Dit protocol biedt een richtlijn voor het waterdicht maken van de huid met cyanoacrylaat om opname van urine door vacht en huid te voorkomen. Het bevat instructies voor het aanbrengen van de lijm op de huid, het implanteren van een blaaskatheter en elektroden voor cystometrie en elektromyografie-opnamen van externe urethrale sluitspier bij wakkere muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimalisatie van urodynamische technieken van muizen voor verbeterde nauwkeurigheid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nauwkeurige meting van urineparameters bij wakkere muizen is cruciaal voor het begrijpen van disfunctie van de lagere urinewegen (LUT), met name bij aandoeningen zoals posttraumatisch ruggenmergletsel (SCI) van de neurogene blaas. Het uitvoeren van cystometrie-opnames bij muizen brengt echter opmerkelijke uitdagingen met zich mee. Wanneer muizen zich tijdens opnamesessies in een liggende en beperkte positie bevinden, heeft urine de neiging om door de vacht en huid te worden geabsorbeerd, wat leidt tot een onderschatting van het geledigde volume (VV). Het doel van deze studie was om de nauwkeurigheid van cystometrie en externe urethrale sluitspierelektromyografie (EUS-EMG) bij wakkere muizen te verbeteren. We hebben een unieke methode ontwikkeld met behulp van cyanoacrylaatlijm om een waterdichte huidbarrière rond de urethrale meatus en buik te creëren, waardoor urineabsorptie wordt voorkomen en nauwkeurige metingen worden gegarandeerd. De resultaten tonen aan dat na het aanbrengen van het cyanoacrylaat de som van VV en RV consistent bleef met het geïnfuseerde zoutoplossingvolume en dat er na het experiment geen natte gebieden werden waargenomen, wat wijst op een succesvolle preventie van urineabsorptie. Bovendien stabiliseerde de methode tegelijkertijd de elektroden die verbonden waren met de externe urethrale sluitspier (EUS), zorgde voor stabiele elektromyografie (EMG) -signalen en minimaliseerde artefacten veroorzaakt door de beweging van de ontwaakte muis en manipulatie van de experimentator. Methodologische details, resultaten en implicaties worden besproken, waarbij het belang van het verbeteren van urodynamische technieken in preklinisch onderzoek wordt benadrukt.
Inleiding
De opslag en afgifte van urine zijn afhankelijk van de gecoördineerde activiteit van de urineblaas en de externe urethrale sluitspier (EUS). Bij sommige pathologieën, zoals de neurogene blaas, kunnen zowel de detrusorspieren van de blaas als de sluitspier disfunctioneel worden, wat leidt tot aanzienlijke blaasproblemen, vooral na traumatisch ruggenmergletsel1.
Kleine knaagdieren worden vaak gebruikt als experimenteel model om de preklinische functie van de lagere urinewegen (LUT) te bestuderen2. Registratietechnieken voor vulcystommetrie (FC) en EUS-elektromyografie (EUS-EMG) kunnen nauwkeurige objectieve informatie opleveren, afhankelijk van de keuze van de methoden, nauwkeurige metingen en interpretatie van de resultaten3. Urodynamische tests worden vaak gebruikt om het ledigingsvolume (VV), de mictie-efficiëntie (VE) en de blaascapaciteitte evalueren 4. VE meet hoe effectief de blaas zichzelf kan legen. Het wordt berekend door het geledigde volume te delen door de som van de geledigde en resterende volumes (VV+RV). Aan de andere kant wordt de blaascapaciteit berekend door de VV (de hoeveelheid urine die tijdens het plassen wordt uitgestoten) op te tellen bij de RV (de hoeveelheid urine die na het plassen in de blaas achterblijft)5. Daarom zijn de meting van VV en RV de sleutels tot het afleiden van andere parameters.
Het nauwkeurig meten van VV bij muizen tijdens urodynamische tests brengt verschillende uitdagingen met zich mee. De urine van knaagdieren, wanneer fysiek in buikligging in bedwang gehouden, heeft de neiging om door de ventrale buikwand naar beneden te worden getrokken als gevolg van de invloed van de zwaartekracht6. Dit fenomeen kan leiden tot de opname van urine door de buikvacht en -huid, wat op zijn beurt het volume van de uitgescheiden urine onderschat. Gezien de kleine hoeveelheid urine die door muizen wordt geproduceerd, is de impact van deze absorptie op de nauwkeurigheid van de resultaten nog meer uitgesproken7. Bovendien is VV in modellen van SCI vaak lager dan bij normale muizen vanwege de impact van de dyssynergie van de detrusorsluitspierdyssynergie (DSD), die het risico op lekpuntdruk en urineabsorptie door de vacht verhoogt8. Deze factoren hebben een aanzienlijke invloed op de resultaten. Daarom is nauwkeurige meting van VV en RV tijdens terminale urodynamische studies bij muizen cruciaal9. Momenteel is er een gebrek aan details in de methodologieën in de gepubliceerde literatuur over hoe het urinevolume nauwkeurig kan worden gemeten in muismodellen.
Cyanoacrylaatlijm is een type lijm dat vaak wordt gebruikt bij chirurgische ingrepen in mens- en diermodellen vanwege de snelle en effectieve hechtingseigenschappen 10,11,12. Deze lijm is vooral handig voor het sluiten van wonden en snijwonden, omdat het een sterke en flexibele verbinding vormt wanneer het op de huid wordt aangebracht13. Bovendien kan het een grote barrière zijn tegen urine en nattigheid die in contact kunnen komen met vacht en wonden11.
In dit artikel hebben we een nieuwe en kosteneffectieve techniek ontwikkeld die gebruik maakt van cyanoacrylaatlijm om nauwkeurige resultaten te bereiken bij cystometrie en EUS-EMG-opnames bij wakkere muizen. Deze methode zal nuttig zijn bij het begrijpen van de onderliggende oorzaken van blaasdisfunctie en het bedenken van effectievere behandelingen voor LUT-stoornissen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor dieronderzoek is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University School of Medicine. Goedkeuringscode: 21098MD/R/MSS/HZ Goedkeuringsdatum: 29 september 2021.
1. Voorbereiding van de katheter
- Snijd een 30 cm polyethyleen PE-30 buis (.017 inch x .030 inch). Gebruik een aansteker om het ene uiteinde van de buis af te fakkelen, zorg ervoor dat het de vlam niet raakt, en trek de aansteker terug zodra de buis een geschikte ronde, klokvormige punt heeft gevormd.
- Steek voorzichtig ongeveer 3/4 van de 25G-naald in het andere uiteinde van de buis. Bereid een spuit van 1 ml voor en vul deze met steriel 0,9% NaCl. Sluit de spuit aan op de 25 G-naald.
- Voeg de zoutoplossing voorzichtig toe om te controleren of de naald goed is en of er geen lekkage uit de uiteinden van de naald komt. Zorg ervoor dat er geen druk wordt gevoeld en dat de zoutoplossing soepel door de katheter stroomt.
2. Voorbereiding van elektroden
- Bereid 2 staaldraden van 20 cm lang voor. Neem de staaldraden en breng zandpolijstmiddel aan op beide uiteinden van de coatingzone om 5 mm van de draad te strippen.
- Neem een naald van 25G en steek deze aan één kant van de draad in. Zorg ervoor dat u de naald voorzichtig inbrengt om beschadiging van de draad te voorkomen. Buig het gestripte deel van de draad als een haak. De haak helpt om de draad met de EUS-spier te verbinden.
- Gebruik soldeer om de pin aan het andere uiteinde van de gestreepte draad te bevestigen. Solderen helpt de pen aan de draad te bevestigen en zorgt voor een sterke verbinding. Zorg ervoor dat u het tin-lood solderen verwarmt totdat het smelt en de draad en pen bedekt.
3. Voorbereiding van het dier
- Huisvrouwtje C57BL/6 muis (8 weken oud, 18-20 g lichaamsgewicht) in de dierenfaciliteit volgens Institutional Animal Care met een licht-donkercyclus van 12 uur en onbeperkte toegang tot water en standaard voerkorrels.
4. Anesthesie tijdens de operatie
- Plaats de dieren in een kamer van 2% isofluraan en zuivere zuurstof (1 l/min). Bevestig de volledige anesthesie van het dier met behulp van een negatief teenknijponderzoek voordat u het op het masker overbrengt. Eenmaal bevestigd, verandert u de gasconditie in een masker.
- Zorg ervoor dat het anesthesiemasker op de juiste plaats op het steriele operatieveld is bevestigd. Leg het dier op de rug op het steriele laken met de neus in een klein inhalatiemasker (0,8-1 l/min met 2% isofluraan) om de anesthesie te blijven toedienen.
5. Chirurgische voorbereiding
- Bevestig de ledematen van het dier met tape. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht van de onderbuik en rond de urethrale meatus (genitale regio) te scheren.
- Breng een oogzalf aan om mogelijke uitdroging van de ogen te voorkomen. Bereid het geschoren gebied voor met de povidon-jodiumoplossing en veeg de oplossing weg met 70% ethanol. Leg een steriel laken op het operatiegebied.
6. Chirurgische ingreep
- Implantatie van een blaaskatheter
- Maak onder de chirurgische microscoop met behulp van een rechte, botte schaar van Metzenbaum een incisie van 1-2 cm in de middellijn van de buikvlieshuid. Ga verder met het insnijden van de fascia en spieren in de middellijn om de blaas bloot te leggen via de incisiewond.
- Zodra de blaas zichtbaar is door de incisiewond, gaat u verder met het terugtrekken van alle omliggende organen of weefsels indien nodig om een duidelijk zicht op het operatieveld te krijgen. Zorg ervoor dat u onnodige manipulatie of spanning op de blaas vermijdt, omdat dit kan leiden tot complicaties zoals urineverlies of letsel aan omliggende structuren.
- Pak de blaaskoepel vast en plaats een taskoord met behulp van een 5-0 niet-resorbeerbare monofilamenthechting met een taps toelopende naald.
- Maak met een microschaar een kleine cystostoma in het koord van de tas en maak een gat totdat de urine eruit stroomt.
- Pak de ronde punt van de katheter vast en steek deze door het gat. Zodra de punt van de buis door het gat is gegaan, hecht u het taskoord om de buis. Trek vervolgens de buis voorzichtig naar buiten totdat de punt onder de hechting wordt gevoeld.
- Laat langzaam 1 ml zoutoplossing trekken vanaf het andere uiteinde van de buis om de blaas uit te zetten. Controleer op eventuele lekkage rond de katheter. Als er lekkage aanwezig is, plaats dan een extra hechtdraad.
- Zodra de zoutoplossing uit de urethra komt, trekt u de zoutoplossing terug om de blaas te decomprimeren.
- Implantatie van EUS-elektroden (Figuur 1)
- Gebruik een chirurgische schaar om de incisie in de buik te verlengen tot aan de bekkenbodem.
- In lijn met de blaas verplaats je de spieren en vliezen naar de pudenduskanalen en lokaliseer je de urethra en de externe sluitspier. Pas op dat u de darmbeen- en middelste staartvaten en pudenduszenuwen niet beschadigt.
- Prik bilateraal in de huid, op 1 cm afstand van de urethrale meatus, met behulp van de naald met de elektrode.
- Pak de punt van de haak voorzichtig met een pincet vast en trek de naald voorzichtig weg van de huid.
- Haak de EUS-spier met de punt van de elektrode voorzichtig bilateraal vast. Vermijd te diep te stoten, omdat dit de spier kan beschadigen, wat kan leiden tot mogelijk urineverlies.
- Gebruik het 3-0 niet-resorbeerbare monofilament om de bekken- en buikspieren en de huid te hechten.
- Waterdicht maken van de huid
- Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op de huid waar de elektroden uitkomen om de elektroden op hun plaats te bevestigen.
- Breng de cyanoacrylaatlijm aan op 1 cm afstand rond de urethrale meatus en 3 cm verder uitstrekkend tot aan de buik en het gehechte gebied. Om contact met de lijm te voorkomen, houdt u de meatus voorzichtig omhoog met een pincet.
- Gebruik een micropipet van 0,5-10 μl om de versnellervloeistof op te zuigen om de lijm te drogen.
LET OP: Versnellervloeistof is een brandbare vloeistof. - Voeg de versnellervloeistof toe om een goede hechtingsreactie te garanderen. Dit zal helpen om de lijm sneller te drogen en ervoor te zorgen dat deze stevig vastzet.
- Urodynamisch preparaat
- Bereid een omgekeerde polystyreen weegboot voor met een lengte, breedte en diepte van 4,5 cm. Snijd het in een driehoekige vorm met een basis van 4 cm om de urethra meatus van de muis in deze ruimte te plaatsen. Zet de wegwerpbasisvorm, 37 mm x 24 mm x 5 mm, onder de ruimte voor het opvangen van de urine.
- Plaats de muis terug in buikligging en verplaats hem voorzichtig op een op maat gemaakte plaat die is uitgerust met een gasmasker.
- Zorg ervoor dat de urethrale meatus goed in de groef is geplaatst. Houd het hoofd en de ledemaat van de muis voorzichtig vast met tape en plaats de plaat op een verwarmingskussen totdat de muis weer volledig bij bewustzijn is (Figuur 2).
- Voer cystometrie alleen uit als de muis volledig wakker is, dat is ten minste 40 minuten na herstel van de anesthesie.
7. Voorbereiding van cystomametrie en EUS-EMG-registratie
- Stel de infuuspomp in en kalibreer deze volgens de instructies van de fabrikant.
- Neem een spuit van 20 ml met een diameter van 19,05 mm en vul deze met steriel 0,9% NaCl op kamertemperatuur. Bevestig de spuit aan de infuuspomp. Stel de infusiesnelheid in op 0,01 ml/min.
- Sluit de spuit via de PE-30-slang aan op één kant van de driewegconnector. Sluit de blaaskatheter aan de andere kant aan op een drukopnemer. Voordat u de blaaskatheter aansluit, moet u ervoor zorgen dat u alle luchtbellen verwijdert.
- Bevestig de drukopnemer op hetzelfde niveau als de muisblaas. De drukopnemer is via een versterker aangesloten op het data-acquisitiesysteem.
- Bevestig de ene aardingslijnhaak aan de huid en de andere aan de plaatsen van de elektrodeconnector. Noteer de druk in de software.
- Controleer na het starten van de software de intravesicale druk (IVP) en EUS-EMG-signalen. Sla de naam van het monster op en stel de tijd in.
- Start de pompinfusie. Neem de signalen op.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cystommetrie en EUS-EMG-activiteitstracering werden gebruikt om de gegevens te analyseren. De continue cystometriemethode omvat het inspuiten van zoutoplossing in de blaas en het gelijktijdig meten van de druk- en volumeveranderingen in de blaas. Om VV te meten, werd 0,4 ml zoutoplossing toegediend met een snelheid van 0,01 ml/min en werd urine gedurende 40 minuten in een dop verzameld. Het residu na de urinelozing (PVR) kan worden verkregen door de zoutoplossing door de katheter op te zuigen. Bij normale muizen zonder l...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze urodynamische techniek beschrijft een verbeterde procedure voor het meten van het urinevolume en het EUS-EMG-signaal bij wakkere en ingetogen muizen. De aanwezigheid van vacht rond de urethrale meatus en de buikstreek kan de nauwkeurigheid van de VV-meting verstoren door urine te absorberen. Hoewel de vacht rond de urethrale meatus en de buik vóór de operatie zorgvuldig was geschoren, absorbeerden de resterende kleine vachten in deze gebieden en de huid nog steeds urine, waardoor er meestal een nat gebied in de buik...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door NIH-NINDS (R21NS130241), IND DEPT HLTH (55051, 74247, 74244) en US ARMY (HT94252310700).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accelerator | BOB SMITH INDUSTRIES | BSI-152 | |
| Cyanoacrylate | TED PELLA, Inc | 14478 | |
| Disposable base mold | TED PELLA, Inc | 27147-4 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus PHD ULTRA | 70-3006 | |
| Isoflurane | Henry Schein Inc | 1182097 | |
| PIN | World Precision Instruments | 5482 | |
| Polyethylene Tubing 30 | Braintree Scientific Inc | PE30 | |
| Sterile Weighing Boat | HEATHROW SCIENTIFIC | 797CK2 | |
| Windaq/Lite | DATAQ INSTRUMENTS | 249022 |
Referenties
- Leslie, S. W., Tadi, P., Tayyeb, M. Neurogenic bladder and neurogenic lower urinary tract dysfunction. Statpearls. , (2024).
- Doelman, A. W., Streijger, F., Majerus, S. J., Damaser, M. S., Kwon, B. K. Assessing neurogenic lower urinary tract dysfunction after spinal cord injury: Animal models in preclinical neuro-urology research. Biomedicines. 11 (6), 1539(2023).
- Fraser, M. O., et al. Best practices for cystometric evaluation of lower urinary tract function in muriform rodents. Neurourol Urodyn. 39 (6), 1868-1884 (2020).
- Hashimoto, M., et al. Sex differences in lower urinary tract function in mice with or without spinal cord injury. Neurourol Urodyn. 43 (1), 267-275 (2024).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury-a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Lee, J., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. Int Urogynecol J. 14, 31-37 (2003).
- Mann-Gow, T. K., et al. Evaluating the procedure for performing awake cystometry in a mouse model. J Vis Exp. (123), e55588(2017).
- Saito, T., et al. Time-dependent progression of neurogenic lower urinary tract dysfunction after pinal cord injury in the mouse model. Am J Physiol Renal Physioly. 321 (1), F26-F32 (2021).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, 8-15 (2015).
- Habib, A., Mehanna, A., Medra, A. Cyanoacrylate: A handy tissue glue in maxillofacial surgery: Our experience in alexandria, egypt. J Maxillofac Oral Surg. 12, 243-247 (2013).
- Sunjic Roguljic, V., Roguljic, L., Jukic, I., Kovacic, V. The influence of wound closure techniques after surgical decompression in patients with carpal tunnel syndrome on sleep disturbance and life quality: A prospective comparison of surgical techniques. Clin Pract. 14 (2), 546-555 (2024).
- Sohn, J. J., Gruber, T. M., Zahorsky-Reeves, J. L., Lawson, G. W. Comparison of 2-ethyl-cyanoacrylate and 2-butyl-cyanoacrylate for use on the calvaria of cd1 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 55 (2), 199-203 (2016).
- Ren, H., et al. Injectable, self-healing hydrogel adhesives with firm tissue adhesion and on-demand biodegradation for sutureless wound closure. Sci Adv. 9 (33), 4327(2023).
- Ito, H., Pickering, A. E., Kanai, A., Fry, C. H., Drake, M. J. Muro-neuro-urodynamics; a review of the functional assessment of mouse lower urinary tract function. Front Physiol. 8, 240395(2017).
- Abdelkhalek, A. S., Youssef, H. A., Saleh, A. S., Bollen, P., Zvara, P. Anesthetic protocols for urodynamic studies of the lower urinary tract in small rodents-a systematic review. PloS One. 16 (6), e0253192(2021).
- Saab, B. J., et al. Short-term memory impairment after isoflurane in mice is prevented by the α5 γ-aminobutyric acid type a receptor inverse agonist l-655,708. J Am Soc Anesthesiol. 113 (5), 1061-1071 (2010).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69 (10), 1193-1202 (2001).
- Weiss, D. A., et al. Morphology of the external genitalia of the adult male and female mice as an endpoint of sex differentiation. Mol Cell Endocrinol. 354 (1-2), 94-102 (2012).
- Leggat, P. A., Kedjarune, U., Smith, D. R. Toxicity of cyanoacrylate adhesives and their occupational impacts for dental staff. Ind Health. 42 (2), 207-211 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
