Methodenartikel

Eiwittechniek door gist Surface Display

DOI:

10.3791/66994

⸱

29 november 2024

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Institute of Biochemistry, BOKU University, 2CD Laboratory for Next Generation CAR T Cells, 3St. Anna Children's Cancer Research Institute, CCRI

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwittechnologie maakt het mogelijk om bestaande functies van een bepaald eiwit te verbeteren of nieuwe functies te genereren. Een van de meest gebruikte en veelzijdige hulpmiddelen op het gebied van eiwittechniek is de weergave van gistoppervlakken, waarbij een pool van gerandomiseerde eiwitten tot expressie wordt gebracht op het oppervlak van gist. De koppeling van fenotype (bijv. binding van het door gist weergegeven eiwit aan het antigeen van belang) en genotype (het plasmide dat codeert voor de eiwitvariant) maakt het mogelijk om deze bibliotheek te selecteren op gewenste eigenschappen en vervolgens te sequencen Door magnetische parelselectie te combineren met flowcytometrische sortering, kunnen eiwitvarianten met verbeterde binding aan een doelwitantigeen worden geselecteerd en verrijkt. Met name kan naast affiniteitsrijping ook binding aan een doel worden bereikt zonder enige initiële bindingsaffiniteit. Hier bieden we een stapsgewijs protocol dat alle essentiële onderdelen van een selectiecampagne voor het weergeven van gistoppervlakken behandelt en voorbeelden geeft van typische resultaten van het weergeven van gistoppervlakken. We tonen aan dat het weergeven van gistoppervlakken een breed toepasbare en robuuste methode is die kan worden toegepast in elk moleculair biologisch laboratorium met toegang tot flowcytometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gistoppervlakteweergave is een van de belangrijkste technologieën op het gebied van eiwitengineering. Het maakt de selectie van eiwitvarianten mogelijk met gewenste eigenschappen zoals verbeterde affiniteit of stabiliteit. Het werd voor het eerst geïntroduceerd in 19971 en is een van de meest gebruikte weergavetechnologieën naast faagweergave 2,3, ribosoomweergave4 en weergave van zoogdiercellen 5,6,7. Het eiwit van belang (POI) wordt weergegeven op het oppervlak van gistcellen door het te fuseren om eiwitten te verankeren. Er is een reeks verschillende ankereiwitten beschikbaar, en meestal wordt de POI gefuseerd met de C-terminus van het gistagglutinine-paringseiwit Aga2p 1,8. Bovendien wordt de POI meestal geflankeerd door twee tags, zoals een hemagglutinine-tag (HA-tag) en c-myc-tag, die detectie van het weergaveniveau mogelijk maakt met behulp van fluorescerend gelabelde antilichamen en flowcytometrie (Figuur 1A). Typische gistselectiecampagnes omvatten een combinatie van magnetische kralenselecties en flowcytometrische sortering. De korrelselecties maken het mogelijk om grote aantallen cellen te verwerken en eiwitvarianten te verrijken die binden aan het doelantigeen, ook met lage affiniteiten, aangezien multivalente interacties met de met antigeen geladen korrels leiden tot aviditeitseffecten en daarom het verlies van varianten met lage affiniteit voorkomen (Figuur 1B). Flowcytometrische analyse en selectie bieden het voordeel dat de binding van de weergegeven POI-varianten aan het gelabelde antigeen kan worden gevisualiseerd. Bijgevolg kunnen de bindende populaties worden gesorteerd en gekweekt, wat leidt tot de verrijking van eiwitvarianten met gewenste eigenschappen gedurende verschillende sorteerrondes. Bovendien kunnen extra rondes van willekeurige mutagenese worden uitgevoerd om de diversiteit verder te vergroten en daarmee de kans op het vinden van extra mutaties die bijdragen aan de affiniteit en/of stabiliteit van het eiwit.

Het weergeven van het gistoppervlak biedt bepaalde voordelen, zoals (a) een eukaryote expressiemachinerie, die zowel oxidatieve eiwitvouwing als eukaryote posttranslationele modificaties mogelijk maakt (zoals N-glycosylering), (b) expressienormalisatie als gevolg van de detectie van de twee peptide-tags die het eiwit flankeren, (c) visuele inspectie van de selectievoortgang door flowcytometrie (bijv. percentage bindingscellen en bindingsintensiteit) en (d) de mogelijkheid om individuele eiwitmutanten te analyseren op gist (bijv. het analyseren van thermostabiliteit en affiniteit), een tijdbesparend alternatief voor moeizame eiwitexpressie en -zuivering9. In feite hebben zowel affiniteiten (KD-waarden) als stabiliteiten (T50-waarden) van eiwitten die aan het gistoppervlak worden weergegeven, goede correlaties laten zien met gegevens die zijn verkregen met behulp van biofysische methoden en oplosbare eiwitten 9,10,11,12. Gistoppervlakteweergave is gebruikt voor de engineering van een verscheidenheid aan eiwitten, bijv. antilichaamfragmenten 13,14,15,16, het10e type III fibronectinedomein17,18, rcSso7d19,20 of knottinen 21. Evenzo is er uitgebreid onderzoek gedaan om de ontwerpen van gistbibliotheken te optimaliseren door de gerandomiseerde posities en het gebruik van aminozuurcodons te wijzigen 17,22,23. De weergave van het gistoppervlak is succesvol gebleken voor de engineering van stabiliteit 14,15,24,25, affiniteit 18,26,27, enzymatische activiteit 28,29,30,31 en eiwitexpressie32. Bovendien werden meer geavanceerde toepassingen zoals voorwaardelijke binding in de aan- of afwezigheid van een klein molecuul bereikt met behulp van gistoppervlakteweergave20.

In dit protocol beschrijven we alle essentiële stappen voor een selectiecampagne met gistoppervlakteweergave met het voorbeeld van de G4-bibliotheek (gebaseerd op het10e type III fibronectinedomein, Fn3) geselecteerd tegen het antigeen humaan retinolbindend eiwit 4 (hRBP4) in aanwezigheid van het kleine molecuul A112020. Deze selectie werd uitgevoerd om een eiwit-eiwitinteractie te verkrijgen die afhankelijk is van een klein molecuul dat als moleculaire schakelaar kan worden gebruikt. Merk op dat, hoewel alternatieve benaderingen mogelijk zijn met weergave van het gistoppervlak, typische gistselecties meestal gericht zijn op binding aan een doelantigeen zonder enige eerdere bindingsaffiniteit. We behandelen alle stappen van een gistselectiecampagne, waaronder de teelt van een gistbibliotheek, kralenselecties, flowcytometrische sortering en affiniteitsrijping door foutgevoelige PCR (epPCR). Daarom vormt dit protocol een aanvulling op eerdere protocollen voor de weergave van gistoppervlakken33,34 en kan het worden gebruikt als basis voor selecties van de weergave van het gistoppervlak (Figuur 1) met een bepaalde gistbibliotheek en doelantigeen naar keuze.

figure-introduction-1
Figuur 1: Principe van weergave van gistoppervlak en een typische workflow voor selecties van gistoppervlakweergave. (A) De POI wordt gekloond in een vector voor het weergeven van gistoppervlak en meestal geflankeerd door een N-terminale HA- en een C-terminale c-myc-tag. Het construct is versmolten met het gistparingseiwit Aga2p voor weergave op het oppervlak. Het afgebeelde eiwit is het gemanipuleerde bindmiddel "RS3" van PDB ID: 6QBA20. (B) Stroomdiagram ter illustratie van een typische workflow voor selectiecampagnes voor het weergeven van gistoppervlakken, die verrijking van eiwitvarianten combineren met gewenste eigenschappen door kralenselecties en flowcytometrische sortering, evenals epPCR voor affiniteitsrijping. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ontdooien en kweken van gistbibliotheken

  1. Ontdooi voldoende hoeveelheden van de ingevroren gistbibliotheek bij RT en verdun onmiddellijk in SD-CAA (zie tabel 1) tot een OD600 van ongeveer 1 (dit komt overeen met 1 x 107 cellen/ml).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de diversiteit van de bibliotheek met minimaal 10x bedekt. Dus, als de bibliotheekgrootte goed is voor 2,5 x 108 klonen (dit is de diversiteit van de G4-bibliotheek die in dit voorbeeld wordt gebruikt), inoculeer dan minimaal 2,5 x 109 cellen in 250 ml SD-CAA om een OD600 van 1 te bereiken. Dit protocol kan ook worden gestart met vloeibare culturen (gistcellen die pas zijn getransformeerd met een bibliotheek).
  2. Beoordeel het aantal levensvatbare cellen.
    1. Neem een aliquot van 100 μl uit deze gistsuspensie (bij OD600 van 1) en voer een verdunningsreeks van 1:10 uit met 900 μl SD-CAA-medium in microcentrifugebuisjes.
    2. Bereid verdunningen tot 10-5 en plaat 100 μL verdunningen 10-3, 10-4 en 10-5 op SD-CAA-platen (Tabel 1). Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 °C. Zorg ervoor dat het aantal levensvatbare cellen na ontdooien de bibliotheekdiversiteit met ten minste 10 keer overschrijdt.
    3. Ga intussen verder met de resterende celsuspensie en kweek de gistcultuur met de G4-bibliotheek in glazen kolven 's nachts bij 30 °C tijdens het schudden (180 rpm). Ga na de incubatie gedurende een nacht verder met deel 2 (Inductie van eiwitexpressie op het gistoppervlak).
    4. Tel na 2-3 dagen incubatie de kolonies op de SD-CAA-platen door visuele inspectie. Houd bij het berekenen van het uiteindelijke aantal levensvatbare cellen na ontdooien rekening met de verdunningsfactor en de verhouding van de vergulde (d.w.z. 100 μL) versus het oorspronkelijke kweekvolume (d.w.z. 250 ml).
      Levensvatbare cellen/ml = aantal kolonies op de plaat × verdunningsfactor
      Levensvatbare cellen (totaal) = (levensvatbare cellen/ml) × kweekvolume
Gemiddeld/bufferBestanddeelConcentratie [g/L]Opmerkingen/Beschrijving
SD-CAAD-glucose20Los alle mediacomponenten op in 1000 ml ddH2O en steriel filtraat met steriele wegwerpfilters van 0,22 μm.
Stikstofbasis gist6.7
Casminozuren5
Citroenzuur monohydraat7.4
Tri-natriumcitraat dihydraat10.83
SG-CAAD-galactose20Los alle mediacomponenten op in 1000 ml ddH2O en steriel filtraat met steriele wegwerpfilters van 0,22 μm.
D-glucose2
Stikstofbasis gist6.7
Casaminozuren5
Di-natriumwaterstoffosfaat heptahydraat10.2
Natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat8.56
SD-CAA-platenSorbitol182Los sorbitol, dinatriumwaterstoffosfaatheptahydraat, natriumdiwaterstoffosfaatmonohydraat en agar-agar op in 900 ml ddH2O en autoclaaf. Los de resterende componenten op en filtreer ze steriel in 100 ml ddH2O en voeg toe als de geautoclaveerde media lauw zijn.
Di-natriumwaterstoffosfaat heptahydraat10.2
Natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat7.44
Agar-agar15
D-glucose20
Stikstofbasis gist6.7
Casaminozuren5
YPDPepton20Bereid een 10x D-glucosebouillon (200 g/L) en steriel filtraat met steriele wegwerpfilters van 0,22 μm. Los pepton- en gistextract op in 900 ml ddH2O en autoclaaf. Als het lauwwarm is, voeg dan 100 ml 10x D-glucose toe.
Gist extract10
D-glucose20
YPD-platenPepton20Bereid een 10x D-glucosebouillon (200 g/L) en steriel filtraat met steriele wegwerpfilters van 0,22 μm. Los pepton, gistextract en agar-agar op in 900 ml ddH2O en autoclaaf. Als het lauwwarm is, voeg dan 100 ml 10x D-glucose toe.
Gist extract10
D-glucose20
Agar-agar15
PBSABSA1Los BSA op in PBS en steriel filtraat met steriele wegwerpfilters van 0,22 μm.

Tabel 1: Samenstelling van media en buffers.

2. Inductie van eiwitexpressie op het gistoppervlak

  1. Na een nacht incubatie bereiken de gistculturen doorgaans een OD600 tussen 2-20. Meet de OD600 met een fotometer om de dichtheid van de gistcultuur te bepalen.
    OPMERKING: OD-metingen zijn alleen lineair in het bereik van 0,1-1. Voer daarom verdunningen uit (meestal 1:20 en 1:50) in SD-CAA om de OD600 te bepalen.
    1. Verdun de cellen in SD-CAA tot een OD600 van 1 en zorg ervoor dat de diversiteit 10x wordt gedekt (d.w.z. 2,5 x 109 cellen worden gebruikt voor de verdunning van de G4-bibliotheek). Ga door met incuberen bij 30 °C tijdens het schudden om de cellen een exponentiële groeifase te laten bereiken.
    2. Bereid glycerolvoorraden (met een diversiteit van 50x) van gistbibliotheken (in SD-CAA met 15% glycerol) van de nachtcultuur. Centrifugeer hiervoor het vereiste aantal gistcellen (2000 x g, 3 min, 4 °C), gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet in 1 ml SD-CAA-medium aangevuld met 15% glycerol. Vries de glycerolvoorraden onmiddellijk in bij -80 °C.
      OPMERKING: De levensvatbaarheid van gistcellen wordt verhoogd als gistculturen vóór het invriezen tot een stationaire fase worden gekweekt. In latere selectierondes, wanneer de diversiteit van de bibliotheken lager is, is het meestal voldoende om 700 μL van de gistcultuur te gebruiken en deze te mengen met 300 μL SD-CAA aangevuld met 50% glycerol. Hier vertonen gistculturen doorgaans OD600-waarden van 15 in de stationaire fase, maar de werkelijke waarde kan afhangen van de gebruikte fotometer. Zo kan de stationaire fase worden bepaald door herhaalde OD600-metingen . Als de OD600-waarde gedurende een incubatietijd van 2 uur niet toeneemt, wordt een stationaire fase bereikt.
  2. Centrifugeer een geschikt volume cellen om de diversiteit 10x te dekken bij 2000 x g gedurende 5 minuten, 4-6 uur na de verdunning van de gistcultuur (typische OD600-waarden liggen tussen 4-6), en gooi het supernatant weg.
  3. Resuspendeer de celpellet in SG-CAA (zie tabel 1) tot een OD600 van 1 en breng deze over in een verse glazen kolf.
    OPMERKING: Repensie in een galactose-bevattend medium induceert expressie van het eiwit op het oppervlak door de galactose-induceerbare promotor.
  4. Incubeer gistculturen een nacht bij 20 °C terwijl je schudt bij 180 tpm om oppervlakte-expressie van de POI te induceren. Na nachtelijke inductie zullen gistculturen doorgaans OD600-waarden tussen 2-5 bereiken; als de inductietemperatuur wordt verhoogd tot 37 °C, verwacht dan OD600-waarden van 4-10.
    OPMERKING: Het verlagen van de temperatuur tot 20°C vertraagt de celgroei en levert doorgaans betere weergaveniveaus op. Inductie bij 37 °C kan echter nuttig zijn om de selectiedruk naar gestabiliseerde mutanten te verhogen35.

3. Eerste kralenselectieronde van gistbibliotheken (positieve selectie)

OPMERKING: Een standaard procedure voor het selecteren van kralen omvat 6 stappen (Tabel 2).

DagStap
0Cultuur overnachten
1Inductie van eiwitexpressie op het oppervlak van de gistcellen
2Eerste kraalselectie met 1 positieve selectie
3Verwijdering van de kralen, passeren, inductie van eiwitexpressie op het oppervlak van de gistcellen en bevriezing van de bibliotheek
4Tweede kraalselectie met 3 negatieve en 1 positieve selectie
5Verwijderen van de kralen en bevriezen van de bibliotheek

Tabel 2: Typische tijdlijn voor de geleiding van kralenselecties van een gistbibliotheek.

  1. Voorbereiding van de kralen
    1. Bereid de kralen voor (zie materiaaltabel) voor de eerste kralenselectie: Resuspendeer voor elke buis 10 μL magnetische kralen van het biotinebindmiddel (4 × 105 kralen/μL) in 990 μL PBSA (Tabel 1) om te wassen, plaats de buis 2 minuten op een magnetisch rek met het deksel open. Verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal de wasstap met 1 ml PBSA.
      OPMERKING: Als er meerdere buisjes kralen met hetzelfde gebiotinyleerde antigeen nodig zijn, kunnen deze in deze stap in één buisje worden bereid om een uniforme antigeen-pareloplossing te verkrijgen. In dit geval moet de hoeveelheid antigeen in de volgende stap dienovereenkomstig worden verhoogd.
    2. Resuspendeer de korrels in een totaal volume van 1 ml PBSA met 6,7-33 pmol gebiotinyleerd antigeen (hier: 6,86 μl hRBP4 met een concentratie van 0,125 mg/ml) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Hoewel 6,7 pmol antigeen voldoende is, moeten 33 pmol worden gebruikt als het antigeen niet beperkend is. Als de selectie wordt uitgevoerd op een antigeen gebonden aan een geneesmiddel of ligand met een klein molecuul, zoals in dit geval, moet dit geneesmiddel/ligand aanwezig zijn tijdens de selectie en moet het in deze stap worden toegevoegd (hier: 5 μM A1120).
    3. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C door zachtjes te schudden of te roteren.
      OPMERKING: Cellen kunnen tijdens deze stap worden voorbereid.
    4. Na de incubatie en voordat u de cellen toevoegt, plaatst u de buis 2 minuten op een magnetisch rek met het deksel open. Verwijder het bovenstaande en was de met antigeen beladen korrels met 1 ml PBSA zoals hierboven beschreven. Herhaal de wasstap.
      OPMERKING: Als een antigeen gebonden aan een geneesmiddel of ligand wordt geselecteerd, moet de wasbuffer dit geneesmiddel of ligand in overmaat bevatten (hier: 5 μM A1120).
    5. Resuspendeer de met antigeen beladen korrels in 50 μl PBSA (in aanwezigheid van het geneesmiddel of ligand, indien van toepassing).
      OPMERKING: Als dezelfde met antigeen beladen kralen zijn voorbereid voor meerdere buisjes, pas dan het volume dienovereenkomstig aan (voor de G4-bibliotheek is het uiteindelijke volume hier 100 μL, wat parels oplevert voor twee buisjes).
  2. Bereiding van de gistcellen
    1. Meet OD600 van de geïnduceerde gistcultuur zoals hierboven beschreven.
    2. Pellet voldoende cellen om 10x de diversiteit van de bibliotheek te dekken (2000 x g, 10 min, 4 °C). Gebruik voor de G4-bibliotheek 2,5 x 109 cellen voor centrifugatie. Verwijder het bovenstaande en was de cellen met 10 ml PBSA.
    3. Centrifugeer opnieuw (2000 x g, 10 min, 4 °C) en suspendeer de cellen tot een concentratie van 1,25 x 109 cellen/ml in het juiste volume PBSA (hier: 2 ml) en breng over naar een microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Het volume van PBSA is afhankelijk van het aantal cellen.
    4. Centrifugeer (2000 x g, 3 min, 4 °C) en resusteer in 950 μL PBSA.
  3. Incubatie van gistcellen met met antigeen beladen korrels
    1. Voeg 50 μl met antigeen beladen parels toe aan 950 μl celsuspensie en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C tijdens het schudden of roteren.
    2. Plaats na de incubatie de cel-antigeen-pareloplossing op een magnetisch rek met het deksel open. Pipetteer vloeistof van het deksel naar de buis om de hele gistcultuur aan magnetische selectie te onderwerpen. Wacht 2 minuten voordat u ongebonden cellen voorzichtig weggooit. Onmiddellijk wassen met 1 ml PBSA.
      OPMERKING: Als selecties worden uitgevoerd in de aanwezigheid van een geneesmiddel/ligand - in dit voorbeeld A1120 - moet dit aanwezig zijn in PBSA.
    3. Na de wasstap met PBSA worden de cellen snel geresuspendeerd in 1 ml SD-CAA om te voorkomen dat ze uitdrogen.
    4. Voeg 200 ml SD-CAA toe en voer seriële verdunningen uit zoals hierboven beschreven. Plaats 100 μL op SD-CAA-platen en incubeer gedurende 2-3 dagen bij 30 °C om de nieuwe maximale diversiteit te bepalen. Hier is de diversiteit van de G4-bibliotheek na de eerste kralenselectie 1,25 x106 cellen.
      OPMERKING: Aangezien de originele bibliotheek in deze selectieronde 10-voudig is oversampled, is het redelijk om aan te nemen dat de meeste klonen na selectie meerdere keren aanwezig zullen zijn in de verrijkte pool. Als gevolg hiervan zal de werkelijke diversiteit lager zijn, en dit aantal moet als een maximale waarde worden beschouwd. Meestal wordt de diversiteit binnen deze eerste selectieronde met minimaal 100x verminderd. Incubeer de resterende cultuur (200 ml) bij 30 °C en schud (180 rpm) gedurende ten minste 16 uur. Het protocol kan na een nacht incubatie worden gepauzeerd door de cellen bij 4 °C te plaatsen.

4. Verwijderen van de korrels en opkweken voorafgaand aan de volgende kralenselectieronde

  1. Meet OD600 zoals hierboven beschreven. Pellet voldoende cellen om de diversiteit met minstens 10x te dekken (2000 x g, 3 min, RT). Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 1 ml SD-CAA.
  2. Breng over naar een microcentrifugebuis en plaats deze 2 minuten op een magnetisch rek met het deksel open. Breng de ongebonden cellen over naar een nieuwe microcentrifugebuis en herhaal het scheidingsproces.
  3. Verdun de ongebonden cellen in 100 ml SD-CAA en incubeer bij 30 °C met schudden bij 180 tpm tot een OD600 van 3-4 is bereikt.
    OPMERKING: Als de OD600 lager is dan 4 vóór het verwijderen van de kralen, kunnen de cellen direct daarna worden geïnduceerd zonder incubatie.
  4. Wanneer een OD600 van 3-4 is bereikt, centrifugeer dan een voldoende aantal cellen om de diversiteit ten minste 10x te dekken (2000 x g, 3 min, RT) en suspendeer in SG-CAA tot een OD600 van 1 voor inductie van eiwitexpressie en incubeer bij 20 °C terwijl u 's nachts bij 180 tpm schudt.
  5. Wanneer de resterende SD-CAA-gistcultuur de stationaire groeifase heeft bereikt (OD600 boven 15), pellet dan voldoende cellen om de diversiteit 50x te dekken (2000 x g, 3 min, RT). Vries de cellen in door centrifugatie (2000 x g, 3 min), gevolgd door resuspensie van de celpellet in SD-CAA met 15% glycerol en opslag bij -80 °C.

5. Tweede kralen selectieronde met 3 negatieve en 1 positieve selectie

  1. Bereid de cellen en de antigeenkorrels voor zoals hierboven beschreven. Bereid een oplossing van kale kralen (zonder het antigeen toe te voegen) voor de negatieve selecties.
    LET OP: Aangezien er 3 negatieve selecties worden uitgevoerd, kunnen de kralen samen worden voorbereid voor alle drie de rondes.
  2. suspendeer na het wassen de antigeenkorrels opnieuw in 50 μl PBSA en suspendeer kale korrels in 150 μl PBSA (als ze voor alle drie de negatieve selecties zijn bereid).
  3. Voeg voor de eerste negatieve selectie 50 μL gewassen kale korrels toe aan 950 μL gewassen cellen in PBSA en incubeer gedurende 1,5 uur bij 4 °C.
  4. Plaats na de incubatie de buisjes met de kale kralencelsuspensies op een magnetisch rek met het deksel open. Spuit de vloeistof in het deksel in de tube en wacht 2 minuten. Breng de ongebonden cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 50 μL gewassen kale korrels toe.
  5. Herhaal de procedure nog twee rondes van negatieve selectie. Bereid ondertussen met antigeen beladen kralen voor op de positieve selectie.
  6. Voeg na 3 negatieve selectierondes 50 μl met antigeen geladen pareloplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C.
  7. Plaats de cellen met de met antigeen beladen kralen op een magnetisch rek met het deksel open en pipetteer alle vloeistof die in het deksel zit in de buis. Wacht 2 minuten voordat u ongebonden cellen weggooit.
  8. Voer alle resterende stappen uit zoals beschreven voor de eerste selectie van antigeenkorrels. Het enige verschil met de eerste positieve selectie (stap 3.3.2) is het aantal wasstappen: in plaats van één keer te wassen met PBSA, wast u de kralencelsuspensie twee keer met PBSA om de strengheid van de selectie te verhogen.
    OPMERKING: Meestal wordt de diversiteit weer verminderd met 10x-100x. De maximale diversiteit van de G4-bibliotheek na deze tweede kralenselectie was 3,45 x 105 cellen. Zoals hierboven vermeld, zal de werkelijke diversiteit naar verwachting lager zijn als gevolg van oversampling van de bibliotheek.

6. Selectie van bibliotheken via flowcytometrische sortering

  1. Na een nacht inductie van oppervlakte-expressie in SG-CAA, meet OD600 zoals hierboven beschreven. Pellet voldoende cellen om 10x de diversiteit te dekken (2000 x g, 5 min, RT). Gooi het bovenstaande weg.
  2. Resuspendeer de pellet in PBSA en breng deze over in microcentrifugebuisjes. Gebruik 3 x 107 cellen voor het kleuren voor elk buisje. Bereid zoveel tubes voor als nodig is, afhankelijk van de diversiteit. Bereid één controlebuis voor op kleuring zonder het antigeen.
    OPMERKING: Als er bijvoorbeeld 30 x 106 cellen moeten worden gesorteerd, pellet dan 300 x 106 cellen om een zichtbare celpellet te krijgen en verlies van cellen in de volgende stappen te voorkomen. Resuspendeer in 5 ml PBSA en breng 3 tot 4 aliquots van elk 500 μl over in microcentrifugebuisjes. Bereid ongeveer 3 keer meer cellen voor dan het aantal dat gesorteerd moet worden, omdat een fractie van de cellen verloren gaat tijdens het kleuringsproces. Als de selectie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een geneesmiddel/ligand, bereid dan een aanvullende controle voor met alleen het antigeen, maar zonder het geneesmiddel/ligand.
  3. Centrifugeer opnieuw (2000 x g, 5 min, RT), suspendeer de pellet in 200 μL PBSA met het antigeen (hRBP4 met 5 μM A1120) en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Alle stappen vanaf dit punt moeten worden uitgevoerd op ijs en met koude reagentia. Om uitputting van antilichamen of antigeenen te voorkomen, moeten alle reagentia worden toegevoegd in een stoichiometrische overmaat in vergelijking met het totale aantal door gist weergegeven eiwitten in de buis. Anders bestaat het risico dat de binding van door gist vertoonde varianten wordt beperkt vanwege de beperkte beschikbaarheid van antigenen en/of antilichamen. Gewoonlijk worden 5 x 104 moleculen per gistcel gebruikt voor de berekening, en het toevoegen van ten minste een 10-voudige stochiometrische overmaat aan antigeen en antilichamen wordt geadviseerd. Als het antigeen zeer beperkt is, kan het overschot worden teruggebracht tot een factor 5. Een meer gedetailleerde toelichting, inclusief voorbeelden voor berekeningen om liganddepletie te voorkomen, is te vinden in een eerder protocol9.
  4. Na incubatie cellen centrifugeren (2000 x g, 5 min, 4 °C) en wassen met 1 ml PBSA (als er een geneesmiddel/ligand aanwezig is tijdens selecties - zoals A1120 in dit geval - moet dit aanwezig zijn in de wasbuffer).
  5. Resuspendeer de cellen in 100 μl koude PBSA met de antilichamen voor het weergeven van kleuring en detectie van het gebonden antigeen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    1. Gebruik anti-c-myc-antilichaam (eindverdunning 1:100) om weergegeven POI van volledige lengte te detecteren. Gebruik anti-HA-antilichaam (eindverdunning 1:50) om de totale hoeveelheid weergegeven eiwitten te detecteren. Gebruik Penta-His antilichaam (eindverdunning 1:20) of streptavidine (eindverdunning 1:200) om gistcellen te selecteren die binden aan het oplosbare antigeen dat respectievelijk een 6x HIS-tag of biotine bevat.
    2. Wissel de detectiereagentia af tussen sorteerrondes om verrijking van eiwitvarianten die aan het secundaire reagens binden te voorkomen.
      OPMERKING: Er kunnen verschillende fluorofoorcombinaties worden gebruikt, maar Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 647 zijn goede opties omdat ze geen compensatie vereisen bij flowcytometrie. Om uitputting van antilichamen te voorkomen, moet het worden toegevoegd in een stoichiometrische overmaat in vergelijking met het totale aantal door gist weergegeven eiwitten in de buis. Meestal zijn de berekeningen gebaseerd op 5 x 104 moleculen per gistcel. Een meer gedetailleerde uitleg is gegeven in eerdere protocollen9.
  6. Na incubatie centrifugeren de cellen (2000 x g, 5 min, 4 °C) en voegen ze 1 ml PBSA (met het geneesmiddel/ligand, voor de door hRBP4 geselecteerde G4-bibliotheek 5 μM A1120) toe aan de pellet en centrifugeren ze opnieuw. Verwijder het grootste deel van het bovenstaande middel en bewaar slechts 20-30 μL om te voorkomen dat de pellet uitdroogt.
  7. Resuspendeer de pellet in koude PBSA alleen vlak voor het sorteren en sorteer op de gistcellen die Fn3-moleculen vertonen met de gewenste eigenschappen (d.w.z. binding aan hRBP4 in aanwezigheid van A1120).
    OPMERKING: De poortstrategie is weergegeven in figuur 2A.
  8. Sorteer de cellen rechtstreeks in SD-CAA-medium, voeg na het sorteren meer SD-CAA-medium toe en incubeer bij 30 °C met schudden bij 180 tpm.
    OPMERKING: Als het volume na het sorteren aanzienlijk toeneemt, moet een centrifugatiestap worden uitgevoerd (2000 x g, 5 min, RT) om de overtollige omhulselvloeistof te verwijderen en worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een vers SD-CAA-medium. Noteer het aantal cellen dat in de nieuwe buis is gesorteerd, want dit wordt de nieuwe maximale diversiteit voor de volgende sorteerronde. Zoals hierboven vermeld, zal de werkelijke diversiteit van de bibliotheek lager zijn als gevolg van oversampling van de bibliotheek.
  9. Herhaal de cytometrische sortering gedurende verschillende rondes om een verrijking van bindende eiwitvarianten in de gistbibliotheek te zien (Figuur 2B).
    OPMERKING: Het kan nuttig zijn om de bibliotheken naast elkaar te vergelijken in een analytisch flowcytometrisch experiment. In latere selectierondes kan het verlagen van de concentratie van het antigeen nuttig zijn om onderscheid te maken tussen bindmiddelen met een lagere en hogere affiniteit en specifiek te sorteren op de eiwitvarianten die bij lage concentraties een hoger bindingssignaal naar het doelwit vertonen (Figuur 2C). In latere selectierondes is het ook mogelijk om te sorteren op verhoogde thermostabiliteit. Voor dit doel werd willekeurige mutagenese van de bibliotheek door middel van epPCR uitgevoerd, zoals beschreven in sectie 7. Bereid cellen voor die vergelijkbaar zijn met andere flowcytometrische sorteerrondes door inductie, bepaling van OD600 en wassen van cellen. Plaats gistcellen in PBSA gedurende 10 minuten op ijs, gevolgd door een incubatie van 10 minuten in een thermocycler voor de hitteschok bij een verhoogde temperatuur. Leg ze daarna opnieuw 10 minuten op ijs en ga verder met het kleuringsprotocol. Gestabiliseerde varianten zijn bestand tegen thermische denaturatie en vertonen daarom een behouden binding na de warmte-incubatie. Verschillende temperaturen kunnen worden getest op hitteschok, afhankelijk van de initiële thermostabiliteit van het wildtype eiwit. Meestal zijn temperaturen van 40-80 °C geschikt. Boven de 48 °C zal de levensvatbaarheid van gistcellen echter drastisch afnemen. Daarom is het noodzakelijk om de plasmiden te extraheren na het sorteren van de door hitte geschokte gistbibliotheek, zoals besproken in stap 7.1. In dit geval moeten EBY100-cellen vers worden getransformeerd met verrijkte varianten voordat ze doorgaan naar de volgende sorteerronde36. Een meer gedetailleerd protocol voor het verhogen van de thermostabiliteit is elders te vinden37. Als de denaturatie van het weergegeven eiwit omkeerbaar is, zal deze methode niet werken. U kunt ook de dag voor het sorteren eiwitexpressie induceren bij 37 °C in plaats van 20 °C en sorteren op eiwitvarianten die nog steeds een efficiënte weergave van volledige lengte vertonen.

7. Affiniteitsrijping met epPCR om willekeurige mutaties te introduceren

OPMERKING: Affiniteitsrijping met behulp van epPCR kan worden uitgevoerd vóór de eerste flowcytometrische sorteerronde of tussen flowcytometrische sorteerrondes door. Voor de selectie van de G4-bibliotheek met hRBP4 in aanwezigheid van A1120 werd affiniteitsrijping uitgevoerd vóór de eerste ronde van flowcytometrische sortering. Dit is ook afhankelijk van de bibliotheekgrootte na beadselectie en het bindingssignaal dat kan worden gedetecteerd met flowcytometrie. Met name in gevallen waarin affiniteiten na beadselecties niet voldoende zijn om een signaal te verkrijgen in flowcytometrische experimenten (omdat het antigeen snel dissocieert tijdens de wasstappen), kan epPCR verbeterde varianten genereren die vervolgens kunnen worden gedetecteerd en geselecteerd via flowcytometrie.

  1. Voer een gist miniprep DNA-extractie uit de verrijkte gistbibliotheek uit met behulp van de in de handel verkrijgbare plasmide miniprep II-kit (zie Materiaaltabel) met de volgende aanpassingen:
    1. Meet de celdichtheid van de nachtcultuur, verdun 's ochtends tot een OD600 van 0,2 en incubeer bij 30 °C door te schudden.
    2. Wanneer OD600 0,6 bereikt, oogst dan 3 ml cultuur door de cellen gedurende 2 minuten op 600 x g te centrifugeren.
    3. Voeg 200 μL Oplossing 1 toe aan de pellet. Voeg 6 μL Zymolyase toe. Resuspendeer de pellet door middel van flicking of milde vortex en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
    4. Voeg 200 μL Oplossing 2 toe en meng voorzichtig. Voeg 400 μL Oplossing 3 toe en meng voorzichtig.
    5. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 3 min.
    6. Breng het bovenstaande over naar de spin-I-kolom, centrifugeer gedurende 30 s op maximale snelheid en gooi de doorstroming weg.
    7. Wassen met 550 μL wasbuffer met ethanol en centrifugeren op maximale snelheid gedurende 2 min.
    8. Breng de kolom over naar een schone microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid om de resterende wasbuffer te verwijderen.
    9. Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis, voeg 10 μL nucleasevrij water toe en draai 1 minuut op maximale snelheid om het DNA te elueren.
  2. Voer een eerste PCR uit om de sjabloon voor epPCR te amplificeren.
    1. Amplificeer het DNA door PCR met behulp van primers die aan de buitenkant van het inzetstuk op de weergavevector van het gistoppervlak gloeien.
      OPMERKING: Aangezien veel genomisch gist-DNA samen met het plasmide van belang wordt geëlueerd tijdens de gist miniprep, wordt deze stap aanbevolen om een schoon DNA-fragment te verkrijgen dat kan worden gebruikt als sjabloon voor de epPCR.
    2. Gebruik voor pCTCON2 primers fwd 5'- GGCTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAG
      GGTCGGCTAGC en rev 5'- CTATTACAAGTCC
      TCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCGGATCC met de reactiecomponenten beschreven in tabel 3 en cyclusomstandigheden weergegeven in tabel 4.
    3. Zuiver de PCR met een PCR- en DNA-opruimset. Elute in 20 μL nucleasevrije H2O.
  3. Voer epPCR uit om willekeurige mutaties te introduceren.
    1. Voer een epPCR uit met nucleotide-analogen met de aangegeven ingrediënten (Tabel 5) en voorwaarden (Tabel 6).
    2. Laat het hele epPCR-product gedurende 45 minuten op een preparatieve 1% agarosegel bij 120 V draaien. Voeg een markering toe en laat een rijstrook tussen het epPCR-product en de ladder. Snijd de gewenste band weg die overeenkomt met de verwachte grootte van de insert, zuiver deze met behulp van een gelextractiekit en meet de DNA-concentratie.
  4. Amplificeer het gerandomiseerde DNA door middel van PCR.
    1. Amplificeer 50 ng van het DNA met een Q5-polymerase. Stel 2 x 100 μL PCR-reactie in voor elke elektroporatie (Tabel 7) met de aangegeven voorwaarden (Tabel 8). Gebruik dezelfde primers die voor de eerste PCR zijn gebruikt.
      OPMERKING: Er zijn grote hoeveelheden DNA nodig voor elektroporatie tot gist.
    2. Analyseer 5 μL van het PCR-product op een 1% agarosegel, laat 45 minuten met 120 V draaien.
  5. Zuiver het geamplificeerde DNA met ethanolprecipitatie.
    1. Zwembad 2 x 100 μL samen. Voeg 20 μL (10% van het volume) steriel gefilterd 3 M natriumacetaat, pH 5,2 toe.
      LET OP: Deze buffer kan van tevoren worden voorbereid en een paar maanden bij RT worden bewaard.
    2. Voeg 440 μL 100% ethanol toe (of minstens 2 x volume) en incubeer 2 minuten bij RT.
    3. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant, voeg 500 μL 70% ethanol toe en meng kort.
    4. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant, voeg 500 μL 100% ethanol toe en meng kort.
    5. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het bovenstaande en laat de DNA-pellet drogen onder een laminaire stromingskap totdat alle ethanol is verdampt.
      OPMERKING: Gebruik een warmteblok op 48 °C om dit proces te versnellen. Het is mogelijk dat de DNA-pellet niet altijd zichtbaar is.
    6. Los de gedroogde DNA-pellet op in 10 μL nucleasevrije H2O.
      OPMERKING: DNA moet in zo min mogelijk hoeveelheden worden opgelost. Meet de DNA-concentratie niet.

Inhoud [μL]Uiteindelijke concentratie
5x Q5-verbeteraar101x
5x Q5 buffer101x
Grondverf voor 10 μM2.50,5 μM
Primer rev 10 μM2.50,5 μM
dNTP's 10 mM1200 μM
Q5-polymerase0.520 E/ml
DNA van gist miniprep10
Nuclease-vrij H2O13.5

Tabel 3: Voorwaarden voor de1e stap PCR voor amplificatie van de POI-genen uit de geïsoleerde gist miniprep.

StapTemperatuurTijd
Initiële denaturatie98 °Cjaren 30
25 cycli98 °C10 seconden
72 °Cjaren 30
72 °Cjaren 30
Laatste verlenging72 °C2 minuten
Houden4 °C

Tabel 4: Cyclusomstandigheden voor de1e stap PCR voor amplificatie van de POI-genen uit de geïsoleerde gist miniprep.

Inhoud [μL]Uiteindelijke concentratie
Nuclease-vrij H2Otot 50
10x Thermopol buffer51x
Primer_fwd (10 μM)2.50,5 μM
Primer_rev (10 μM)2.50,5 μM
dNTP's (10 mM)1200 μM
8-oxo-dGTP (100 μM)12 μM
dPTP (100 μM)12 μM
PCR-product van 1e PCRXX50 ng
Taq DNA-polymerase0.50,05 U/μL

Tabel 5: Voorwaarden voor de epPCR die wordt uitgevoerd na amplificatie van het POI-DNA met de1e stap PCR.

StapTemperatuurTijd
Initiële denaturatie94 °Cjaren 30
15 cycli94 °C45 seconden
60 °Cjaren 30
72 °C1 minuut
Laatste verlenging72 °C10 minuten
Houden4 °C

Tabel 6: Cyclusomstandigheden voor de epPCR.

Inhoud [μL]Uiteindelijke concentratie
5x Q5-verbeteraar201x
5x Q5 buffer201x
Grondverf voor 10 μM50,5 μM
Primer rev 10 μM50,5 μM
dNTP's 10 mM1200 μM
Q5-polymerase120 E/ml
50 ng DNAXX
ddH20tot 100

Tabel 7: Voorwaarden voor de2e stap PCR voor amplificatie van het epPCR-product vóór elektroporatie van EBY100-cellen.

StapTemperatuurTijd
Initiële denaturatie98 °Cjaren 30
25 cycli98 °C10 seconden
72 °Cjaren 30
72 °Cjaren 30
Laatste verlenging72 °C2 minuten
Houden4 °C

Tabel 8: Cyclusomstandigheden voor de2e stap PCR voor amplificatie van het epPCR-product.

8. Linearisatie van de gistweergavevector voor elektroporatie

  1. Lineariseer de pCTCON2-vector voor de weergave van het gistoppervlak (Addgene-plasmide #41843).
    1. Voer een grootschalige digest uit en gebruik deze verteerde gelineariseerde vector voor alle verdere elektroporaties.
    2. Ontsmet 2 x 200 μg pCTCON2-plasmide-DNA met Sal I gedurende 24 uur bij 37 °C voor een eerste linearisatie (Tabel 9).
  2. Vergist met NheI en BamHI gedurende 24 uur bij 37 °C om de bijsluiter te accijnzen (tabel 10).
  3. Voeg ten slotte 5 μL van elk enzym toe aan de buis (Sal I, NheI, BamHI) en incubeer opnieuw gedurende 24 uur bij 37 °C.
  4. Voer de verteerde vector uit op een preparatieve agarosegel. Snijd de banden weg en zuiver ze met een gelextractieset. Elueer de vector in 20 μL, meet de DNA-concentratie en pas deze aan op ongeveer 2 μg/μL.
    OPMERKING: Het langdurig verteren van het plasmide zorgt voor voldoende splitsing van de insert en zal resulteren in minder achtergrond van de vector na elektroporatie.
DNA200 μg
10-voudig SnijSmartBuffer50 μL
Sal I-HF (NEB)30 μL (60 E)
H2OTot 500 μL

Tabel 9: Voorwaarden voor de eerste stap van de grootschalige digest van het gistoppervlak display vector pCTCON2.

pCTCON2 (Sal I verteerd)500 μL
10-voudig SnijSmartBuffer37,5 μL
NheI-HF (NEB)15 μL (30 E)
BamHI-HF (NEB)15 μL (30 E)
H2Otot 875 μL

Tabel 10: Voorwaarden voor de tweede stap van de grootschalige digest van het gistoppervlak display vector pCTCON2.

9. Elektroporatie van EBY100 met gerandomiseerd DNA en gelineariseerde vector

  1. Bereid de EBY100-gistcellen (ATCC, zie materiaaltabel) voor door ze 3 dagen voor elektroporatie uit een glycerolvoorraad te halen. Aangezien niet-getransformeerde EBY100-cellen niet de weergavevector van het gistoppervlak bevatten, moet u YPD-platen met volledige media gebruiken (tabel 1). Incubeer bij 30 °C.
  2. Inoculeer een dag voor de elektroporatie een enkele EBY100-kolonie in een vers bereid YPD-medium van 30 ml (tabel 1). Incubeer een nacht bij 30 °C terwijl je schudt bij 180 rpm.
    LET OP: Het YPD-medium mag niet ouder zijn dan 1 maand.
  3. Verdun de volgende ochtend de EBY100 nachtcultuur tot een OD600 van 0,2 in 100 ml YPD-medium en incubeer bij 30 °C terwijl u schudt bij 180 tpm.
    OPMERKING: Een kweekvolume van 50 ml is voldoende voor 2 elektroporaties. Doorgaans wordt 100 ml voorbereid om voldoende cellen te hebben voor de controles (alleen cellen en cellen plus vector).
  4. Wanneer een OD600 van 1,3-1,5 is bereikt, pellet de cellen in buisjes van 50 ml bij 2000 x g gedurende 3 minuten en verwijder de supernatant.
  5. Resuspendeer de pellet in 25 ml steriel gefilterd lithiumacetaat van 100 mM (zie materiaaltabel). Voeg vers bereide steriel gefilterde DTT (1 M) (zie materiaaltabel) toe aan een eindconcentratie van 10 mM.
    OPMERKING: Het lithiumacetaatvolume moet de helft zijn van het oorspronkelijke volume van YPD. Schaal indien nodig af of omhoog. Lithiumacetaat (100 mM) kan van tevoren worden bereid en enkele maanden bij RT worden bewaard, maar de 1 M DTT-voorraad moet vlak voor gebruik worden bereid en op ijs worden bewaard.
  6. Incubeer de cellen bij 30 °C terwijl u 10 minuten schudt.
  7. Centrifugeer op 2000 x g gedurende 3 minuten, gooi het bovenstaande weg en plaats de cellen op ijs.
    OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd op ijs en met gekoelde reagentia, cuvetten en microcentrifugebuisjes.
  8. Resuspendeer de pellet in 25 ml koel steriel H2O. Centrifugeer op 2000 x g gedurende 3 min.
    OPMERKING: Het gebruikte H2O-volume moet de helft zijn van het oorspronkelijke YPD-volume.
  9. Resuspendeer in 350 μl steriel H2O.
    OPMERKING: Het totale volume na resuspensie moet 500 μL zijn. Voeg indien nodig meer H2O toe.
  10. Bereid de DNA-bibliotheek parallel voor: Plaats de microcentrifugebuisjes met de ethanolgezuiverde inserts op ijs en voeg 4 μg gelineariseerde pCTCON2-vector toe.
  11. Voeg 250 μL van de cellen toe aan het DNA en meng voorzichtig door te knippen. Breng over naar een voorgekoelde elektroporatiecuvet van 2 mm en bewaar op ijs tot de elektroporatie.
    OPMERKING: Voeg besturingselementen toe (alleen cellen zonder DNA en cellen met gelineariseerde vector alleen zonder insert) om het succes van elektroporatie te bepalen.
  12. Elektroporaat met behulp van elektroporatiecuvetten van 2 mm (zie materiaaltabel) onder de volgende omstandigheden: blokgolfprotocol, enkele puls, 500 V, pulsduur van 15 ms.
    OPMERKING: Typische droops zijn 3% - 9%. Andere elektroporators kunnen worden gebruikt, maar de aangegeven omstandigheden zijn geoptimaliseerd voor het instrument dat in dit onderzoek wordt gebruikt.
  13. Red de cellen met 1 ml voorverwarmde YPD, breng ze over naar een voorverwarmde microcentrifugebuis en incubeer zonder te schudden gedurende 1 uur bij 30 °C.
    NOTITIE: Plaats het verwarmingsblok naast de elektroporator om ervoor te zorgen dat de herstelbuisjes op de juiste temperatuur blijven.
  14. Plaat 100 μL van 10-3, 10-4, 10-5 en 10-6 verdunningen van cellen op SD-CAA-platen (zie tabel 1) en houd rekening met de groei van transformatoren bij 30 °C.
    OPMERKING: De theoretische bibliotheekdiversiteit wordt verkregen door het aantal transformatoren terug te berekenen naar het oorspronkelijke cultuurvolume, hier 1 ml. Doorgaans levert dit transformatieprotocol ongeveer 107-10 8 getransformeerde cellen op.
  15. Pellet de resterende cellen bij 2000 x g gedurende 3 min, suspendeer opnieuw in 200 ml SD-CAA en incubeer bij 30 °C met schudden bij 180 tpm gedurende een nacht. De getransformeerde cellen die de epPCR-gerandomiseerde bibliotheek bevatten, kunnen ofwel in SD-CAA worden gepasseerd en de volgende dag worden geïnduceerd voor oppervlakte-expressie in SG-CAA, ofwel worden bewaard bij 4 °C tot verder gebruik. Vries de glycerolvoorraden van de bibliotheek in na epPCR na het bepalen van de diversiteit. Aangezien de volgende dag nog steeds een fractie van de cellen niet-getransformeerde cellen zal zijn die tijdens de transformatieprocedure zijn overgedragen zonder een plasmide te verkrijgen, wordt aanbevolen om in de eerste passagestap ten minste 20-voudig van de bibliotheekdiversiteit te passeren om dit effect te compenseren.

10. Sequencing van gistbibliotheken na verschillende selectierondes

  1. Extraheer het gist-DNA door een gist miniprep uit te voeren zoals hierboven beschreven.
  2. Elektroporaat commerciële E. coli 10-bèta elektrocompetente cellen (zie materiaaltabel) met het geïsoleerde DNA.
  3. Plaats de elektroporatiecuvetten (1 mm, zie materiaaltabel) en de microcentrifugebuisjes op ijs. Verwarm de microcentrifugebuisjes met 950 μL uitgroeimedium bij 37 °C om de cellen na elektroporatie terug te winnen.
  4. Ontdooi de cellen op ijs en meng door voorzichtig tegen de tube te tikken. Breng 50 μL van de cellen over in een gekoelde microcentrifugebuis. Voeg 1 μL van het gist miniprep DNA toe.
  5. Breng de cel-DNA-mix voorzichtig over in een gekoelde elektroporatiecuvet.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen en zorg ervoor dat de cellen zich op de bodem van de cuvet afzetten.
  6. Elektroporeren met een elektroporatie-apparaat onder de volgende omstandigheden: 2,0 kV; 200 Ω; 25 μF.
    OPMERKING: Typische tijdconstanten zijn 4,8-5,1 ms. Andere elektroporators kunnen worden gebruikt, maar de aangegeven omstandigheden zijn geoptimaliseerd voor het instrument dat in dit onderzoek wordt gebruikt.
  7. Voeg onmiddellijk 950 μL voorverwarmd uitgroeimedium van 37 °C (zie materiaaltabel) toe aan de cuvetten, meng voorzichtig en breng terug naar de warme microcentrifugebuisjes.
    NOTITIE: Plaats het verwarmingsblok naast de elektroporator om ervoor te zorgen dat de herstelbuisjes op de juiste temperatuur blijven.
  8. Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 °C en 300 tpm. Plaat 10 μL, 100 μL en de rest van de cellen (na centrifugatie) op een voorverwarmde selectieve LB-plaat (zie tabel 1). Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
    OPMERKING: Voor de pCTCON2-vector wordt ampicilline gebruikt voor de selectie van antibiotica.
  9. Maak een kopieerplaat met LB-agar en het benodigde antibioticum (hier wordt ampicilline gebruikt): pipetteer 200 μL LB-agar met 100 μg/ml ampicilline in elk putje van een plaat met 96 putjes en laat het stollen.
  10. Bereid een sequentieplaat met 96 putjes voor met 50 μL LB met 100 μg/ml ampicilline per putje.
  11. Pluk een enkele kolonie van de platen en inoculeer eerst de kopieerplaat en hetzelfde putje van de volgordeplaat.
    OPMERKING: De kopieerplaat zorgt ervoor dat de gewenste plasmiden gemakkelijk kunnen worden verkregen door een vloeibare cultuur te inoculeren en een miniprep uit te voeren.
  12. Incubeer de kopieerplaat een nacht bij 37 °C en bewaar hem vervolgens bij 4 °C.
  13. Incubeer de volgplaat gedurende 3-4 uur bij 37 °C terwijl u schudt (180 tpm) afgedekt met plastic of aluminiumfolie.
  14. Verzegel de sequencingplaat en stuur deze op voor sequencing samen met 500 μL 10 μM pCTCON2 sequencing primer (5'-CGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTC).
  15. Voor de analyse van de sequenties vertaalt u de verkregen DNA-sequenties naar aminozuursequenties met behulp van een geschikt programma naar keuze, bijvoorbeeld EMBOSS Transeq38. Gebruik vervolgens Multiple Sequence Alignment (MUSCLE)39 of een vergelijkbare uitlijningstool om de variantsequenties met elkaar en met het ouderlijke wildtype-eiwit uit te lijnen.
    OPMERKING: Door sequentiebepaling uit te voeren van bibliotheken van verschillende selectierondes (bijvoorbeeld na een eerdere selectieronde, evenals na extra selectierondes met lagere antigeenconcentraties om varianten met hoge affiniteit te verrijken), is het mogelijk om verschillende varianten te identificeren. Dit is sterk afhankelijk van de striktheid van de poorten die tijdens sorteerrondes worden toegepast en dus van de diversiteit van de bibliotheken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De G4-bibliotheek werd geselecteerd tegen het antigeen hRBP4 gebonden aan het kleine molecuul geneesmiddel A1120. De kleuring van de bibliotheken voor flowcytometrische sortering werd uitgevoerd zoals beschreven in methode 6, en de toegepaste poortstrategie wordt weergegeven in figuur 2A. Een eerste poort omvatte alle cellen op basis van celmorfologie, en de tweede poort (histogram van FSC-Width) toonde een strikte poortstrategie die werd toegepast om afzonderlijke cellen te selecteren en celaggregaten te verwijderen. De derde en laatste poort toonde de weergave van eiwitvarianten (x-as) versus antigeenbinding (y-as). Gistcellen die zowel display- als bindingssignalen vertoonden, werden gesorteerd. Belangrijk is dat de sorteerpoort op een strikte manier is ingesteld om bindingsdomeinen te verrijken met een hoog bindingssignaal en dus een hoge affiniteit. Deze strenge selectie leverde een verrijking op van het tonen van gistcellen die specifiek binden aan het doelantigeen tijdens de selectiecampagne (Figuur 2B). In latere flowcytometrische sorteerrondes werd de antigeenconcentratie 10-voudig verlaagd (van 100 nM naar 10 nM). Daarom werd het totale bindingssignaal verminderd en waren alleen bindmiddelen met een hoge affiniteit nog detecteerbaar en gesorteerd (Figuur 2C).

figure-results-1
Figuur 2: Representatieve resultaten van een selectie van een gistoppervlak van de op Fn3 gebaseerde G4-bibliotheek voor binding aan het antigeen (hRBP4 in aanwezigheid van A1120). (A) De algemene poortstrategie voor het sorteren van gistbibliotheken. De eerste poort (FSC vs. SSC) is om alle gistcellen te selecteren en verstrooiingsgebeurtenissen uit te sluiten; de tweede poort (histogram van FSC-W) heeft tot doel celaggregaten te verwijderen en alleen enkele gistcellen te selecteren. De derde poort zet het weergaveniveau van het oppervlak uit (detectie van de HA- of c-myc-tag) versus binding aan het antigeen (hier hRBP4 in aanwezigheid van 5 μM A1120, gedetecteerd door anti-His-antilichaam). De bibliotheek werd bovendien alleen gekleurd met secundaire antilichamen (zonder antigeen), waar geen antigeenbinding wordt verwacht. Gesorteerde cellen zijn blauw gemarkeerd. (B) Evolutie van de G4-bibliotheek gedurende 3 rondes van flowcytometrische sortering. Verrijking van de bindingspopulatie kan bij elke selectieronde worden waargenomen. (C) Het gebruik van lagere antigeenconcentraties maakt het mogelijk eiwitvarianten te selecteren met een hogere affiniteit voor het doelantigeen. Bij verlaging van de antigeenconcentratie (hier hRBP4) met 10-voudig, verschijnen verschillende diagonalen, wat wijst op de aanwezigheid van klonen met een hogere (gesorteerde cellen, blauw) of lagere affiniteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gistoppervlakteweergave is geëvolueerd als een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt in eiwittechnologie. Hoewel het vaak wordt gebruikt voor de engineering van affiniteit 1,18,40,41, expressie/stabiliteit 24,27,42,43 en activiteit 28,44, worden verdere toepassingen zoals het in kaart brengen van epitopen45,46 of karakterisering van de individuele mutanten op het oppervlak van gistcellen9 zijn ook mogelijk. In dit protocol bieden we de basisstappen voor het starten van een selectiecampagne voor het weergeven van gistoppervlakken, inclusief de selectie met magnetische kralen en door cytometrische sortering, evenals diversificatie van de gistbibliotheek door epPCR voor affiniteitsrijping.

Een essentiële vereiste voor conventionele selecties van gistoppervlakken is de beschikbaarheid van oplosbaar eiwit van voldoende kwaliteit. Beginnen met een goed gevouwen doeleiwit met een hoge zuiverheid en een gedefinieerde oligomerisatietoestand (d.w.z. monomeer eiwit mag alleen als monomeer aanwezig zijn) biedt het hoogste slagingspercentage om te selecteren voor een eiwitvariant die bindt aan het doelantigeen met hoge affiniteit. Een alternatief voor moeilijk tot expressie gebrachte doeleiwitten zijn celgebaseerde selecties, die een redelijke strategie bieden om deze beperking te omzeilen47. Het weergeven van gistoppervlakken biedt echter veel voordelen, zoals de mogelijkheid om de resulterende eiwitvarianten direct op het oppervlak van de gist te karakteriseren zonder de noodzaak om moeizaam en tijdrovend te klonen, expressie in een oplosbaar formaat en eiwitzuivering. Zowel de affiniteit als de stabiliteit van de varianten kunnen direct op het gistoppervlak9 worden geanalyseerd.

In dit protocol tonen we aan hoe de G4-bibliotheek van eiwitvarianten, meer bepaald van het10e type III-domein van humaan fibronectine, werd geselecteerd voor binding aan het antigeen hRBP4 in aanwezigheid van het kleine molecuul A1120. De combinatie van bead-selecties en flowcytometrische sortering leverde een verrijking van varianten op, die een verhoogde binding aan het doelantigeen vertoonden tijdens selectierondes (Figuur 2B). We hebben aangetoond dat het gebruik van lagere concentraties antigeen de selectie van eiwitvarianten met hoge affiniteit mogelijk maakt (Figuur 2C). Doorgaans liggen de affiniteiten die kunnen worden bereikt met gistweergaveselecties in het nanomolaire of zelfs picomolaire bereik18. De uiteindelijke affiniteiten zijn afhankelijk van het doelantigeen, het aantal selectierondes en affiniteitsrijping, de gebruikte bindingssteiger en de toegepaste gating-strategie. De karakterisering van individuele eiwitvarianten wordt in dit protocol niet behandeld, maar wordt in detail uitgelegd in ons eerdere werk9. Hoewel gistweergave oorspronkelijk werd gebruikt voor de engineering van antilichaamfragmenten zoals scFvs 1,40, is de methode ook veel gebruikt voor eiwitten die niet op antilichamen zijngebaseerd10.

Kortom, gistoppervlakteweergave is een krachtig hulpmiddel voor eiwitengineering dat het mogelijk maakt om eiwitvarianten te genereren met nieuwe of verbeterde eigenschappen, zoals binding aan bijna elk doeleiwit en/of verhoogde stabiliteit.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.W.T. ontvangt financiering van Miltenyi Biotec. Alle auteurs zijn uitvinders van patentaanvragen voor technologieën en gemanipuleerde eiwitten die zijn ontwikkeld met behulp van gistoppervlakteweergave.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF-project W1224 - Doctoraatsprogramma over biomoleculaire technologie van eiwitten - BioToP en FWF-project ESP 465-B), het federale ministerie van Digitale en Economische Zaken van Oostenrijk, de Nationale Stichting voor Onderzoek, Technologie en Ontwikkeling van Oostenrijk aan de Christian Doppler Research Association (Christian Doppler Laboratory for Next Generation CAR T Cells), en door particuliere donaties aan het St. Anna Children's Cancer Research Institute (Wenen, Oostenrijk). E.S. is een ontvanger van een DOC Fellowship van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen aan het St. Anna Children's Cancer Research Institute. Figuren zijn gemaakt met BioRender.com.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10-bèta electrocompetent E. coli NEBC3020K
Agar-Agar, Kobe ICarl Roth5210.5
Ampicillin natriumzoutCarl RothK029.2
Anti-c-myc antilichaam, clone 9E10, AF488InvitrogenMA1-980-A488 (Thermo Fisher)
Anti-c-myc antilichaam, clone 9E10, AF647InvitrogenMA1-980-A647 (Thermo Fisher)
Anti-HA antilichaam, clone 16B12, AF488BioLegend901509 (Biozym)
Anti-HA antilichaam, clone 16B12, AF647BioLegend682404 (Biozym)
BamHI-HFNEBR3136S
Rund serum albumine, cold ethanol fractieSigma-AldrichA4503
Citroenzuur monohydraatSigma-AldrichC1909
D-GalactoseCarl Roth4987.2
D-GlucoseSigma-AldrichG8270
Difco gist stikstof baseBecton Dickinson (BD) 291940
Di-Natrium waterstof fosfaat heptahydraatCarl RothX987.3
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632
D-SorbitolCarl Roth6213.1
Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x)Thermo Scientific14190169
Dynabeads Biotin BinderInvitrogen11047 (Fisher Scientific)
DynaMag-2 MagneetThermo Fisher12321D
EBY100ATCCMYA-4941
Electroporatie cuvet 1 mm (voor E.coli)VWR732-1135
Electroporatie cuvet 2 mm (voor gist)VWR732-1136
Ethanol absoluutMERCK1070172511
GeneMorph II Random Mutagenesis KitAgilent Technologies200550
Gibco Bacto Casamino ZurenBecton Dickinson (BD)223120
GlycerolAppliChem131339.1211
LE agarose Biozym840004
Lithiumaccetaan dihydraatSigma-AldrichL4158
Monarch DNA Gel Extractie KitNEBT1020S
Monarch PCR & DNA Cleanup KitNEBT1030S
Multifuge 1S-RHeraeus
NheI-HFNEBR3131S
Outgrowth mediumNEBB9035S
pCTCON2Addgene#41843
Penicilline G natriumzoutSigma-AldrichP3032
Penta-His antilichaam, AF488Qiagen35310
Penta-His antilichaam, AF647Qiagen35370
Pepton ex caseine trachtisch verteerdCarl Roth8986.3
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEBM0491S
SaII-HFNEBR3138S
NatriumacetaatSigma-AldrichS8750-1KG
NatriumchlorideCarl Roth3957.2
Natrium diwaterstoffosfaat monohydraatCarl RothK300.2
Steritop draadgewonden flesdopfilterMERCKS2GPT01RE
Streptavidine, AF488InvitrogenS32354 (Thermo Fisher)
Streptavidine, AF647InvitrogenS32357 (Thermo Fisher)
Streptomycine sulfaatSigma-AldrichS6501
Tri-Natrium citraat dihydraatCarl Roth4088.1
UV-Vis spectrofotometerAgilent8453
Gist extract, micro-gegranuleerdCarl Roth2904.4
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep IIZymo ResearchD2004 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  2. Scott, J. K., Smith, G. P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science. 249 (4967), 386-390 (1990).
  3. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  4. Schaffitzel, C., Hanes, J., Jermutus, L., Pluckthun, A. Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J Immunol Methods. 231 (1-2), 119-135 (1999).
  5. Ho, M., Nagata, S., Pastan, I. Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (25), 9637-9642 (2006).
  6. Wagner, A., et al. Identification of activating mutations in the transmembrane and extracellular domains of EGFR. Biochemistry. 61 (19), 2049-2062 (2022).
  7. Wagner, A., et al. PhosphoFlowSeq - A high-throughput kinase activity assay for screening drug resistance mutations in EGFR. J Mol Biol. 433 (22), 167210(2021).
  8. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of yeast surface display for protein engineering. Methods Mol Biol. 1319, 155-175 (2015).
  9. Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins. Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).
  10. Gai, S. A., Wittrup, K. D. Yeast surface display for protein engineering and characterization. Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 467-473 (2007).
  11. Orr, B. A., Carr, L. M., Wittrup, K. D., Roy, E. J., Kranz, D. M. Rapid method for measuring ScFv thermal stability by yeast surface display. Biotechnol Prog. 19 (2), 631-638 (2003).
  12. Teufl, M., Zajc, C. U., Traxlmayr, M. W. Engineering strategies to overcome the stability-function trade-off in proteins. ACS Synth Biol. 11 (3), 1030-1039 (2022).
  13. Wozniak-Knopp, G., et al. Introducing antigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties. Protein Eng Des Sel. 23 (4), 289-297 (2010).
  14. Traxlmayr, M. W., et al. Directed evolution of stabilized IgG1-Fc scaffolds by application of strong heat shock to libraries displayed on yeast. Biochim Biophys Acta. 1824 (4), 542-549 (2012).
  15. Traxlmayr, M. W., et al. Directed evolution of Her2/neu-binding IgG1-Fc for improved stability and resistance to aggregation by using yeast surface display. Protein Eng Des Sel. 26 (4), 255-265 (2013).
  16. Hasenhindl, C., et al. Stability assessment on a library scale: a rapid method for the evaluation of the commutability and insertion of residues in C-terminal loops of the CH3 domains of IgG1-Fc. Protein Eng Des Sel. 26 (10), 675-682 (2013).
  17. Koide, A., Wojcik, J., Gilbreth, R. N., Hoey, R. J., Koide, S. Teaching an old scaffold new tricks: monobodies constructed using alternative surfaces of the FN3 scaffold. J Mol Biol. 415 (2), 393-405 (2012).
  18. Hackel, B. J., Kapila, A., Wittrup, K. D. Picomolar affinity fibronectin domains engineered utilizing loop length diversity, recursive mutagenesis, and loop shuffling. J Mol Biol. 381 (5), 1238-1252 (2008).
  19. Traxlmayr, M. W., et al. Strong enrichment of aromatic residues in binding sites from a charge-neutralized hyperthermostable Sso7d scaffold library. J Biol Chem. 291 (43), 22496-22508 (2016).
  20. Zajc, C. U., et al. A conformation-specific ON-switch for controlling CAR T cells with an orally available drug. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (26), 14926-14935 (2020).
  21. Moore, S. J., Cochran, J. R. Engineering knottins as novel binding agents. Methods Enzymol. 503, 223-251 (2012).
  22. Hackel, B. J., Ackerman, M. E., Howland, S. W., Wittrup, K. D. Stability and CDR composition biases enrich binder functionality landscapes. J Mol Biol. 401 (1), 84-96 (2010).
  23. Hackel, B. J., Wittrup, K. D. The full amino acid repertoire is superior to serine/tyrosine for selection of high affinity immunoglobulin G binders from the fibronectin scaffold. Protein Eng Des Sel. 23 (4), 211-219 (2010).
  24. Laurent, E., et al. Directed evolution of stabilized monomeric CD19 for monovalent CAR interaction studies and monitoring of CAR-T cell patients. ACS Synth Biol. 10 (5), 1184-1198 (2021).
  25. Julian, M. C., et al. Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies. Protein Eng Des Sel. 28 (10), 339-350 (2015).
  26. Cochran, J. R., Kim, Y. S., Lippow, S. M., Rao, B., Wittrup, K. D. Improved mutants from directed evolution are biased to orthologous substitutions. Protein Eng Des Sel. 19 (6), 245-253 (2006).
  27. Kieke, M. C., et al. High affinity T cell receptors from yeast display libraries block T cell activation by superantigens. J Mol Biol. 307 (5), 1305-1315 (2001).
  28. Lipovsek, D., et al. Selection of horseradish peroxidase variants with enhanced enantioselectivity by yeast surface display. Chem Biol. 14 (10), 1176-1185 (2007).
  29. Fushimi, T., et al. Mutant firefly luciferases with improved specific activity and dATP discrimination constructed by yeast cell surface engineering. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (9), 4003-4011 (2013).
  30. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Park, S. W., Lee, D. S., Kim, Y. S. Engineering a U-box of E3 ligase E4B through yeast surface display-based functional screening generates a variant with enhanced ubiquitin ligase activity. Biochem Biophys Res Commun. 612, 147-153 (2022).
  32. Schutz, M., et al. Directed evolution of G protein-coupled receptors in yeast for higher functional production in eukaryotic expression hosts. Sci Rep. 6, 21508(2016).
  33. Angelini, A., et al. Protein engineering and selection using yeast surface display. Methods Mol Biol. 1319, 3-36 (2015).
  34. Chen, T. F., de Picciotto, S., Hackel, B. J., Wittrup, K. D. Engineering fibronectin-based binding proteins by yeast surface display. Methods Enzymol. 523, 303-326 (2013).
  35. Shusta, E. V., Holler, P. D., Kieke, M. C., Kranz, D. M., Wittrup, K. D. Directed evolution of a stable scaffold for T-cell receptor engineering. Nat Biotechnol. 18 (7), 754-759 (2000).
  36. Traxlmayr, M. W., Obinger, C. Directed evolution of proteins for increased stability and expression using yeast display. Arch Biochem Biophys. 526 (2), 174-180 (2012).
  37. Traxlmayr, M. W., Shusta, E. V. Directed evolution of protein thermal stability using yeast surface display. Methods Mol Biol. 1575, 45-65 (2017).
  38. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI Job Dispatcher sequence analysis tools framework in 2024. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W521-W525 (2024).
  39. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  40. Chao, G., et al. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. VanAntwerp, J. J., Wittrup, K. D. Fine affinity discrimination by yeast surface display and flow cytometry. Biotechnol Prog. 16 (1), 31-37 (2000).
  42. McConnell, A. D., et al. A general approach to antibody thermostabilization. MAbs. 6 (5), 1274-1282 (2014).
  43. Pavoor, T. V., Wheasler, J. A., Kamat, V., Shusta, E. V. An enhanced approach for engineering thermally stable proteins using yeast display. Protein Eng Des Sel. 25 (10), 625-630 (2012).
  44. Chen, I., Dorr, B. M., Liu, D. R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11399-11404 (2011).
  45. Traxlmayr, M. W., et al. Construction of a stability landscape of the CH3 domain of human IgG1 by combining directed evolution with high throughput sequencing. J Mol Biol. 423 (3), 397-412 (2012).
  46. Chao, G., Cochran, J. R., Wittrup, K. D. Fine epitope mapping of anti-epidermal growth factor receptor antibodies through random mutagenesis and yeast surface display. J Mol Biol. 342 (2), 539-550 (2004).
  47. Stern, L. A., et al. Cellular-based selections aid yeast-display discovery of genuine cell-binding ligands: Targeting oncology vascular biomarker CD276. ACS Comb Sci. 21 (3), 207-222 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flow CytometryMagnetic Bead SelectionAntigen BindingProtein Variant LibraryAffinity MaturationSurface ExpressionNegative SelectionAntibody Staining

Gerelateerde artikelen