Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66986

⸱

27 september 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

In dit artikel

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Samenvatting

Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest voorkomende en agressieve vorm van primaire hersenmaligniteit waarvoor geen genezing bestaat. De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij de toediening van therapieën aan GBM. Hier wordt een beeldgestuurd, op ijzeroxide gebaseerd nanoplatform voor therapeutische toediening gerapporteerd dat in staat is om deze fysiologische barrière te omzeilen op grond van grootte en zich op te hopen in het tumorgebied, waardoor de lading wordt afgeleverd. Dit 25 nm nanoplatform bestaat uit verknoopte dextran-gecoate ijzeroxide nanodeeltjes gelabeld met Cy5.5 fluorescerende kleurstof en die antisense oligonucleotide als lading bevatten. De magnetische ijzeroxidekern maakt het mogelijk om de nanodeeltjes te volgen door middel van in vivo magnetische resonantiebeeldvorming, terwijl Cy5.5-kleurstof het volgen door optische beeldvorming mogelijk maakt. Dit rapport beschrijft de monitoring van de accumulatie van dit nanodeeltjesplatform (MN-anti-miR10b genoemd) in orthotopisch geïmplanteerde glioblastoomtumoren na intraveneuze injectie. Daarnaast geeft het inzicht in de in vivo afgifte van RNA-oligonucleotiden, een probleem dat de vertaling van RNA-therapieën naar de kliniek heeft belemmerd.

Inleiding

Glioblastoma multiforme (GBM) is de hoogste graad van astrocytoom waarvoor vrijwel geen genezing mogelijk is. Jaarlijks worden ongeveer 15.000 mensen gediagnosticeerd met glioblastoom, met een sombere mediane overleving van ongeveer 15 maanden en een 5-jaarsoverleving van 5%1. In de afgelopen decennia is er een marginale verbetering van de prognose opgetreden, ondanks meerdere inspanningen om therapeutische opties te bevorderen. De huidige zorgstandaard voor GBM omvat maximale chirurgische resectie, indien mogelijk, gevolgd door radiotherapie en chemotherapie2. Temozolomide (TMZ), de chemotherapie bij uitstek, was de nieuwste therapie voor glioblastoom waarvan werd ontdekt dat deze een opmerkelijke klinische werkzaamheid vertoonde; ten minste 50% van de GBM-tumoren vertoont echter TMZ-resistentie3. Ondanks dit rigoureuze therapeutische regime is er nog steeds een aanzienlijke klinische behoefte aan verbeterde glioblastoomtherapie.

De ontwikkeling van therapieën voor GBM en andere hersengerelateerde ziekten wordt aanzienlijk belemmerd door de selectieve aard van de bloed-hersenbarrière (BBB). De BBB is een fysiologische barrière die bestaat uit endotheelcellen, pericyten en astrocyten aan de voeteneinden, die het semi-permeabele membraan tussen de bloedsomloop en de hersenen creëert, waardoor de vrije doorgang van moleculen en cellen naar de hersenen wordt beperkt4. Hoewel beschermend in de normale fysiologie en cruciaal voor de homeostase van de hersenen, voorkomt de BBB dat veel therapieën de hersenen bereiken, wat de behandeling van GBM bemoeilijkt. Inspanningen om de afgifte van therapieën aan GBM te verbeteren, hebben geleid tot de ontwikkeling van op nanodeeltjes gebaseerde afgiftevoertuigen, gerichte ultrasone geneesmiddelafgifteverbetering en receptor-gemedieerde geneesmiddelafgifte 5,6.

Nanodeeltjes zijn naar voren gekomen als een veelbelovend medium voor het ontwikkelen van therapieën voor een groot aantal ziekten, waaronder kanker. De toepassing van nanodeeltjes voor beeldvorming en therapeutische doeleinden in GBM is geprobeerd met behulp van verschillende nanodeeltjesconstructen 7,8. Met de nadruk op het afleveren van geneesmiddelen aan GBM in combinatie met in vivo beeldvorming van de toediening, maakt de voorgestelde aanpak gebruik van magnetische nanodeeltjes (MN) bestaande uit een ijzeroxidekern en bedekt met dextran voor stabiliteit. De magnetische eigenschappen van deze nanodeeltjes zorgen ervoor dat ze worden gedetecteerd door middel van magnetische resonantie (MR) beeldvorming, terwijl eenvoudige conjugatiechemie met de geamineerde dextraancoating conjugatie mogelijk maakt van therapeutische delen zoals RNA-moleculen, extra targetinggroepen of beeldvormingsgroepen (zoals Cy5.5 nabij-infrarood optische kleurstof)9,10. Naast de beeldvormingsmogelijkheden kan het nanoplatform de halfwaardetijd van RNA-therapieën verlengen door de oligonucleotide te beschermen tegen endogene nucleasen, waardoor de therapeutische afgifte wordt verbeterd. Hier wordt de toepassing van dit nanoplatform voor in vivo toediening van therapeutische oligonucleotiden (MN-anti-miR10b genoemd) aan GBM gepresenteerd, gecontroleerd door in vivo beeldvorming. Eerder werd het vermogen van dit nanoplatform om te accumuleren aangetoond in GBM-cellen in vitro, wat een aanzienlijk verlies van levensvatbaarheid van tumorcellen veroorzaakte11. Voorafgaand aan het uitvoeren van therapeutische in vivo studies, is het noodzakelijk om in vivo toediening van dit nanoplatform aan GBM-tumoren in diermodellen aan te tonen. Om dit te bereiken, werden orthotope GBM-diermodellen geproduceerd en werd intraveneuze toediening van het construct uitgevoerd, gevolgd door in vivo beeldvorming. Hier worden de protocollen van deze onderzoeken uiteengezet die accumulatie in het tumorgebied aantonen, bevestigd door in vivo beeldvorming en ex vivo microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij proefdieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Michigan State University. Vrouwelijke athymische naaktmuizen werden gekocht van Jackson Labs (stam #007850) op de leeftijd van 7 weken en mochten 1 week acclimatiseren voorafgaand aan de implantatieoperatie. Muizen waren ongeveer 21-25 g op het moment van implantatie. U251-cellen die vuurvliegluciferase tot expressie brengen, werden gegenereerd en geleverd door Dr. Ana deCarvalho12.

1. Celkweek en voorbereiding op implantatie

  1. Kweek luciferase-gelabelde, menselijke glioblastoomcellen, U251 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met D-glucose, L-glutamine en natriumpyruvaat en aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Zodra de cellen 70% confluentie bereiken, trypsiniseren met 0,25% trypsine/EDTA gedurende 1-2 minuten bij 37 °C. Gebruik 2-4 ml voor een T-75 kolf, of 4-6 ml voor een T-175 kolf.
  3. Nadat de cellen uit de kolf zijn losgekomen, doof u de reactie met een verhouding van 2:1 van aangevuld DMEM en mengt u voorzichtig door te pipetteren om de cellen te dissociëren tot een eencellige suspensie. Breng de cellen over in een conische buis en pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten.
  4. Zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de celpellet in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Tel de cellen met een hemocytometer met behulp van trypanblauwe kleuring om dode cellen uit te sluiten en bereken het totale aantal levende cellen. Pelleteer de cellen opnieuw, zoals hierboven beschreven.
  5. Resuspendeer de celpellet tot een concentratie van 1 x 108 cellen/ml in PBS en bewaar de celsuspensie op ijs voor intracraniële implantatie.

2. Orthotope tumorimplantatie uit de vrije hand

OPMERKING: Dit protocol is een bewerking van Irtenkauf et al. (Dr. Ana deCarvalho's procedure; Henry Ford Health Hermelin Hersentumor Centrum)12. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de veiligheid voor zowel proefpersonen als onderzoekers te garanderen. De implantatiemethode uit de vrije hand maakt een snellere procedure mogelijk om grotere monstergroottes te bereiken met behoud van de kwaliteit van intracraniële implantatie. Als alternatief kan een stereotaxisch apparaat worden gebruikt om de tumor op dezelfde coördinaten te implanteren die hieronder worden beschreven.

  1. Weeg de naakte, athymische muis en dien een verdovende oplossing van ketamine/xylazine (100 mg/kg/10 mg/kg) toe door intraperitoneale injectie met een spuit van 28 G. Plaats de muis in een herstelkooi op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Bevestig de verdoving door de pedaalreflex te controleren.
  2. Breng oogheelkundige oogzalf aan, dien ketoprofen (5 mg/kg) subcutaan toe met een spuit van 28 G en geef identificerende oorstoten.
  3. Steriliseer de operatieplaats aan de bovenkant van het hoofd met 70% ethanol gevolgd door betadine scrub en herhaal 3x. Maak vervolgens een incisie van 5-7 mm met een kleine chirurgische schaar rechts van de middellijn van het hoofd en trek de huid terug met een fijne pincet om de schedel en hechtlijnen van de schedel bloot te leggen.
  4. Schrob de schedel met een wattenstaafje om het botvlies te verwijderen, zodat u toegang krijgt tot het bot. Breng een oplossing van 3% waterstofperoxide aan met een nieuw wattenstaafje om het bot uit te drogen. Veeg met een nieuw wattenstaafje overtollig waterstofperoxide en eventueel gevormd schuim weg. Herhaal deze stap 3x totdat de bregma zichtbaar is op de schedel en het bot voldoende droog is om te boren. Een voldoende droge schedel heeft sterk witte hechtlijnen en verminderde roodheid vanaf het begin.
  5. Meet met betrekking tot de bregma -2,5 mm mediaal/lateraal en -1 mm anterieur/posterieur met een liniaal en markeer de boorplaats met een marker. Meet opnieuw voordat u gaat boren om er zeker van te zijn dat de markering zich in de juiste positie bevindt.
  6. Neem een elektrische microchirurgische boor (11.000 RPM) met een boorbraam van 0,5 mm en maak voorzichtig een gat in de schedel waar eerder gemarkeerd. Absorbeer eventueel bloed of vocht dat zich op de boorlocatie kan ophopen met een vers wattenstaafje.
  7. Bereid een spuit van 33 g microliter met een naaldhuls voor op een blootgestelde naaldlengte van 3 mm. Zuig 5 μl van de eerder bereide 1 x 108 cel/ml celsuspensie op na kort resuspenderen met een pipet en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de injectieoplossing zitten. Veeg overtollige celsuspensie aan de buitenkant van de naald en naaldhuls voorzichtig weg met een 70% isopropanoldoekje.
  8. Steek de naald verticaal in de boorplaats totdat de naaldhuls het verder inbrengen van de naald stopt. Trek de naald voorzichtig ongeveer 0,5 mm terug om ruimte te creëren voor de geïnjecteerde cellen om zich op te hopen.
  9. Injecteer de celsuspensie langzaam gedurende een periode van 1 minuut. Zodra het volledige volume is geïnjecteerd, houdt u de naald nog een minuut op diepte om de uitstroom van de injectieoplossing te verminderen. Trek vervolgens de naald voorzichtig terug.
  10. Veeg met een schoon wattenstaafje alle vloeistof weg die zich op de injectieplaats ophoopt en breng vervolgens botwas aan om het gat af te dichten.
  11. Sluit de incisie met een veterinaire binding en laat deze drogen. Breng met een schoon wattenstaafje topische lidocaïne aan als pijnstiller.
  12. Houd de muis in de gaten totdat deze volledig hersteld en ambulant is. Dien ketoprofen (5 mg/kg) subcutaan toe gedurende 2 dagen na implantatie voor pijnbestrijding.

3. Synthese van het nanodeeltjesplatform

  1. Synthese en conjugeer de nanodeeltjes met Cy5.5 en oligonucleotide (anti-miR10b) zoals eerder beschreven11.

4. Toediening van MN-anti-miR10b

OPMERKING: In deze studie werden de injecties eenmaal per week gedaan gedurende 6 weken, beginnend 7 dagen na implantatie, maar hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor verschillende injectiefrequenties.

  1. Weeg de muis en bereken het volume MN-anti-miR10b dat aan de muis moet worden toegediend. Doses MN-anti-miR10b worden gegeven bij 20 mg Fe/kg in GBM-modellen van muizen. Een muis van 20 g krijgt bijvoorbeeld een dosering van 80 μl van 5 mg Fe/ml MN-anti-miR10b. Controlemuizen krijgen een gelijk volume PBS dat overeenkomt met dit doseringsschema.
  2. Bereid een spuit van 28 G voor met de dosis MN-anti-miR10b en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de injectieoplossing zitten.
  3. Verdoof de muis onder 2%-4% isofluraan voor inductie en 1,5%-2% voor onderhoud met een debiet van 1,5 l/min in een inductiebox. Verplaats de muis naar een neuskegel en ga door met het toedienen van anesthesie. Controleer de diepte van de anesthesie en breng dierenartszalf aan.
  4. Steriliseer de staart met een doekje van 70% isopropanol en laat overtollige alcohol drogen.
  5. Draai de staart om de laterale staartaders naar de bovenkant van de staart te positioneren. Richt vervolgens op de ader, steek de naald in de staart en breng een vacuüm tot stand door de zuiger terug te trekken.
  6. Breng de naald in totdat er bloed in de spuit komt, wat aangeeft dat het bloed met succes in de ader is binnengekomen.
  7. Injecteer langzaam MN-anti-miR10b en trek de naald terug na volledige toediening. Oefen druk uit op de injectieplaats met gaas totdat het bloeden stopt.
  8. Haal de muis uit de neuskegel. Houd de muis in de gaten totdat deze volledig hersteld en ambulant is.
    OPMERKING: Bolustoediening van nanodeeltjes kan ademnood veroorzaken. Houd de muis zorgvuldig in de gaten en pas onmiddellijk lichte borstcompressies toe als er tekenen van ademnood zijn.

5. In vivo bioluminescentie en fluorescentie beeldvorming

OPMERKING: In vivo bioluminescentie- en fluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd in het In Vivo Imaging System (IVIS) vóór en 24 uur nadat het nanodeeltje is geïnjecteerd.

  1. Bereid steriel gefilterde D-luciferine in een concentratie van 30 mg/ml in PBS zonder Mg2+ en Ca2+.
  2. Open de IVIS-bedieningssoftware en begin met initialiseren om de machine voor te bereiden. Terwijl het systeem initialiseert, selecteert u een map om afbeeldingen op te slaan door Acquisitie > Automatisch opslaan in te selecteren en definieert u de map voor de bestanden die moeten worden opgeslagen.
  3. Weeg de muis op beeldvormingstijdstippen en bereken het volume D-luciferine dat moet worden toegediend voor een dosering van 150 mg/kg. Bereid een spuit van 28 G voor met het volume en bescherm de oplossing tegen direct licht. Deze studie omvatte beeldvorming 2 dagen na de implantatieoperatie om het zaaien te bevestigen, en wekelijkse beeldvorming begon op dag 7 na implantatie onmiddellijk voorafgaand aan de wekelijkse behandelingen.
  4. Verdoof de muis onder 2%-4% isofluraan voor inductie en 1,5%-2% voor onderhoud met een debiet van 1,5 l/min in een inductiekamer. Eenmaal verdoofd, knijpt u de muis voorzichtig in uw nekvel om verder letsel aan de operatieplaats te voorkomen en injecteert u de dosis D-luciferine intraperitoneaal. Laat de muis herstellen en wacht 10 minuten voordat u beeldvorming maakt, zodat het bioluminescentiesignaal zich kan ontwikkelen en stabiliseren.
  5. Terwijl het bioluminescentiesignaal zich ontwikkelt, bereidt u de IVIS-scanner voor op bioluminescentiebeeldvorming. Plaats de zwarte mat met lage fluorescentie op de beeldvormingstafel en configureer de neuskegelarray voor het aantal onderwerpen dat moet worden afgebeeld.
  6. Klik in de software op Imaging Wizard. Selecteer Bioluminescentiebeeldvorming en selecteer vervolgens Filter openen. Selecteer op het volgende scherm Onderwerp van de afbeelding en Gezichtsveld. De IVIS is nu ingesteld voor bioluminescentiebeeldvorming.
  7. Begin 3 minuten voor de beeldvorming met het voorbereiden van de inductiebox door het isofluraan/zuurstofmengsel de box te laten vullen. Plaats de muizen 2 minuten voor de beeldvorming in de inductiebox voor verdoving.
  8. Eenmaal verdoofd, verplaatst u de muizen van de inductiebox naar de IVIS voor beeldvorming en legt u ze allemaal in buikligging. Zorg voor onderhoudsanesthesie met 2% isofluraan tijdens beeldvorming.
  9. Zodra de muizen in de IVIS-scanner zijn geplaatst, klikt u op Sequentie verkrijgen. Maak een foto met behulp van instellingen voor automatische belichting met een minimale signaaldrempel van 3.000 count. Bioluminescentiebeeldvorming visualiseert de lokalisatie van met luciferase gelabelde U251-glioblastoomcellen. Automatische belichting legt een beeld vast met een belichtingsduur die is berekend op basis van het helderste signaal in beeld tot de door de gebruiker gedefinieerde maximale lengte van 5 minuten.
    OPMERKING: Een typische kooi met muizen vereist een enkel beeld, omdat het zaaien over het algemeen uniform is. In gevallen met een of meer heldere muizen kunnen muizen worden verwijderd en kan een herhalingsacquisitie worden uitgevoerd om signalen van zwakke muizen beter op te vangen.
  10. Wijzig na bioluminescentiebeeldvorming de IVIS-instellingen om epifluorescentiebeeldvorming voor te bereiden en fluorescentiescans uit te voeren.
    1. Selecteer in de wizard Beeldvorming de optie Fluorescentie > Gefilterd paar met Epi-Illuminatie. Selecteer in het volgende scherm de sondes die u wilt afbeelden, zoals Cy5.5. Selecteer het onderwerp en het gezichtsveld van de afbeelding. De IVIS-scanner is nu ingesteld voor fluorescentiebeeldvorming van de sondes die in het vorige scherm zijn geselecteerd.
  11. Maak een foto met behulp van instellingen voor automatische belichting met een minimale signaaldrempel van 6.000 count. Cy5.5 fluorescentiebeeldvorming visualiseert de lokalisatie van MN-anti-miR10b. Automatische belichting legt een beeld vast met een belichtingsduur die is berekend op basis van het helderste signaal in beeld tot de door de gebruiker gedefinieerde maximale lengte van 5 minuten.
    OPMERKING: Fluorescentiebeeldvorming duurt zelden langer dan 1 minuut belichting, zelfs niet bij controlemuizen die met PBS zijn geïnjecteerd. Een enkel beeld is altijd voldoende, omdat de signaalafwijking tussen behandelde muizen klein is.
  12. Verwijder de muis na beeldvorming uit de IVIS. Controleer totdat u volledig hersteld bent van anesthesie en ambulant.

6. In vivo magnetische resonantie beeldvorming

OPMERKING: MR-beeldvorming wordt uitgevoerd vóór en 24 uur na injectie van nanodeeltjes en kan worden uitgevoerd bij dezelfde dieren die optische en bioluminescentiebeeldvorming ondergaan.

  1. Verdoof de proefmuis in een inductiebox onder 2%-4% isofluraan voor inductie en 1,5%-2% voor onderhoud met een debiet van 1,5 l/min. Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis liggend op het MRI-bed bovenop de ademhalingsballon. Plaats de neuskegel goed op de snuit om anesthesie toe te dienen tijdens beeldvorming en breng oogheelkundige oogzalf aan.
  2. Immobiliseer en positioneer het hoofd voor scannen met behulp van een bijtstang en oorstangen.
  3. Installeer de gesmeerde rectale temperatuursonde en zorg ervoor dat de ademhaling en temperatuurbewaking werken. Plaats de hersenspoel van de muis over het hoofd door de pinnen op het muisbed in de gaten op de spoel te plaatsen en plak de spoel op zijn plaats om beweging tijdens het scannen te verminderen.
  4. Plaats een klein kussentje voor warmwatercirculatie over de bovenkant van de muis om de lichaamstemperatuur op peil te houden terwijl deze verdoofd is. Zorg ervoor dat er enige afstand is tussen de spoel en de verwarmingsdeken om vervorming van het beeld door waterinterferentie te beperken.
  5. Beweeg de muis en het beeldvormingsbed in de positie om te scannen.
  6. Stem de MRI-spoelen af en stem ze af door de Wobble-installatiestap in de acquisitiesoftware te starten. Gebruik aan de servicekant van de MRI de tune- en match-knoppen op de spoel om ervoor te zorgen dat het spoor gecentreerd (tune) en zo diep mogelijk is (match).
  7. Verkrijg een drievlaks lokalisatorscan en pas het beeldvormingsbed aan om de hersenen indien nodig in het isocentrum van de magneet te positioneren.
  8. Verkrijg 2D T2-gewogen scans om het geïnjecteerde middel in de tumor te detecteren met de volgende parameters: herhalingstijd (TR) = 2500 ms, echotijd (TE) = 25 ms, het gezichtsveld (FOV) 20 x 20 mm, 18 coronale plakjes, 0,2 mm plakspleet, 150 x 150 μm resolutie in het vlak, plakdikte van 0,5 mm.
  9. Verkrijg een B0-kaart van het hele brein om een gelokaliseerde shim te berekenen met behulp van het Mapshim-hulpprogramma. Gebruik vervolgens 3D T2 gewogen beelden om de nanodeeltjes te visualiseren met TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, resolutie 100 μm isotroop.
  10. Verkrijg de T2*- kaart voor verdere beeldvorming van nanodeeltjes met behulp van het 2D T2-gewogen beeld als referentie voor de positiescan over de tumor. Gebruik TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 coronale plakjes, geen plakjes. Resolutie in vlak 100 μm in vlak. Verkrijg 10 positieve echobeelden met een echotijdafstand van 5 ms.
  11. Bewaak de ademhaling en lichaamstemperatuur tijdens de beeldvormingssequenties en pas indien nodig de isofluraan en de watertemperatuur aan.
  12. Haal na de beeldvorming de muis uit de MRI-scanner en plaats deze in een verwarmde herstelkooi. Houd de muis in de gaten totdat deze volledig is hersteld van anesthesie en ambulant.

7. Ex vivo bioluminescentie en fluorescentie beeldvorming

  1. Voer ex vivo bioluminescentie- en fluorescentiebeeldvorming uit in de IVIS, vergelijkbaar met de in vivo beeldvorming. Voer de IVIS-initialisatie- en scaninstellingsstappen uit zoals hierboven beschreven.
  2. Weeg de muis op het experimentele eindpunt en bereken het volume D-luciferine dat moet worden toegediend voor een dosering van 150 mg/kg. Injecteer de dosis D-luciferine en voer 10 minuten na de injectie live beeldvorming uit, zoals eerder beschreven.
  3. Na de laatste in vivo bioluminescentie- en fluorescentiebeeldvorming, euthanaseert u de muis snel door cervicale dislocatie terwijl u nog onder narcose bent, ontleedt u de muis en verzamelt u de belangrijkste organen, waaronder de hersenen, op een petrischaal.
  4. Plaats de petrischaal met uitgesneden organen in de IVIS-scanner en beeld de organen af met zowel bioluminescentie- als fluorescentiemodaliteiten met behulp van dezelfde acquisitie-instellingen als de in vivo beeldvorming.
  5. Vries alle organen die nodig zijn voor verdere analyse in OCT snel in door de cryomal met het monster in OCT langzaam in een ondiepe poel van vloeibare stikstof met een lange tang te laten zakken totdat de OCT volledig wit wordt. Zorg ervoor dat vloeibare stikstof niet in contact komt met vloeibare OCT of de mal te snel laat zakken, omdat dit bubbels van de OCT zal veroorzaken. Bewaar ingevroren monsters bij -80 °C.
  6. Bewaar de hersenen met de tumor in OCT en vries ze snel in voor cryosectie. Bewaren bij -80 °C tot nodig voor analyse.

8. Fluorescentie microscopie

  1. Bereid de cryostaat voor op cryosectie. Stel de temperatuur van de kamer en de kop van het monster in tussen -15 °C en -20 °C.
  2. Haal het flash-bevroren brein in OCT uit de opslag van -80 °C en plaats het in de cryostaatkamer. Laat de monsters opwarmen tot de kamertemperatuur van de kamer (-20 °C) voordat u ze in secties snijdt.
  3. Snijd met een enkelsnijdend scheermes de hersenen coronaal op de injectieplaats. Dit is meestal zichtbaar als een kuiltje op het oppervlak van de hersenen. Monteer het monster op de preparaatschijf met behulp van een kleine hoeveelheid OCT om de snijkant van de te snijden hersenen te positioneren. Oefen voldoende druk uit met het gekoelde gewicht in de kamer om een stabiele montage van het monster te garanderen.
  4. Verplaats het gemonteerde monster en de sampleschijf op de samplekop ter voorbereiding op het doorsnijden. Snijd het weefsel af tot de gewenste diepte door secties van 20 μm te nemen en pas de hoek van het monster aan om het weefsel zo dicht mogelijk bij het weefsel te snijden.
  5. Zodra de gewenste weefseldiepte is bereikt, stelt u de cryostaat in om secties van 5 - 7 μm van het monster te nemen. Monteer de secties op glazen objectglaasjes die vooraf zijn gelabeld met descriptoren zoals muis-ID, weefselcoupe en objectglaasjesnummer door de geladen kant van het microscoopglaasje snel op de sectie te laten zakken.
  6. Maak verse 4% paraformaldehyde (PFA). Dompel het objectglaasje met tissue 15 minuten onder in de PFA-oplossing om het weefsel te fixeren. Spoel het glaasje na fixatie 3x af met DPBS.
  7. Voeg aan het nu gefixeerde weefselgedeelte op het objectglaasje een druppel van 40 μL montagemedium toe dat 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat, dat celkernen kleurt. Plaats voorzichtig een glazen dekglaasje van 24 mm x 50 mm op de montagemedia en zorg ervoor dat het hele weefsel in de montagemedia is omhuld.
  8. Visualiseer het weefsel met behulp van DAPI (emissie (em) bij 359 nm, excitatie (ex) bij 457 nm) en Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm) fluorescentiemicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

MN-anti-miR10b werd gesynthetiseerd en gekarakteriseerd, zoals eerder beschreven11. Transmissie-elektronenmicroscopie van MN-anti-miR10b toont de morfologie en polydispersiteit van het nanoplatform (Figuur 1B). Dit nanoplatform heeft een gemiddelde grootte van 25,12 ± 0,34 nm met een zeta-potentiaal van 13,18 ± 1,47 mV (Figuur 1C,D). In deze onderzoeken werden naakte athy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende kritieke stappen in de verschillende methoden voor het valideren van de accumulatie van de nanodeeltjes in de BBB kunnen doorslaggevend zijn voor het succes van het protocol. Beginnend met de orthotope implantatie van GBM-cellen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de hechtlijnen van de schedel zichtbaar zijn na het drogen van het bot; Dit helpt bij de nauwkeurige plaatsing van de tumorcellen. Voor het boren door de schedel is het het beste om lichte druk uit te oefen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Z.M. en A.M. zijn medeoprichters en aandeelhouders van TransCode Therapeutics Inc. De overige auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

De financiering voor deze studie werd gedeeltelijk verstrekt door de subsidie van de Henry Ford Health Systems Michigan State University Health Sciences Alliance aan AM en A.dC. We danken Dr. Danielle R. Ferguson voor het toezicht houden op dierstudies aan de Michigan State University en voor het goedkeuren van deze video.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Athymic nude "J:NU" muizenJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:007850Immunodeficiënte muizenmodel
0,25% TrypsineGibco25200-056Celcultuurreagens voor U251
1,7 mL microcentrifugebuisjeDOT ScientificRN1700-GMTVoor weefselverzameling
10 µL, Neuros-sering, Model 1701 RN, 33 gauge, Point Style 4Hamilton65460-06Spuit voor intracraniële implantatie van tumorcellen
3M Vetbond3M1469SBWeefselkleefstof voor het sluiten van chirurgische plekken
4% ParaformaldehydeThermo ScientificJ199943-K2Weefselfixeermiddel
70% isopropoyl alcoholdoekjeCardinalMW-APLTopisch antisepticumdoekje voor tumorimplantatie en injectie in de staarvan
Aperio VersaLeicaVoor het scannen van gekleurde weefselsectieslides
Betadine Surgical ScrubPurdue6761815101Topisch antisepticum voor tumorimplantatie
BioSpec 70/30BrukerMagnetische resonantiebeeldvormingscanner
Bone WaxMedlineDYNJBW25Boterwas voor het verzegelen van de implantatieplaats
Boortjes voor microboorF.S.T.19007-05Boor gebruikt om een gat in de schedel te maken voor tumorimplantatie
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20Weefselmontagemedium dat DAPI-kleuring bevat
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065Celcultuurmedium voor U251
Extra Fine Graefe-tangF.S.T.11150-10Chirurgisch instrument voor tumorimplantatie
Fetaal bovien serumCorning35-010-CVAanvulling voor celcultuurmedium voor U251
Fijne schaar - Scherp 10,5 cmF.S.T.14060-10Chirurgisch instrument voor tumorimplantatie
Glydo (Lidocaïne)Sagent673-76Topisch pijnstillend middel voor chirurgische plek
Ideal Micro DrillCellPoint Scientific67-1200ABoor gebruikt om een gat in de schedel te maken voor tumorimplantatie
Insulinespuit 1CC 29G X 1/2"Becton, Dickinson324704Spuit voor injectie van D-Luciferine en injectie in de staarvan van nanodeeltjes
IsofluraanCovetrus11695067772Anesthesie
IsofluraanverdamperSOMNI ScientificVS6002Anesthesietoestel
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging SystemPerkinElmer/Revvity128201Bioluminescentie- en fluorescentiebeeldvormingscanner
IVISbrite D-Luciferine KaliumzoutPerkinElmer/Revvity122799-100MGSubstraat voor bioluminescentie-beeldvorming
Ketaset (Ketamine)Zoetis10004027Anesthesie voor tumorimplantatiechirurgie
Ketofen (Ketoprofen)Zoetis10004031Pijnstiller voor tumorimplantatiechirurgie
Leica CM1950LeicaCM1950Voor cryosectie van OCT-ingebedde monsters
PBSGibco14190-144Celcultuurreagens en celsuspensieoplossing voor implantatie van U251
Penicilline-streptomycineGibco15140-122Antibioticum voor celcultuurmedium voor U251
Puralube diergeneeskundig zalfMWI Veterinary27505Oogzalf voor bescherming tijdens tumorimplantatie
LinialF.S.T.18000-30Gebruikt om de boorplek voor implantatie te meten
Tissue-Tek Cryomold  Intermediate 15 x 15 x 5 mmSakura4566Verzamelvorm voor het verzamelen van weefselmonsters
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Vriesmiddel voor het verzamelen van weefselmonsters
U-251 MG-cellijn menselijkMillapore Sigma9063001Menselijk glioblastoomcellijn
Xylazininjectieoplossing, 100 mg/mlCovetrus1XYL006Paralytica voor tumorimplantatiechirurgie

Referenties

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Bloed-hersenbarrièreijzeroxide-nanodeeltjesmagnetische resonantie-imagingfluorescentie-imagingbioluminescentie-imagingtumoraccumulatie
Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.