Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Glaucoom is wereldwijd een belangrijke oorzaak van blindheid en wordt gekenmerkt door een complex pathogeen mechanisme dat het herstel van het gezichtsvermogen uitdagend maakt. Muizen dienen als waardevolle diermodellen voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van glaucoom vanwege hun relatief homogene genetische achtergrond en retinale ganglioncellen (RGC's), die structureel lijken op die bij mensen. Nauwkeurige beoordeling van RGC-schade en behandelingsresultaten in glaucoommodellen van muizen vereist het bepalen van het RGC-getal over het hele netvlies. Dit protocol schetst een uitgebreide methode met de isolatie van het hele netvlies, het labelen van RGC's met specifieke antilichamen en snelle, nauwkeurige automatische telling van RGC's met behulp van een op AI gebaseerd programma. De gestroomlijnde aanpak maakt een efficiënte en nauwkeurige kwantificering van RGC-aantallen in het netvlies van muizen mogelijk, waardoor de evaluatie van RGC-degeneratie en mogelijke therapeutische interventies wordt vergemakkelijkt. Door onderzoekers in staat te stellen de omvang van RGC-schade te beoordelen, draagt dit protocol bij aan een beter begrip van de pathogenese van glaucoom en helpt het bij het ontwikkelen van effectieve behandelingsstrategieën om verlies van het gezichtsvermogen te beheersen en te voorkomen.
Inleiding
Glaucoom wordt gekenmerkt door de progressieve dood van ganglioncellen, wat een aanzienlijke uitdaging vormt voor het herstel van het gezichtsvermogen 1,2. Deze ziekte is een belangrijk aandachtspunt van oogheelkundig onderzoek vanwege de prevalentie en impact op het gezichtsvermogen3. Muismodellen zijn onmisbaar bij glaucoom
onderzoek vanwege hun homogene genetische achtergrond, hoge voortplantingsvermogen en de gelijkenis van hun ganglionceleigenschappen met die van mensen4. Het primaire doel van deze methode is het nauwkeurig kwantificeren van retinale ganglioncellen (RGC's) in muismodellen, wat essentieel is voor het begrijpen van de pathogenese van glaucoom en het ontwikkelen van relevante behandelingen.
De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze techniek komt voort uit de behoefte aan een betrouwbare en efficiënte methode om RGC-degeneratie in muismodellen te beoordelen. Traditionele methoden, zoals het labelen van RGC's in retinale secties, leveren vaak onbetrouwbare resultaten op vanwege de niet-uniforme verdeling van RGC's in het netvlies5. Het kwantificeren van RGC's over het hele netvlies weerspiegelt beter veranderingen in hun aantallen en is cruciaal voor het evalueren van ziekteprogressie en therapeutische interventies.
Deze methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. Het handmatig tellen van retinale ganglioncellen (RGC's) in een normaal volwassen muizennetvlies, dat 40.000 tot 60.000 RGC's bevat, kan bijvoorbeeld tijdrovend en foutgevoelig zijn 6,7,8. De software voor automatische RGC-telling die we hebben ontwikkeld, maakt nauwkeurige tellingen mogelijk in minder dan 3 minuten, wat onderzoekers mogelijk een aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaart. Bovendien minimaliseert de op AI gebaseerde software die wordt gebruikt voor automatisch tellen vertekening en verbetert het de reproduceerbaarheid.
Bovendien biedt deze techniek een gestandaardiseerde benadering om RGC-degeneratie te beoordelen in verschillende muismodellen en experimentele omstandigheden, wat waardevolle gegevens bijdraagt aan het onderzoek naar glaucoom. De methode sluit aan bij andere onderzoeken die het belang van netvliesanalyse van het hele vat benadrukken voor het begrijpen van netvliesveranderingen bij ziekten9.
Om lezers te helpen bepalen of deze methode geschikt is voor hun toepassing, is het belangrijk op te merken dat deze techniek bijzonder voordelig is voor onderzoekers die degeneratie van retinale ganglioncellen (RGC) bestuderen in muismodellen van glaucoom of andere netvliesaandoeningen. De methode is aanpasbaar aan verschillende experimentele opstellingen en biedt een hoge mate van nauwkeurigheid en efficiëntie bij RGC-tellingen, waardoor het ideaal is voor zowel kleinschalige als grootschalige studies. Bovendien maken het eenvoudige ontwerp van het protocol en de beschikbaarheid van gebruiksvriendelijke software het toegankelijk voor onderzoekers met verschillende niveaus van expertise op het gebied van netvliesanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedure voldeed aan de richtlijnen van de Association for Research in Vision and Ophthalmology voor het gebruik van dieren in onderzoek en werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Sichuan Provincial People's Hospital. C57Bl/6J mannelijke muizen (2 maanden oud) werden in deze studie gebruikt. Figuur 1 illustreert de algemene procedure die hier wordt beschreven. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.
1. Isolatie van het netvlies van de hele berg
- Dierenoffers
- Offer de muizen op met behulp van cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) (Figuur 2A). Voorafgaand aan cervicale dislocatie,
Verdoof de muizen door inademing van isofluraan (3%-5% in zuurstof) of door intraperitoneale injectie van het ketamine/xylazine-mengsel.
- Offer de muizen op met behulp van cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) (Figuur 2A). Voorafgaand aan cervicale dislocatie,
- Enucleatie en verwerking van de oogbol
- Markeer de rand van het hoornvlies aan de dorsale zijde van de oogbol met een blauwe stift om de oriëntatie tijdens de daaropvolgende dissectie te onthouden.
- Verwijder resterend spierweefsel dat aan de oogbol is bevestigd met een schaar. Breng de ontkernde oogbol over in een microcentrifugebuis van 2 ml met ronde bodem, gevuld met 1x PBS, voor een korte spoeling (Figuur 2C).
- Fixatie
- Breng de oogbol over naar een andere microcentrifugebuis met ronde bodem van 2 ml met vers gemaakte 4% paraformaldehyde (PFA) voor fixatie bij 4 °C gedurende 10 minuten (Figuur 2D).
- Maak een kleine incisie (ongeveer 1-2 mm) op het hoornvlies met een fijne schaar onder een ontleedmicroscoop.
- Plaats de oogbol terug in het fixeermiddel voor verdere fixatie bij 4 °C gedurende 3 uur om de weefselmorfologie te behouden (Figuur 2D).
- Verwijdering van hoornvlies en lens 1,9
- Maak met een fijne chirurgische schaar een kleine incisie van ongeveer 1 mm rond de cornea-limbus, de grens tussen het hoornvlies en de sclera.
- Snijd voorzichtig rond de omtrek van het hoornvlies en snijd het volledig weg om de onderliggende structuren bloot te leggen.
- Gebruik een fijne pincet om de lens voorzichtig vast te pakken en voorzichtig uit de omliggende weefsels te tillen om schade aan het netvlies te voorkomen. Behoud de structurele integriteit van het netvlies met delicate operaties.
- Breng de oogschelp over naar een microcentrifugebuis voor verdere verwerking.
OPMERKING: Snijd het hoornvlies weg en verwijder de lens efficiënter met behulp van de "kruisspleet"-techniek10. Maak twee loodrechte spleten over het hoornvlies en gebruik een pincet om de lens eruit te halen.
- Sclerale incisie
- Knip een precieze spleet in de sclera af met een fijne oogheelkundige schaar om de volgende dissectiestappen te vergemakkelijken (Figuur 2J).
- Scheiding van het netvlies
- Steek een tang met tanden in de incisie tussen de sclera en het netvlies. Pak de rand van de sclera voorzichtig vast en vermijd overmatige kracht om te voorkomen dat het weefsel scheurt.
- Vergroot de incisie geleidelijk door de tang langs de grens tussen de sclera en het netvlies te bewegen met langzame, gestage handbewegingen. Gebruik het getande deel van de pincet om de sclera voorzichtig van het netvlies te scheiden en ervoor te zorgen dat het netvlies niet wordt beschadigd (Figuur 2J).
- Netvlies snijden
- Verdeel het netvlies met een scherpe schaar in vier flappen van ongeveer gelijke grootte. Zorg ervoor dat de sneden ongeveer halverwege de richting van de oogzenuw zijn en op 90° van elkaar zijn gericht.
- Reiniging van het netvlies
- Vouw het ontlede netvlies voorzichtig open met een zachte borstel en verwijder voorzichtig vuil van het oppervlak (Figuur 2K).
- Definitieve fixatie
- Breng het geïsoleerde netvlies over naar een microcentrifugebuis met verse 4% PFA met behulp van een pasteurpipet voor eenmalig gebruik. Laat fixatie op ijs nog 5 uur tot een nacht toe voor weefselconservering.
2. Immunokleuring
- Was
- Was het geïsoleerde netvlies van de hele berg in 1x PBS met zachte agitatie gedurende 5 minuten. Gooi de PBS-oplossing weg. Herhaal dit proces twee keer om resten fixeermiddel en vuil te verwijderen.
- Blokkeren
- Dompel het gewassen netvlies gedurende 30 minuten onder in een blokkerende bufferoplossing (1x PBS met 4% normaal ezelserum (NDS) en 0,2% Triton X-100) om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen en de permeabilisatie te verbeteren (Figuur 3A).
- Incubatie van primaire antilichamen
- Vervang de blokkeerbuffer door primair antilichaam BRN3A (verdund 1:200 in de blokkeerbuffer). Incubeer het netvlies een nacht bij 4 °C om specifieke antigeen-antilichaambinding mogelijk te maken (Figuur 3B).
- Was
- Was het netvlies drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen en achtergrondkleuring te verminderen (Figuur 3C).
- Incubatie van secundaire antilichamen
- Incubeer het netvlies met Alexa594- of Alexa488-geconjugeerd secundair antilichaam tegen konijnen (verdund 1:300) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur om doelantigenen te visualiseren (Figuur 3D).
- Was
- Voer drie opeenvolgende wasbeurten uit met 1x PBS gedurende elk 5 minuten om overtollige secundaire antilichamen te verwijderen en niet-specifieke binding te minimaliseren.
- Montage
- Breng het immunogekleurde netvlies voorzichtig over op een glazen microscoopglaasje en druk het voorzichtig plat om vouwen of vervorming te minimaliseren.
- Breng een klein druppeltje anti-fade montagemedium aan op het midden van het netvlies en zorg voor een gelijkmatige verdeling over het weefsel.
- Plaats voorzichtig een dekglaasje over het gemonteerde netvlies en vermijd luchtbellen (Figuur 3E,F).
3. Beeldverwerking
OPMERKING: Importeer de afbeelding in de RGC-software voor automatisch tellen en begin met tellen. Het aantal BRN3A-positieve cellen voor het gehele netvlies kan in minuten worden bepaald. Download de AutoCount-software van GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Volg de gedetailleerde installatiestappen voor de onderstaande software:
- Download de code via de GitHub-link . Men ontvangt een bestand met de naam "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Pak dit bestand uit.
- Download de benodigde bestanden van de cloudschijf (zie Materiaaltabel) en pak ze uit. Het gedownloade bestand heeft de naam "yolov5_cpu". Pak dit pakket uit naar de huidige map om onverwachte problemen te voorkomen.
- Zoek het configuratiebestand uit stap 1 en wijzig de inhoud ervan om naar het pad "yolov5_cpu" te verwijzen.
OPMERKING: Als de gedownloade "yolov5_cpu" bijvoorbeeld in "D:\1me\yolov5_cpu_" is geplaatst, wijzigt u het bestand "config.ini" in stap 1 in "D:/1me/yolov5_cpu" (gebruik / in plaats van \). (Figuur 4A). - Open de grafische interface door op userinterface.exe te klikken. Het eerste laden kan traag zijn (uitvoeren als beheerder) (Figuur 4B).
- Controleer na het openen van de software of het modelbestand "pmse_plus.pt" aanwezig is in de hoofdmap van station C. Als het niet aanwezig is, kopieer het dan naar deze map.
OPMERKING: Het modelbestand "pmse_plus.pt" bevindt zich in de map gewichten van de map "yolov5", te vinden in de uitgepakte map Intelligent-kwantificerende RGCs (Afbeelding 4C). - Bereid de te detecteren beelden voor.
OPMERKING: Met de software kunnen slechts één of vijf foto's tegelijk worden gelezen. Als u meer leest, resulteert dit in een fout.
4. Geautomatiseerde celtelling
- Open de telsoftware (Figuur 5A).
- Klik op OPEN AFBEELDING om de afbeelding te importeren (Figuur 5B).
- Klik op RUN om de software automatisch de cellen te laten tellen (Figuur 5C).
OPMERKING: De software markeert de getelde cellen met een rood vierkant vak en geeft het aantal cellen weer in de rechterbovenhoek (Figuur 5D).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft de methodologie voor immunokleuring van het netvlies van muizen in het algemeen, waardoor een nauwgezette weefselvoorbereiding, nauwkeurige antilichaamincubatie en betrouwbare geautomatiseerde celtelling wordt gegarandeerd. De procedure vergemakkelijkt robuuste etikettering en kwantificering van retinale ganglioncellen (RGC's), waardoor een nauwkeurige beoordeling van cellulaire populaties in verschillende experimentele contexten mogelijk is. De methode werd gebru...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een methode voor het bepalen van alle retinale ganglioncellen (RGC's) in het netvlies van een muis, die kan worden gebruikt om de progressie van RGC-degeneratie in muismodellen voor glaucoomstudies te volgen. Het netvlies van muizen is een delicaat zenuwweefsel5 en het isoleren van het netvlies van het hele netvlies van de ogen van muizen vereist herhaalde oefening. Tijdens experimenten bleek dat de fixatietijd de morfologie van het netvlies aan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoeksproject werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82371059 (H.Z.)), het Department of Science and Technology van de provincie Sichuan, China (2023JDZH0002 (H.Z.)), het Chengdu Science and Technology Bureau (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)), en Sichuan Provincial People's Hospital (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1× PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher | A-11012 | |
| Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285] | Abcam | ab245230 | |
| AutoCount software | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| Cloud disk | Google drive link | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| Cloud disk | Baidu link | Extraction code: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Marker | Sharpie | ||
| Normal Donkey Serum | Biosharp, Labgic | 25030081 | |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sucrose | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
Referenties
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
