Verbetering van de resultaten van studenten met een aanpasbare cursus moleculair klonen Cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring

Samenvatting

Een aanpasbare Gibson Assembly moleculaire kloonmodule werd gebruikt in een cursusgebaseerd undergraduate research experience (CURE) -formaat voor studenten van laboratoriumcursussen moleculaire biologie. Beoordeling van de leerresultaten van studenten toonde een beter begrip en vertrouwen in moleculair klonen na voltooiing van de CURE, en nieuwe plasmiden werden gekloond voor onderzoek naar biosynthese van natuurlijke producten.

Samenvatting

De voortdurende vooruitgang van moleculaire biologietechnieken vereist dat curricula voor moleculaire biologie regelmatig worden verfijnd om studenten effectief voor te bereiden op de arbeidsmarkt met moderne competenties. Met name de opkomst van Gibson Assembly, een zeer aanpasbare en adaptieve moleculaire kloontechniek, heeft het landschap van moleculair klonen in tal van onderzoeksomgevingen verbeterd. Daarom hebben we een Gibson Assembly-kloonmodule gemaakt voor implementatie in een laboratoriumcursus moleculaire biologie aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo en hebben we de leerresultaten van studenten van de module geëvalueerd. Gedurende drie iteraties van de cursus namen studenten deel aan een op experimenten gebaseerd onafhankelijk project waarbij drie unieke plasmidebibliotheken werden gekloond ter ondersteuning van onderzoeksprojecten op het gebied van biosynthese van natuurlijke producten. Studenten kregen pre- en post-vragenlijsten om hun begrip van moleculair klonen en hun vertrouwen in moleculair-biologische termen en technieken te evalueren. De antwoorden van de studenten toonden een significante toename in zowel het leren van moleculaire kloonconcepten als in zelfgerapporteerd vertrouwen in moleculaire kloontermen en -technieken. Dit moduleraamwerk kan worden gegeneraliseerd om Gibson Assembly voor verschillende toepassingen te onderwijzen, waardoor instructeurs een toolkit krijgen voor het aanleren van een aanpasbare en opkomende kloontechnologie terwijl ze hun onderzoeksprojecten bevorderen.

Inleiding

Het opleiden van studenten in fundamentele moleculaire biologieconcepten en laboratoriumtechnieken is cruciaal voor hun wetenschappelijke en professionele ontwikkeling, aangezien deze methodologieën gebruikelijk zijn in verschillende onderzoeksomgevingen, waaronder de academische wereld en de industrie. Als zodanig zijn studenten in de biologie (concentratie van moleculaire en cellulaire biologie) en biochemie aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) verplicht om een laboratoriumcursus moleculaire biologie in de hogere divisie te volgen om deze onderwerpen te leren en toe te passen (CHEM / BIO 475). Er is eerder een basiscurriculum voor deze cursus ontwikkeld waarin studenten op topoisomerase gebaseerde (TOPO) klonen uitvoeren om een actine-bevattend plasmide samen te stellen dat is bereid uit een gist complementair DNA (cDNA) sjabloon¹. Studenten ontwerpen experimenten op basis van vragen die authentieke onderzoekshypothesen nabootsen, waardoor ze meer vertrouwd raken met laboratoriumpraktijken en onderzoekend leren. Voortdurende vooruitgang op het gebied van moleculaire biologie vereist dat de overeenkomstige curricula worden aangepast om studenten met moderne competenties voor te bereiden op de arbeidsmarkt. Met name het gebruik van Gibson Assembly is overheersender geworden in de wetenschappelijke gemeenschap; hoewel de methode oorspronkelijk was ontwikkeld om kunstmatige chromosomen te synthetiseren², hebben meer dan 5.000 publicaties op het moment van dit rapport verwezen naar het originele werk van Gibson et al. Gibson Assembly is uniek in vergelijking met traditionele kloonmethodologieën: het is in hoge mate aanpasbaar en kan gemakkelijk meerdere lineaire DNA-fragmenten lilateren zonder dat er restrictieplaatsen nodig zijn om de juncties te produceren. Zo zagen we de mogelijkheid om het CHEM/BIO 475-curriculum te vernieuwen om moderne moleculaire kloontechnieken op te nemen en het op onderzoek gebaseerde cursusmodel te verbeteren.

Het is vastgesteld dat onderzoekservaringen van studenten bijdragen aan een groter conceptueel inzicht, ontwikkeling van vaardigheden en doorzettingsvermogen in de wetenschap³, maar niet alle niet-gegradueerde studenten hebben de mogelijkheid om rechtstreeks deel te nemen aan een onderzoekslaboratorium. Om de uitdaging van de beperkte studentencapaciteit in onderzoekslaboratoria aan te gaan, zijn cursusgebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaringen (CURE's) ontwikkeld en gebruikt om de toegankelijkheid van wetenschap te vergroten door middel van authentiek onderzoek in de klas. Hoewel CURE's variëren in hun implementatie, zijn er gemeenschappelijke praktijken vastgesteld die de vijf principes van wetenschappelijk onderzoek aanpakken. In een goed ontworpen CURE zullen studenten 1) wetenschappelijke praktijken gebruiken, 2) samenwerken in een onderzoeksproject, 3) proberen nieuwe ontdekkingen te doen, 4) bijdragen aan werk dat relevant is buiten het klaslokaal, en 5) hypothesen en methoden opnieuw beoordelen en herzien in het geval van experimenteel falen⁴. Net als bij traditionele onderzoekservaringen van studenten in een laboratorium, is aangetoond dat CURE's het vertrouwen van studenten in wetenschap, wetenschappelijke vaardigheden, projecteigenaarschap en doorzettingsvermogen in wetenschap, technologie, techniek en wiskunde (^STEM) versterken5. Hoewel CURE's met moleculair klonen eerder zijn gerapporteerd 6,7,8,9,10,11,12,13, zijn we niet op de hoogte van enkele die het aanpassingsvermogen van Gibson Assembly benadrukken om een bibliotheek van authentieke onderzoeksplasmiden te maken.

Hier rapporteren we een uitbreiding van het huidige, op onderzoek gebaseerde CHEM/BIO 475-curriculum aan de California Polytechnic State University, San Luis Obispo met twee belangrijke verbeteringen: praktische ervaring met het gebruik van Gibson Assembly en deelname van studenten aan een CURE, die originele plasmideconstructies heeft opgeleverd voor onderzoeksprojecten die worden gefinancierd door de National Science Foundation (NSF-1708919 en NSF-2300890). Gedurende drie implementaties van dit curriculum hebben studenten bijgedragen aan twee verschillende onderzoeksprojecten gericht op de biosynthese van natuurlijke producten van bioactieve moleculen geproduceerd door Actinomycetota. Natuurlijke producten bevatten vaak farmacoforen met antibiotica-, schimmelwerende en/of kankerbestrijdende activiteiten, waardoor deze kleine moleculen belangrijk zijn bij het ontdekken van geneesmiddelen en potentieel voor klinische relevantie¹⁴. Dit onderzoek vereist de oprichting van plasmidebibliotheken om onderzoek mogelijk te maken naar zowel de functie als het technische potentieel van bacteriële biosynthetische enzymen. In deze CURE ontwierpen en voerden studenten Gibson Assembly-experimenten uit om de unieke plasmidebibliotheken te klonen die relevant zijn voor deze onderzoeksprojecten (Figuur 1). Bovendien is het formaat en het ontwerp van de module onderscheidend omdat deze gemakkelijk kan worden aangepast om plasmiden te genereren die interessant zijn voor andere onderzoeksprojecten.

Figuur 1: Overzicht van de rol van Gibson Assembly in ons onderzoekslaboratorium. Actinomycetota produceert natuurlijke producten met kleine moleculen met klinisch relevante bioactiviteiten met behulp van genclusters die coderen voor biosynthetische enzymen. In ons onderzoek worden plasmiden met een biosynthetisch gen geassembleerd via Gibson Assembly voor stroomafwaarts onderzoek naar de functie van het gecodeerde enzym. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Laboratorium overzicht

Molecular Biology Laboratory is een cursus in de hogere divisie die vereist is voor majors in de biochemie en biologie met een concentratie in moleculaire en cellulaire biologie. Andere studenten die aan de vereisten voldoen, zijn welkom om de cursus te volgen als een keuzevak in de hogere divisie. De cursus staat op de lijst van de afdeling Chemie en Biochemie en de afdeling Biologie van Cal Poly. Faculteiten van beide afdelingen geven om beurten de cursus per semester (twee kwartalen Biologie, een kwart Scheikunde en Biochemie).

De klas komt twee keer per week samen in het laboratorium voor perioden van 170 minuten en één keer per week voor een lezing van 50 minuten. Labsecties bevatten maximaal 16 studenten en elk kwartaal worden 2-3 labsecties aangeboden. De cursus duurt 10 weken en het eindexamen wordt afgenomen tijdens de laatste bijeenkomst in week 10. De collegetijd wordt besteed aan het bespreken van de theorie achter veel van de experimentele technieken die in het lab worden uitgevoerd, evenals actuele onderwerpen in de moleculaire biologie die niet in het lab aan bod komen. Het kerncurriculum van het lab omvat het proces van het klonen van het actine-gen uit gist¹, dat ongeveer 7 weken duurt (13-14 laboratoriumvergaderingen). Technieken omvatten micropipetteren, gist-RNA-isolatie, amplificatie van een gistgen met behulp van reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR), TOPO-klonen, blauw-witte screening, plasmide-isolatie en verificatie van insertie door restrictiedigest en PCR, in silico-analyse van klonen en DNA-sequentieanalyse. Het curriculum voor de laatste 3 weken van de cursus is naar goeddunken van de docent, maar houdt in dat studenten een "onafhankelijk project" voltooien met ongedefinieerde resultaten.

Overzicht van experimenten

Een van de aandachtspunten van onze onderzoeksgroep zijn biosynthetische routes in Actinomycetota. Bij het ontwerpen van het onafhankelijke project hadden we ons voorgesteld dat studenten plasmiden zouden maken via Gibson Assembly voor gebruik in onze onderzoeksprojecten die de biosynthese van natuurlijke producten onderzoeken. Hoewel de iteraties van de cursusmodule die hier worden beoordeeld, specifiek waren voor plasmiden die de manipulatie van biosynthetische routes mogelijk maken, is de Gibson Assembly-workflow enorm aanpasbaar voor andere moleculaire kloonprojecten (Figuur 2). De workflow werd opgesplitst in drie verschillende experimenten (A, B en C) die werden voltooid over twee collegeperiodes en zes labperioden (in totaal 3 weken) (zie aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2). Experimenten werden voorafgegaan door werkbladen om de voorbereiding van studenten te ondersteunen en het begrip van studenten te beoordelen (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5). De workflow wordt gepresenteerd in een formaat dat flexibel is voor de behoeften en interesses van een instructeur.

Afbeelding 2: Workflow van de Gibson-assemblagemodule. Dag 1 en Dag 4 zijn collegeperiodes waarin studenten in silico-sequentieanalyse en experimenteel ontwerp voltooien. Dagen 2-3 en 5-8 zijn laboratoriumvergaderingen waar de stappen om nieuwe plasmiden te klonen via Gibson Assembly worden uitgevoerd, gevolgd door isolatie en screening. Het geïllustreerde stroomdiagram is gegroepeerd op basis van de drie experimenten die studenten uitvoeren (A, B en C). Meer gedetailleerde aanwijzingen en protocollen zijn te vinden in de handleidingen voor instructeurs en studenten die respectievelijk als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2 worden geleverd. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De onafhankelijke projectmodule van Gibson Assembly werd voor het eerst getest in het voorjaarskwartaal van 2019 in CHEM/BIO 475. In 2020 en 2021 werd de cursus online gegeven vanwege de SARS-CoV-2-pandemie. Toen de persoonlijke instructie in het voorjaar van 2022 en 2023 werd hervat, werden studenten binnen de cursus uitgenodigd om deel te nemen aan een onderzoek naar de leerresultaten van een onafhankelijk project van Gibson Assembly waarbij originele, onderzoeksrelevante plasmiden zouden worden gekloond. In 2019 creëerden studenten een bibliotheek van plasmiden bestaande uit gencassettes uit het genoom van Micromonospora echinospora ATCC 15837 die werden gekloond in pKC1132 (Figuur 3). Deze plasmidebibliotheek wordt in ons onderzoekslaboratorium gebruikt om genen van belang te inactiveren in een vermeende biosynthetische gencluster voor het natuurlijke product TLN-05220¹⁵. Als aanvulling op onze geninactiveringsstudies hebben studenten in 2022 een kleine bibliotheek van genen van de vermeende TLN-05220-gencluster gekloond in pUC19 (figuur3); onze onderzoeksgroep heeft deze plasmiden gebruikt voor het subkloneren van genen in expressievectoren, waaronder pET28b, voor overexpressie en zuivering van eiwitten. Studenten in het cohort van 2023 hebben bijgedragen aan het lopende werk aan een biosynthetisch engineeringproject voor het epoxomicinesynthetase¹⁶. In teams van 3-4 kloonden studenten gemanipuleerde domeinen van niet-ribosomale peptidesynthetase¹⁷ modules in verschillende eiwitexpressievectoren om de overexpressie en zuivering van deze enzymen in ons onderzoekslaboratorium te optimaliseren (Figuur 3). Redundantie werd ingebouwd in het kloonplan voor elk cohort. Het cohort van 2019 bevatte bijvoorbeeld 44 studenten en 15 plasmiden werden aan de klas toegewezen om te klonen. Zo werd twee of drie keer geprobeerd elk plasmide te klonen.

Figuur 3: Samenvatting van gekloonde plasmiden en studentdeelnemers tijdens onafhankelijke projectiteraties in 2019, 2022 en 2023. Het Gibson Assembly-project is drie keer ingezet. In elk aanbod kloonden student-deelnemers een andere bibliotheek van plasmiden om te gebruiken in onderzoeksprojecten die biosynthetische routes onderzoeken. Projecten in 2019 en 2022 ondersteunden ons lopende werk aan het natuurlijke product TLN-05220¹⁵ met twee fragmenten (één gencassette of gen en een vector) Gibson Assembly-reacties. Het project van 2023 betrof domeinwisseling binnen modules 1 en 2 van een niet-ribosomaal peptidesynthetase (NRPS)-enzym dat betrokken is bij de biosynthese van epoxomicine¹⁶. De gearceerde fragmenten vertegenwoordigen twee verschillende mutanten van het verwisselde domein, en effen kleuren vertegenwoordigen domeinen die niet zijn verwisseld. In totaal werden acht verschillende genfragmenten (vier voor module 1 en vier voor module 2) gegenereerd met overhangs die compatibel zijn voor Gibson Assembly. Voor elke module werden twee verschillende combinaties van drie genfragmenten geassembleerd met een van de twee verschillende vectoren (pBAD33 en pET28, in totaal vier fragmenten per assemblage), voor het potentieel om acht gemanipuleerde NRPS-plasmiden te genereren. Wetenschapsiconen uit Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Overzicht assessment

Ten minste 1 week voor de start van het onafhankelijke Gibson Assembly-project werden studenten in de cohorten van 2022 en 2023 uitgenodigd om deel te nemen aan een onderzoek naar leerresultaten, dat op dezelfde manier is opgezet als een onderzoek dat werd uitgevoerd in een enquête van de laboratoriumcursus biochemie bij Cal Poly¹⁸. Student-deelnemers vulden een meerkeuze-pre-vragenlijst in tijdens de labvergadering vóór de start van het onafhankelijke project en een meerkeuze-post-vragenlijst tijdens de laatste labvergadering (d.w.z. nadat ze de Gibson Assembly-module hadden voltooid). De pre- en post-vragenlijsten bestonden uit 28 identieke vragen met twee extra vragen in de post-vragenlijst (30 in totaal). Er werden tien inhoudsvragen geschreven om de kennis van studenten over enzymen en mechanismen die betrokken zijn bij moleculair klonen te beoordelen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], Gibson-assemblage, transformatie, blauw-witte screening). De volgende zeven vragen vroegen studenten om zelf hun bekendheid met moleculaire kloneringstermen (bijv. DNA-polymerase, exonuclease, ligase) te beoordelen. De volgende 10 vragen stelden studenten in staat om zelf hun vermogen te beoordelen om moleculaire kloontechnieken uit te voeren (bijv. DNA-sequentieanalyse, restrictie-digestiereacties, agarosegelelektroforese). Studenten meldden ook of ze zich op hun gemak zouden voelen bij het nastreven van een carrière in de moleculaire biologie op basis van hun kennis van moleculaire kloontechnieken. In de post-vragenlijst werden twee aanvullende vragen opgenomen voor studenten om zelf te beoordelen of ze zich inzetten voor het leren in de cursus en of de cursus een waardevolle leerervaring was (aanvullend bestand 6 en aanvullend bestand 7). Alle gegevens van de pre- en post-vragenlijstantwoorden van studenten in 2022 en 2023 werden gecombineerd voor analyse en zijn beschikbaar in aanvullende tabel S1.

Protocol

De onderzoeken met menselijke deelnemers werden beoordeeld en goedgekeurd door proefpersonen in de Research Institutional Review Board van Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). De deelnemers gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.

Het volgende protocol schetst de voorbereiding van de instructeur (stappen 1.1-1.3), de acties van studenten voor een onderwijsmodule met drie experimenten die PCR omvat om lineaire fragmenten te verkrijgen (stappen 2.1-2.7), Gibson-assemblage, transformatie en selectie van klonen (stappen 3.1-3.5), plasmide-isolatie en screening (stappen 4.1-4.4) en beoordeling van leerresultaten (5.1-5.2). De voorbereiding van de instructeur beschrijft een representatief voorbeeld van het ontwerp van de primer en de voorbereiding van een gewenste plasmidekaart in silico. Alle secties van het protocol zijn aanpasbaar voor andere gewenste plasmiden. Elk studentenexperiment is verdeeld in twee labvergaderingen van 3 uur.

1. Voorbereiding van de instructeur

1. Gibson Assembly primer ontwerp met behulp van Benchling Assembly Wizard
   1. Bepaal de DNA-sjabloonbron voor de geninsert(s), zoals genomisch DNA, plasmide en synthetisch DNA.
      NOTITIE: Voor genen die zullen worden geamplificeerd uit complexe genomische DNA-sjablonen, wordt geadviseerd om eerst unieke bindingsplaatsen te bepalen voor primers binnen de genomische DNA-sjabloon die specifiek zijn voor het gen of de genen van belang, met behulp van de National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)²¹, zoals beschreven in aanvullend bestand 1. Voor eenvoudige sjablonen zoals plasmiden of synthetisch DNA gaat u verder met de volgende stap.
   2. Haal DNA-sequenties op van de geninsert(s) en vector (zie bijvoorbeeld polyketidehydroxylase-gensequentie en pUC19-sequentie geleverd als GenBank-bestanden in het aanvullende bestand 8). Importeer de gewenste insert-sequentie(s) en de gewenste vectorsequentie naar Benchling, elk als een nieuw DNA-sequentiebestand. Open elke geïmporteerde sequentie die moet worden opgenomen in de Gibson Assembly-reactie.
      NOTITIE: Men kan DNA-sequentiebestanden in verschillende formaten importeren, waaronder GenBank en FASTA. Men kan ook een sequentie rechtstreeks uit een database importeren met een toetredingsnummer of een nucleotidesequentie plakken die is gekopieerd uit een ander bestand of een andere viewer.
   3. Zoek onder aan het scherm de tool Assembly Wizard . Klik op Assembly Wizard en selecteer vervolgens Nieuwe assembly maken. Selecteer uit de beschikbare opties Gibson en klik op Start om de montage te starten.
   4. Selecteer in het vectorsequentievenster alle basen die in de assemblage moeten worden opgenomen uit de vectorbackbone. Begin de selectie op de nucleotidepositie aan het 3' -uiteinde van de geninsert (bijv. positie 657 van pUC19) en selecteer alle resterende nucleotiden die moeten worden opgenomen (bijv. via positie 656 om de volledige pUC19-sequentie op te nemen). Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Backbone onder aan het scherm | Fragment instellen.
      NOTITIE: Schakel tussen de weergaven Sequentiekaart en Plasmide van de vector om alle gewenste basissen van een cirkelvormige sjabloon te selecteren. Als u van plan bent het vectorfragment via restrictiedigest (in plaats van PCR) voor Gibson-assemblage voor te bereiden, kunt u de backbone-sequentie lineariseren met een restrictie-enzymknipplaats (bijv. XbaI). Klik hiervoor op de geknipte site, houd Shift ingedrukt en klik opnieuw op de geknipte site . Klik vervolgens op Fragment instellen om de backbone in te stellen. Houd er rekening mee dat vectorspecifieke primers niet worden gegenereerd door Benchling als de backbone wordt gelineariseerd met een restrictie-enzym in de Assembly Wizard.
   5. Selecteer in het venster met de invoegvolgorde alle basissen van de wisselplaat die in het merk moeten worden opgenomen. Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm | Fragment instellen.
   6. In het geval van meerdere gen-inserts, klikt u op de knop + aan de rechterkant van de Assembly Wizard. Selecteer in het venster voor de invoegvolgorde alle insteekvoetstukken die in het merk moeten worden opgenomen. Eenmaal geselecteerd, klikt u op het tabblad Invoegen onder aan het scherm | Fragment instellen.
   7. Zodra alle fragmenten zijn ingesteld, wijzigt u de naam van de assemblage naar de gewenste plasmidenaam en klikt u op Assembleren rechts van de assembly wizard. Selecteer de gewenste maplocatie voor zowel de Sequence Folder als de Primer Folder. Klik op Maken om de recombinante plasmidereeks samen te stellen.
   8. Open het geassembleerde plasmide en klik op Assemblagegeschiedenis om een eenvoudige plasmidekaart en een overzicht van de sequenties waaruit het is afgeleid weer te geven. Zorg ervoor dat de nucleotideposities voor elk fragment overeenkomen met het gewenste ontwerp.
   9. Bekijk op het tabblad Assemblageparameters de namen van de primers die voor de assemblage zijn ontworpen. Merk op dat er twee primers zullen worden ontworpen voor elke insert (een voorwaartse en een achterwaartse), en dat de primernamen zullen worden afgeleid van de titels van de DNA-sequentiebestanden. Zorg er ook voor dat de smelttemperaturen van de primer en de voorgestelde gloeitemperaturen compatibel zijn in dit venster (zie aanvullend bestand 8, Representatieve primers).
      1. Als de smelt- of gloeitemperaturen van de primer niet ideaal zijn, past u de primersequenties handmatig aan (bijv. het verwijderen van nucleotiden om de smelttemperatuur te verlagen) binnen de primersequentiebestanden. U kunt ook op Opnieuw openen klikken en de primerinstellingen aanpassen door op de knop Enzym-/primerinstellingen naast de knop Assembleren in de montagewizard te klikken. Herhaal vervolgens de montagestap en onderzoek de primersequenties opnieuw.
      2. Als een bibliotheek van plasmiden moet worden gekloond met veel verschillende genen die in dezelfde vectorruggengraat worden gekloond,
      3. Gebruik in elk geval hetzelfde primerpaar voor de vector. Om dit te doen, verwijdert u handmatig alle nucleotiden uit de vectorprimers die de overhangen zouden installeren die specifiek zijn voor de insert. Deze nucleotiden zouden worden gevonden aan het 5' -uiteinde van de primer. Zorg er na verwijdering voor dat de smelttemperaturen van de primer en de gloeitemperaturen compatibel zijn (zie aanvullend bestand 8, Representatieve primers).
      4. Zorg ervoor dat alle paren van de insteekprimer zeer vergelijkbare smelttemperaturen en gloeitemperaturen hebben.
         NOTITIE: Dit vermindert de noodzaak om de gloeitemperatuur van elk paar te optimaliseren en zorgt ervoor dat alle PCR-reacties van studenten tegelijkertijd kunnen worden gefietst met behulp van hetzelfde thermocyclerprogramma.
   10. Zodra het ontwerp van de primer voor de gewenste plasmiden is voltooid, klikt u op Voltooien in de montagewizard. Bestel de primers bij een DNA-synthesebedrijf en haal monsters op van de DNA-sjablonen voor insert(s) en vector.
   11. Test zowel insert- als vectorspecifieke primerparen voor optimale gloeitemperaturen met behulp van een gradiënt-PCR-experiment met de DNA-sjablonen. Test de door Benchling aanbevolen gloeitemperaturen in eerste instantie ± 3 °C.
   12. Zodra de gloeitemperaturen zijn bepaald, maakt u aliquots van primeroplossingen, DNA-sjablonen en noodzakelijke reagentia voor PCR-reacties voor studenten.
2. Geef de leerlingen vóór de experimenten werkbladen ter ondersteuning van de voorbereiding en om het begrip te beoordelen (Aanvullend Bestand 4, Aanvullend 5 en Aanvullend 6).
3. Gegevensverzameling over leerresultaten
   NOTITIE: Als u geïnteresseerd bent in het verzamelen van leerresultaatgegevens van de Gibson Assembly-module en het publiceren van de resultaten, zorg dan voor goedkeuring voor onderzoek met menselijke proefpersonen volgens het beleid van de instelling.
   1. Nodig de studenten uit om ten minste 1 week voor de start van het onafhankelijke project Gibson Assembly deel te nemen aan een onderzoek naar leerresultaten.
   2. Laat de student-deelnemers de meerkeuze-pre-vragenlijst (Aanvullend Dossier 6) invullen tijdens de labvergadering voor de start van het zelfstandige project.

2. Studentenexperiment A: PCR om lineaire fragmenten te verkrijgen

1. Verkrijg primers en sjabloon-DNA-oplossingen voor PCR bij de instructeur.
2. Pipetreacties van 25 μl, inclusief DNA-polymerase MasterMix, DNA-sjabloon, voorwaartse en achterwaartse primers en nucleasevrij water volgens de instructies in de studentenhandleiding (zie aanvullend bestand 2).
3. Cyclus de reactie in een thermocycler volgens de studentenhandleiding in aanvullend bestand 2. Zorg ervoor dat de gloeitemperatuur van de reactie geschikt is voor de primers en dat de verlengingstijd geschikt is voor de lengte van de gewenste amplicon. Raadpleeg Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3 voor gedetailleerde instructies.
4. Bewaar PCR-reacties bij 4 °C of -20 °C tot de volgende laboratoriumperiode.
5. Analyseer 5 μL van elke reactie via agarosegelelektroforese. Terwijl de gel draait, voegt u 1 μL DpnI-restrictie-enzym toe aan elke reactie die plasmide-DNA als sjabloon heeft gebruikt. Incubeer dit mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
   NOTITIE: DpnI zal alle resterende circulaire plasmide-DNA-sjabloon degraderen, waardoor het minder waarschijnlijk wordt dat het valse positieven verkrijgt in de transformatiestap.
6. Beeld de gel af om te bevestigen dat de PCR succesvol was en dat de juiste amplificatie werd bereikt. Zuiver eventuele succesvolle PCR-reacties met een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit. Meet de concentratie (ng/μL) van het gezuiverde PCR-product met behulp van een microvolumespectrofotometer voor gebruik in latere Gibson-assemblageberekeningen.
7. Ontwerp vóór de volgende klassikale bijeenkomst het reactierecept voor Gibson Assembly (zie aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 4).

3. Studentenexperiment B: Gibson Assemblage, transformatie en selectie van klonen

1. Pipetteer de Gibson Assembly-reactie volgens het ontworpen recept. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 50 °C. Terwijl reacties incuberen, bereid je je voor op transformatie door chemisch competente Escherichia coli-cellen op ijs te ontdooien.
2. Transformeer 2 μL van de Gibson Assembly in chemisch competente cellen via een hitteschok. Pipetteer 100 μL van de getransformeerde cellen op twee selectieplaten en verspreid met gesteriliseerde kralen. Bereid ^10-4, ^10-5 en ^10-6 verdunningen van de resterende cellen op Luria-Bertani (LB) agar. Plaat 100 μL van elke seriële verdunning op LB (geen selectie) en verspreid met gesteriliseerde kralen.
   NOTITIE: Deze stap maakt het mogelijk om de transformatie-efficiëntie te berekenen.
3. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Bewaar de platen bij 4 °C tot de volgende lesperiode.
4. Tel kolonies op alle platen en bereken de transformatie-efficiëntie volgens de instructies in aanvullend bestand 2. Streep een selectieve plaat met vier kolonies opnieuw uit een van beide selectieve platen en broed deze plaat een nacht uit bij 37 °C.
   NOTITIE: Dit dient als een back-upcultuur van je positieve klonen.
5. Selecteer, omcirkel en label met behulp van een stift vier verschillende kolonies op het selectieplaatje met de initialen van de leerling en een nummer (bijv. ABC1). Haal een nieuwe LB-agarplaat met antibioticum op voor selectie, gebruik een marker om de plaat in kwadranten (d.w.z. vierden) te verdelen en gebruik vervolgens ~1/2 van elke kolonie om opnieuw te strepen op het respectievelijke gelabelde kwadrant en de andere 1/2 om een vloeibare LB-cultuur van 5 ml te inoculeren voor elk van de vier geselecteerde kolonies. Zorg ervoor dat u de buisjes labelt met de respectieve kolonie-identiteit (bijv. ABC1) en voeg de juiste concentratie antibioticum toe voor selectie. Incubeer de vloeibare culturen in een schudbroedmachine 's nachts bij 37 °C en de agarplaat in een statische broedmachine bij 37 °C; bewaar vloeibare culturen en platen bij 4 °C tot de volgende lesperiode.

4. Studentenexperiment C: Plasmide-isolatie en screening

1. Isoleer plasmide-DNA uit de vloeibare culturen van experiment B met behulp van een miniprep-kit. Meet de concentratie van geïsoleerd plasmide (in ng/μL).
2. Ontwerp een restrictiedigest of PCR-scherm om de geïsoleerde plasmiden te analyseren (zie gedetailleerde instructies in aanvullend bestand 2 en rapporteer verwachtingen in aanvullend bestand 5).
3. Pipetteer de restrictie, verteer reacties of reacties volgens ontworpen recepten en incubeer bij eerder ontworpen temperaturen en duur.
4. Analyseer de resultaten via agarosegelelektroforese.

5. Beoordeling

1. Laat de student-deelnemers de meerkeuze-post-vragenlijst (aanvullend bestand 7) invullen tijdens de labvergadering nadat de Gibson Assembly-module is voltooid.
2. Combineer alle gegevens van de antwoorden voor en na de vragenlijst voor analyse.
   1. Onderzoek de statistische significantie van de toename van de gemiddelde score van elke individuele inhoudsvraag tussen de vragenlijsten met behulp van tweezijdige gepaarde t-toetsen en de d-effectgrootte van Cohen.
   2. Evalueer de toename van het zelfvertrouwen van studenten voor elke afzonderlijke term en techniek om de mate van verandering en de statistische significantie ervan te bepalen.
   3. Bepaal de impact van de achtergrond van de student en academische factoren op het leren van studenten door gebruik te maken van genormaliseerde leerwinst (NLG) en ongepaarde t-toetsen.
   4. Beoordeel de houding van de studenten ten opzichte van de projectervaring en de carrière in de moleculaire biologie door de gemiddelde scores te evalueren.

Resultaten

Succes van studenten in klonen
In elke iteratie van de Gibson Assembly-module (2019, 2022 en 2023) werd studenten gevraagd een rapport op te stellen met een samenvatting van hun bevindingen. In 2019 meldden 36 van de 44 studenten (81,8%) dat ze hun plasmiden met succes hadden gekloond op basis van de resultaten van het scherm dat ze voor Experiment C hadden ontworpen. In totaal rapporteerden 14 van de 20 studenten (70,0%) succes bij het klonen van hun toegewezen constructen in 2022, terwijl bij het teamgebaseerde project in 2023 12 van de 27 studenten (44,4% of 4 van de 8 groepen) succes rapporteerden op basis van hun screeninganalyses. De conclusies in de studentenrapporten werden beoordeeld door de instructeur of studentonderzoekers; Interpretaties van studenten werden gecorrigeerd als bleek dat de screeningsresultaten hun beweringen niet ondersteunden. Eén monster van elk afzonderlijk plasmide werd geanalyseerd door middel van Sanger-sequencing, waarbij de sequenties van de plasmide-inserts voor alle 15 gewenste plasmiden in 2019 en alle 12 plasmiden in 2022 werden bevestigd. In 2023 werd Oxford-nanopore-sequencing van het hele plasmide gebruikt om alle 8 plasmiden te analyseren; Slechts 1 van de 8 plasmiden kwam echter overeen met de gewenste sequentie.

Inhoudelijke beoordeling van concepten uit de moleculaire biologie
Het inhoudsgedeelte van de vragenlijst bestond uit 10 meerkeuzevragen die het begrip van studenten van moleculaire biologie en moleculaire kloonconcepten testten. Vergelijking van de gemiddelde inhoudsscores voor en na de vragenlijst voor alle 10 inhoudsvragen onthulde een significante stijging van 63,7% naar 80,4% (p < 0,05, dubbelzijdig gepaarde t-toets; Figuur 4), wat suggereert dat het onafhankelijke project van de Gibson Assembly het begrip van studenten van moleculaire biologie en kloonconcepten verbeterde. Een Cohen's d-test stelde vast dat deze significante toename overeenkomt met een grote effectgrootte (d = 0,891), wat een sterk verschil ondersteunt tussen de pre- en post-antwoorden van studenten op inhoudsvragen.

Figuur 4: Verbetering van het begrip van studenten van moleculaire biologie en moleculair klonen na het onafhankelijke project. Grafiek van de antwoorden van studenten op vragen over het testen van inhoud in moleculaire biologie en moleculair klonen voor en na voltooiing van het onafhankelijke project (steekproefomvang, n, van 46; Gibson Assembly Pre- en Post-vragenlijsten in respectievelijk aanvullend dossier 6 en aanvullend bestand 7). Gemiddelde pre- en post-scores werden geanalyseerd via een tweezijdige gepaarde t-toets, wat wijst op een significante toename van correcte antwoorden van leerlingen (p < 0,5). De vakken vertegenwoordigen de middelste 50% van de scores (d.w.z.^25e tot^75e percentielen) en de snorharen vertegenwoordigen de minimum- en maximumscores (%). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vervolgens onderzochten we of de toename van de gemiddelde score van elke individuele inhoudsvraag statistisch significant was tussen de pre- en post-vragenlijsten. Analyses met behulp van tweezijdige gepaarde t-tests toonden aan dat de antwoorden van studenten op vragen over PCR-reacties, DpnI-restrictie-digesten, Gibson Assembly-enzymen en Gibson Assembly-insert- en vectorsequenties significante verhogingen vertoonden (p < 0,05) na voltooiing van het onafhankelijke project. Deze op inhoud gebaseerde vragen hadden relatief lage pre-vragenlijstscores in vergelijking met het algemene inhoudsgemiddelde van 63,7%, met de laagste scores op vragen over DpnI-digesten en Gibson Assembly-enzymen (respectievelijk 34,8% en 47,8%). Het gemiddelde na het project voor de bovengenoemde vragen steeg tot respectievelijk 71,7% en 89,1%, wat dichter bij het algemene inhoudsgemiddelde van 80,4% ligt. Deze gegevens tonen aan dat tegen het einde van het project het begrip van studenten van zowel DpnI-digesten als Gibson Assembly-enzymen verbeterde met een grotere effectgrootte dan het algemene inhoudsgedeelte van de vragenlijst (d = 0,982).

Attitudinale beoordeling van moleculair-biologische termen en laboratoriumtechnieken
De attitudevragen werden in de studentenvragenlijst opgesplitst in twee secties. In het eerste deel beoordeelden de studenten zelf hun kennis van zeven termen uit de moleculaire biologie op een schaal van 1-4 (1 = "Ik heb geen idee wat deze term betekent" tot 4 = "Ik weet wat deze term betekent en zou het gemakkelijk aan iemand anders kunnen uitleggen"). De gemiddelde termijnbetrouwbaarheid nam significant toe van 3,52 naar 3,87 met een grote effectgrootte (respectievelijk p = 5,32 × 10-15 en d = 1,40; Figuur 5A). Het tweede attitudinale gedeelte vroeg studenten of ze het eens waren met de stelling "Ik voel me op mijn gemak bij het uitvoeren ..." elf verschillende laboratoriumtechnieken voor moleculaire biologie op een schaal van 1-5 (1 = "Helemaal mee oneens" tot 5 = "Helemaal mee eens"). Het gemiddelde vertrouwen van deze elf technieken nam significant toe van 3,82 naar 4,33 met een grote effectgrootte (p = 2,08 × ^10-11 en d = 1,09; Figuur 5B).

Figuur 5: Verhoogd vertrouwen van studenten in hun begrip van moleculaire biologie en kloontermen en -technieken na het onafhankelijke project. Doos- en snorhaardiagrammen van het vertrouwen van studenten in moleculaire biologie (A) termen en (B) technieken in de pre- en post-vragenlijsten (Gibson Assembly Pre- en Post-Questionnaires in Supplemental File 6 en Supplemental File 7, respectievelijk). Voor termvertrouwen (paneel A) selecteerden studenten vertrouwen op een 4-delige schaal (1-"Ik heb geen idee wat deze term betekent" tot 4-"Ik weet wat deze term betekent en zou het gemakkelijk aan iemand anders kunnen uitleggen"; steekproefomvang n van 45). Het vertrouwen in de laboratoriumtechniek (paneel B) werd beoordeeld op een 5-delige schaal (1-Helemaal mee oneens tot 5-Helemaal mee eens; steekproefomvang n van 42). Gemiddelde pre- en post-scores werden geanalyseerd via tweezijdige gepaarde t-tests, wat wijst op een significante toename van het vertrouwen van studenten voor zowel de term- als de techniekdatasets (p < 0,5). Het vak toont de middelste 50% (d.w.z.^25e tot^75e percentielen) van de antwoorden met snorharen die minimale en maximale subjectieve betrouwbaarheidsrangschikkingen weergeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

We evalueerden de toename van het zelfvertrouwen van studenten voor elke individuele term en techniek en stelden vast dat elke term behalve DNA-polymerase en -transformatie een statistisch significante toename vertoonde (p < 0,05, tweezijdig gepaarde t-toets; Tabel 1). Elke student behalve één markeerde "Ik weet wat deze term betekent en kan het gemakkelijk aan iemand anders uitleggen" voor de term DNA-polymerase op zowel de pre- als de post-vragenlijsten, dus er was geen ruimte voor verbetering in die term (Tabel 1). Voor de transformatieperiode koos 73,91% van de studenten het hoogste betrouwbaarheidsniveau (nummer 4 op de schaal) in de pre-enquête, vergeleken met 80,4% in de post-enquête. Negen van de elf beoordeelde laboratoriumtechnieken vertoonden een significante toename van het zelfvertrouwen van studenten; dit is exclusief molariteitsberekeningen en gelelektroforese (tabel 1). Gemiddeld rapporteerden studenten hoge pre-vragenlijstscores voor beide technieken (respectievelijk 4,71 en 4,57, versus een techniekgemiddelde van 3,81), wat aangeeft dat studenten al vertrouwen hadden in deze termen voorafgaand aan het Gibson Assembly-project. Vragen die het vertrouwen van studenten in algemene biologievragen beoordeelden (bijv. DNA-polymerase, gelelektroforese, molariteitsberekeningen) vertoonden over het algemeen geen statistisch significante veranderingen (Tabel 1). Alle gespecialiseerde Gibson Assembly-vragen vertoonden echter een significante toename met de grootste effectgroottes (d > 1,6), waarbij de techniek 'Gibson Assembly' de grootste verandering in het zelfvertrouwen van studenten liet zien (Tabel 1 en Figuur 6).

Soort inhoud	Term/Techniek	Reactie van Avg Questionnare		Statistische significantie		Effect Grootte (d)
		Pre	Verzenden	p-waarde	Ja/Nee
Algemene biochemie	DNA-polymerase term	3.98	3.98	Ongedefinieerde	Nee	0
	Molariteit Berekening Techniek	4.71	4.77	4.45E-01	Nee	0.130
	Gel elektroforese techniek	4.57	4.68	1.68E-01	Nee	0.254
Moleculair klonen	Primers ontwerpen Techniek	3.05	3.57	7.23E-04	Ja	0.536
	In silico klonen Techniek	3.61	4.07	5.75E-04	Ja	0.533
	Blauw-witte afscherming Term	3.59	4.34	4.10E-06	Ja	0.655
	PCR-screening term	3.78	4.31	1.02E-06	Ja	0.936
	Gibson Assembly Term	2.87	3.78	7.41E-13	Ja	1.69
	Gibson Assemblage Techniek	2.59	4.20	1.14E-15	Ja	1.61

Tabel 1: Significante stijgingen met betrekking tot attitudevragen gericht op moleculair klonen, maar niet op algemene biochemie. Het gemiddelde op de pre- en post-vragenlijst (Gibson Assembly Pre- en Post-Questionnaires in Supplemental File 6 en Supplemental File 7, respectievelijk) voor geselecteerde term- en techniekvragen. Tweezijdige gepaarde t-testen werden gebruikt om de significantie te beoordelen (als p < 0,05, ja; als p ≥ 0,05, nee). Voor de term DNA-polymerase waren de antwoorden van de studenten identiek tussen de pre- en post-vragenlijst, dus p is niet gedefinieerd. De effectgrootte van het vergelijken van de antwoorden van studenten voor elke pre- en post-vraag werd bepaald met behulp van de d-waarden van Cohen (d ≥ 0,8 wordt als een groot effect beschouwd). Hoe groter de effectgrootte, hoe groter de kans dat de pre- en post-responsen duidelijk zijn binnen de steekproefset. De steekproefomvang n is 45 en 42 voor respectievelijk term- en techniekvragen. Afkorting: AVG = gemiddeld.

Figuur 6: Verhogingen voor attitudevragen over Gibson Assembly. Aantal antwoorden voor studenten meldde vertrouwen in de Gibson Assembly (A) term en (B) techniek in de pre- en post-vragenlijsten. De antwoorden op termbetrouwbaarheid waren op een 4-delige schaal (1 - "Ik heb geen idee wat deze term betekent" tot 4 - "Ik weet wat deze term betekent en zou het gemakkelijk aan iemand anders kunnen uitleggen"). De antwoorden op het vertrouwen van de laboratoriumtechniek varieerden van 1-Helemaal mee oneens tot 5-Helemaal mee eens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vervolgens hebben we beoordeeld of achtergrondfactoren van studenten van invloed zijn op hoeveel een student heeft geleerd van het onafhankelijke project. Het is aangetoond dat zowel prestatieperceptie¹⁹ als prestatiekloof²⁰ blijven bestaan in niet-gegradueerde STEM-cursussen vanwege geslacht; daarom gebruikten we genormaliseerde leerwinst (NLG) en ongepaarde t-toetsen om te bepalen of een vergelijkbare genderkloof werd waargenomen in deze onafhankelijke projecten. Op basis van deze statistische tests ontdekten we niet dat het geslacht van studenten een impact had op de leerresultaten van studenten. We hebben ook gecontroleerd of academische factoren zoals major, GPA, cijfers in eerder cursuswerk en het eindcijfer in BIO/CHEM 475 een significant verband hadden met de leerresultaten van studenten van het onafhankelijke project. Terwijl studenten met als hoofdvak biochemie (aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2) hogere GPA's en eindcursuscijfers hadden en elk afzonderlijk een hogere gemiddelde NLG vertoonden, vertoonden de ongepaarde t-tests geen statistische significantie tussen deze individuele achtergrondfactoren en leerresultaten. Ongepaarde t-testen werden ook gebruikt om verschillen in NLG tussen de cohorten van 2022 en 2023 te beoordelen. Het cohort van 2023 bleek een significant hogere leerwinst te hebben dan het cohort van 2022 voor de inhoudsvragen (aanvullende tabel S3). Dit geeft aan dat ondanks het lagere slagingspercentage van het klonen van het cohort van 2023, ze een beter begrip kregen van moleculaire biologie en moleculaire kloonconcepten dan het cohort van 2022. Hoewel de redenen voor dit verschil onduidelijk zijn, tonen deze gegevens aan dat succes met klonen niet nodig is voor effectief onderwijs met deze module.

Naast het evalueren van de beheersing van laboratoriumtechnieken door studenten, beoordeelden we hun houding ten opzichte van de projectervaring en de carrière in de moleculaire biologie. Eén vraag, die zowel in de pre- als post-projectbeoordelingen aan bod kwam, peilde naar hun comfortniveau bij het nastreven van een loopbaan met moleculaire biologietechnieken. Uit de resultaten blijkt dat het project het comfort van studenten in de carrière van de moleculaire biologie aanzienlijk heeft verbeterd (p = 8,46 × ^10-5), waarbij de gemiddelde score steeg van 3,60 naar 4,09 op onze schaal van 1-5. Bovendien bevatte de vragenlijst na het project vragen over de toewijding van studenten aan het maximaliseren van hun leerervaring en hun beoordeling van de waarde van het project. Respondenten beoordeelden hun inzet met een gemiddelde van 4,48 en beschouwden het project als een zeer waardevolle leermogelijkheid, met een gemiddelde beoordelingsscore van 4,73. Alles bij elkaar onderstrepen deze bevindingen de waarde van het onafhankelijke project voor de academische groei van studenten, evenals het enthousiasme en vertrouwen in de inspanningen van de moleculaire biologie.

Aanvullende tabel S1: Geanonimiseerde onbewerkte gegevens. Alle antwoorden en majors van studenten uit de pre- en post-vragenlijsten die zijn verzameld tijdens de iteraties van 2022 en 2023 van de Gibson Assembly CURE-module. Raadpleeg Aanvullend Dossier 6 en Aanvullend Dossier 7 om respectievelijk de bijbehorende voor- en navragen te zien. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Verschillen in genormaliseerde leerwinst per major voor elk onderdeel van de vragenlijst. Ongepaarde t-toetsen bepaalden dat geen enkel vraagtype significante verschillen vertoonde in genormaliseerde leerwinst (NLG) per hoofdvak (p < 0,05). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S3: Verschil in genormaliseerde leerwinst per cohort voor elk onderdeel van de vragenlijst. Ongepaarde t-tests toonden aan dat het cohort van 2023 een significant hogere genormaliseerde leerwinst (NLG) heeft voor inhoudsvragen in vergelijking met het cohort van 2022 (p < 0,05). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Instructeurshandleiding voor Gibson Assembly CURE-module. Een handleiding voor instructeurs om de Gibson Assembly CURE-module te implementeren. Er worden stapsgewijze instructies gegeven voor instructeurs om zich voor te bereiden op de cursus door Gibson Assembly Primers te ontwerpen en te screenen op basis van hun interessante sjabloon. De onderwerpen en activiteiten die instructeurs tijdens elk college en elke labperiode voor experimenten AC-oefeningen moeten behandelen, worden geschetst. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Studentenhandleiding voor Gibson Assembly CURE-module. Een handleiding om aan studenten te geven, inclusief relevante achtergrondinformatie over Gibson Assembly en stapsgewijze protocollen voor elk experiment (AC). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Experiment A planningswerkbladen (individueel en team). Individuele en teamwerkbladen voor studenten om PCR-amplificatie voor Gibson Assembly-fragment(en) te begrijpen en zich erop voor te bereiden. Slechts één van deze werkbladen mag door de instructeur worden toegewezen op basis van de structuur van het onafhankelijke project (individueel of teamgebaseerd). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Experiment B planningswerkblad. Studentenwerkblad om te helpen bij de berekeningen die nodig zijn voor het instellen van de Gibson Assembly-reactie. Het aantal fragmenten in het werkblad kan worden aangepast op basis van het kloonontwerp voor de plasmiden van belang. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Experiment C planningswerkblad. Werkblad voor studenten om te helpen bij het ontwerpen van een restrictiedigest of PCR-experiment om te screenen op het plasmide van belang. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Gibson Assembly Pre-vragenlijst. Vragenlijst met achtentwintig vragen die aan studenten wordt gegeven voorafgaand aan de start van de Gibson Assembly CURE-module. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: Gibson Assembly Post-vragenlijst. Vragenlijst met dertig vragen die aan studenten wordt gegeven na het voltooien van de Gibson Assembly CURE-module. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 8: Zip-map met GenBank (.gb) sequentiebestanden van een polyketidehydroxylase-gen, pUC19-vector en Gibson-geassembleerd plasmide, en tabel met representatieve primers. Raadpleeg deze bestanden voor een voorbeeldig primerontwerp in de wizard Benchling Assembly en voor het voltooien van werkbladen voor experimentele planning. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier stellen we een aanpasbaar niet-gegradueerd klassikaal laboratoriumproject voor dat studenten moleculair klonen leert door middel van Gibson Assembly in een cursusgebaseerde onderzoeksomgeving. In totaal werden 28 nieuwe plasmiden gekloond door niet-gegradueerde studenten in een klaslokaal. Het door individuele studenten gerapporteerde succes varieerde van 44,4% tot 81,8% over drie cohorten, en het totale succes van klonen was 80% (28 van de in totaal 35 toegewezen plasmiden werden met succes gekloond). Het lagere succes van klonen in 2023 was waarschijnlijk te wijten aan twee samengestelde factoren. Eerst werden buisjes met sjabloon-DNA-monsters gelabeld met zeer nauw verwante namen; het is mogelijk dat er verwisselingen waren van de DNA-sjablonen die door student-onderzoekers waren opgesteld, wat leidde tot de combinatie van niet-compatibele lineaire fragmenten tijdens de Gibson Assembly-reactie die door studenten in het onderwijslaboratorium werd uitgevoerd. In toekomstige iteraties van dit project moet sjabloon-DNA eerst worden gesequenced of gescreend met een restrictiedigest om de juiste identiteit te bevestigen voordat het aan studenten wordt verstrekt. Ten tweede bestond de iteratie van dit project in 2023 uit assemblages met vier fragmenten (één vector en drie inserts), in tegenstelling tot assemblages met twee fragmenten in voorgaande jaren (één vector en één insert). Dit kan ook het succes van het klonen voor dit project hebben verminderd, omdat meer fragmenten in Gibson Assembly de reactie-efficiëntie kunnen verlagen²². In toekomstige iteraties van dit project kan meer redundantie worden ingebouwd door meer groepen hetzelfde plasmide te laten klonen of door groepen meerdere Gibson-assemblagereacties te laten opzetten met verschillende insert-to-vector-verhoudingen om de kans op succesvolle plasmideligatie en -transformatie te vergroten. Bovendien kan het opnemen van langere overlappingen tussen fragmenten en het verlengen van de incubatietijd van de Gibson Assembly-reactie het succes in assemblages met 4-6 fragmenten vergroten²³.

Naast het klonen van nieuwe plasmiden, geven de enquêteresultaten voor en na het project aan dat studenten hun begrip van moleculaire biologie en moleculaire kloonconcepten hebben verbeterd, met de hoogste effectgrootte voor vragen met betrekking tot het klonen van Gibson Assembly. Bovendien verbeterde het zelfgerapporteerde vertrouwen van studenten in termen van moleculaire biologie en laboratoriumtechnieken aanzienlijk na voltooiing van het project voor de meerderheid van de beoordeelden. Gibson Assembly is een belangrijke en veelzijdige moleculaire kloontechniek die wordt gebruikt in academisch onderzoek en in de biotechnologie-industrie². Door deze concepten en praktische vaardigheden in een laboratoriumcursus te onderwijzen, hebben alle niet-gegradueerde studenten gelijke kansen om af te studeren met onderzoekscompetentie en inhuurbare vaardigheden wanneer ze de arbeidsmarkt betreden of vervolgonderwijs volgen.

Het beschreven Gibson Assembly-curriculum omvat de vijf componenten van een succesvolle CURE⁴. Studenten gebruikten wetenschappelijke praktijken door hun eigen protocollen te ontwerpen, inclusief doelen en verwachtingen op basis van PCR-amplicongroottes en limietdigest-sneden (aanvullend bestand 3, aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5). Het onafhankelijke project bevordert de samenwerking tussen studenten door de voorbereiding van elk vereist fragment te verdelen over de leden binnen een groep en uiteindelijk de fragmenten van elk groepslid te gebruiken in één ligatiereactie (Experiment A Planning Worksheet (Team-Based) in Supplemental File 3). De plasmiden die deze onafhankelijke projecten wilden klonen, zijn plasmiden met nieuwe expressie die relevant zijn voor onderzoeksprojecten buiten het klaslokaal, en die mogelijk gegevens opleveren voor publiceerbaar onderzoek. Net als bij een meer traditionele onderzoekservaring, waren de slagingspercentages voor klonen in de CURE-cursus niet 100%. Studenten werd gevraagd om variabelen te evalueren die mogelijk negatieve resultaten hebben opgeleverd en om hypothesen voor te stellen die verklaren waarom het plasmide niet met succes is gekloond, wat dient als een authentieke leerervaring voor studenten met betrekking tot onderzoeksresultaten.

In deze Gibson Assembly CURE-iteratie kloonden studenten plasmiden die relevant zijn voor onderzoek naar natuurlijke producten van Actinomycetota; De workflow is echter ook zo ontworpen dat deze in hoge mate kan worden aangepast aan andere projecten. De hier gepresenteerde protocollen zijn gegeneraliseerd, waardoor studenten plasmiden kunnen klonen die voor een groot aantal onderzoeksdoeleinden kunnen worden gebruikt binnen zes laboratoriumvergaderingen en twee lezingen. Het raamwerk stelt studenten in staat om nieuwe plasmiden individueel te klonen, of voor studenten om samen te werken om een enkel plasmide te klonen uit >2 lineaire fragmenten in een teamgebaseerde aanpak. Over het algemeen kan deze aanpak worden aangepast aan een breed scala aan onderzoeksprojecten die mogelijk een verschillend gebruik van Gibson Assembly vereisen.

Deze studie evalueerde de leerwinst van studenten door middel van een op CURE gebaseerde benadering van het onderwijzen van Gibson Assembly, maar aanvullend inzicht kon worden verkregen door uitbreiding van de studie. Hoewel het pre- en post-vragenlijstformaat evaluatie van leerresultaten mogelijk maakte dankzij het onafhankelijke project, werd er geen vergelijking gemaakt met het op colleges gebaseerde onderwijs van Gibson Assembly. Een vergelijking van de op experimenten gebaseerde CURE met een op colleges gebaseerde of een meer traditionele laboratoriumactiviteit, waarbij de experimentele resultaten al zijn ontworpen voor studenten, zou meer inzicht geven als verbeterde Gibson Assembly-leerresultaten specifiek zijn voor het CURE-cursusmodel. Ten slotte, terwijl sommige inhoudelijke vragen met betrekking tot Gibson Assembly aanzienlijke verbeteringen in begrip vertoonden, deden andere dat niet. Vragen met betrekking tot de homologe overlappingen die worden gebruikt in Gibson Assembly, hoe ze zijn geïnstalleerd en hoe ze recombineren in een Gibson Assembly-kloonreactie verbeterden niet. Dit suggereert dat verdere uitleg of een aanvullende leerbeoordeling over deze onderwerpen het begrip van studenten zou kunnen verbeteren in toekomstige implementaties van dit curriculum.

De onafhankelijke projectstructuur van Gibson Assembly wordt nog steeds geïmplementeerd bij Cal Poly. In toekomstige iteraties van de cursus zal dit project worden aangepast om een hogere onafhankelijkheid van studenten, het genereren van hypothesen en experimenteel ontwerp mogelijk te maken. Een aanstaande curriculumwijziging bij Cal Poly biedt de mogelijkheid om het onafhankelijke project uit te breiden met door studenten geleid primerontwerp, selectie van vectorruggengraat, sequentieanalyse en/of stroomafwaarts testen van plasmiden, zoals voor eiwitexpressie. Bovendien kan het onafhankelijke project worden aangepast om andere relevante moleculair-biologische technieken te onderwijzen, zoals plaatsgerichte mutagenese of genbewerking, afhankelijk van de behoeften van lopende onderzoeksprojecten. Het wijzigen van de technieken die studenten in het onafhankelijke project gebruiken, zou meer onderscheidingsvermogen kunnen bieden over welke onderwerpen geschikt zijn voor het CURE-formaat en welke moeilijk te implementeren blijken te zijn.

Alles bij elkaar beschrijft dit rapport een aanpasbare Gibson Assembly-onderwijsmodule die een CURE implementeert om zowel het begrip van studenten van een opkomende kloonmethodologie te verbeteren als om de competentie in het wetenschappelijke proces te vergroten. Het onafhankelijke project verbeterde de leerresultaten van studenten en het vertrouwen in de meeste beoordeelde termen en technieken in de moleculaire biologie. We moedigen het gebruik en de aanpassing van deze module aan om niet alleen nieuwe onderzoeksplasmiden te creëren, maar ook om de toegankelijkheid van en het vertrouwen in onderzoekstechnieken voor studenten te verbeteren, waardoor studenten beter worden voorbereid op toekomstige carrières in STEM. Idealiter zal dit werk leiden tot verbeteringen in de curricula van de moleculaire biologie en het aanpassingsvermogen van STEM-cursussen aanmoedigen naarmate wetenschappelijke onderzoeksmethodologieën zich blijven ontwikkelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs, 10  mM)	Fisher Scientific	FERR0191	Homemade' MasterMix component
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	FERR0861	Homemade' MasterMix component
DpnI	New England Biolabs	R0176S	1000 units
Fisherbrand Isotemp Microbiologische Incubator	Fisher Scientific	15-103-0513
FisherBrand Isotemp Water Bath	Fisher Scientific	S28124
GelRed Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	NC9594719	10,000X
GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	Thermo Scientific	FERK0831	100 Preps
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM0314	100 applications
LB Broth, Miller	Fisher BioReagents	BP9723-500	500 g
Magnesium chloride hexahydrate	Fisher Scientific	BP214-500	Homemade' MasterMix component
Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler	Eppendorf	6337000027
Microfuge 16 Centrifuge	Beckman Coulter	A46474
Micromonospora echinospora bacteria	American Type Culture Collection	ATCC 15837
Microwave Oven	General Electric	2440640
Molecular Biology Grade Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	100 g
Nanodrop One Microvolume Spectrophotometer	Thermo Scientific	13-400-518
NEB 5-alpha Competent E. coli	New England Biolabs	C2987H	20 x 0.05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621S	10 reactions
New Brunswick Innova 40 Benchtop Orbital Shaker	New Brunswick	M1299-0090
Nuclease Free Water	Fisher BioReagents	BP248450	50 mL
PEG-8000	Fisher Scientific	BP233-100	Homemade' MasterMix component
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530	Homemade' MasterMix component
Portable Balance	Ohaus	SKX123
pUC19 vector	New England Biolabs	N3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S	100 reactions
T5 Exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Homemade' MasterMix component
Taq DNA Ligase	New England Biolabs	M0208	Homemade' MasterMix component
Tris-HCl	Fisher Scientific	AAA1137918	Homemade' MasterMix component
TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)	Thermo Scientific	FERR1161	5 x 1 mL
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4019	100 Preps
β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)	New England Biolabs	B9007S	Homemade' MasterMix component