleculen of siRNA die de levensvatbaarheid van de cel in gevaar kunnen brengen.

Samenvattend bieden de tests die in deze studie worden beschreven en volledig worden beschreven in een recente publicatie⁷ een snelle en robuuste beoordeling van cellulaire DSBR-vaardigheid. Ze zijn zeer gevoelig en titreerbaar, waardoor ze vatbaar zijn voor zowel genetische als farmacologische studies. Cruciaal is dat, aangezien de reportersubstraten in cellen kunnen worden geïntroduceerd door voorbijgaande transfectie, ze het potentieel hebben om te worden gebruikt in elk transfecteerbaar celmodel van belang, in plaats van beperkt te zijn tot specifieke cellijnen door stabiele integratie zoals het geval is met chromosomale DSBR-reporters. Een duidelijke beperking van deze extrachromosomale tests van reporters is echter dat het gebrek aan integratie in het genoom de fysiologische, gechromatineerde context van DNA-herstel en de bijbehorende regulerende signalen en orkestratie mogelijk niet volledig recapituleert¹⁵. Daartoe zijn extrachromosomale reporter-assays een aanvulling op bestaande methoden voor DSBR-beoordeling en breiden ze de toolkit van middelen uit die geschikt zijn voor zowel fundamenteel onderzoek als de ontdekking van geneesmiddelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x TBE buffer	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-acrylamide gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE buffer	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple	NEB	B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Voor parelgebaseerde zuivering van DNA
Antarctic phosphatase en 10X buffer	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	Plate reader
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Celteller
Aangepaste oligonucleotiden	Sigma-Aldrich	Aangepaste bestelling	Voor resectie-onafhankelijk MMEJ-substraat. Zie tabel 2.
D300e	Tecan	30100152	DMSO-gebaseerde verbinding dispenser
D300e D4+ cassette	Tecan	30097371	Grote volume cassette voor D300e verbinding dispenser
D300e T8+ cassette	Tecan	30097370	Kleine volume cassette voor D300e verbinding dispenser
Dimethyl sulfoxide, celkweekkwaliteit	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Drager voor verbindingen, gebruikt in figuur 4 en figuur 5
DSBR reporter bron plasmiden	Artios		Beschikbaar voor de academische gemeenschap op aanvraag
EcoRV-HF en 10x CutSmart buffer	NEB	R3195M
Ethanol absoluut	VWR	20821.365
Foetaal bovien serum	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder	Thermo Fisher	SM1211	DNA ladder met laag molecuulgewicht
HEK-293 cellen	ATCC	CRL-1573	Voorbeeld cel lijn gebruikt in protocol
HindIII-HF en 10x CutSmart buffer	NEB	R3104M
HyClone moleculaire biologie kwaliteit water	Fisher Scientific	10275262
I-SceI en 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME reagens en buffer	PolyPlus	114-15	Lipide-gebaseerde transfectie reagens
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Centrifuge voor 15 of 50 mL buizen
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Kweekmedium voor HEK-293 cellen
Microplate shaker	Fisherbrand	15504070	Microplate orbital shaker
MicroStar 17R	VWR	521-1647	Centrifuge voor 1.5 of 2 mL buizen
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Cel of water-gebaseerde reagens dispenser
MultiDrop Standard Cassette	Thermo Fisher	24072670	Cassette voor MultiDrop reagens dispenser
NanoDLR Stop & Glo Buffer en Substraat	Promega	N1630 of N1650	Reporter luciferase (NanoLuc) reagens om Firefly luminiscentie te dempen en NanoLuc luminiscentie te detecteren. Onderdeel van de Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer en Substraat	Promega	N1630 of N1650	Controle luciferase (Firefly) assay reagens om Firefly te detecteren. Onderdeel van de Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (zonder calcium of magnesium)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly plasmid (of vergelijkbaar)	Promega	E1310 (of equivalent)	Firefly controle plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (of vergelijkbaar)	Promega	N1091 (of equivalent)	NanoLuc controle plasmid, voor aanpassing van apparaat instellingen/optimalisatie experimenten
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder	NEB	N0552S	DNA ladder met hoog molecuulgewicht
Natrium Acetaat (3 M), pH 5.5	Thermo Fisher	AM9740	Voor pH aanpassing tijdens gel extractie met QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10.000x)	Invitrogen	S11494	Voor visualisatie van ssDNA en dsDNA
SYBR Safe (10.000x)	Invitrogen	S33102	Voor visualisatie van alleen dsDNA
T4 DNA Ligase en 10x Ligase buffer	NEB	M0202L
Trypan Blauw kleurstof 0,4%	Invitrogen	T10282	Voor meting van levensvatbaarheid tijdens celtelling
Trypsin-EDTA oplossing; 0,25% Trypsin en 0,53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI en 10x CutSmart buffer	NEB	R0146M