De studie introduceert Zebra II, een geavanceerd systeem voor langdurige ECG-acquisitie en analyse bij zebravissen. Dit systeem beschikt over een onafhankelijk perfusiesysteem en meerpuntselektroden voor het behandelen van meerdere vissen in gecontroleerde omgevingen. De acute effecten van Amiodarone werden beoordeeld en geanalyseerd met wild-type zebravissen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zebra II als een nieuw systeem om elektrofysiologische signalen bij zebravissen op te nemen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebrafish en hun mutante lijnen zijn uitgebreid gebruikt in biomedisch onderzoek, cardiovasculaire studies en geneesmiddelenscreening. In het huidige onderzoek wordt de commerciële versie van het nieuwe systeem, Zebra II, gepresenteerd. Het protocol demonstreert de verwerving en analyse van elektrocardiogram (ECG) van meerdere zebravissen in controleerbare werkomgevingen. Het apparaat bestaat uit een extern en onafhankelijk perfusiesysteem, een 4-punts elektrode, temperatuursensoren en een ingebouwd elektronisch systeem. In eerdere studies onderging het apparaatoptype validatie tegen het gevestigde iWORX-systeem via verschillende tests, waarbij vergelijkbare gegevenskwaliteit en ECG-respons op medicamenteuze interventies werden aangetoond. Hierna ging het onderzoek verder met het onderzoeken van de invloed van anesthetische geneesmiddelen en temperatuurschommelingen op het ECG van zebravissen, wat onmiddellijke gegevensevaluatie vereiste. Dankzij de capaciteit van het apparaat voor consistente aflevering van anesthetica en geneesmiddelen, was het mogelijk om de ECG-gegevensverzameling tot 1 uur te verlengen, wat aanzienlijk langer is dan de 5 minuten duur die door huidige systemen wordt ondersteund. Dit artikel introduceert een baanbrekende, cloudgebaseerde, geautomatiseerde analyse met behulp van gegevens van vier zebravissen, wat een efficiënte methode biedt voor het uitvoeren van combinatie-experimenten en een aanzienlijke vermindering van tijd en moeite. Het systeem bleek effectief te zijn in het vastleggen en analyseren van ECG, met name bij het detecteren van door geneesmiddelen veroorzaakte aritmieën bij wild-type zebravissen. Bovendien maakte de mogelijkheid om gegevens over meerdere kanalen te verzamelen de uitvoering van gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken met zebravismodellen mogelijk. Het ontwikkelde ECG-systeem overwint bestaande beperkingen en toont het potentieel om de ontdekking van geneesmiddelen en cardiovasculair onderzoek met zebravissen aanzienlijk te versnellen.
Inleiding
Hart- en vaatziekten (CVZ) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Volgens het AHA-updaterapport van 2024 sterven er dagelijks ongeveer 2552 mensen aan CVZ in de VS, en de gemiddelde directe en indirecte kosten van CVZ werden geschat op $378,0 miljard in 2017-20181. Atriumfibrilleren (AF) is een van de meest voorkomende hartritmestoornissen in de VS2 en wordt geassocieerd met een ongunstige prognose, waardoor het risico op een beroerte en overlijden in zowel CVZ- als niet-hart- en vaatziektenscenario's toeneemt, wat leidt tot een verhoogd risico op nadelige uitkomsten3. Dit type hartritmestoornis onderscheidt zich door snelle en onregelmatige elektrische activiteit in de atria, wat meestal resulteert in een snelle en onregelmatige ventriculaire ritme4. Verder is er, gezien de recente gebeurtenissen rondom COVID-19, een toename van studies en bewijs dat een verhoogde verschijning van hartritmestoornissen in verband met COVID-19 laat zien, meestal sinusbradycardie5. Aan de andere kant van AF presenteert sinusbradycardie een verlaagde en langzamere hartslag, met een hartslag lager dan 60 slagen per minuut (bpm). Voor deze diagnose is een elektrocardiogram (ECG) vereist dat een normale sinusritme toont bij een snelheid lager dan 60 bpm.
De zebravis, Danio rerio, heeft zich bewezen als een ideaal model voor onderzoek naar hart- en vaatziekten en voor het ontwikkelen van medicijnen vanwege zijn homologie met de mens in zowel morfologie, fysiologie als genetica6,7. Ondanks dat de zebravis slechts twee onderscheidbare kamers heeft in vergelijking met de vierkamerige hart bij de mens, bezit de zebravis een vergelijkbare contractiele structuur met een analoog geleidingssysteem8,9. Daarom is het zebravismodel geschikt voor het onderzoeken van hartritmestoornissen en het onderzoeken van de associatie tussen gerelateerde genetische paden en elektrofysiologische kenmerken door ECG-analyse. Wat betreft het sensorontwerp voor ECG-opname bij zebravissen, worden conventionele naaldelektroden vaak gebruikt10. Andere onderzoeken presenteerden alternatieven voor conventionele naalden door een ander type naald te ontwerpen gemaakt van verschillende materialen11, deze bevatten materialen zoals wolfraamfilament, roestvrij staal en zilverdraad om de kwaliteit van de geregistreerde gegevens te beoordelen. Samen met de draagbare ECG-kit, probeerden ze een universele platform te vestigen voor zowel onderzoeks- als educatieve laboratoria.
Het naaldsysteem werd ook in andere onderzoeken ingezet11,12,13,14 voor het uitvoeren van onderzoek naar biologische en/of door geneesmiddelen geïnduceerde effecten, waarbij het bemoedigende resultaten toonde. Om optimale signalen te verkrijgen, was het echter noodzakelijk om de naalden zorgvuldig door de dermis van de zebravis te steken. Deze invasieve procedure kan schade veroorzaken aan het hart van de vis vanwege de scherpte van de naalden, waardoor mogelijk de signaalmorfologie verandert13. Bovendien stelt het nauwkeurig plaatsen van de elektrode op het kleine hart zonder schade toe om een duidelijke ECG-opname te garanderen, een aanzienlijke leercurve. Bijgevolg zijn er verschillende alternatieve sondesystemen geïntroduceerd, zoals micro-elektrodenarrays (MEA) en 3D-geprinte sensoren. Zowel ons team als andere onderzoekers hebben met succes MEA gebruikt voor dataverzameling, waarbij data zijn verkregen die een goede signaal-ruisverhouding (SNR) bieden, samen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie15,16,17. Bijvoorbeeld, introduceerden we een MEA die het hart van de vis omhult, waardoor het mogelijk is om locatiespecifieke ECG-signalen vast te leggen15,16. In tegenstelling hiermee ontwikkelde een ander team een ander type MEA op basis van een flexibele gedrukte circuitbord (FPCB) gemaakt van polyimidefilm, gericht op het opnemen van meerdere elektro-encefalogrammen (EEG's) voor epilepsieonderzoek18. Terwijl MEA's het opnemen van talrijke signalen mogelijk maken, zijn ze beperkt door de capaciteit om slechts één vis tegelijk te beoordelen vanwege het beperkte aantal elektrodenkanalen. Als reactie op deze beperking hebben we onlangs een geavanceerd systeem geïntroduceerd dat in staat is tot gelijktijdige ECG-opnamen van meerdere vissen19. Dit systeem gebruikt twee elektroden, elk 125 µm dik en gemaakt van polyimide, met goud-gespoten elektroden gepositioneerd aan de onderkant van hun behuizing om gegevensverzameling te vergemakkelijken. Echter, de opname van een watercirculatiepomp introduceerde ruis, wat de signaal-ruisverhouding (SNR) kwaliteit van de ECG-signalen beïnvloedde. Bovendien was het gebruik van omvangrijke en dure dataverzamelingshulpmiddelen noodzakelijk, die een bekabelde verbinding met een computer vereisten. Op de markt bieden systemen zoals iWORX verbeterde draagbaarheid door een compacte versterker, maar ze staan voor onopgeloste problemen: (i) hun opnametijd is te kort (3-5 min) voor experimenten die langere duur nodig hebben, zoals die met acute geneesmiddeleffecten; (ii) de vereiste voor anesthesie van de dieren, wat hen kan stressen en intrinsiek cardiaal elektrofysiologisch data kan vervormen; (iii) handmatige, sequentiële metingen belemmeren onderzoek met grote aantallen vissen; en (iv) de noodzaak voor offline, arbeidsintensief ECG-gegevensverwerking
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Strikt volgens de ethische richtlijnen zorgen voor het welzijn en de juiste behandeling van de zebravissen die betrokken zijn bij onze experimenten. Alle experimentele activiteiten werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen vastgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC). De experimenten en bevindingen die hier worden beschreven, werden uitgevoerd met de goedkeuring van IACUC onder het geautoriseerde protocol AUP-21-066.
1. Voorbereiding en opslag van stamoplossingen
VOORSICHT: Bereid de tricaine stamoplossing voor in een afzuigkap en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
- Meet 400 mg tricainepoeder af en los het op in 97,9 mL gedeïoniseerd (DI) water. Plaats een magnetische roerder in de container en meng de oplossing geleidelijk.
- Pas de pH aan door incrementeel minder dan 17 mL NaOH-oplossing toe te voegen. Blijf NaOH druppels toevoegen tot de pH een bereik van 6,8.-7,2 bereikt.
- Bepaal de uiteindelijke concentratie van tricaine-oplossing, rekening houdend met de toegevoegde NaOH die nodig is om de pH aan te passen en op te slaan.
OPMERKING: Tricaine-oplossing is lichtgevoelig en moet worden bewaard in een amberkleurig container bij 4 °C wanneer het niet in gebruik is. - Meet 258,13 mg Amiodarone af en los het op in 1 L DI water. Plaats een magnetische roerder in de container en roer een paar minuten totdat de oplossing volledig is opgelost en vrij is van elk poeder. Bewaar de oplossing in een koelkast bij 4°C wanneer het niet in gebruik is.
OPMERKING: Amiodarone moet worden bereid in een afzuigkap en opgeslagen in een koelkast bij 4 °C. Draag altijd de juiste PBM.
2. Vishouderij
- Houd de vissen in individuele tanks die zijn verbonden met een circu-lerend watersysteem, waarbij de temperatuur tussen de 28-29°C wordt gehouden.
- Zorg voor continue monitoring van de waterkwaliteit en houd u aan een cyclus van 14 uur dag/10 uur nacht.
- Verdeel de 40 vissen in vier groepen, elk bestaande uit 10 vissen, en huisvest ze in aparte tanks.
3. Instellen van het apparaat
OPMERKING: De procedure die in stap 3.2 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd voor elke kamer van het apparaat (Figuur 1). Hoewel elke kamer anders kan worden ingesteld, is het voor consistentie in het experiment raadzaam om uniforme instellingen over alle kamers te handhaven.
- Verbind het apparaat met een stroombron en start de werking door op de Rode Knop op het voorpaneel te drukken.
- Navigeer via het touchscreen van het apparaat om de te configureren kamer te kiezen.
- Stel de instelling van de laagdoorlaatfilter in op 0,1 Hz en de instelling van de hoogdoorlaatfilter in op 500 Hz. Pas de versterkingsinstelling aan naar 10.000.
- Til de voorklep op om toegang te krijgen tot de vier kamers. Voordat u het experiment start, dompelt u de spons (standaard cellulosespons) van elke kamer onder in tricaine-oplossing en perst u eventueel overtollig vocht eruit.
- Draai de vier-elektroden array zodat de spons toegankelijk is voordat u de vissen introduceert.
4. Amiodarone behandeling
OPMERKING: Gebruik het water uit de vistanks (viswater) om verdunde oplossingen van Amiodarone en Tricaine te bereiden. Stappen 4.3 en 4.4 moeten worden herhaald voor elke groep die in stap 2.3 is gescheiden voor elke oplossing die in stap 4.1 is bereid.
- Volg de onderstaande stappen om de Amiodarone stamoplossing te verdunnen.
- Verdun 8,75 mL stamoplossing in 41,25 mL viswater om een concentratie van 70 µM te bereiken.
- Verdun 12,5 mL stamoplossing in 37,5 mL viswater om een concentratie van 100 µM te bereiken.
- Verdun 25 mL stamoplossing in 25 mL viswater om een concentratie van 200 µM te bereiken.
- Bereid de anesthesieoplossing voor door 4 mL tricaine stamoplossing te verdunnen in 100 mL viswater, resulterend in een tricaineconcentratie van 0,16 mg/mL
- Dompel elke vis individueel gedurende 5 minuten in de bereide Amiodarone-oplossing. Gebruik timers om de onderdompelingsduur nauwkeurig te bewaken.
- Breng de vis over in tricaineoplossing gedurende 2-3 minuten voor anesthesie. Zorg ervoor dat de behandeling de dood van de vis niet veroorzaakt. Als een vis abnormaal gedrag vertoont, zoals kleurverlies of een significante vermindering van kieuwbeweging, verwijder deze onmiddellijk uit de oplossing en plaats hem terug in schoon viswater.
5. ECG gegevensverzameling
OPMERKING: Volg onmiddellijk deze instructies na het voltooien van stap 4.4. Herhaal het proces voor elke kamer voordat u het apparaat afsluit. De kamers zijn ontworpen om vissen te huisvesten met een breedte van 4-10 mm en een lengte van 25-50 mm.
- Til de vis uit de tricaineoplossing en plaats hem op de spons, ervoor zorgen dat de buikzijde naar boven wijst.
- Plaats de elektrodenarray in een ruitvorm over de borststreek van de vis om ECG-signalen vanuit vier verschillende punten gelijktijdig te vangen (Figuur 2A,B). Zorg ervoor dat u elke elektrode zorg
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De mogelijkheid om gelijktijdig ECG-signalen van meerdere vissen vast te leggen onderscheidt dit apparaat aanzienlijk, wat een aanzienlijk voordeel biedt in het verminderen van de tijd die nodig is voor medicijn- of hartonderzoek bij zebravissen of andere soortgelijke soorten (Figuur 1). Het vastleggen van nauwkeurige ECG-signalen kan uitdagend zijn vanwege de anatomische variaties tussen vissen, vooral wat betreft de plaatsing van de elektroden. Traditioneel vereist het verkrijgen van een d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De huidige stappen werden aangepast en verbeterd volgens deze nieuwe apparaatversie van een eerder onderzoek door ons team20. Hierbij is ook een gelabelde computer-aided design (CAD) van het apparaat opgenomen.
Zoals gemarkeerd in de probleemoplossingsgids van het protocol, vereist het apparaat dat de gebruiker bepaalde cruciale stappen met zorgvuldigheid en precisie uitvoert, aangezien deze stappen van cruciaal belang zijn voor de kwaliteit van het ECG-signaal. In over...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Hung Cao en Michael Lau zijn de oprichters van Sensoriis, Inc. Het systeem Zebra II van Sensoriis is ontwikkeld met ondersteuning van de NIH, SBIR Phase II grant #R44OD024874. De Universiteit van Californië, Irvine, heeft de relatie van Hung Cao met Sensoriis, Inc. beoordeeld en goedgekeurd in overeenstemming met haar beleid inzake belangenverstrengeling. De andere auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de steun van de NIH SBIR Phase II #R44OD024874 aan H.C. en M.P.H.L. De auteurs willen ook de financiële steun bedanken die is verstrekt door de Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) in Mexico via de beurs genaamd Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Amiodarone Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | Amiodarone poeder |
| Benchtop pH/mV Meter | Sper Scientific | 10500308 | |
| Ethyle3-Aminobenzoate, Methanesulfonic Acid Salt, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | Tricaine poeder |
| Isotemp Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | SP88854200 | |
| Zebra II System | Sensoriis | N/A | Commercieel Zebrafish ECG-opnamesysteem |
| Zebrafish ECG System | iWorx | ZS-200 | Commercieel Zebrafish ECG-opnamesysteem |
Referenties
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American heart association. Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).
- Zulkifly, H., Lip, G. Y. H., Lane, D. A. Epidemiology of atrial fibrillation. Int J Clin Pract. 72 (3), e13070(2018).
- Ferreira, C., Providência, R., Ferreira, M. J., Gonçalves, L. M. Atrial fibrillation and non-cardiovascular diseases: A systematic review. Arq Bras Cardiol. 105 (5), 519-526 (2015).
- Hu, Z., Ding, L., Yao, Y. Atrial fibrillation: mechanism and clinical management. Chin Med J. 136 (22), 2668-2676 (2023).
- Babapoor-Farrokhran, S., Rasekhi, R. T., Gill, D., Babapoor, S., Amanullah, A. Arrhythmia in COVID-19. SN Comp Clin Med. 2 (9), 1430-1435 (2020).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Koopman, C. D., et al. The zebrafish grime mutant uncovers an evolutionarily conserved role for Tmem161b in the control of cardiac rhythm. Proc Natl Acad Sci. 118 (9), e2018220118(2021).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. , Springer International Publishing. (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 161-171 (2010).
- Sun, P., et al. Micro-electrocardiograms to study post-ventricular amputation of Zebrafish heart. Ann Biomed Engg. 37 (5), 890-901 (2009).
- Lin, M. H., et al. Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish. Sci Rep. 8 (1), 15986(2018).
- Chaudhari, G. H., Chennubhotla, K. S., Chatti, K., Kulkarni, P. Optimization of the adult zebrafish ECG method for assessment of drug-induced QTc prolongation. J Pharmacol Toxicol Methods. 67 (2), 115-120 (2013).
- Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation. Sci Rep. 6, 25073(2016).
- Stoyek, M. R., Rog-Zielinska, E. A., Quinn, T. A. Age-associated changes in electrical function of the zebrafish heart. Prog Biophys Mol Biol. 138, 91-104 (2018).
- Cao, H., et al. Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium. Integ Biol. 6 (8), 789-795 (2014).
- Lenning, M., et al. Real-time monitoring and analysis of zebrafish electrocardiogram with anomaly detection. Sensors. 18 (1), 61(2018).
- Yu, F., et al. Flexible microelectrode arrays to interface epicardial electrical signals with intracardial calcium transients in zebrafish hearts. Biomed Microdev. 14 (2), 357-366 (2012).
- Cho, S. J., et al. Zebrafish as an animal model in epilepsy studies with multichannel EEG recordings. Sci Rep. 7 (1), 3099(2017).
- Continuous electrocardiogram monitoring in Zebrafish with prolonged mild anesthesia. Le, T., et al. 42nd Ann Int Conf IEEE Engg Med Biol Soc, , 2610-2613 (2020).
- Le, T., et al. A novel wireless ECG system for prolonged monitoring of multiple zebrafish for heart disease and drug screening studies. Biosensors Bioelectron. 197, 113808(2022).
- Kouzehgar, K., Eslamian, S. Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams. Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).
- Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (1), H269-H273 (2006).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
