Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Verbetering van de resultaten van studenten met een aanpasbare cursus moleculair klonen Cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67067

⸱

15 november 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een aanpasbare Gibson Assembly moleculaire kloonmodule werd gebruikt in een cursusgebaseerd undergraduate research experience (CURE) -formaat voor studenten van laboratoriumcursussen moleculaire biologie. Beoordeling van de leerresultaten van studenten toonde een beter begrip en vertrouwen in moleculair klonen na voltooiing van de CURE, en nieuwe plasmiden werden gekloond voor onderzoek naar biosynthese van natuurlijke producten.

Samenvatting

De voortdurende vooruitgang van moleculaire biologietechnieken vereist dat curricula voor moleculaire biologie regelmatig worden verfijnd om studenten effectief voor te bereiden op de arbeidsmarkt met moderne competenties. Met name de opkomst van Gibson Assembly, een zeer aanpasbare en adaptieve moleculaire kloontechniek, heeft het landschap van moleculair klonen in tal van onderzoeksomgevingen verbeterd. Daarom hebben we een Gibson Assembly-kloonmodule gemaakt voor implementatie in een laboratoriumcursus moleculaire biologie aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo en hebben we de leerresultaten van studenten van de module geëvalueerd. Gedurende drie iteraties van de cursus namen studenten deel aan een op experimenten gebaseerd onafhankelijk project waarbij drie unieke plasmidebibliotheken werden gekloond ter ondersteuning van onderzoeksprojecten op het gebied van biosynthese van natuurlijke producten. Studenten kregen pre- en post-vragenlijsten om hun begrip van moleculair klonen en hun vertrouwen in moleculair-biologische termen en technieken te evalueren. De antwoorden van de studenten toonden een significante toename in zowel het leren van moleculaire kloonconcepten als in zelfgerapporteerd vertrouwen in moleculaire kloontermen en -technieken. Dit moduleraamwerk kan worden gegeneraliseerd om Gibson Assembly voor verschillende toepassingen te onderwijzen, waardoor instructeurs een toolkit krijgen voor het aanleren van een aanpasbare en opkomende kloontechnologie terwijl ze hun onderzoeksprojecten bevorderen.

Inleiding

Het opleiden van studenten in fundamentele moleculaire biologieconcepten en laboratoriumtechnieken is cruciaal voor hun wetenschappelijke en professionele ontwikkeling, aangezien deze methodologieën gebruikelijk zijn in verschillende onderzoeksomgevingen, waaronder de academische wereld en de industrie. Als zodanig zijn studenten in de biologie (concentratie van moleculaire en cellulaire biologie) en biochemie aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) verplicht om een laboratoriumcursus moleculaire biologie in de hogere divisie te volgen om deze onderwerpen te leren en toe te passen (CHEM / BIO 475). Er is eerder een basiscurriculum voor deze cursus ontwikkeld waarin studenten op topoisomerase gebaseerde (TOPO) klonen uitvoeren om een actine-bevattend plasmide samen te stellen dat is bereid uit een gist complementair DNA (cDNA) sjabloon1. Studenten ontwerpen experimenten op basis van vragen die authentieke onderzoekshypothesen nabootsen, waardoor ze meer vertrouwd raken met laboratoriumpraktijken en onderzoekend leren. Voortdurende vooruitgang op het gebied van moleculaire biologie vereist dat de overeenkomstige curricula worden aangepast om studenten met moderne competenties voor te bereiden op de arbeidsmarkt. Met name het gebruik van Gibson Assembly is overheersender geworden in de wetenschappelijke gemeenschap; hoewel de methode oorspronkelijk was ontwikkeld om kunstmatige chromosomen te synthetiseren2, hebben meer dan 5.000 publicaties op het moment van dit rapport verwezen naar het originele werk van Gibson et al. Gibson Assembly is uniek in vergelijking met traditionele kloonmethodologieën: het is in hoge mate aanpasbaar en kan gemakkelijk meerdere lineaire DNA-fragmenten lilateren zonder dat er restrictieplaatsen nodig zijn om de juncties te produceren. Zo zagen we de mogelijkheid om het CHEM/BIO 475-curriculum te vernieuwen om moderne moleculaire kloontechnieken op te nemen en het op onderzoek gebaseerde cursusmodel te verbeteren.

Het is vastgesteld dat onderzoekservaringen van studenten bijdragen aan een groter conceptueel inzicht, ontwikkeling van vaardigheden en doorzettingsvermogen in de wetenschap3, maar niet alle niet-gegradueerde studenten hebben de mogelijkheid om rechtstreeks deel te nemen aan een onderzoekslaboratorium. Om de uitdaging van de beperkte studentencapaciteit in onderzoekslaboratoria aan te gaan, zijn cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaringen (CURE's) ontwikkeld en gebruikt om de toegankelijkheid van wetenschap te vergroten door middel van authentiek onderzoek in de klas. Hoewel CURE's variëren in hun implementatie, zijn er gemeenschappelijke praktijken vastgesteld die de vijf principes van wetenschappelijk onderzoek aanpakken. In een goed ontworpen CURE zullen studenten 1) wetenschappelijke praktijken gebruiken, 2) samenwerken in een onderzoeksproject, 3) proberen nieuwe ontdekkingen te doen, 4) bijdragen aan werk dat relevant is buiten het klaslokaal, en 5) hypothesen en methoden opnieuw beoordelen en herzien in het geval van experimenteel falen4. Net als bij traditionele onderzoekservaringen van studenten in een laboratorium, is aangetoond dat CURE's het vertrouwen van studenten in wetenschap, wetenschappelijke vaardigheden, projecteigenaarschap en doorzettingsvermogen in wetenschap, technologie, techniek en wiskunde (STEM) versterken5. Hoewel CURE's met moleculair klonen eerder zijn gerapporteerd 6,7,8,9,10,11,12,13, zijn we niet op de hoogte van enkele die het aanpassingsvermogen van Gibson Assembly benadrukken om een bibliotheek van authentieke onderzoeksplasmiden te maken.

Hier rapporteren we een uitbreiding van het huidige, op onderzoek gebaseerde CHEM/BIO 475-curriculum aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo met twee belangrijke verbeteringen: praktische ervaring met het gebruik van Gibson Assembly en deelname van studenten aan een CURE, die originele plasmideconstructies heeft opgeleverd voor onderzoeksprojecten die worden gefinancierd door de National Science Foundation (NSF-1708919 en NSF-2300890). Gedurende drie implementaties van dit curriculum hebben studenten bijgedragen aan twee verschillende onderzoeksprojecten gericht op de biosynthese van natuurlijke producten van bioactieve moleculen geproduceerd door Actinomycetota. Natuurlijke producten bevatten vaak farmacoforen met antibiotica-, schimmelwerende en/of kankerbestrijdende activiteiten, waardoor deze kleine moleculen belangrijk zijn bij het ontdekken van geneesmiddelen en potentieel voor klinische relevantie14. Dit onderzoek vereist de oprichting van plasmidebibliotheken om onderzoek mogelijk te maken naar zowel de functie als het technische potentieel van bacteriële biosynthetische enzymen. In deze CURE ontwierpen en voerden studenten Gibson Assembly-experimenten uit om de unieke plasmidebibliotheken te klonen die relevant zijn voor deze onderzoeksprojecten (Figuur 1). Bovendien is het formaat en het ontwerp van de module onderscheidend omdat deze gemakkelijk kan worden aangepast om plasmiden te genereren die interessant zijn voor andere onderzoeksprojecten.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de rol van Gibson Assembly in ons onderzoekslaboratorium. Actinomycetota produceert natuurlijke producten met kleine moleculen met klinisch relevante bioactiviteiten met behulp van genclusters die coderen voor biosynthetische enzymen. In ons onderzoek worden plasmiden met een biosynthetisch gen geassembleerd via Gibson Assembly voor stroomafwaarts onderzoek naar de functie van het gecodeerde enzym. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Laboratorium overzicht

Molecular Biology Laboratory is een cursus in de hogere divisie die vereist is voor majors in de biochemie en biologie met een concentratie in moleculaire en cellulaire biologie. Andere studenten die aan de vereisten voldoen, zijn welkom om de cursus te volgen als een keuzevak in de hogere divisie. De cursus staat op de lijst van de afdeling Chemie en Biochemie en de afdeling Biologie van Cal Poly. Faculteiten van beide afdelingen geven om beurten de cursus per semester (twee kwartalen Biologie, een kwart Scheikunde en Biochemie).

De klas komt twee keer per week samen in het laboratorium voor perioden van 170 minuten en één keer per week voor een lezing van 50 minuten. Labsecties bevatten maximaal 16 studenten en elk kwartaal worden 2-3 labsecties aangeboden. De cursus duurt 10 weken en het eindexamen wordt afgenomen tijdens de laatste bijeenkomst in week 10. De collegetijd wordt besteed aan het bespreken van de theorie achter veel van de experimentele technieken die in het lab worden uitgevoerd, evenals actuele onderwerpen in de moleculaire biologie die niet in het lab aan bod komen. Het kerncurriculum van het lab omvat het proces van het klonen van het actine-gen uit gist1, dat ongeveer 7 weken duurt (13-14 laboratoriumvergaderingen). Technieken omvatten micropipetteren, gist-RNA-isolatie, amplificatie van een gistgen met behulp van reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR), TOPO-klonen, blauw-witte screening, plasmide-isolatie en verificatie van insertie door restrictiedigest en PCR, in silico-analyse van klonen en DNA-sequentieanalyse. Het curriculum voor de laatste 3 weken van de cursus is naar goeddunken van de docent, maar houdt in dat studenten een "onafhankelijk project" voltooien met ongedefinieerde resultaten.

Overzicht van experimenten

Een van de aandachtspunten van onze onderzoeksgroep zijn biosynthetische routes in Actinomycetota. Bij het ontwerpen van het onafhankelijke project hadden we ons voorgesteld dat studenten plasmiden zouden maken via Gibson Assembly voor gebruik in onze onderzoeksprojecten die de biosynthese van natuurlijke producten onderzoeken. Hoewel de iteraties van de cursusmodule die hier worden beoordeeld, specifiek waren voor plasmiden die de manipulatie van biosynthetische routes mogelijk maken, is de Gibson Assembly-workflow enorm aanpasbaar voor andere moleculaire kloonprojecten (Figuur 2). De workflow werd opgesplitst in drie verschillende experimenten (A, B en C) die werden voltooid over twee collegeperiodes en zes labperioden (in totaal 3 weken) (zie aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2). Experimenten werden voorafgegaan door werkbladen om de voorbereiding van studenten te ondersteunen en het begrip van studenten te beoordelen (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5). De workflow wordt gepresenteerd in een formaat dat flexibel is voor de behoeften en interesses van een instructeur.

figure-introduction-2
Afbeelding 2: Workflow van de Gibson-assemblagemodule. Dag 1 en Dag 4 zijn collegeperiodes waarin studenten in silico-sequentieanalyse en experimenteel ontwerp voltooien. Dagen 2-3 en 5-8 zijn laboratoriumvergaderingen waar de stappen om nieuwe plasmiden te klonen via Gibson Assembly worden uitgevoerd, gevolgd door isolatie en screening. Het geïllustreerde stroomdiagram is gegroepeerd op basis van de drie experimenten die studenten uitvoeren (A, B en C). Meer gedetailleerde aanwijzingen en protocollen zijn te vinden in de handleidingen voor instructeurs en studenten die respectievelijk als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2 worden geleverd. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De onafhankelijke projectmodule van Gibson Assembly werd voor het eerst getest in het voorjaarskwartaal van 2019 in CHEM/BIO 475. In 2020 en 2021 werd de cursus online gegeven vanwege de SARS-CoV-2-pandemie. Toen de persoonlijke instructie in het voorjaar van 2022 en 2023 werd hervat, werden studenten binnen de cursus uitgenodigd om deel te nemen aan een onderzoek naar de leerresultaten van een onafhankelijk project van Gibson Assembly waarbij originele, onderzoeksrelevante plasmiden zouden worden gekloond. In 2019 creëerden studenten een bibliotheek van plasmiden bestaande uit gencassettes uit het genoom van Micromonospora echinospora ATCC 15837 die werden gekloond in pKC1132 (Figuur 3). Deze plasmidebibliotheek wordt in ons onderzoekslaboratorium gebruikt om genen van belang te inactiveren in een vermeende biosynthetische gencluster voor het natuurlijke product TLN-0522015. Als aanvulling op onze geninactiveringsstudies hebben studenten in 2022 een kleine bibliotheek van genen van de vermeende TLN-05220-gencluster gekloond in pUC19 (figuur3); onze onderzoeksgroep heeft deze plasmiden gebruikt voor het subkloneren van genen in expressievectoren, waaronder pET28b, voor overexpressie en zuivering van eiwitten. Studenten in het cohort van 2023 hebben bijgedragen aan het lopende werk aan een biosynthetisch engineeringproject voor het epoxomicinesynthetase16. In teams van 3-4 kloonden studenten gemanipuleerde domeinen van niet-ribosomale peptidesynthetase17 modules in verschillende eiwitexpressievectoren om de overexpressie en zuivering van deze enzymen in ons onderzoekslaboratorium te optimaliseren (Figuur 3). Redundantie werd ingebouwd in het kloonplan voor elk cohort. Het cohort van 2019 bevatte bijvoorbeeld 44 studenten en 15 plasmiden werden aan de klas toegewezen om te klonen. Zo werd twee of drie keer geprobeerd elk plasmide te klonen.

figure-introduction-3
Figuur 3: Samenvatting van gekloonde plasmiden en studentdeelnemers tijdens onafhankelijke projectiteraties in 2019, 2022 en 2023. Het Gibson Assembly-project is drie keer ingezet. In elk aanbod kloonden student-deelnemers een andere bibliotheek van plasmiden om te gebruiken in onderzoeksprojecten die biosynthetische routes onderzoeken. Projecten in 2019 en 2022 ondersteunden ons lopende werk aan het natuurlijke product TLN-0522015 met twee fragmenten (één gencassette of gen en een vector) Gibson Assembly-reacties. Het project van 2023 betrof domeinwisseling binnen modules 1 en 2 van een niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS)-enzym dat betrokken is bij de biosynthese van epoxomicine16. De gearceerde fragmenten vertegenwoordigen twee verschillende mutanten van het verwisselde domein, en effen kleuren vertegenwoordigen domeinen die niet zijn verwisseld. In totaal werden acht verschillende genfragmenten (vier voor module 1 en vier voor module 2) gegenereerd met overhangs die compatibel zijn voor Gibson Assembly. Voor elke module werden twee verschillende combinaties van drie genfragmenten geassembleerd met een van de twee verschillende vectoren (pBAD33 en pET28, in totaal vier fragmenten per assemblage), voor het potentieel om acht gemanipuleerde NRPS-plasmiden te genereren. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Overzicht assessment

Ten minste 1 week voor de start van het onafhankelijke Gibson Assembly-project werden studenten in de cohorten van 2022 en 2023 uitgenodigd om deel te nemen aan een onderzoek naar leerresultaten, dat op dezelfde manier is opgezet als een onderzoek dat werd uitgevoerd in een enquête van de laboratoriumcursus biochemie bij Cal Poly18. Student-deelnemers vulden een meerkeuze-pre-vragenlijst in tijdens de labvergadering vóór de start van het onafhankelijke project en een meerkeuze-post-vragenlijst tijdens de laatste labvergadering (d.w.z. nadat ze de Gibson Assembly-module hadden voltooid). De pre- en post-vragenlijsten bestonden uit 28 identieke vragen met twee extra vragen in de post-vragenlijst (30 in totaal). Er werden tien inhoudsvragen geschreven om de kennis van studenten over enzymen en mechanismen die betrokken zijn bij moleculair klonen te beoordelen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], Gibson-assemblage, transformatie, blauw-witte screening). De volgende zeven vragen vroegen studenten om zelf hun bekendheid met moleculaire kloneringstermen (bijv. DNA-polymerase, exonuclease, ligase) te beoordelen. De volgende 10 vragen stelden studenten in staat om zelf hun vermogen te beoordelen om moleculaire kloontechnieken uit te voeren (bijv. DNA-sequentieanalyse, restrictie-digestiereacties, agarosegelelektroforese). Studenten meldden ook of ze zich op hun gemak zouden voelen bij het nastreven van een carrière in de moleculaire biologie op basis van hun kennis van moleculaire kloontechnieken. In de post-vragenlijst werden twee aanvullende vragen opgenomen voor studenten om zelf te beoordelen of ze zich inzetten voor het leren in de cursus en of de cursus een waardevolle leerervaring was (aanvullend bestand 6 en aanvullend bestand 7). Alle gegevens van de pre- en post-vragenlijstantwoorden van studenten in 2022 en 2023 werden gecombineerd voor analyse en zijn beschikbaar in aanvullende tabel S1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De onderzoeken met menselijke deelnemers werden beoordeeld en goedgekeurd door proefpersonen in de Research Institutional Review Board van Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). De deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.

Het volgende protocol schetst de voorbereiding van de instructeur (stappen 1.1-1.3), de acties van studenten voor een onderwijsmodule met drie experimenten die PCR omvat om lineaire fragmenten te verkrijgen (stappen 2.1-2.7), Gibson-assemblage, transformatie en selectie van klonen (stappen 3.1-3.5), plasmide-isolatie en screening (stappen 4.1-4.4) en beoordeling van leerresultaten (5.1-5.2). De voorbereiding van de instructeur beschrijft een representatief voorbeeld van het ontwerp van de primer en de voorbereiding van een gewenste plasmidekaart in silico. Alle secties van het protocol zijn aanpasbaar voor andere gewenste plasmiden. Elk studentenexperiment is verdeeld in twee labvergaderingen van 3 uur.

1. Voorbereiding van de instructeur

  1. Gibson Assembly primer ontwerp met behulp van Benchling Assembly Wizard
    1. Bepaal de DNA-sjabloonbron voor de geninsert(s), zoals genomisch DNA, plasmide en synthetisch DNA.
      NOTITIE: Voor genen die zullen worden geamplificeerd uit complexe genomische DNA-sjablonen, wordt geadviseerd om eerst unieke bindingsplaatsen te bepalen voor primers binnen de genomische DNA-sjabloon die specifiek zijn voor het gen of de genen van belang, met behulp van de National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)21, zoals beschreven in aanvullend bestand 1. Voor eenvoudige sjablonen zoals plasmiden of synthetisch DNA gaat u verder met de volgende stap.
    2. Haal DNA-sequenties op van de geninsert(s) en vector (zie bijvoorbeeld polyketidehydroxylase-gensequentie en pUC19-sequentie geleverd als GenBank-bestanden in het aanvullende bestand 8). Importeer de gewenste insert-sequentie(s) en de gewenste vectorsequentie naar Benchling, elk als een nieuw DNA-sequentiebestand. Open elke geïmporteerde sequentie die moet worden opgenomen in de Gibson Assembly-reactie.
      NOTITIE: Men kan DNA-sequentiebestanden in verschillende formaten importeren, waaronder GenBank en FASTA. Men kan ook een sequentie rechtstreeks uit een database importeren met een toetredingsnummer of een nucleotidesequentie plakken die is gekopieerd uit een ander bestand of een andere viewer.
    3. Zoek onder aan het scherm de tool Assembly Wizard . Klik op Assembly Wizard en selecteer vervolgens Nieuwe assembly maken. Selecteer uit de beschikbare opties Gibson en klik op Start om de montage te starten.
    4. Selecteer in het vectorsequentievenster alle basen die in de assemblage moeten worden opgenomen uit de vectorbackbone. Begin de selectie op de nucleotidepositie aan het 3' -uiteinde van de geninsert (bijv. positie 657 van pUC19) en selecteer alle resterende nucleotiden die moeten worden opgenomen (bijv. via positie 656 om de volledige pUC19-sequentie op te nemen). Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Backbone onder aan het scherm | Fragment instellen.
      NOTITIE: Schakel tussen de weergaven Sequentiekaart en Plasmide van de vector om alle gewenste basissen van een cirkelvormige sjabloon te selecteren. Als u van plan bent het vectorfragment via restrictiedigest (in plaats van PCR) voor Gibson-assemblage voor te bereiden, kunt u de backbone-sequentie lineariseren met een restrictie-enzymknipplaats (bijv. XbaI). Klik hiervoor op de geknipte site, houd Shift ingedrukt en klik opnieuw op de geknipte site . Klik vervolgens op Fragment instellen om de backbone in te stellen. Houd er rekening mee dat vectorspecifieke primers niet worden gegenereerd door Benchling als de backbone wordt gelineariseerd met een restrictie-enzym in de Assembly Wizard.
    5. Selecteer in het venster met de invoegvolgorde alle basissen van de wisselplaat die in het merk moeten worden opgenomen. Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm | Fragment instellen.
    6. In het geval van meerdere gen-inserts, klikt u op de knop + aan de rechterkant van de Assembly Wizard. Selecteer in het venster voor de invoegvolgorde alle insteekvoetstukken die in het merk moeten worden opgenomen. Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm | Fragment instellen.
    7. Zodra alle fragmenten zijn ingesteld, wijzigt u de naam van de assemblage naar de gewenste plasmidenaam en klikt u op Assembleren rechts van de assembly wizard. Selecteer de gewenste maplocatie voor zowel de Sequence Folder als de Primer Folder. Klik op Maken om de recombinante plasmidereeks samen te stellen.
    8. Open het geassembleerde plasmide en klik op Assemblagegeschiedenis om een eenvoudige plasmidekaart en een overzicht van de sequenties waaruit het is afgeleid weer te geven. Zorg ervoor dat de nucleotideposities voor elk fragment overeenkomen met het gewenste ontwerp.
    9. Bekijk op het tabblad Assemblageparameters de namen van de primers die voor de assemblage zijn ontworpen. Merk op dat er twee primers zullen worden ontworpen voor elke insert (een voorwaartse en een achterwaartse), en dat de primernamen zullen worden afgeleid van de titels van de DNA-sequentiebestanden. Zorg er ook voor dat de smelttemperaturen van de primer en de voorgestelde gloeitemperaturen compatibel zijn in dit venster (zie aanvullend bestand 8, Representatieve primers).
      1. Als de smelt- of gloeitemperaturen van de primer niet ideaal zijn, past u de primersequenties handmatig aan (bijv. het verwijderen van nucleotiden om de smelttemperatuur te verlagen) binnen de primersequentiebestanden. U kunt ook op Opnieuw openen klikken en de primerinstellingen aanpassen door op de knop Enzym-/primerinstellingen naast de knop Assembleren in de montagewizard te klikken. Herhaal vervolgens de montagestap en onderzoek de primersequenties opnieuw.
      2. Als een bibliotheek van plasmiden moet worden gekloond met veel verschillende genen die in dezelfde vectorruggengraat worden gekloond,
      3. Gebruik in elk geval hetzelfde primerpaar voor de vector. Om dit te doen, verwijdert u handmatig alle nucleotiden uit de vectorprimers die de overhangen zouden installeren die specifiek zijn voor de insert. Deze nucleotiden zouden worden gevonden aan het 5' -uiteinde van de primer. Zorg er na verwijdering voor dat de smelttemperaturen van de primer en de gloeitemperaturen compatibel zijn (zie aanvullend bestand 8, Representatieve primers).
      4. Zorg ervoor dat alle paren van de insteekprimer zeer vergelijkbare smelttemperaturen en gloeitemperaturen hebben.
        NOTITIE: Dit vermindert de noodzaak om de gloeitemperatuur van elk paar te optimaliseren en zorgt ervoor dat alle PCR-reacties van studenten tegelijkertijd kunnen worden gefietst met behulp van hetzelfde thermocyclerprogramma.
    10. Zodra het ontwerp van de primer voor de gewenste plasmiden is voltooid, klikt u op Voltooien in de montagewizard. Bestel de primers bij een DNA-synthesebedrijf en haal monsters op van de DNA-sjablonen voor insert(s) en vector.
    11. Test zowel insert- als vectorspecifieke primerparen voor optimale gloeitemperaturen met behulp van een gradiënt-PCR-experiment met de DNA-sjablonen. Test de door Benchling aanbevolen gloeitemperaturen in eerste instantie ± 3 °C.
    12. Zodra de gloeitemperaturen zijn bepaald, maakt u aliquots van primeroplossingen, DNA-sjablonen en noodzakelijke reagentia voor PCR-reacties voor studenten.
  2. Geef de leerlingen vóór de experimenten werkbladen ter ondersteuning van de voorbereiding en om het begrip te beoordelen (Aanvullend Bestand 4, Aanvullend 5 en Aanvullend 6).
  3. Gegevensverzameling over leerresultaten
    NOTITIE: Als u geïnteresseerd bent in het verzamelen van leerresultaatgegevens van de Gibson Assembly-module en het publiceren van de resultaten, zorg dan voor goedkeuring voor onderzoek met menselijke proefpersonen volgens het beleid van de instelling.
    1. Nodig de studenten uit om ten minste 1 week voor de start van het onafhankelijke project Gibson Assembly deel te nemen aan een onderzoek naar leerresultaten.
    2. Laat de student-deelnemers de meerkeuze-pre-vragenlijst (Aanvullend Dossier 6) invullen tijdens de labvergadering voor de start van het zelfstandige project.

2. Studentenexperiment A: PCR om lineaire fragmenten te verkrijgen

  1. Verkrijg primers en sjabloon-DNA-oplossingen voor PCR bij de instructeur.
  2. Pipetreacties van 25 μl, inclusief DNA-polymerase MasterMix, DNA-sjabloon, voorwaartse en achterwaartse primers en nucleasevrij water volgens de instructies in de studentenhandleiding (zie aanvullend bestand 2).
  3. Cyclus de reactie in een thermocycler volgens de studentenhandleiding in aanvullend bestand 2. Zorg ervoor dat de gloeitemperatuur van de reactie geschikt is voor de primers en dat de verlengingstijd geschikt is voor de lengte van de gewenste amplicon. Raadpleeg Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3 voor gedetailleerde instructies.
  4. Bewaar PCR-reacties bij 4 °C of -20 °C tot de volgende laboratoriumperiode.
  5. Analyseer 5 μL van elke reactie via agarosegelelektroforese. Terwijl de gel draait, voegt u 1 μL DpnI-restrictie-enzym toe aan elke reactie die plasmide-DNA als sjabloon heeft gebruikt. Incubeer dit mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
    NOTITIE: DpnI zal alle resterende circulaire plasmide-DNA-sjabloon degraderen, waardoor het minder waarschijnlijk wordt dat het valse positieven verkrijgt in de transformatiestap.
  6. Beeld de gel af om te bevestigen dat de PCR succesvol was en dat de juiste amplificatie werd bereikt. Zuiver eventuele succesvolle PCR-reacties met een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit. Meet de concentratie (ng/μL) van het gezuiverde PCR-product met behulp van een microvolumespectrofotometer voor gebruik in latere Gibson-assemblageberekeningen.
  7. Ontwerp vóór de volgende klassikale bijeenkomst het reactierecept voor Gibson Assembly (zie aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 4).

3. Studentenexperiment B: Gibson Assemblage, transformatie en selectie van klonen

  1. Pipetteer de Gibson Assembly-reactie volgens het ontworpen recept. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 50 °C. Terwijl reacties incuberen, bereid je je voor op transformatie door chemisch competente Escherichia coli-cellen op ijs te ontdooien.
  2. Transformeer 2 μL van de Gibson Assembly in chemisch competente cellen via een hitteschok. Pipetteer 100 μL van de getransformeerde cellen op twee selectieplaten en verspreid met gesteriliseerde kralen. Bereid 10-4, 10-5 en 10-6 verdunningen van de resterende cellen op Luria-Bertani (LB) agar. Plaat 100 μL van elke seriële verdunning op LB (geen selectie) en verspreid met gesteriliseerde kralen.
    NOTITIE: Deze stap maakt het mogelijk om de transformatie-efficiëntie te berekenen.
  3. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Bewaar de platen bij 4 °C tot de volgende lesperiode.
  4. Tel kolonies op alle platen en bereken de transformatie-efficiëntie volgens de instructies in aanvullend bestand 2. Streep een selectieve plaat met vier kolonies opnieuw uit een van beide selectieve platen en broed deze plaat een nacht uit bij 37 °C.
    NOTITIE: Dit dient als een back-upcultuur van je positieve klonen.
  5. Selecteer, omcirkel en label met behulp van een stift vier verschillende kolonies op het selectieplaatje met de initialen van de leerling en een nummer (bijv. ABC1). Haal een nieuwe LB-agarplaat met antibioticum op voor selectie, gebruik een marker om de plaat in kwadranten (d.w.z. vierden) te verdelen en gebruik vervolgens ~1/2 van elke kolonie om opnieuw te strepen op het respectievelijke gelabelde kwadrant en de andere 1/2 om een vloeibare LB-cultuur van 5 ml te inoculeren voor elk van de vier geselecteerde kolonies. Zorg ervoor dat u de buisjes labelt met de respectieve kolonie-identiteit (bijv. ABC1) en voeg de juiste concentratie antibioticum toe voor selectie. Incubeer de vloeibare culturen in een schudbroedmachine 's nachts bij 37 °C en de agarplaat in een statische broedmachine bij 37 °C; bewaar vloeibare culturen en platen bij 4 °C tot de volgende lesperiode.

4. Studentenexperiment C: Plasmide-isolatie en screening

  1. Isoleer plasmide-DNA uit de vloeibare culturen van experiment B met behulp van een miniprep-kit. Meet de concentratie van geïsoleerd plasmide (in ng/μL).
  2. Ontwerp een restrictiedigest of PCR-scherm om de geïsoleerde plasmiden te analyseren (zie gedetailleerde instructies in aanvullend bestand 2 en rapporteer verwachtingen in aanvullend bestand 5).
  3. Pipetteer de restrictie, verteer reacties of reacties volgens ontworpen recepten en incubeer bij eerder ontworpen temperaturen en duur.
  4. Analyseer de resultaten via agarosegelelektroforese.

5. Beoordeling

  1. Laat de student-deelnemers de meerkeuze-post-vragenlijst (aanvullend bestand 7) invullen tijdens de labvergadering nadat de Gibson Assembly-module is voltooid.
  2. Combineer alle gegevens van de antwoorden voor en na de vragenlijst voor analyse.
    1. Onderzoek de statistische significantie van de toename van de gemiddelde score van elke individuele inhoudsvraag tussen de vragenlijsten met behulp van tweezijdige gepaarde t-toetsen en de d-effectgrootte van Cohen.
    2. Evalueer de toename van het zelfvertrouwen van studenten voor elke afzonderlijke term en techniek om de mate van verandering en de statistische significantie ervan te bepalen.
    3. Bepaal de impact van de achtergrond van de student en academische factoren op het leren van studenten door gebruik te maken van genormaliseerde leerwinst (NLG) en ongepaarde t-toetsen.
    4. Beoordeel de houding van de studenten ten opzichte van de projectervaring en de carrière in de moleculaire biologie door de gemiddelde scores te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succes van studenten in klonen
In elke iteratie van de Gibson Assembly-module (2019, 2022 en 2023) werd studenten gevraagd een rapport op te stellen met een samenvatting van hun bevindingen. In 2019 meldden 36 van de 44 studenten (81,8%) dat ze hun plasmiden met succes hadden gekloond op basis van de resultaten van het scherm dat ze voor Experiment C hadden ontworpen. In totaal rapporteerden 14 van de 20 studenten (70,0%) succes bij het klonen van hun toegewezen const...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier stellen we een aanpasbaar niet-gegradueerd klassikaal laboratoriumproject voor dat studenten moleculair klonen leert door middel van Gibson Assembly in een cursusgebaseerde onderzoeksomgeving. In totaal werden 28 nieuwe plasmiden gekloond door niet-gegradueerde studenten in een klaslokaal. Het door individuele studenten gerapporteerde succes varieerde van 44,4% tot 81,8% over drie cohorten, en het totale succes van klonen was 80% (28 van de in totaal 35 toegewezen plasmiden werden m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Auteurs danken Andrea Laubscher voor technische ondersteuning, en Michael Black, Sandi Clement en Javin Oza voor nuttige discussies over de implementatie van onderwijslaboratoria en de beoordeling van leerresultaten. Auteurs waarderen alle studenten die hebben deelgenomen aan de leerresultatenstudie in de cohorten van 2019, 2022 en 2023, evenals onderzoeksstudenten Nathan Kuhn en Aayushi Adettiwar die hielpen bij de voorbereiding van reagentia voor de implementatie van het onderwijslaboratorium. Auteurs erkennen ook financiële steun van het William and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant en de National Science Foundation (NSF-1708919 en NSF-2300890).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs, 10  mM)Fisher ScientificFERR0191Homemade' MasterMix component
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificFERR0861Homemade' MasterMix component
DpnI New England BiolabsR0176S1000 units
Fisherbrand Isotemp Microbiologische IncubatorFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Isotemp Water BathFisher ScientificS28124
GelRed Nucleic Acid Gel StainBiotiumNC959471910,000X
GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro KitThermo ScientificFERK0831100 Preps
GeneRuler 1 kb DNA ladderFisher ScientificFERSM0314100 applications
LB Broth, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 g
Magnesium chloride hexahydrateFisher ScientificBP214-500Homemade' MasterMix component
Mastercycler nexus X2 Gradient ThermocyclerEppendorf6337000027
Microfuge 16 CentrifugeBeckman CoulterA46474
Micromonospora echinospora bacteriaAmerican Type Culture CollectionATCC 15837
Microwave OvenGeneral Electric 2440640
Molecular Biology Grade AgaroseFisher BioReagentsBP160-100100 g
Nanodrop One Microvolume SpectrophotometerThermo Scientific13-400-518
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2987H20 x 0.05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabsE2621S10 reactions
New Brunswick Innova 40 Benchtop Orbital ShakerNew BrunswickM1299-0090
Nuclease Free WaterFisher BioReagentsBP24845050 mL
PEG-8000 Fisher ScientificBP233-100Homemade' MasterMix component
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530Homemade' MasterMix component
Portable BalanceOhausSKX123
pUC19 vectorNew England BiolabsN3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix New England BiolabsM0492S100 reactions
T5 ExonucleaseEpicentreT5E4111KHomemade' MasterMix component
Taq DNA LigaseNew England BiolabsM0208Homemade' MasterMix component
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Homemade' MasterMix component
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)Thermo ScientificFERR11615 x 1 mL
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4019100 Preps
β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)New England BiolabsB9007SHomemade' MasterMix component

Referenties

  1. Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory. Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  3. Bell, J. K., et al. CUREs in biochemistry—where we are and where we should go. Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).
  4. Auchincloss, L. C., et al. Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).
  5. Buchanan, A. J., Fisher, G. R. Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review. CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).
  6. Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).
  7. Li, G., et al. CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research. Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).
  8. Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry. Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).
  9. Li, C., et al. Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology. Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).
  10. Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes. Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).
  11. Dean, D. M., Wilder, J. A. The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods. Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).
  12. Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course. Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).
  13. Roberts, L. A., Shell, S. S. A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation. Front Microbiol. 13, 1025250(2023).
  14. Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects. Microbiol Res. 246, 126708(2021).
  15. Banskota, A. H., et al. TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins. J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).
  16. Schorn, M., et al. Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors. ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).
  17. Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases. J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).
  18. Williams, L. C., et al. The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education. Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).
  19. Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM. PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).
  20. Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors. CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).
  21. Camacho, C., et al. BLAST+: Architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  22. Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly (2024).
  23. Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gibson Assemblycursusgebaseerd onderzoekplasmidenbibliothekenleerdoelen voor studentencurriculum moleculaire biologiekloningstechniekenbiosynthese van natuurproductenlaboratoriumcursusmodule
Verbetering van de resultaten van studenten met een aanpasbare cursus moleculair klonen Cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.