Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het bouwen, steriliseren, assembleren, gebruiken en hergebruiken van de schimmelsnelwegkolommen om bacterie-schimmelparen te verrijken die interageren via schimmelsnelwegen van diverse omgevingssubstraten.
Methodenartikel
Onderzoek naar bacterie-schimmelinteracties met behulp van schimmelsnelwegkolommen in diverse omgevingen en substraten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bacterie-schimmelinteracties (BFI's) spelen een integrale rol bij het vormgeven van de samenstelling van microbiële gemeenschappen, biogeochemische functies, ruimtelijke dynamiek en microbiële verspreiding. Myceliale netwerken gemaakt door filamenteuze schimmels of andere filamenteuze micro-organismen (bijv. Oomyceten) fungeren als 'schimmelsnelwegen' die door bacteriën kunnen worden gebruikt voor transport door heterogene omgevingen, waardoor hun mobiliteit aanzienlijk wordt vergemakkelijkt en ze toegang krijgen tot regio's die moeilijk of onmogelijk te bereiken zijn op zichzelf (bijvoorbeeld vanwege luchtbellen in de bodem). Er zijn verschillende apparaten en experimentele protocollen gemaakt om deze schimmelsnelwegen te bestuderen, waaronder schimmelsnelwegkolommen. De door onze groep ontworpen schimmelsnelwegkolom kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan in-situ - of in-vitrotoepassingen , maar ook voor diverse soorten omgevings- en gastheergerelateerde monsters. Hierin beschrijven we de methoden voor het uitvoeren van experimenten met deze kolommen, waaronder het ontwerpen, printen, steriliseren en voorbereiden van de apparaten. De opties voor het analyseren van gegevens die zijn verkregen uit het gebruik van deze apparaten worden hier ook besproken, en er wordt advies gegeven over het oplossen van problemen met mogelijke valkuilen in verband met experimenten met schimmelsnelwegzuilen. Deze apparaten kunnen worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van de diversiteit, mechanismen en dynamiek van BFI's van schimmelsnelwegen om waardevolle inzichten te verschaffen in de structurele en functionele dynamiek binnen complexe omgevingen (bijv. bodems) en in diverse habitats waarin bacteriën en schimmels naast elkaar bestaan.
Inleiding
Bacteriële-schimmelinteracties (BFI's) zijn uiterst belangrijk bij het vormgeven van de structurele, ruimtelijke en functionele eigenschappen van omgevingsmicrobiomen. Zo genereert de groei en uitbreiding van draadvormige schimmels of andere schimmelachtige draadvormige micro-organismen een biologisch netwerk dat kan fungeren als een 'snelweg' om de verplaatsing van andere micro-organismen, zoals bacteriën, te vergemakkelijken. Heterogeniteit en inconsistente verzadiging binnen omgevingssubstraten kunnen de bacteriële motiliteit belemmeren; Bacteriën kunnen deze snelwegen echter gebruiken om de toegang tot extra delen van de omgeving te vergemakkelijken 1,2. Deze interacties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de ruimtelijke dynamiek van microbiële gemeenschappen. Er zijn verschillende technieken en methoden gebruikt om schimmelsnelwegen te onderzoeken, maar deze zijn grotendeels beperkt tot laboratoriumonderzoek 3,4.
Bij één plaatmethode wordt een groot deel van de agar uit het midden van de petrischaal verwijderd, waardoor er een opening ontstaat tussen twee agar-eilanden. Schimmeldraden kunnen deze kloof overbruggen en bieden compatibele bacteriën de middelen om van het ene agar-eiland naar het andere over te steken5. Andere gemodificeerde petrischaalmethoden zijn onder meer omgekeerde platen waar aarde in het deksel wordt geplaatst, zodat schimmeldraden verticaal kunnen groeien en de media kunnen koloniseren zonder direct contact, wat de middelen biedt voor bacterieel transport 5,6. Een recent ontwikkelde methode op basis van groeimediadruppels kan worden gebruikt om selectief hyfaal transport van bacteriën naar bepaalde voedingsprofielen te evalueren7. Bacteriële brug- en padapparaten zijn ook gebruikt om het effect van abiotische factoren op bacteriële beweging te onderzoeken8. Hoewel er verschillende methoden en technieken zijn gebruikt om schimmelsnelwegen te onderzoeken, blijft er behoefte aan gestandaardiseerde apparaten die een steriele micro-omgeving behouden en tegelijkertijd de aanleg van schimmelsnelwegen bevorderen uit complexe omgevingssubstraten zoals mest, grond en rhizosfeer.
Onze groep ontwierp een 3D-geprinte versie van schimmelsnelwegkolommen waar schimmels bacteriën van het ene uiteinde naar het andere kunnen transporteren9. Deze apparaten zijn samengesteld uit vier geprinte componenten: de kolom zelf met een zandlopervorm en een complexe binnenste roosterstructuur, een ring met schroefdraad en twee doppen (een grote dop en een kleine dop), evenals een stuk gesteriliseerd nylon gaas (Figuur 1). De gemonteerde kolom wordt rechtstreeks op de gewenste omgevingsondergrond aangebracht. De kolom stelt microben vervolgens in staat om een agar-groeimediumplug te koloniseren, bekend als de 'bait'-mediaplug die zich op de bodem van de kolom bevindt en via het gaas in contact staat met het omgevingssubstraat. Dit stuk nylon maaswijdte sluit andere bodembewoners uit die bacteriën kunnen vervoeren, waardoor de bacteriële beweging in de kolommen wordt beperkt tot schimmelsnelwegen. Zodra deze aasplug is gekoloniseerd, kunnen filamenteuze schimmels zich uitbreiden en groeien door het binnenste rooster in het midden van de kolom dat is ontworpen om een onverzadigd systeem te creëren dat lijkt op aarde (of andere onverzadigde media) en mogelijke besmetting van het aasmedium te minimaliseren. De schimmels groeien dan naar de doelmediumplug aan de bovenkant van de kolom en koloniseren deze. Kolommen kunnen worden geïnoculeerd met specifieke schimmelisolaten om hun vermogen om bacteriën te transporteren te testen, of ze kunnen niet-geïnoculeerd worden gelaten om te identificeren welke schimmels uit het substraat in staat zijn om bacteriën te transporteren. Organismen die het doelmedium bereiken, kunnen verder worden gekweekt, geïsoleerd en onderworpen aan sequencing-analyses (hetzij van zuivere culturen, hetzij van gemengde gemeenschappen met behulp van amplicon- of metagenomische sequencing-benaderingen). Over het algemeen bieden de kolommen een gestandaardiseerde, reproduceerbare, herbruikbare en intuïtieve methode voor het ondervragen van schimmelsnelwegen in diverse substraten. Deze apparaten kunnen worden gebruikt voor onderzoek en als leermiddel in de klas, en hierin bieden we instructiestappen voor het gebruik ervan op basis van de experimenten die in het verleden zijn uitgevoerd. Hoewel deze methode de standaardisatie van protocollen vergemakkelijkt, kunnen het ontwerp en de constructie van de apparaten worden aangepast voor andere toepassingen en aanvullende substraten.
Protocol
De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Het kolomontwerp, de materialen en de parameters wijzigen
- Download de openbaar beschikbare kolomontwerpen9 en gebruik ze ongewijzigd of wijzig de kolomontwerpen in compatibele CAD-software (Computer-Aided Design).
- Zorg voor tandheelkundig chirurgisch geleidingshars of selecteer een alternatief 3D-printmateriaal, zoals andere lichtgevoelige heldere harsen.
- Pas de specificaties van de kolom indien nodig aan als de gekozen 3D-printer, 3D-printtechnologie of 3D-printmateriaal wordt gewijzigd ten opzichte van wat eerder werd gebruikt9.
2. 3D afdrukken van de kolommen
- Stel de afdrukparameters in op een plakdikte van 0,05 mm en een belichtingstijd van 0,8 s, of pas de afdrukparameters aan afhankelijk van de geselecteerde printer, het afdrukmateriaal en de afdruksoftware.
- Print de schimmelsnelwegzuilen, de schroefdraadringen en de doppen met een compatibele 3D-printer (Afbeelding 1).
Figuur 1: Componenten van de schimmelsnelwegkolom. (A,B) Boven- en zijaanzichten van de small cap, de schroefdraadring en de large cap (van links naar rechts). (C,D) Boven- en zijaanzicht van de small cap. (E,F) Boven- en zijaanzicht van de ring met schroefdraad. (G,H) Boven- en zijaanzicht van de grote kap. (I) Een stuk nylon gaasfilter (25 μm) dat aan het einde van de kolom wordt geplaatst en in het omgevingssubstraat wordt geplaatst om te voorkomen dat microfauna de kolom binnendringt. (J) Niet-gemonteerde kolom. (K) Geassembleerde kolom: het 'Aas'-uiteinde gaat in het substraat en het 'Target'-uiteinde blijft onbedekt en uit het substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Reinigen van de 3D-geprinte kolomcomponenten
- Dompel de bedrukte kolommen, doppen en ringen met schroefdraad 15 minuten onder in 99% isopropylalcohol bij kamertemperatuur en schud ze door het bad elke minuut 10-15 s met de hand heen en weer te bewegen om overtollige hars te verwijderen.
- Breng de componenten over naar een vers bad met 99% isopropylalcohol. Dompel 5 minuten onder en schud met de hand op dezelfde manier als in stap 3.1.
- Breng de componenten over naar een ultrasone reiniger gevuld met zuiver water, dompel de componenten onder en schud gedurende 2 minuten op een gemiddelde snelheid. Verwarm het water niet. Verwijder de onderdelen.
- Laat alle onderdelen minimaal 30 minuten aan de lucht drogen.
- Om de na-uitharding van de hars uit te voeren, stelt u alle 3D-geprinte componenten bloot aan 405 nm licht gedurende 30 minuten bij 60 °C.
4. Steriliseren van de kolommen
- Als het gekozen materiaal autoclaveerbaar is, worden de kolommen, schroefdraadringen, doppen en vellen van 25 μm nylon gaas afzonderlijk of in een groter bekerglas gedurende 20-30 minuten bij 121 °C, 1 atm geautoclaveerd.
OPMERKING: Componenten van de kolom kunnen na het autoclaveren van vorm en kleur veranderen, maar ze behouden de gewenste materiaaleigenschappen. De uiteindelijke grootte, vorm en kleur van de kolomcomponenten na het autoclaveren worden weergegeven in figuur 1.
5. Media klaarmaken voor de columns
- Bereid 90 mm petrischaaltjes met gesteriliseerde media op basis van agar: natriumcarboxymethylcellulosemedium (CMC), moutextractagar (MEA), aardappeldextrose-agar (PDA) of Reasoner's 2A-agar (R2A)9,10. Bereid de media voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Steriliseer de media door gedurende 21 minuten of de door de fabrikant aanbevolen tijd bij 121 °C, 1 atm, te autoclaveren en giet in petrischaaltjes van 90 mm tot de agar dicht bij de bovenkant van de zijkanten van de petrischaaltjes is (Figuur 2). Voer deze stap uit in een biologische veiligheidskast om de steriliteit te verhogen.
- Laat de agar stollen en drogen volgens de instructies van de fabrikant.
Figuur 2: Assemblageproces voor de schimmelkolommen van de snelweg. Met behulp van een open uiteinde van de kolom zelf wordt een stekker uitgesneden en ingestoken, en de onderzoeker draait de kolom terwijl deze van de media wordt verwijderd om ervoor te zorgen dat de stekker binnen het uiteinde van de kolom blijft. Dat uiteinde wordt afgedekt met het kleine dopstuk. Een mediastekker wordt vervolgens op dezelfde manier aan het andere uiteinde van de kolom toegevoegd. Het gaasstuk wordt vervolgens over dit uiteinde geplaatst en vastgezet met de schroefdraadring. De grote dop wordt vervolgens gebruikt op dit 'Bait' uiteinde over de schroefdraadring. De kant met het gaas wordt in het omgevingssubstraat geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Voorbereiding van de schimmelkolommen van de snelweg
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om de steriliteit van de kolomcomponenten en de media te behouden. Figuur 2 illustreert het assemblageproces van de schimmelsnelwegkolom.
- Gebruik het uiteinde van de kolom zelf (zonder doppen erop) om een mediastekker te verwijderen die strak in het ene uiteinde van de kolom past. Gebruik een draaiende beweging terwijl de kolom van het medium wordt getild, zodat de agar binnen het uiteinde van de kolom blijft. U kunt ook het einde van de kolom als sjabloon gebruiken, de media uitsnijden en deze met behulp van een pipetpunt in de kolom overbrengen.
- Nadat de eerste stekker aan het einde van de kolom is toegevoegd, voegt u de kleine dop aan dit uiteinde toe om een steriele micro-omgeving voor de doelmedia te behouden.
- Draai de kolom om en herhaal stap 6.1 voor het andere uiteinde van de kolom.
- Knip een rond stuk met een diameter van ~2 cm van het geautoclaveerde nylon gaas (poriegrootte van 25 μm) af met een gesteriliseerde schaar (Figuur 1). Leg het gaas over het blootgestelde uiteinde van de kolom. Draai de ring met schroefdraad op dit aasmedia-uiteinde van de kolom terwijl u het gaas in de draden vastzet.
- Plaats de grote dop aan de onderkant van de kolom over het gaas en het andere uiteinde van de schroefdraadring en houd deze dop erop bij het opbergen of vervoeren van de kolom.
7. Het substraat of aasmedium voorinoculeren met een schimmel van belang
OPMERKING: Deze stap is optioneel.
- Inoculeer een interessante schimmel (bijv. een schimmel waarvan bekend is dat deze schimmelsnelwegen creëert) op het gewenste substraat door de schimmel eerst te laten groeien op een vast schimmelgroeimedium (bijv. MEA, PDA; bereid zoals beschreven in stap 5) in een petrischaaltje en een klein (~1 cm) stukje agar met zichtbare schimmelgroei over te brengen naar het substraat.
OPMERKING: Eerdere experimenten9 hebben 10 dagen lang voorgekoloniseerd mestsubstraat met Coprinopsis cinerea gebruikt voordat de kolommen aan het voorgekoloniseerde substraat werden toegevoegd. - In plaats van het substraat voor te koloniseren, voegt u een aasschimmel toe aan een petrischaaltje of rechtstreeks aan de bodem van het aasmedium in de kolom met behulp van een kleine hoeveelheid schimmelmycelia (bijvoorbeeld door een steriele lus te vegen).
- Wacht voor de petrischaal tot er zichtbare groei is die een groot deel van de petrischaal bedekt (ongeveer 50%-75% van de bedekte plaat), en stamp vervolgens het aasmediagedeelte rechtstreeks uit de gekoloniseerde petrischaal die zich het dichtst bij de buitenrand van de schimmelgroei bevindt (zoals beschreven in stap 6.1).
- Wanneer u de aasmedia direct voorkoloniseert, wacht dan tot er duidelijke groei is in de aasmedia voordat u de kolom aan het substraat toevoegt (dit zal waarschijnlijk enkele dagen duren).
OPMERKING: Eerdere experimenten9 hebben 14 dagen oude media gebruikt die vooraf waren gekoloniseerd met C. cinerea als aasmedia; De pre-kolonisatietijden zijn afhankelijk van de groeisnelheid van de schimmel, het mediatype en de incubatieomstandigheden.
8. Voorbereiding van de controlebehandelingen en replicaten
- Bereid negatieve controlekolommen voor (zoals beschreven in stap 1-6) en inoculeer ze niet en plaats deze kolommen niet in het substraat. Gebruik ze om een basislijn te bieden voor latere analyses en om eventuele verontreinigingen in het voorbereidingsproces te beoordelen.
- Neem ten minste drie replica's van kolommen op voor elk experiment.
9. De kolom toevoegen aan het substraat
- Zet een laboratoriummicrokosmos op (bijv. aarde in een doos, pot of buis; Figuur 3A) Of breng de kolommen naar een interessante veldsite.
- Verwijder de grote dop van de onderkant van de kolom om de ring met schroefdraad en het gaas bloot te leggen.
- Voeg de kolom toe aan het substraat van belang (Figuur 3) volgens de specifieke overwegingen voor elk substraattype die hieronder worden beschreven. Indien nodig, en om schade aan het gaas tot een minimum te beperken, maakt u een kuil in de ondergrond met behulp van een gehandschoende hand of klein gereedschap (bijv. een kleine troffel) voordat de kolom in de ondergrond wordt geplaatst.
- Mest: De zuilen werden vroeger met succes gebruikt in verse paardenmest. Bewaar de mest voor gebruik bij 4 °C en voeg toe aan kamers, zoals magenta dozen, voordat u de kolommen toevoegt. Plaats de kolom in de ondergrond om 1-2 cm van de totale kolomhoogte te bedekken.
- Grond: Plaats de kolommen zo dat het hele onderste gedeelte zich in de grond bevindt (~1-2 cm gronddiepte) (Figuur 3B). De kolommen kunnen op de bovenkant van de grond rusten of worden begraven tot vlak onder de kleine kap aan de doelzijde.
- Rhizosfeer: Plaats de kolommen in de grond rond de plantenwortels volgens de instructies in stap 9.3.2 tijdens het kantelen en plaats de kolom dicht bij bepaalde wortels om de kans op het vangen van micro-organismen in de rhizosfeer te vergroten (Figuur 3C).
- Substraten in buizen: Voeg ~10 ml van een interessant substraat toe aan een conische buis van 50 ml of iets dergelijks en maak het substraat indien gewenst nat (bijv. in omgevingen met een zeer lage luchtvochtigheid) met zuiver water. Steek de kolom in de buis zodat de bodem wordt ingegraven en er geen delen van de schroefdraadring of het gaas zichtbaar zijn (Figuur 3A). Schroef het deksel van de 50 ml tube dicht en plaats deze in een 50 ml tube rek om hem rechtop te houden.
10. Kolom in de ondergrond laten zitten
- Laat de kolom 3-21 dagen in het substraat staan.
OPMERKING: De hoeveelheid tijd die de kolommen nodig hebben om in hun substraten te blijven, hangt af van de groeisnelheid van de gebruikte aasschimmels, de groeisnelheid van schimmels die de aasmedia koloniseren en de omgevingsomstandigheden (droge omstandigheden leiden bijvoorbeeld tot snellere uitdroging van de media en kunnen dus niet zo lang worden gebruikt). - Stel een gewenste licht/donker-cyclus voor het experiment vast; Eerdere experimenten hebben de kolommen in het laboratorium in het donker gehouden, terwijl de kolommen in het veld zijn onderworpen aan de lokale dag/nacht-omstandigheden9.
11. De kolom van de ondergrond verwijderen
- Nadat de kolom gedurende de gewenste tijd in contact is geweest met het substraat, verwijdert u de kolom, schudt u voorzichtig het overtollige substraat eraf en voegt u de large-cap weer toe aan de onderkant van de kolom onder het gaas om de kolom te transporteren.
- Plaats de kolom in een steriel bekerglas of een tube van 50 ml voor transport. Houd de kolom rechtop tijdens het transport.
12. Kweekisolaten van het doelmedium van de kolom
- Verwijder in een steriele omgeving, zoals een biologische veiligheidskast, de grote dop van het aasmedium, de ring met schroefdraad en het gaas. Gooi het gaas weg.
OPMERKING: Als een onderzoeker geïnteresseerd is in welke organismen het aasmedium hebben gekoloniseerd, volg dan de stappen 12.3-12.4 met de plugg van het aasmedium naast de plug van het doelmedium. - Verwijder de kleine dop van het kolomuiteinde met het doelmedium.
- Verwijder de plug van het doelmedium door de kolom om te draaien zodat de doelplug uit de kolom kan vallen, of door een gesteriliseerde tang of pipetpunten te gebruiken om de plug eruit te halen. Plaats de plug van het doelmedium rechtstreeks in het midden van een petrischaal van 90 mm gevuld met een agarmedium naar keuze (zoals bereid in stap 5).
OPMERKING: Schimmel- of bacteriespecifieke media kunnen hier worden gebruikt om de groei van leden uit beide koninkrijken te bevorderen; de plug kan ook in twee of meer stukken worden verdeeld met behulp van een gesteriliseerde schaar of een pipetpunt, waardoor op meerdere mediatypen kan worden geplateerd en/of doelmedia kunnen worden bewaard voor DNA-extracties (zie stap 14). - Incubeer de petrischaal die is geënt met de plug van het doelmedium gedurende ten minste 72 uur bij 25 °C in het donker.
13. Subcultuur om micro-organismen te isoleren
OPMERKING: Deze stap is optioneel.
- Voor bacteriën: Gebruik een steriele inoculatielus om over een enkele interessante kolonie te vegen terwijl u het contact met andere delen van de petrischaal minimaliseert. Streep de kolonie op een verse petrischaal van 90 mm met het geprefereerde bacteriële medium, zoals R2A (zoals bereid in stap 5), met behulp van elke methode die het mogelijk maakt om afzonderlijke kolonies te vormen (bijv. strepen in vier zones). Incubeer de petrischaal gedurende 24-72 uur bij 25-37 °C en controleer op koloniegroei.
- Voor schimmels: Snijd met behulp van een steriele inoculeringslus, een steriel scheermes of een steriele pipetpunt een minimaal deel (1 mm2) agar uit dat schimmelvliesgroei bevat. Plaats het kleine stukje agar op een vers petrischaaltje van 90 mm met het gewenste schimmelmedium, zoals MEA of PDA, zoals bereid in stap 5. Incubeer de petrischaal gedurende maximaal een week bij 25 °C in het donker en controleer dagelijks om overgroei te voorkomen.
- Herhaal stap 1 of stap 2 indien nodig totdat de morfologieën van het organisme uniform zijn.
14. DNA extraheren van de plaat of rechtstreeks van het doelmedium
- Vries de gehele agarpluggen (target en/of aas) of de geselecteerde stukken uit de kolommen in centrifugebuisjes van 1,5 ml bij -20 °C in of dompel stukjes van de pluggen onder in een conserveermiddel in een centrifugebuisje van 1,5 ml vóór de extractie als de extracties niet onmiddellijk plaatsvinden.
- Als er gekweekt is op basis van het doel en/of de aasmedia en als er daaropvolgende subkweekstappen zijn genomen, stempel of snijd dan een stuk agar van ~ 1 cm met schimmel- of bacteriegroei (of een mix van beide als er geen volgende isolatiestappen zijn genomen).
- Voor extracties van geïsoleerde bacteriekolonies veegt u een kolonie van de plaat met behulp van een steriele inoculatielus en wervelt u deze rechtstreeks in de extractiebuffer die is gekoppeld aan de commerciële DNA-extractiekit (stap 14.4).
- Maal de agarstukjes afzonderlijk in vloeibare stikstof met behulp van een vijzel en stamper en breng gemalen weefsel over in extractiebuizen.
- Gebruik een in de handel verkrijgbare DNA-extractiekit die is geoptimaliseerd voor aarde of bacteriën en schimmels, en volg de instructies van de fabrikant om het DNA te extraheren (zie materiaaltabel).
- Kwantificeer het resulterende DNA met behulp van een fluorometer of een vergelijkbaar systeem.
15. Beoordeling van de microbiële taxonomische diversiteit in de doel- en/of lokaasmedia met behulp van amplicon- of metagenomische sequencingbenaderingen
- Voer amplicon-sequencing uit (16S en/of interne getranscribeerde spacer [ITS]) of metagenomische sequencing volgens de onderstaande stappen:
- Amplicon-sequencing: Amplificeer het V3-V4 16S rRNA-gengebied met behulp van de primers Bakt 341F (5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3") en Bakt 805R (5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3"). Versterk het schimmelgebied ITS2 met behulp van de primers ITS3 KYO2 (5′-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3") en ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3") 9.
- Bereid ampliconbibliotheken voor met behulp van commerciële bibliotheekvoorbereidingskits die compatibel zijn met de gekozen sequencer. Sequentie de amplicons met behulp van een short-read sequencer om 150 of 250 basenpaar gepaarde lezingen met voldoende dekking te genereren door de instructies van de fabrikant van het sequencingplatform voor de belastingsconcentratie te volgen.
- Metagenomische sequencing: Creëer een metagenomische bibliotheek van het geëxtraheerde DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare metagenomische bibliotheekvoorbereidingskit die compatibel is met de gekozen sequencer. Sequentie van de metagenoombibliotheek met behulp van een short-read sequencer die is ingesteld om 150 of 250 basenpaar paired-end reads te genereren met voldoende dekking (~10-20 Gb per metagenoom) door de instructies van de fabrikant van het sequencingplatform voor de laadconcentratie te volgen.
16. Analyseren van de sequentiegegevens
- Analyseer amplicongegevens: Gebruik het QIIME2-platform 11 met DADA212 om amplicongegevens te analyseren voordat de resultaten worden gevisualiseerd13. Volg de onderstaande stappen om QIIME2 uit te voeren in het webgebaseerde bio-informaticaplatform Empowering the Development of Genomics Expertise (EDGE)14. QIIME2 kan ook worden uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare tutorials, zoals de gids "Moving Pictures" die online wordt aangeboden (https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/).
- Navigeer naar https://edgebioinformatics.org/ en log in of maak een account aan.
- Selecteer QIIME2 UITVOEREN op de startpagina. Selecteer Bestanden uploaden in de linkermenubalk om bestanden te uploaden van de amplicon-sequencing-runs.
- Maak een metagegevenstoewijzingsbestand met behulp van de instructies die worden meegeleverd wanneer de 'i' naast 'Metagegevenstoewijzingsbestand' met de muis over wordt geplaatst.
- Voeg alle vereiste informatie toe (project-/runnaam, leestype, parameters, enz.) en selecteer de juiste geüploade invoergegevens. Zorg ervoor dat DADA2 is geselecteerd als kwaliteitscontrolemethode12; Andere parameters kunnen als standaardwaarden worden gehandhaafd, tenzij andere wijzigingen gewenst zijn.
- Selecteer het amplicontype als 16S Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) voor de bacteriële amplicons of Fungal ITS voor de schimmelamplicons. Analyseer onafhankelijk van elkaar bacteriële (16S) en schimmelgegevens (ITS).
- Druk op verzenden en wacht tot de run is afgelopen om de resultaten te bekijken.
- Visualisaties van amplicongegevens genereren (optioneel): Voer aanvullende communitygegevensanalyses uit in R met behulp van veelgebruikte pakketten zoals phyloseq (https://github.com/joey711/phyloseq), VEGAN (https://github.com/vegandevs/vegan) en APE (https://emmanuelparadis.github.io/) volgens de richtlijnen in GitHub en via het R-pakket Help beschikbaar in R Studio door naar het menu Pakketten te navigeren, op het gedownloade pakket te klikken en de documentatie weer te geven.
- Metagenomische gegevens analyseren
- Navigeer naar de NMDC EDGE-site 15 (https://nmdc-edge.org/home) en log in met een ORCiD-account (https://orcid.org/).
- Selecteer Bestanden uploaden in de menubalk aan de linkerkant van het scherm en sleep en zet neer of blader naar de juiste invoer-FASTQ-bestanden.
- Selecteer Metagenomics, vervolgens de optie Meerdere workflows uitvoeren in de menubalk aan de linkerkant van het scherm en stel alle workflows in op Aan. Voeg een projectnaam en een optionele beschrijving toe.
- Selecteer de geüploade RAW-leesbestanden (fastq) en selecteer het juiste bestandsformaat (interleaved of paired).
- Start de uitvoering door op Verzenden te klikken en de overzichtstabellen en visualisaties weer te geven wanneer de uitvoering is voltooid door het project te selecteren op het tabblad Mijn projecten boven aan het scherm.
17. Creëren van aanvullende visualisaties van taxonomiegegevens uit amplicon- en/of metagenomische resultaten
- Genereer cirkelvormige cladogrammen met behulp van het GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan)-pakket volgens de instructies in GitHub.
OPMERKING: Taxonomie (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy) ID's van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) kunnen worden verkregen uit representatieve sequentietoewijzingen en worden doorgegeven aan het 'eftech'-programma van de Entrez Direct E-utilities om taxonomie-rollup-informatie te verzamelen die vereist is door GraPhlAn16.
18. Hergebruik van de kolommen
- Als de kolommen nog gemonteerd zijn, schroeft u de doppen, de schroefdraadring en het gaas los en verwijdert u deze. Gooi het gaas weg. Verwijder alle resterende agarpluggen, was de kolommen met 99% isopropylalcohol en gezuiverd water en reinig en droog de componenten zoals beschreven in de stappen 3.1-3.4.
- Bereid nieuwe vellen nylon gaas voor om te worden geautoclaveerd.
- Autoclaaf de componenten volgens de richtlijnen in stap 4.1.
Resultaten
De volledig geassembleerde schimmelsnelwegkolom is ongeveer 5 cm lang (Figuur 1). De kolom mag op geen enkel gebied worden gebroken en de doppen en de schroefdraadring moeten gemakkelijk en strak in elkaar passen om micro-omgevingen in de kolom te creëren. Het filtergaas kan verder uitsteken dan de ring met schroefdraad (zoals weergegeven in afbeelding 1 en afbeelding 2), of het kan worden bijgesneden met een gesteriliseerde schaar. De agarpluggen moeten goed passen aan elk uiteinde van de kolom. Wanneer het in het substraat wordt geplaatst, moet het filtergaas in contact komen met het substraat en mag de kolom niet volledig worden begraven.
Kolommen werden eerder getest in paardenmest9. De kolommen werden ook in bulk- en rhizosfeergrond geplaatst op een onderzoeksveldlocatie, evenals in kleine hoeveelheden grond in buizen van 50 ml in het laboratorium (Figuur 3). Nadat de schimmelsnelwegkolommen van het substraat waren verwijderd en gedemonteerd, was microbiële groei zichtbaar op zowel het aas als de doelmediapluggen (voorbeelden weergegeven in figuur 4A). Bacteriën en schimmels werden geïsoleerd uit doel- en aasmedia via subkweektechnieken (Figuur 4B), en de microben die aanwezig waren op de mediapluggen werden taxonomisch geïdentificeerd met behulp van amplicon-sequencing (Figuur 4C,D). Figuur 4C,D toont de gecombineerde resultaten van de amplicon-sequencing in meerdere experimenten, en laat zien welke microben in staat waren om de doelmediastekker te bereiken uit kolommen die aan paardenmest waren toegevoegd9. Visualisaties van deze bacteriële en schimmelgegevens werden gegenereerd zoals beschreven in stap 17. Resultaten kunnen ook worden weergegeven als relatieve abundanties van taxa.
Suboptimale resultaten zijn verkregen in gevallen waarin de kolommen werden toegevoegd aan omgevingen met een extreem lage luchtvochtigheid en de mediastekkers binnen enkele dagen volledig waren uitgedroogd, wat leidde tot geen herstel van gekoloniseerde microben (Figuur 5A). We hebben ook gevallen gezien waarin microben gewoon niet groeien uit de doelmediastekker (Figuur 5B), en gevallen waarin we niet voldoende sequentiegegevens uit de doelmediastekker halen voor zinvolle analyses. Andere gevallen waarin schimmels uit de kolommen groeien, hebben ook geleid tot de noodzaak om de experimenten opnieuw uit te voeren (Figuur 5C).
Figuur 3: Voorbeelden van de kolommen die in milieumonsters zijn geplaatst in laboratorium- en veldomgevingen. (A) Kolom geplaatst in een buis van 50 ml met bevochtigde grond in een laboratoriumomgeving. Ook afgebeeld met een liniaal voor schaal. (B) Kolom geplaatst in de grond in het veld. (C) Kolom geplaatst in het wortelnetwerk van een plant in het veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van succesvolle kolomexperimenten. (A) Voorbeelden van gekoloniseerde mediapluggen die uit kolommen zijn geëxtraheerd. (B) Voorbeelden van schimmelisolaten die zijn gesubcultureerd uit doelmedia. Het substraat was aarde. Boven ITS-sequentie NCBI BLAST-identiteit van links naar rechts: Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii en Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Circulaire cladogrammen die de fylogenetische diversiteit weergeven van (C) schimmel-ITS en (D) bacteriële 16S-sequenties die zijn teruggevonden uit de doelmedia na meerdere schimmelsnelwegexperimenten met paardenmest. Secties zijn gekleurd en gelabeld per stam, met eindknopen die unieke geslachten vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Suboptimale resultaten van kolomexperimenten. (A) Een voorbeeld van een uitgedroogde mediastekker als gevolg van omgevingsomstandigheden met een lage luchtvochtigheid. (B) Voorbeeld van geen microbiële groei uit een kolommediastekker. (C) Voorbeeld van overgroei van de schimmel door de bovenkant (doelmedium) van de kolom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Bij het genereren van de kolomcomponenten kan de selectie van een 3D-printer en printmateriaal worden aangepast op basis van beschikbaarheid en gewenste materiaaleigenschappen17,18. De biocompatibiliteit, oppervlaktetextuur, autoclaveerbaarheid, het vermogen om fijnschalige details te printen en relatieve transparantie werden allemaal in overweging genomen bij de materiaalkeuze van onze groep. Andere kenmerken, zoals porositeit, hydrofobiciteit, afdrukparameters, enz., moeten ook in overweging worden genomen. Voorafgaand aan de definitieve selectie werden verschillende harsen getest (zie Tabel met materialen), en veel biocompatibele materialen zullen werken voor het printen van deze kolommen. Het materiaal dat wordt gekozen voor de constructie van de kolomcomponenten zal bepalen welke reinigings-, nahardings- en sterilisatiebenaderingen moeten worden gebruikt. Niet alle materialen zijn autoclaveerbaar en ultraviolet licht, bleekmiddel of andere sterilisatietechnieken kunnen nodig zijn, afhankelijk van de instructies van de fabrikant van het materiaal. Sommige sterilisatie- of reinigingstechnieken kunnen ook het gekozen materiaal beschadigen of niet compatibel zijn, dus er moet bijzondere aandacht worden besteed aan deze informatie van de fabrikant van het materiaal. Voor 3D-printers zijn enkele overwegingen onder meer printtijd, materiaalcompatibiliteit, grootte van het bouwplatform, printtechnologie en kosten19. De 3D-geprinte onderdelen van de kolommen kunnen kwetsbaar zijn en breken als ze te krachtig worden gehanteerd. Het schroefdraad voor de ring en de doppen zijn niet altijd precies uitgelijnd, daarom raden we aan om extra componenten te printen en te steriliseren voorafgaand aan de assemblagestap, of om voorlopig te printen om te testen hoe de gekozen parameters en het gekozen materiaal het schroefdraad beïnvloeden. De ontwerpspecificaties voor het schroefdraad in de doppen en de ring moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het gekozen 3D-printmateriaal. De afmetingen, de complexiteit van het rooster en andere fysieke kenmerken kunnen allemaal worden gewijzigd in CAD-ontwerpsoftware voordat ze worden afgedrukt. Zoals ontworpen, is de kolom zelf 4 cm hoog en heeft de roosterstructuur in het midden van de kolom een eenheidscel van 2 mm, een stutdiameter van 0,5 mm en de gehele roosterhoogte is 22 mm9. Deze parameters kunnen worden aangepast als een onderzoeker bijvoorbeeld een grotere of complexere roosterstructuur wil. Over het algemeen zorgt de 3D-geprinte productie van deze apparaten voor ontwerpflexibiliteit en zorgt het er tegelijkertijd voor dat een enkel ontwerp op een gestandaardiseerde manier kan worden gebruikt in organisaties en groepen, en zelfs kan worden gebruikt als leermiddelen in de klas9.
Voor verschillende stappen in het protocol kan probleemoplossing nodig zijn, afhankelijk van de omgeving of experimentele opstelling. De schimmelkolommen van de snelweg zijn niet erg effectief in omstandigheden met een lage luchtvochtigheid, omdat de mediapluggen snel uitdrogen voordat ze de schimmelgroei bevorderen, wat de duur van experimenten in deze omgevingen kan beperken (Figuur 5A). Technieken die de effectiviteit van de kolommen in omgevingen met een lage luchtvochtigheid hebben verbeterd, zijn onder meer het kunstmatig verhogen van de luchtvochtigheid door toevoeging van vocht aan het substraat en/of het afdichten van de kolom en het substraat in een secundaire container met een waterbron (bijv. een kleine container met zuiver water). De zandlopervorm en roosterstructuur werden opgenomen om alleen bacteriële beweging te voorkomen (zonder de aanleg van een schimmelsnelweg) als condensatie zich zou vormen in omgevingen met een hoge luchtvochtigheid. Snelgroeiende schimmels kunnen het oppervlak van het doelwit en de aasmedia overwoekeren en uit de boven- of onderkant van de kolom steken (Figuur 5C). Door de incubatietijd van de aasschimmel of de duur van het experiment te verkorten, kan deze overgroei worden geminimaliseerd of geëlimineerd. Bovendien is een beperking van deze apparaten dat snelgroeiende schimmels in het substraat van belang de kolonisatie van aas- en doelmedia door langzaam groeiende schimmels kunnen beperken, waardoor mogelijk wordt vertekend welke snelweginteracties worden waargenomen. Sommige schimmels, vooral langzamer groeiende schimmels, koloniseren het aasmedium mogelijk niet op een manier waardoor ze door de agarplug en in de roosterstructuur kunnen groeien. Als er voldoende vocht in de omgeving is, kunnen dunnere agarpluggen worden gebruikt om de groei in het rooster te stimuleren na de kolonisatie van de aasagarplug. Media kunnen worden gekozen op basis van of een onderzoeker wil selecteren op schimmel- of bacteriegroei, maar dit kan de subcultuur ook beperken tot organismen die de voorkeur geven aan dat mediatype20. Als er geen groei wordt gezien in de doelmedia, kan het nodig zijn om het aasmedium of substraat te inoculeren met een schimmel waarvan bekend is dat deze schimmelsnelwegen creëert.
Metagenomische of amplicon-sequencing kan worden uitgevoerd als onderdeel van deze experimenten, en beide strategieën geven hun eigen beperkingen en sterke punten21. Metagenomische sequencing is ideaal voor het verkrijgen van aanvullende genomische informatie over de microben. De winbare hoeveelheid nucleïnezuren rechtstreeks uit de doelmedia kan echter erg laag zijn, wat het gebruik van amplicon-sequencing of andere amplificatiemethoden voorafgaand aan sequencing kan vereisen. Amplicon-sequencingbibliotheken moeten afzonderlijk worden opgesteld (16S en ITS), en deze methode mist taxonomische resolutie en beperkt alle beoordelingen over genoomkenmerken of functioneel potentieel die kunnen worden bereikt met behulp van metagenomische sequencing. Directe sequencingmethoden van de pluggen kunnen de voorkeur hebben in gevallen waarin microben niet kunnen worden gesubcultureerd. Het wordt aanbevolen om pluggen op te splitsen in meerdere secties om zowel kweek- als sequencing-benaderingen mogelijk te maken.
Een voordeel van deze apparaten is dat ze zowel in het laboratorium als in het veld kunnen worden gebruikt. Er moet speciaal op worden gelet dat de kolommen in het veld rechtop kunnen blijven staan en worden beschermd tegen dieren en omgevingsverstoringen die de plaatsing ervan kunnen verstoren. De kolommen zijn nog niet getest in een horizontale positie, in een positie waar ze volledig bedekt zijn met een substraat, en ze zijn niet getest in omgevingen die zijn blootgesteld aan aanzienlijke regenval of sneeuw. Zoals hierboven vermeld, is de roosterstructuur ontworpen om de kans te minimaliseren dat bacteriën zich naar het doelmedium kunnen verplaatsen in omgevingen met een hoge luchtvochtigheid. Het is echter mogelijk dat als de kolom zou worden blootgesteld aan grotere hoeveelheden water en dit water de kolom volledig zou verzadigen, de bacteriële beweging door de kolom zou worden vergemakkelijkt, onafhankelijk van eventuele aanwezige schimmelsnelwegen. Voor experimenten in het laboratorium kunnen de kolommen worden gebruikt in conische buizen van 50 ml, kleine microkosmossen van substraten, in de grond rond potplanten, in dozen of in andere gecontroleerde experimentele systemen. De kolommen zijn met succes gebruikt in de bodem, rhizosferen en mest, en hun nut kan worden uitgebreid naar andere substraten, waaronder bladafval, slib, zand, sneeuw, compost, enz.
De kolommen van de schimmelsnelweg maken een aantal vergelijkingen mogelijk om dit BFI-fenotype binnen verschillende steekproeftypen te begrijpen. Door de samenstelling van de gemeenschap tussen het aas en de doelmedia te vergelijken, kan worden aangegeven welke bacteriën schimmelsnelwegen kunnen gebruiken en welke schimmels als potentiële snelwegen kunnen dienen9. Als metagenoomsequencing wordt gebruikt, kunnen ook genomische kenmerken worden onderzocht die organismen onderscheiden van het aas versus doelmedia. Het is ook mogelijk om doelmedia te vergelijken van kolommen die in verschillende substraten zijn geplaatst (bijv. grond versus mest) of die onder verschillende omstandigheden (bijv. temperatuur of vochtigheid) in hetzelfde substraat zijn geplaatst. Over het algemeen breiden de schimmelkolommen van de snelweg de mogelijkheden van eerdere methoden voor het ondervragen van deze vorm van BFI uit en maken ze uitgebreid onderzoek mogelijk naar deze interacties die de ruimtelijke dynamiek van complexe omgevingsmicrobiomen vormgeven.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door een Science Focus Area Grant van het Amerikaanse Department of Energy (DOE), Biological and Environmental Research (BER), Biological System Science Division (BSSD) onder subsidienummer LANLF59T.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 50 mL tubes | Greiner BIO-ONE | 5622-7261 | 50 mL tubes voor het uitvoeren van kolomexperimenten in het lab |
| 90 mm Petri schotels | Thermo Scientific Nunc | 08-757-099 | Petri schotels voor het bereiden van agar en voor microbieel groei |
| Asiga Freeform Pico Plus 39 digital light processing (DLP) 3D printer | Asiga Germany | Freeform Pico Plus 39 | 3D printer gebruikt om batches van de kolommen te genereren; andere 3D printers kunnen worden gebruikt |
| Autoclaaf | Fisher Scientific | LS40F20 | Op staand tafelblad te plaatsen autoclaaf om de kolomcomponenten te steriliseren |
| Beker | Fisher Scientific | FB100600 | 600 mL beker voor verschillende toepassingen gedurende het protocol |
| Dental LT Clear Resin V2 | Formlabs | RS-F2-DLCL-02 | Alternatieve hars voor 3D-printen die werd getest |
| Dental Surgical Guide Resin | Formlabs | RS-F2-SGAM-01 | Werd gebruikt om de in het manuscript besproken kolommen te genereren; Andere fotogevoelige harsen kunnen in plaats van dit materiaal worden gebruikt |
| DNA Low Bind 1.5 mL tubes | Eppendorf | 13-698-791 | Buisjes die worden gebruikt voor verschillende bereidingen, inclusief extracties van nucleïnezuur |
| DNA/RNA shield preservative | Zymo Research | R1100-50 | Conserveermiddel dat wordt gebruikt voorafgaand aan extracties van nucleïnezuur |
| EDGE Bioinformatica | Open source; Ontwikkeld door het Los Alamos National Laboratory (LANL) | n/a | Bioinformaticaplatform voor het verwerken van amplicongegevens |
| FastDNA spin kit voor grond | MP Biomedicals LLC | 116560200-CF | DNA-extractieoptie voor grond |
| Pincet | Fisher Scientific | 10-300 | Pincet dat gesteriliseerd kan worden |
| Formlabs BioMed Clear Resin | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Alternatieve hars voor 3D-printen die werd getest |
| Formlabs Form 3B+ stereolithography (SLA) 3D printer | Formlabs | Form 3B+ | Alternatieve 3D printer |
| Formlabs IBT Resin | Formlabs | RS-F2-IBCL-01 | Alternatieve hars voor 3D-printen die werd getest |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-598 | Wordt gebruikt om microben te isoleren/over te dragen |
| Malt Extract Agar (MEA) | Criterion | 89405-654 | Een mediatype dat in kolommen wordt gebruikt |
| MiSeq sequencer + MiSeq sequencing kit | Illumina | SY-410-1003 | Kan andere sequencers gebruiken |
| Mortar & Pestel | Fisher Scientific | FB961K; FB961A | Kan elk gewoon mortel & pestel gebruiken dat tussen gebruiken kan worden gesteriliseerd |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit voor Illumina | New England Biolabs | E7805S | Bibliotheekvoorbereidingskit voor metagenomisch sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit (24 samples) | Illumina | FC-131-1024 | Bibliotheekvoorbereidingskit voor amplicon sequencing |
| NMDC EDGE | Open source: Ontwikkeld door de National Microbiome Data Collaborative (NMDC) | n/a | Bioinformaticaplatform voor het verwerken van metagenomische gegevens |
| Nylon gaas | Sefar | 03-25/19 | Het gaas dat als onderdeel van de kolomconstructie wordt gebruikt |
| Pipetpunten | Rainin | 30807966 | Kan voor de protocolstappen veel verschillende gesteriliseerde pipetpunten gebruiken |
| Potato Dextrose Agar | Cole Parmer | EW-14200-28 | Een mediatype dat in kolommen wordt gebruikt |
| QIIME2 | Open source | n/a | Software voor het verwerken van amplicongegevens |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Wordt gebruikt om DNA na extracties te kwantificeren |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33238 | Wordt gebruikt om DNA na extracties te kwantificeren |
| Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit | Zymo Research | D6005 | DNA-extractieoptie die werkt met zowel bacteriën als schimmels |
| R2A agar | BD Difco | 218263 | Een mediatype dat in kolommen wordt gebruikt (bacteriemedia) |
| Rack voor 50 mL tubes | Fisher Scientific | 03-448-11 | Rack om 50 mL tubes rechtop te houden |
| Schaar | Fisher Scientific | 12-000-155 | Fijne precisieschaar die kan worden gesteriliseerd |
| Natriumcarboxymethylcellulose medium | Aldrich | 419273-100G | Een mediatype dat in kolommen wordt gebruikt |
| SolidWorks CAD software | SolidWorks | n/a | Software die wordt gebruikt om de kolommen te ontwerpen |
| Trowel scoop | Fisher Scientific | S41701 | Om een kuiltje in het substraat te maken voordat de kolom wordt toegevoegd |
| UltraPure DNase/RNase-Free Gedistilleerd Water | Invitrogen: ThermoFisher Scientific | 10977015 | Water voor de waterbad van de ultrasonicator |
| Ultrasonicator | Fisher Scientific | FB-11201 | Ultrasonicator voor het reinigen van de kolommen |
Referenties
- Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review. Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).
- Kohlmeier, S., et al. Taking the fungal highway: Mobilization of pollutant-degrading bacteria by fungi. Environ Sci Technol. 39 (12), 4640-4646 (2005).
- Simon, A., Hervé, V., Al-Dourobi, A., Verrecchia, E., Junier, P. An in situ inventory of fungi and their associated migrating bacteria in forest soils using fungal highway columns. FEMS Microbiol Ecol. 93 (1), 217(2017).
- Wick, L. Y., et al. Effect of fungal hyphae on the access of bacteria to phenanthrene in soil. Environ Sci Technol. 41 (2), 500-505 (2007).
- Bravo, D., et al. Isolation of oxalotrophic bacteria able to disperse on fungal mycelium. FEMS Microbiol Lett. 348 (2), 157-166 (2013).
- Furuno, S., Remer, R., Chatzinotas, A., Harms, H., Wick, L. Y. Use of mycelia as paths for the isolation of contaminant-degrading bacteria from soil. Microb Biotechnol. 5 (1), 142-148 (2012).
- Buffi, M., et al. Fungal drops: A novel approach for macro- and microscopic analyses of fungal mycelial growth. Microlife. 4, 042(2023).
- Kuhn, T., et al. Design and construction of 3D printed devices to investigate active and passive bacterial dispersal on hydrated surfaces. BMC Biol. 20 (1), 203(2022).
- Junier, P., et al. Democratization of fungal highway columns as a tool to investigate bacteria associated with soil fungi. FEMS Microbiol Ecol. 97 (2), 003(2021).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol. 49 (1), 1-7 (1985).
- Bolyen, E., et al. Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Vázquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. EMPeror: A tool for visualizing high-throughput microbial community data. Gigascience. 2 (1), 16(2013).
- Li, P. -E., et al. Enabling the democratization of the genomics revolution with a fully integrated web-based bioinformatics platform. Nucleic Acids Res. 45 (1), 67-80 (2017).
- Eloe-Fadrosh, E. A., et al. The National Microbiome Data Collaborative Data Portal: An integrated multi-omics microbiome data resource. Nucleic Acids Res. 50 (1), D828-D836 (2022).
- Kans, J. Entrez Direct: E-utilities on the Unix Command Line. Entrez Programming Utilities Help. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK179288/ (2024).
- Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3D printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
- Guttridge, C., Shannon, A., O'Sullivan, A., O'Sullivan, K. J., O'Sullivan, L. W. Biocompatible 3D printing resins for medical applications: A review of marketed intended use, biocompatibility certification, and post-processing guidance. Ann 3D Print Med. 5, 100044(2022).
- Yao, L., et al. Comparison of accuracy and precision of various types of photo-curing printing technology. J Phys Conf Ser. 1549 (3), 032151(2020).
- Basu, S., et al. Evolution of bacterial and fungal growth media. Bioinformation. 11 (4), 182-184 (2015).
- Liu, Y. -X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein Cell. 12 (5), 315-330 (2021).
Herprints en machtigingen
