Methodenartikel

CIRCLE-Seq voor ondervraging van off-target genbewerking

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67069

⸱

1 november 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Gates Institute, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

In dit artikel

Samenvatting

Een belangrijke barrière voor technologieën zoals CRISPR zijn de off-target gebeurtenissen die vitale genen kunnen verstoren. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is een techniek die is ontworpen om onbedoelde splitsingsplaatsen te identificeren. Deze methode brengt de genoombrede activiteit van CRISPR-Cas9 met hoge gevoeligheid en zonder bias in kaart.

Samenvatting

Circularisatie voor In Vitro Rapportage van Splitsingseffecten door Sequencing (CIRCLE-seq) is een nieuwe techniek die is ontwikkeld voor de onpartijdige identificatie van onbedoelde splitsingsplaatsen van CRISPR-Cas9 door middel van gerichte sequentiebepaling van CRISPR-Cas9 gesplitst DNA. Het protocol omvat het circulair maken van genomisch DNA (gDNA), dat vervolgens wordt behandeld met het Cas9-eiwit en een interessant gids-RNA (gRNA). Na de behandeling wordt het gesplitste DNA gezuiverd en bereid als een bibliotheek voor Illumina-sequencing. Het sequencingproces genereert lezingen met gepaarde uiteinden, die uitgebreide gegevens bieden over elke splitsingsplaats. CIRCLE-seq biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere in vitro methoden, waaronder minimale sequencingdiepte-eisen, lage achtergrond en hoge verrijking voor Cas9-gesplitst gDNA. Deze voordelen vergroten de gevoeligheid bij het identificeren van zowel bedoelde als onbedoelde splitsingsgebeurtenissen. Deze studie biedt een uitgebreide, stapsgewijze procedure voor het onderzoeken van de off-target activiteit van CRISPR-Cas9 met behulp van CIRCLE-seq. Dit protocol wordt bijvoorbeeld gevalideerd door genoombrede onbedoelde splitsingsplaatsen van CRISPR-Cas9 in kaart te brengen tijdens de modificatie van de AAVS1-locus . Het hele CIRCLE-seq-proces kan in twee weken worden voltooid, waardoor er voldoende tijd is voor celgroei, DNA-zuivering, bibliotheekvoorbereiding en Illumina-sequencing. De invoer van sequentiegegevens in de CIRCLE-seq-pijplijn vergemakkelijkt een gestroomlijnde interpretatie en analyse van splitsingsplaatsen.

Inleiding

Genoommanipulatie heeft de afgelopen twintig jaar aanzienlijke vooruitgang geboekt, met als belangrijke mijlpaal de ontdekking van geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)-Cas9 in 20121. Door gebruik te maken van de programmeerbare aard van bacteriële DNA-endonucleasen, maakt CRISPR-Cas9-technologie nauwkeurige targeting en modificatie van bijna elke DNA-sequentie mogelijk. Sinds de oprichting is het systeem geoptimaliseerd om alleen te vertrouwen op het Cas9-endonuclease en een gids-RNA (gRNA) om specifieke genomische regio's te bewerken. Het potentieel van CRISPR-Cas9 als curatieve therapie is aangetoond in klinische onderzoeken voor verschillende aandoeningen, zoals aangeboren amaurosis van Leber, transthyretine-amyloïdose en sikkelcelanemie, onder andere 2,3,4.

CRISPR-Cas9 induceert dubbelstrengs breuken (DSB's), die doorgaans worden opgelost door een van de twee mechanismen: de foutgevoelige niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of de preciezere homologiegerichte reparatie (HDR), op voorwaarde dat er een sjabloon-DNA beschikbaar is. De neiging van CRISPR-Cas9 om NHEJ-geassocieerde inserties en deleties (indels) te veroorzaken, samen met splitsing op onbedoelde genomische plaatsen, beperkt de toepassing ervan in klinische omgevingen 5,6,7,8,9,10. Bovendien kunnen onbedoelde genomische modificaties cryptische splitsingsplaatsen, onzin- of missense-mutaties creëren, chromothripsis induceren of een oncogeen potentieel verlenen aan celresultaten die zijn waargenomen in verschillende onderzoeken naar genoombewerking 11,12,13,14,15. Concluderend is het nauwkeurig identificeren van de off-target activiteit van CRISPR-Cas9 cruciaal voor de klinische toepassingen ervan, met name in systemische gentherapieën die miljarden cellen kunnen veranderen.

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om CRISPR-Cas9 off-target splitsingsplaatsen te identificeren, waaronder Genome-wide Unbiased Identification of Double-stranded breaks (GUIDE)-seq16, waarbij dubbelstrengs oligodeoxynucleotiden worden gebruikt om DSB's in levende cellen te labelen. Desalniettemin is een punt van kritiek op deze methode dat valse positieven kunnen voortkomen uit willekeurige DSB's of uit PCR-artefacten, die moeten worden weggegooid door vastgelegde sites uit te sluiten die een slechte gelijkenis vertonen met de on-target sites. De methode gebaseerd op het gebruik van Integrase-Defective Lentiviral Vector (IDLV) is minder gevoelig en zal waarschijnlijk veel off-target sites missen17. Andere in situ-methoden zoals DSBCapture, BLESS en BLISS 18,19,20 betrekken vaste cellen en labelen DSB's rechtstreeks, maar ze worden beperkt door hun afhankelijkheid van onmiddellijke DSB-vangst en de afwezigheid van exogeen DNA. Digenome-seq21, een in vitro methode, en Selective enrichment and Identification of Tagged genomic DNA Ends by sequencing (SITE-seq)22 bieden beide sequencing-oplossingen, maar hebben hun beperkingen in respectievelijk achtergrondruis en single-end analyse. Ontdekking van in situ Cas off-targets en verificatie door sequencing (Discover-Seq)23 biedt in vivo en in situ identificatie van Cas9-activiteit via MRE11-binding, maar detecteert alleen DSB's die bestaan op het moment van monstervoorbereiding24. Ten slotte maakt Inference of CRISPR Edits (ICE) gebruik van een bio-informaticabenadering om CRISPR-bewerkingen robuust te analyseren met behulp van Sanger-gegevens25.

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde procedure voor Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq): een in vitro techniek die de genoombrede off-target activiteit van Cas9 nuclease in een complex met het gRNA van belang26 gevoelig en onpartijdig in kaart brengt. Deze aanpak begint met het kweken van de cellen van belang en het isoleren van DNA, gevolgd door willekeurige afschuiving door middel van gerichte ultrasone trillingen en vervolgens exonuclease- en ligasebehandeling. Dit proces produceert uiteindelijk cirkelvormige dubbelstrengs DNA-moleculen, die vervolgens worden gezuiverd door middel van plasmideveilige DNase-behandeling. Dit circulaire DNA wordt vervolgens blootgesteld aan het Cas9-gRNA-complex, dat zich splitst op zowel bedoelde als onbedoelde splitsingsplaatsen, waarbij blootgestelde DNA-uiteinden achterblijven die fungeren als substraten voor Illumina-adapterligatie. Dit proces produceert een gevarieerde bibliotheek van genomisch DNA (gDNA) die beide uiteinden van elke nuclease-geïnduceerde DSB bevat, zodat elke lezing alle informatie bevat die nodig is voor elke splitsingsplaats. Dit maakt het gebruik van Illumina-sequencing mogelijk met lagere sequencing-dekkingsvereisten, waardoor CIRCLE-seq zich onderscheidt van andere vergelijkbare methoden die hierboven zijn genoemd. Het is belangrijk op te merken dat hoewel CIRCLE-seq een hogere off-target gevoeligheid heeft dan andere protocollen als in-vitromethode , dit ten koste gaat van hogere fout-positieven vanwege de afwezigheid van het epigenetische landschap dat aanwezig is in andere methoden zoals GUIDE-seq16. Bovendien zijn DSB-DNA-reparatie en de bijbehorende machinerie niet aanwezig in CIRCLE-seq, waardoor indels of juiste reparatie worden opgeheven die anders zou worden waargenomen.

Naast het beschrijven van het stapsgewijze protocol om CIRCLE-seq uit te voeren, wordt het protocol gevalideerd door bijvoorbeeld genoombrede onbedoelde splitsingsplaatsen van CRISPR-Cas9 te identificeren die optreden tijdens de modificatie van de AAVS1-locus . Dit eenvoudig te volgen protocol biedt gedetailleerde instructies, van de kweek van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en gDNA-isolatie tot gDNA-circularisatie, Cas9-gRNA-splitsing, bibliotheekvoorbereiding, sequencing en pijplijnanalyse. Gezien de lage dekkingsvereisten voor sequencing, is CIRCLE-seq beschikbaar voor elk laboratorium met toegang tot sequencing van de volgende generatie.

Protocol

De details van de reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Celcultuur (5 dagen)

  1. Neem een negatieve controle op in dit protocol. Bereid voldoende cellen voor op een extra 25 μg gDNA (~2.0e, 7 cellen per monster).
  2. Cultuur iPSC's volgens het vastgestelde protocol27. Verzamel de cellen en suspendeer ze opnieuw in 10 ml PBS. Pipetteer een celmonster van 6 μl en resusinfecteer in een verhouding van 1:1 met trypanblauw. Gebruik een geautomatiseerde cellenteller om de steekproef te tellen.
  3. 2 x 107 cellen per buisje en vervolgens gedurende 3 minuten bij 25 °C bij 300 x g centrifugeren (kamertemperatuur (RT)). Dit is voldoende voor meerdere replicaten. Pipetteer af en gooi de supernatant weg.

2. Genomische DNA-isolatie (1 dag)

  1. Gebruik de in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskit om het gDNA te isoleren, volgens de instructies van de fabrikant:
    1. Voeg 200 μl PBS toe aan een conische buis van 15 ml met de celpellet en suspendeer opnieuw. Piket vervolgens 3 ml cellysisbuffer en 15 μl proteïnase K in de buis. Keer de tube 25 keer om om goed te mengen. Plaats de buis in een waterbadschudder die is ingesteld op 55 °C en 150 tpm gedurende 3 uur, of een nacht voor een optimale DNA-opbrengst.
    2. Pipetteer in 15 μL RNase A. Keer 25 keer om. Plaats gedurende 1 uur in een waterbad van 37 °C.
    3. Koel het monster 5 minuten op ijs. Voeg vervolgens 1 ml eiwitprecipitatieoplossing toe, vortex op hoge snelheid gedurende 20 s en centrifugeer op 2000 x g gedurende 10 minuten bij RT. Eiwitten moeten een zichtbare, compacte pellet vormen op de bodem van de buis. Als de pellet niet zichtbaar is, incubeer het monster dan nog 5 minuten op ijs en centrifugeer opnieuw.
    4. Voeg 3 ml 100% isopropanol toe aan een nieuwe conische tube van 15 ml. Piket het bovenstaande uit stap 2.1.3 voorzichtig in de buis. Keer de buis 50 keer om om te mengen en centrifugeer vervolgens 3 minuten bij 2000 x g en kamertemperatuur. Zonder de DNA-pellet te verstoren, zuigt u het bovenstaande voorzichtig op met behulp van een pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümval en keert u de buis om op een schoon, pluisvrij doekje.
    5. Pipetteer 3 ml 70% (v/v) ethanol op de DNA-pellet en keer 10 keer om om te wassen. Centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 3 minuten bij RT. Giet vervolgens voorzichtig de supernatant af.
    6. Houd het buisje open en laat de resulterende DNA-pellet 30 minuten drogen, zorg ervoor dat alle ethanol volledig is verdampt. Pipetteer er 50 μL DNA-hydratatieoplossing in en meng grondig door voorzichtig te pipetteren.
    7. Los het DNA op door het monster gedurende 1 uur in een waterbadschudder bij 65 °C te plaatsen en laat het monster vervolgens een nacht bij RT staan. Centrifugeer het monster bij RT en 2.000 x g gedurende 1 minuut en gebruik de dsDNA BR-testkit met bijbehorende buisjes om het geïsoleerde DNA te kwantificeren met de fluorometer.

3. Bereiding van gRNA (7 dagen)

  1. Bestel het synthetische gRNA van interesse bij een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Dit protocol is ook compatibel met crRNA/tracrRNA.

4. gRNA in vitro splitsingstest

OPMERKING: Hier wordt een doelwit in het AAVS1-gen gebruikt. Om andere interessante genen aan te pakken, ontwerpt u primers (tabel 1) om het doelgebied te versterken en vervangt u de primers in de volgende stappen door aangepaste primers.

  1. Bereid de PCR-reactie voor: Meng 25 μL Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix (eindconcentratie 1x), 0,5 μL AAVS1 F Primer (eindconcentratie 0,1 μM), 0,5 μL AAVS1 R Primer (eindconcentratie 0,1 μM), 5 μL gDNA (100 ng, 20 ng/μL, uit stap 2.1.6) en 19 μL nucleasevrije H2O (Totaal volume: 50 μL).
  2. Gebruik de volgende thermocyclerparameters: Denaturatie: 98 °C gedurende 2 min (1 cyclus), Denaturatie: 98 °C gedurende 10 s (10 cycli), Gloeien: 72-62 °C (-1 °C/cyclus) gedurende 15 s (10 cycli), Verlenging: 72 °C gedurende 30 s (10 cycli), Denaturatie, 98 °C gedurende 10 s (30 cycli). Gloeien: 65 °C gedurende 15 s (30 cycli), Verlenging: 72 °C gedurende 30 s (30 cycli), Eindverlenging: 72 °C gedurende 5 min (1 cyclus), Vasthouden: 4 °C voor onbepaalde tijd.
  3. Gebruik AMPure XP-korrels om het product van de PCR-reactie te zuiveren. Piket eerst in 1,8x volumes, of 90 μl, XP-korrels op het PCR-product. Pipetteer tien keer om goed te mengen. Laat het mengsel 5 minuten op RT staan om te incuberen.
  4. Scheid met behulp van een magnetisch rek de kralen van de oplossing door de PCR-reactieplaat 3 minuten op de magneet te plaatsen. Pipetteer de geklaarde oplossing af en gooi deze weg. Voeg 200 μL 80% ethanol (v/v) toe aan de korrels, incubeer gedurende 30 s en verwijder vervolgens de ethanol. Herhaal deze wasstap twee keer om er zeker van te zijn dat de ethanol volledig is verwijderd.
  5. Laat de monsters 3 minuten op natuurlijke wijze drogen door de plaat op de magneet te plaatsen. Verwijder de plaat van de magneet en voeg 40 μL TE-buffer toe, pH 8,0. Meng door tien keer op en neer te pipetteren. Laat het monster 2 minuten op RT staan.
  6. Plaats de PCR-reactieplaat nog een minuut op de magneet. Breng na 1 minuut het bovenstaande over op een nieuwe plaat. Meet de gezuiverde PCR-opbrengst met behulp van een spectrofotometer en analyseer deze op een TapeStation met behulp van een optische buisstrip met een optische buisstripdop, samen met High Sensitivity D1000 ScreenTape en High Sensitivity D1000 reagentia (ladder en buffer), volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het voorbereide monster maximaal enkele maanden bij -20 °C.
  7. Verdun Cas9-nuclease-eiwit als volgt tot 1 μM: Meng 2 μL 10x Cas9-buffer (eindconcentratie 1x), 1 μL Cas9-nuclease, S. pyogenes (eindconcentratie 1 μM) en 17 μL nucleasevrije H2O in een totaal volume van 20 μL.
  8. Voer een RNase-vrije procedure uit om gRNA-afbraak te voorkomen. Verdun gRNA (vanaf stap 3.1) tot 3 μM in H2O tot een totaal volume van 10 μL.
    OPMERKING: Gebruik de volgende formule om het molecuulgewicht van gRNA te schatten: Molecuulgewicht van ssRNA (g/mol) = (lengte van ssRNA (nt) x 321,47 g/mol) + 18,02 g/mol. Ter referentie: een 104 nt lang gRNA bij 3 μM is ongeveer 100 ng/μL.

5. DNA-afschuiving (3 uur)

  1. Bereid de ME220 voor door eerst de bedieningsarm te richten. Vul vervolgens het reservoir met gezuiverd gedeïoniseerd H2O. Ga op de laptop van het controlestation naar Water Works en klik op Vullen. Stel de temperatuur in op 4,5 °C.
  2. Breng 25 μg gDNA over in een microbuisje (microbuisje-130 AFA Fiber Screw-Cap). Vul vervolgens de buis tot een totaal volume van 130 μL met 1x TE. Gebruik de volgende voorwaarden om het DNA te knippen tot een gemiddelde lengte van ca. 300 bp: stel de duur in op 10 s; piekvermogen tot 70; Factor invoerrechten % tot 20; cycli/burst tot 50; dit alles stelt het gemiddelde vermogen automatisch in op 14.0.

6. Zuiveren van afgesneden genomisch DNA (1 uur)

  1. Verdeel het afgeknipte genomische DNA in twee porties van elk 65 μL. Zuiveren met 1,8 keer het volume XP-korrels (117 μl), volgens de procedure die wordt beschreven in de stappen 4.3-4.6. Breng het bovenstaande over op een nieuwe PCR-plaat en meet de hoeveelheid met behulp van een spectrofotometer.
  2. Laat 1 μL van het geëlueerde geschoren gDNA op een TapeStation lopen, volgens de instructies van de fabrikant, om ervoor te zorgen dat het gDNA wordt afgeschoven tot een brede verdeling van ca. 300 bp. Bewaar het geschoren gDNA indien nodig maximaal enkele maanden bij -20 °C.

7. Voorbereiding van de CIRCLE-seq bibliotheek (3 dagen)

  1. Haarspeld adapter gloeien
    1. Resuspendeer oSQT1288 (Tabel 1), de haarspeldadapter, tot een eindconcentratie van 100 μM in 1x TE.
    2. Voer het gloeien van de adapter als volgt uit: meng 40 μL oSQT1288 (eindconcentratie 40 μM), 10 μL 10x STE (eindconcentratie 1x) en 50 μL nucleasevrije H2O voor een totaal volume van 100 μL.
    3. Gebruik de volgende gloeiparameters: 95 °C gedurende 5 min, -1 °C per min gedurende 70 cycli, onbeperkt op 4 °C houden.
  2. Eindreparatie uitvoeren. Gebruik de PCR-vrije HTP-bibliotheekvoorbereidingskit en bereid de End-Repair Master Mix voor.
    1. Meng 8 μL nucleasevrije H2O, 7 μL 10x end-repair buffer (eindconcentratie 1x) en 5 μL end-repair enzymmix (eindvolume 20 μL Total End-Repair Master Mix).
    2. Pipetteer 20 μl van het end-repair mastermengsel in het geschoren gDNA-monster uit de stappen 4.3-4.6. Meng 20 μL End-Repair Master Mix met 50 μL geschoren gDNA voor een eindvolume van 70 μL.
    3. Plaats het mengsel 30 minuten in een thermocycler op 20 °C en houd het vervolgens onbeperkt op 4 °C.
    4. Voeg 1,7x volumes, of 120 μL, XP-kralen toe en volg de zuiveringsstappen van stap 4.3-4.6. Elute met 42 μL TE, pH 8,0. Zorg ervoor dat de kralen in oplossing blijven voor de volgende stap.
  3. Voer A-tailing uit. Bereid met behulp van de HTP Library Preparation (PCR-vrije) Kit de A-tailing Master Mix.
    1. Meng 5 μL 10x A-tailing buffer (eindconcentratie 1x) en 3 μL A-tailing enzym (totaal eindvolume van 8 μL A-tailing Master Mix).
    2. Pipetteer 8 μl van de A-tailing Master Mix in elk DNA-monster dat kralen bevat uit stap 7.2.4, waarbij 8 μl A-tailing Master Mix wordt gemengd met 42 μl End-Repaired DNA dat kralen bevat (totaal eindvolume van 50 μl). Plaats in een thermocycler bij 30 °C gedurende 30 min. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1,8 volumes, of 90 μl, PEG/NaCl SPRI-oplossing (een onderdeel van de HTP Library Preparation Kit (PCR-vrij; 96 reacties)) op het A-staart-DNA. Zuiver het A-staart DNA volgens stap 4.3-4.6. Elueer het A-staart-DNA in 30 μL TE, pH 8,0. Bewaar de kralen in oplossing voor de volgende stap.
  4. Voer de ligatie van de adapter uit. Bereid met behulp van de HTP Library Preparation Kit (PCR-vrij) de Adapter Ligation Master Mix voor.
    1. Meng 10 μL 5x ligatiebuffer (eindconcentratie 1x), 5 μL DNA-ligase en 5 μL gegloeide haarspeldadapter (40 μM) uit stap 7.1.3. Zorg voor de eindconcentratie 4 μM voor een totale Adapter Ligation Master Mix van 20 μL.
    2. Pipetteer 20 μl Adapter Ligation Master Mix in elk geëlueerd DNA-monster dat kralen bevat uit stap 7.3.3 (totaal eindvolume van 50 μl per monster).
    3. Plaats gedurende 1 uur in een thermocycler bij 20 °C. Onbeperkt op 4 °C houden.
    4. Breng 1x volumes, of 50 μL, PEG/NaCl SPRI-oplossing over naar het adapter-geligeerde DNA en zuiverings volgens de stappen 4.3-4.6. Elute met 30 μL TE, pH 8,0, en decanteer de supernatanten in een nieuwe halfrok PCR-plaat. Combineer en kwantificeer het DNA met behulp van de dsDNA BR-assay. Bewaar indien nodig gezuiverd adapter-geligeerd DNA maximaal 1 maand bij -20 °C.
  5. Bereid de Lambda Exonuclease/Exonuclease I (E. coli) Master Mix voor (dient bij het elimineren van enkel- of dubbelstrengs DNA zonder adapters die aan beide uiteinden zijn afgebonden).
    1. Neem 1 μg Adapter Ligated DNA uit stap 7.4.4 en verdun het tot 40 μl. Meng 5 μL 10x Exonuclease I reactiebuffer (eindconcentratie 1x), 4 μL Lambda Exonuclease (eindconcentratie 0,4 E/μL) en 1 μL Exonuclease I (E. coli) (eindconcentratie 0,4 U/μL) voor een totaal volume van de Lambda Exonuclease/Exonuclease I Master Mix van 10 μL.
    2. Pipetteer 10 μL van de Lambda Exonuclease/Exonuclease I Master Mix op 40 μL (1 μg) adapter-geligeerd DNA (totaal volume van 50 μL). Plaats in een thermocycler bij 37 °C gedurende 1 uur, vervolgens 75 °C gedurende 10 min. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1,8x volumes, of 90 μL, XP-korrels naar het met Lambda Exonuclease/Exonuclease I behandelde DNA. Zuiveren volgens de instructies in de stappen 4.3-4.6. Elute in 40 μL TE, pH 8,0. Zorg ervoor dat de kralen in oplossing blijven voor de volgende enzymatische stap.
  6. Behandel met USER-enzym en T4 polynucleotidekinase (PNK). Bereid de USER/T4 PNK Master Mix voor (nodig om de 4-bp overhangen los te maken en om de ligatieklare DNA-uiteinden voor te bereiden die nodig zijn voor de daaropvolgende ligatiereactie).
    1. Meng 5 μL 10x T4 DNA Ligasebuffer (Eindconcentratie 1x), 3 μL USER-enzym (Eindconcentratie 0,05 E/μL) en 2 μL T4 PNK (Eindconcentratie 0,4 E/μL), voor een totaal volume van de USER/PNK-mastermix van 10 μL.
    2. Pipetteer 10 μL van de USER Enzyme/T4 PNK Master Mix op 40 μL lambda en exonuclease I-behandeld DNA-monster met kralen uit stap 7.5.3 voor een totaal volume van 50 μL. Plaats gedurende 1 uur in een thermocycler bij 37 °C. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1,8x volumes, of 90 μl, PEG/NaCl SPRI-oplossing op het DNA dat is behandeld met USER/T4 PNK en zuiver volgens de stappen 4.3-4.6. Eluet in 35 μL TE, pH 8,0. Decanteer het bovenstaande in een nieuwe halfgerokte PCR-plaat. Combineer en kwantificeer het DNA met behulp van de dsDNA HS-assay.
  7. Voer intramoleculaire circularisatie uit. Bereid de Circularization Master Mix voor.
    1. Meng 8 μL nucleasevrije H2O, 10 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer (eindconcentratie 1x) en 2 μL T4 DNA-ligase (eindconcentratie 8 E/μL), voor een totaal volume van de Circularization Master Mix van 20 μL.
    2. Pipetteer 20 μL van de Circularization Master Mix op 500 ng DNA behandeld met USER/PNK uit stap 7.6.3. Verdun 500 ng DNA behandeld met USER/PNK in 80 μl en voeg vervolgens 20 μl van de Circularization Master Mix toe (totaal volume van 100 μl). Incubeer in een thermocycler bij 16 °C gedurende 16 uur (nacht).
    3. Voeg 1x volumes, of 100 μL, XP-kralen toe aan het gecirkelde DNA en zuiver op volgens de stappen 4.3-4.6. Elute in 38 μL TE, pH 8,0. Decanteer het bovenstaande in een nieuwe halfgerokte PCR-plaat.
  8. Behandelen met Plasmide-Safe ATP-Dependent DNase. Bereid de plasmideveilige ATP-afhankelijke DNase-mastermix voor (nodig voor de afbraak van resterend lineair DNA).
    1. Meng 5 μL 10x Plasmide-veilige reactiebuffer (eindconcentratie 1x), 2 μL ATP (eindconcentratie 1 mM) en 5 μL Plasmide-Safe ATP-afhankelijke DNase (eindconcentratie 1 U/μL), voor een totaal volume van de Plasmid-Safe Master Mix van 12 μL.
    2. Pipetteer 12 μL van de ATP-afhankelijke DNase Master Mix op 38 μL circulair DNA uit stap 7.7.3 (totaal volume van 50 μL). Incubeer in een thermocycler bij 37 °C gedurende 1 uur en vervolgens 70 °C gedurende 30 min. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1x volumes, of 50 μL, XP-korrels in het DNA dat is behandeld met Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase en zuiver volgens de stappen 4.3-4.6. Elute in 15 μL TE, pH 8,0. Decanteer het bovenstaande in een nieuwe halfgerokte PCR-plaat.
    4. Combineer het DNA en kwantificeer met behulp van de dsDNA HS-assay. Bewaar het gecirkelde DNA indien nodig maximaal enkele maanden bij -20 °C.

8. Splitsen van enzymatisch gezuiverd, circulair gDNA in vitro (2 uur)

  1. Voer in vitro splitsing uit met het Cas9:gRNA-complex. Bereid de in vitro Cleavage Master Mix. Meng 5 μL 10x Cas9 Buffer (Eindconcentratie 1x), 4,5 μL S. Pyogenes Cas9 (Eindconcentratie 90 nM) en 1,5 μL gRNA (Eindconcentratie 90 nM) voor een totaal Cleavage Master Mix-volume van 11 μL.
  2. Houd de splitsingsmastermix 10 minuten op RT om Cas9:gRNA RNP-complexen te vormen.
  3. Verdun 125 ng met Plasmid-Safe DNase behandeld DNA uit stap 7.8.3 tot een eindvolume van 39 μl. Voeg vervolgens 11 μL van de Cleavage Master Mix toe aan 39 μL Plasmid-Safe DNase-behandeld DNA voor een totaal volume van 50 μL.
    OPMERKING: Neem in deze stap een negatief controlemonster op, dat bestaat uit circulair DNA gemengd met Cas9-buffer, zonder het Cas9:gRNA-complex.
  4. Incubeer in een thermocycler gedurende 1 uur bij 37 °C. Onbeperkt op 4 °C houden. Voeg 50 μL (1x volume) XP-korrels toe aan het in vitro gesplitste DNA en zuiver het DNA volgens de stappen 4.3-4.6. Elute in 42 μL TE-buffer, pH 8,0. Zorg ervoor dat de kralen in oplossing blijven voor de volgende stap.

9. Voorbereiding van de next-generation sequencing library (4 - 6 uur)

  1. Voer A-tailing uit. Bereid de A-tailing Master Mix voor.
    1. Meng 5 μL 10x A-tailing Buffer (Eindconcentratie 1x) en 3 μL A-tailing Enzyme (totaal volume van de A-tailing mastermix is 8 μL).
    2. Pipetteer 8 μL van de A-tailing Master Mix op 42 μL geëlueerd DNA-monster met kralen uit stap 8.4 (totaal volume van 50 μL). Plaats 30 minuten in een thermocycler bij 30 °C. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1,8x volumes PEG/NaCl SPRI-oplossing, of 90 μl, naar het A-staart-DNA en zuiver het DNA volgens de stappen 4.3-4.6. Eluet in 25 μL TE, pH 8,0. Zorg ervoor dat je de kralen in oplossing bewaart voor de volgende stap.
  2. Voer de ligatie van de adapter uit. Bereid de Adapter Ligation Master Mix voor.
    OPMERKING: Aliquots voor eenmalig gebruik van NEB-adapters moeten worden voorbereid om de vorming van adapterdimeren te voorkomen die wordt veroorzaakt door door vriesdooi geïnduceerde hydrolyse van de 3' T'.
    1. Meng 10 μL 5x ligatiebuffer (eindconcentratie 1x), 5 μL DNA-ligase en 10 μL adapter voor sequencing (eindconcentratie is 3 μM), voor een totaal van 25 μL.
    2. Pipetteer 25 μl van de Adapter Ligation Master Mix in 25 μl A-staartig DNA-monster met kralen uit stap 9.1.3. Plaats 1 uur in een thermocycler bij 20 °C. Onbeperkt op 4 °C houden.
    3. Pipetteer 1x volumes, of 50 μL, PEG/NaCl SPRI-oplossing op het adapter-geligeerde DNA en zuiver het DNA volgens de stappen 4.3-4.6. Eluet in 47 μL TE, pH 8,0. Zorg ervoor dat de kralen in oplossing blijven voor de volgende enzymatische stap.
  3. Voer een behandeling uit met USER-enzym (genereert een enkele nucleotidekloof bij uracilresiduen).
    1. Voeg 3 μL USER-enzym (inbegrepen in Dual Index Primers Kit) toe aan het adapter-geligeerde DNA-monster dat kralen bevat uit stap 9.2.3. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    2. Voeg 35 μL (0,7x volume) PEG/NaCl SPRI-oplossing toe aan het met USER-enzym behandelde DNA en zuiver volgens de stappen 4.3-4.6. Eluet in 20 μL TE-buffer, pH 8,0. Breng het bovenstaande over naar een nieuwe halfgerokte PCR-plaat en meet de DNA-concentratie met behulp van de dsDNA HS-test. De verwachte concentratie moet ca. 2-5 ng/μL.
  4. (Optioneel) Voordat we doorgaan naar de volgende stap, kan de DNA-grootteselectie worden uitgevoerd met behulp van PippinHT. Gebruik de 1,5% PippinHT cassette met een maatbereik van 250-850 bp. De resulterende monsters kunnen in de volgende stap direct in de PCR worden gebruikt.
  5. PCR uitvoeren voor het toevoegen van barcodes
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de gekozen primersequentiecombinaties voor elk monster uniek zijn. Indien mogelijk moet elk monster unieke i5- en i7-barcodes hebben.
    1. Bereid de PCR Master Mix voor om barcodes met gepaarde index toe te voegen. Meng 5 μL nucleasevrije H2O, 25 μL 2x HotStart Ready Mix (eindconcentratie 1x), 5 μL i5 Primer (eindconcentratie 1 μM) en 5 μL i7 Primer (eindconcentratie 1 μM) (totaal mastermixvolume van 40 μL).
    2. Pipetteer 40 μL van de PCR Master Mix op 10 μL gezuiverd DNA behandeld met USER-enzym (ca. 20 ng) vanaf stap 9.3.2 (totaal volume van 50 μL).
    3. Kies de volgende PCR-thermocyclische omstandigheden: Denaturatie: 98 °C gedurende 45 s gedurende 1 cyclus, Denaturatie: 98 °C gedurende 15 s gedurende 20 cycli, Gloeien: 65 °C gedurende 30 s gedurende 20 cycli, Verlenging: 72 °C gedurende 30 s gedurende 20 cycli, Eindverlenging: 72 °C gedurende 1 min gedurende 1 cyclus, Vasthouden: 4 °C voor onbepaalde tijd.
    4. Voeg 0,7x volumes, of 35 μL, XP-korrels toe aan het PCR-product en zuiver volgens de stappen 4.3-4.6. Eluet in 30 μL TE, pH 8,0. Decanteer het bovenstaande in een nieuwe halfgerokte PCR-plaat. Bewaar het gecirkelde DNA indien nodig maximaal enkele maanden bij -20°C.
      OPMERKING: Voer een monster van de PCR uit op Tapestation om de kwaliteit van de bibliotheek te controleren en om de vorming van adapterdimeren te beoordelen. Als adapterdimers worden gedetecteerd, herhaalt u stap 9.5.4.

10. Kwantificering van CIRCLE-seq-bibliotheken door middel van druppel digitale PCR (dd_PCR) (6 uur)

OPMERKING: Kwantificering kan ook worden uitgevoerd met behulp van qPCR, Tapestation of een vergelijkbare methode.

  1. Begin met 5 μL DNA uit de bibliotheek (PCR stap 9.5.4) goed gemengd met 45 μL nucleasevrije TE, maak vervolgens 1:10 seriële verdunningen van elk monster in volumes van 50 μL, variërend van 10-1 tot 10-8 verdunning.
    1. Stel de dd_PCR Master Mix-voorraadoplossing in. Meng 11 μL 2x dd_PCR mix voor sondes (eindconcentratie 1x), 0,055 μl sonde oSQT1310 (eindconcentratie 250 nM), 0,055 μl sonde oSQT1311 (eindconcentratie 250 nM), 0,099 μl primer oSQT1274 (eindconcentratie 450 nM), 0,099 μl primer oSQT1275 (eindconcentratie 450 nM) en 6,292 μl nucleasevrije H2O, voor een totaal dd_PCR Master Mix-volume van 17,6 μL. Bereid een mastermix voor alle monsters voor om ervoor te zorgen dat de volumes voldoende zijn voor nauwkeurig pipetteren.
    2. Analyseer de drie laagste verdunningen (10-6,10-7 en 10-8) in tweevoud (op een plaat met 96 putjes). Er moet een niet-sjabloonbesturingselement (NTC) worden gebruikt.
    3. Pipetteer 17,6 μL van dd_PCR Master Mix op elk monster als volgt: Meng 17,6 μL met 4,4 μL van het monster (voeg nucleasevrije H2O toe aan het putje met NTC), voor een totaal volume van 22 μL. Sluit de plaat af en centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 2000 x g bij RT.
  2. Voer druppelgeneratie, thermocycling en analyse uit. Breng met behulp van een PCR-systeem met druppellezer een DG8-cartridge (8 putjes) over in de cartridgehouder. Doseer in de olierij van de patroon 70 μL druppelgenererende olie voor sondes.
    OPMERKING: Neem 20 μL van het monster uit stap 10.1.2. en voeg het toe aan de voorbeeldrij van de cartridge met 8 putjes, bedek de cartridge met de DG8 rubberen pakking, plaats deze in de druppelgenerator en sluit deze vervolgens om het proces (automatisch) te starten. Als u klaar bent, verwijdert u de cartridge en verplaatst u 40 μl van de druppelrij van de cartridge met 8 putjes naar een halfomzoomde PCR-plaat met 96 putjes, waarbij u ervoor zorgt dat u langzaam pipet.
    1. Plaats het heatblock in de PX1 PCR-plaatafdichter. De sealer begint op te warmen tot 180 °C wanneer deze wordt ingeschakeld. Leg de folie heatseal op de plaat en zorg ervoor dat de rode lijn er bovenop ligt. Plaats de plaat in de PX1 en druk op Seal.
    2. Kies de volgende Thermocycler-omstandigheden: Enzymactivering: 95 °C gedurende 10 min voor 1 cyclus, Denaturatie: 94 °C gedurende 30 s gedurende 40 cycli, Gloeien/Verlengen: 60 °C gedurende 1 min gedurende 40 cycli, Enzymdeactivering: 98 °C gedurende 10 min gedurende 1 cyclus, Vasthouden: 4 °C voor onbepaalde tijd.
    3. Open op de druppellezer de compatibele software en selecteer welke putjes moeten worden gelezen. Selecteer ABS als experimenttype en dd_PCR Supermix voor sondes. Kies 1l: onbekend voor doel 1 en l2 onbekend voor doel 2. Selecteer Toepassen en vervolgens OK. Plaats de plaat in de druppellezer. Voor de verfset kies je FAM/HEX en klik je op Uitvoeren.
  3. Analyseer de dd_PCR resultaten. Bereken de populatie met dubbele positieve druppels met de negatieve controle als referentie. Bereken het gemiddelde van de dubbele waarden en vermenigvuldig dit vervolgens met de verdunningsfactor en de 5-voudige verdunningsfactor van de dd_PCR.
    OPMERKING: Het totale aantal kopieën per microliter wordt als volgt berekend: totaal aantal kopieën per microliter = gemiddelde waarde × verdunningsfactor 5 ×, waarbij 'gemiddelde waarde' staat voor de gemiddelde kwantificeringswaarde van Ch1 en Ch2.
  4. Combineer alle monsters in een enkele bibliotheek met equimolaire concentraties. De 1x gepoolde bibliotheek moet ca. 4,5 x 109 moleculen bevatten en een totaal volume van 5 μL hebben.

11. Sequencing van de volgende generatie

  1. Dien de monsters voor sequencing in bij een extern bureau, zodat de juiste adaptersequenties worden genoteerd.

12. CIRCLE-seq data-analyse (1 - 3 uur)

  1. Installeer Python versie 2.7, Burrows-Wheeler Aligner (BWA) en SAMtools. Download het referentiegenoom (bijv. hg38) van http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz.
    OPMERKING: Als het genoom van de doelsoort niet beschikbaar is, kan de CIRCLE-seq-computationele workflow worden uitgevoerd in een referentie-onafhankelijke modus. In deze situatie kan deze stap worden overgeslagen.
  2. Download en installeer de CIRCLE-seq pipeline met de volgende commando's: (1) git clone https://github.com/tsailabSJ/circleseq.git, (2) cd circleseq, (3) pip install -r requirements.txt.
  3. Maak een manifestbestand in YAML-indeling (.yaml). Hieronder vindt u een voorbeeldmanifest dat kan worden gebruikt met de voorbeelddataset in de CIRCLE-seq-software om de workflow te testen.
    OPMERKING: (1) referentiegenoom: data/input/CIRCLEseq_test_genome.fa; (2) analysis_folder: gegevens/output; (3) bwa: bwa; (4) Samtools: Samtools; (5) read_threshold: ; (6) window_size: ; (7) mapq_threshold: ; (8) start_threshold: ; (9) gap_threshold: ; (10) mismatch_threshold: ; (11) merged_analysis: Waar; (12) Monsters: U2OS_EMX1; (13) Doel: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAANGG; (14) lezen1: gegevens/invoer/EMX1.r1.fastq.gz; (15) LEES 2: Gegevens/invoer/EMX1.r2.fastq.gz; (16) controlread1: gegevens/invoer/EMX1_control.r1.fastq.gz; (17) controlread2: gegevens/invoer/EMX1_control.r2.fastq.gz; (18) beschrijving: U2OS. De volgende manifeste waarden werden gebruikt: read_threshold: 4, window_size: 3, mapq_threshold: 50, start_threshold: 1, gap_threshold: 3, mismatch_threshold: 6
  4. Definieer het referentiegenoom FASTA-bestand, de uitvoermap voor analyse en de paden naar de BWA- en SAMtools-opdrachten. Definieer de doelsequenties en de paden naar de gedemultiplexte FASTQ-bestanden voor zowel de nuclease-gesplitste als de controlemonsters. Meerdere experimenten kunnen tegelijkertijd in batchmodus worden verwerkt door ze allemaal in één manifestbestand op te nemen.
  5. Voer de volgende opdracht uit voor standaardanalyses op basis van referenties: (1) python /path/to/circleseq.py all - manifest; (2) /path/to/manifest.yaml.
  6. U kunt ook de volgende opdracht uitvoeren voor standaard analyses die niet op verwijzingen zijn gebaseerd: (1) Python /path/to/circleseq.py reference-free - manifest; (2) /pad/naar/manifest.yaml.
  7. Wanneer u de volledige pijplijn uitvoert, zoekt u de uitvoerresultaten van elke stap op een afzonderlijke output_folder die voor die specifieke stap is aangewezen.

Resultaten

Hier wordt CIRCLE-seq gebruikt om de nuclease-geïnduceerde splitsingsplaatsen van Cas9 te onderzoeken in een complex met het gRNA dat is ontworpen om zich te richten op de adeno-geassocieerde virusintegratieplaats 1 (AAVS1) met behulp van DNA geïsoleerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Dit gRNA werd eerder beschreven in onze publicatie27. Ongeveer 25 μg gDNA werd geïsoleerd uit iPSC's, afgeschoren door middel van gefocusseerde ultrasoonbehandeling en de grootte werd geselecteerd met behulp van AMPure XP-parelzuivering om fragmenten van ongeveer 300 bps op te leveren. Van deze 25 μg DNA werd ca. 2-5 ng DNA met succes gecirculariseerd voor in vitro Cas9:gRNA-splitsing. De hele procedure is weergegeven in figuur 1.

Na een CIRCLE-seq-procedure en analyse met behulp van onze berekeningsworkflow, wordt een visualisatie van alle gedetecteerde on- en off-target splitsingsplaatsen weergegeven in Figuur 2A. De CIRCLE-seq-pijplijn leverde ook 'samengevoegde lezingen', geanalyseerd via statistische software R om een Manhattan-plot op te leveren met de gedetecteerde nuclease-geïnduceerde splitsingsplaatsen die langs elk chromosoom in kaart zijn gebracht (Figuur 2B).

figure-results-1
Figuur 1: Schema's van de CIRCLE-seq-workflow. De belangrijkste stappen van het protocol worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: CIRCLE-seq visualisatie en Manhattan Plot. (A) Uitlijning van off-target sites ten opzichte van het beoogde doel voor de AAVS1-locus. De doelvolgorde wordt bovenaan weergegeven, waarbij off-doelen worden gerangschikt op basis van het aantal gelezen boeken in aflopende volgorde. Verschillen in de oorspronkelijke doelsequenties worden weergegeven door gekleurde nucleotiden. Een voorbeeld van de belangrijkste onbedoelde splitsingsplaatsen voor de AAVS1-locus wordt getoond. (B) Manhattan-plot die de gedetecteerde onbedoelde splitsingsplaatsen voor de AAVS1-locus illustreert. Staafhoogtes vertegenwoordigen het aantal gelezen waarden voor elke chromosomale positie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AbcVolgorde (5'-3')Opmerkingen/Beschrijving
AAVS1 Enkelvoudig gids-RNA (sgRNA)GGGGCCACUAGGGACAGGAUVoor AAVS1 Locus' Fluorescent Protein Knock-In
AAVS1 Voorwaartse PrimerGCTCTGGGCGGAGGAATATGVoor gRNA in vitro splitsingstest
AAVS1 Omgekeerde PrimerATTCCCAGGGCCGGTTAATGVoor gRNA in vitro splitsingstest
oSQT1288/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaTCIRCLE-seq haarspeld adapter
oSQT1274AATGATACGGCGACCACCGAGTruSeq F1
oSQT1275CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTruSeqF2
oSQT1310/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/TruSeq-sonde
oSQT1311 zei:/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/TruSeq-sonde

Tabel 1: Sequenties van gRNA en primers gebruikt voor CIRCLE-seq-analyse van de AAVS1-locus .

Discussie

Hier wordt aangetoond dat CIRCLE-seq een onbevooroordeelde en zeer gevoelige techniek is voor het identificeren van nuclease-geïnduceerde DSB's in het hele genoom die het gevolg zijn van het richten op de AAVS1-locus in gDNA afgeleid van iPSC's. De AAVS1-site binnen iPSC's staat bekend als een veilige havenlocus die vaak wordt gebruikt als een integratieplaats van exogene genen met behulp van CRISPR-Cas928. Ons recente rapport bestudeerde het potentieel van EGFP-gelabelde iPSC's door CRISPR-gemedieerde integratie van een constitutief tot expressie gebrachte EGFP-reporter uit te voeren in de AAVS1-site , die het labelen en volgen van zowel iPSC's als gedifferentieerde iPSC's mogelijk maakt vanwege de persistentie van EGFP in de hele lijn van de cel27. Deze iPSC-lijn kan in vivo worden gebruikt om de verspreiding van iPSC-afgeleide cellen na transplantatie te evalueren. Aangezien deze cellijn CRISPR-gemodificeerd is en ook wordt gebruikt om de klinische toepassing van iPSC's te testen, is het absoluut noodzakelijk dat de potentiële AAVS1 off-target sites bekend zijn en worden ondervraagd om de veiligheid en werkzaamheid te garanderen, waardoor het een ideale locus is om CIRCLE-seq te testen.

Een opmerkelijk verschil tussen Butterfield et al., eerder gepubliceerde studie27 en deze was het gebruik van een gemodificeerd gRNA om de AAVS1-locus te targeten. Een gRNA kan worden ontworpen om de nauwkeurigheid van genoombewerking te verbeteren24. De geleidingsvolgorde is de meest kritische factor die van invloed is op de efficiëntie op en buiten het doelwit. Daarom werd het gekozen gRNA getest tegen verschillende andere gidsen en bleek het een superieure getrouwheid te hebben. Bovendien onderbouwde een methodenartikel over het herprogrammeren van menselijke fibroblasten de bevinding dat synthetisch afgetopte mRNA's die gemodificeerde nucleobasen bevatten, baat hebben bij een lage activering van antivirale responsen29,30. Hoewel een lage immunogeniciteit misschien niet relevant is in een in-vitrotest, wordt het cruciaal wanneer het uiteindelijke doel is om een klinisch relevante therapie te ontwikkelen die in levende cellen kan worden gebruikt.

CIRCLE-seq heeft veel voordelen ten opzichte van vergelijkbare methoden. Digenoom-seq sequentie bijvoorbeeld zowel nuclease-gesplitst als niet-gesplitst gDNA, met behulp van ~400 miljoen reads21. Dit resulteert in een hoge achtergrond, waardoor het een uitdaging is om laagfrequente bonafide kniplocaties uit te filteren. CIRCLE-seq gebruikt slechts ~3-5 miljoen lezingen vanwege de verrijking van nuclease-gesplitst gDNA, wat resulteert in een lage achtergrond. Bovendien vertrouwen Digenome-seq en een vergelijkbare methode, SITE-seq, op het sequencen van een enkel nuclease-gesplitst DNA-uiteinde. Daarentegen omvatten CIRCLE-seq-lezingen beide uiteinden van de geknipte site, waardoor off-target sites kunnen worden geïdentificeerd zonder dat er een referentie nodig is 21,22,26.

Een voordeel van CIRCLE-seq is de grotere gevoeligheid in vergelijking met de methoden die afhankelijk zijn van celcultuur, zoals GUIDE-seq. Toen de twee methoden werden vergeleken, was CIRCLE-seq in staat om alle off-target sites vast te leggen die door GUIDE-seq waren gedetecteerd en ontdekte extra onbedoelde splitsingssites die GUIDE-seq had gemist. Een opmerkelijk verschil is echter dat GUIDE-seq mogelijk wordt gehinderd door het epigenetische landschap, terwijl CIRCLE-seq toegang heeft tot het hele genoom.

Als in-vitrotest vertoont CIRCLE-seq verschillende beperkingen, waarvan de eerste de detectie van valse positieven is. Terwijl epigenetica de nuclease-activiteit op bepaalde plaatsen in vivo zal belemmeren, verwijdert ultrasoonbehandeling deze obstakels in vitro, waardoor off-target activiteit mogelijk is op locaties die normaal gesproken niet toegankelijk zijn in een cellulaire context. Bovendien is Cas9 in hoge concentraties aanwezig in deze in vitro test, waardoor splitsing mogelijk is die anders in vivo niet mogelijk zou zijn. Deze test vereist ook een relatief grote hoeveelheid start-gDNA, wat, afhankelijk van de beschikbare middelen, het gebruik van dit protocol teniet kan doen. Ten slotte is het mogelijk dat sommige off-target sites niet detecteerbaar zijn vanwege de beperkingen van de huidige next-gen sequencingtechnologieën.

Een recente studie maakte gebruik van een in silico-benadering waarvan het algoritme een aantal relevante parameters identificeerde waarmee verschillende nucleasekarakteriseringsmethoden konden worden vergeleken, waaronder CIRCLE-seq en GUIDE-seq31. Twee van de relevante parameters waren 'verrijking op de cutsite' en '% valse positieven'. Interessant is dat het percentage vals-positieven van CIRCLE-seq werd berekend op 88%, maar dat de verrijking op de cut-site groter was dan bij de andere in vitro methoden. Vergelijkende analyses van elke methode toonden aan dat GUIDE-seq het beste presteerde, omdat het de grootste on-target specificiteit vertoonde met slechts een matig percentage vals-positieven32. Dit maakt CIRCLE-seq niet ongeldig, maar verwijst eerder naar de mogelijkheid om CIRCLE-seq en GUIDE-seq samen te gebruiken, waarbij de bevindingen van CIRCLE-seq worden gevalideerd met GUIDE-seq, aangezien de eerste een hogere gevoeligheid heeft, terwijl de laatste een celgebaseerde methode is met een hoge verrijking op de snijplaats. Gegevens geven ook aan dat amplicon-gebaseerde next-generation sequencing (NGS) de voorkeursmethode zou moeten zijn voor het identificeren van echte off-target modificaties op potentiële kandidaat-locaties31. Deze gegevens suggereren een mogelijke strategie om CIRCLE-seq te gebruiken, gevolgd door GUIDE-seq en vervolgens amplicon-gebaseerde NGS om off-target effecten te onderzoeken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Ik ben hem zeer dankbaar voor de financiële steun van de National Institutes of Health (R01AR078551 en T32AR007411), de Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) Oostenrijk, het Gates Grubstake Fund en het Gates Frontiers Fund.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2-mL Thin-walled Tubes and Flat CapsThermoFisher ScientificAB1114
1.5% PippinHT cassetteSage ScienceHTC1510
10 mL Serological Pipettes FisherScientific12567603
15 mL Conical TubeFisherScientific339651
150 x 25 mm Tissue Culture Dish FisherScientific877224
25 mL Reagent Reservoir FisherScientific2138127C
2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2602
5 mL Serological Pipettes FisherScientific170355
50 mL Conical TubeFisherScientific339653
50x TAE Electrophoresis Buffer ThermoFisher ScientificB49
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Agencourt AMPure XP Reagent, 60 mLBeckman CoulterA63881
Benchtop Microcentrifuge Eppendorf5400002
BsaI-HF New England BioLabs
Buffer QX1Qiagen20912
Cas9 nuclease, Streptococcus Pyogenes New England BioLabsM0386M
CIRCLE-seq Library Preparation and NGS
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning354277Extracellulaire matrix (ECM) voor het kweken van iPSC's
ddPCR SuperMix for Probes Bio-Rad1863010
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad1863051
DG8 Cartridges Bio-Rad1864008
DG8 Gaskets Bio-Rad1863009
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14190144Made by Invitrogen
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad1863005
Droplet Reader Oil Bio-Rad1863004
EDTA (0.5 M)ThermoFisher Scientific15575020
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermoFisher ScientificAM9260GMade by Invitrogen
Eppendorf  ThermoMixer Eppendorf5384000020
Equipment
Ethyl Alcohol, PureSigma-AldrichE7023
Exonuclease I New England BioLabsM0293LE. coli
Filter Unit FisherScientificFB0875713
Filtered Sterile Pipette Tips
Focused Ultrasonicator CovarisME220
Genomic DNA Isolation
Genomic DNA Shearing
Gentra Puregene Cell Core Kit Qiagen158043
gRNAsSynthego
HClThermoFisher ScientificA144500
Heracell VIOS Tri-gas Humidified Tissue Culture IncubatorThermoFisher Scientific51030411Nodig voor het kweken en uitbreiden van iPSC's (37 °C/5% CO2/5% O2)
High Sensitivity D1000 DNA ScreenTapeAgilent5067-5584
High Sensitivity D1000 ReagentsAgilent5067-5585
HTP Library Preparation Kit Kapa BiosystemsKK8235
HyClone Antibiotic Antimycotic SolutionCytivaSV30079.01
IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)Integrated DNA Technologies11050204
Inverted MicroscopeNodig voor het beeldvormen van iPS-kolonies in helder veld en fluorescerende kanalen
iPSC Culture
IsopropanolSigma-Aldrich190764
Lambda Exonuclease New England BioLabsM0262L
Loading Tips, 10 packAgilent5067-5599
Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate AlpaquaA00400
Microcentrifuge TubeAxygen31104051
Microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap Covaris520045
mTeSR-1 5x SupplementStemCell Technology85852
mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)StemCell Technology85851Media voor het onderhouden van iPSC in cultuur
Nanodrop 8000 Spectrophotometer ThermoFisher ScientificND-8000-GL
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabsE7600SDual Index Primers Set 1
Optical tube strip caps, 8x stripAgilent401425
Optical tube strips, 8x stripAgilent401428
Other Reagents
PCR Plate Sealer Bio-RadPX1Model Number PX1
PEG/NaCl SPRI Solution Kapa Biosystems
Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix New England BioLabsM0536L
Pierceable Foil Heat Seal Bio-Rad1814040
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase EpicentreE3110K
Primers, Adapters and ProbesIDTSequences zijn vermeld in Tabel 1
Proteinase K Qiagen19131
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen28704
QIAxcel Gel Analysis System Qiagen9001941
Qubit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856
Qubit

Referenties

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia. N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).
  3. Ledford, H. CRISPR treatment inserted directly into the body for first time. Nature. 579 (7798), 185(2020).
  4. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).
  5. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  6. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  7. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
  8. Hong, S. A., et al. Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).
  9. Zhang, G., et al. Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA. Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).
  10. Lee, J., et al. Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels. Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).
  11. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  12. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
  13. Has, C., Kiritsi, D. Therapies for inherited skin fragility disorders. Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).
  14. Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells. Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).
  15. Hsieh, M. M., et al. Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease. Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).
  16. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).
  17. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).
  18. Lensing, S. V., et al. DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks. Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).
  19. Crosetto, N., et al. Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing. Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).
  20. Yan, W. X., et al. BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks. Nat Commun. 8, 15058(2017).
  21. Kim, D., et al. Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).
  22. Cameron, P., et al. Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage. Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).
  23. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  24. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).
  25. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  26. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  27. Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter. Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).
  28. Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor. Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).
  29. Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nat Commun. 9 (1), 745(2018).
  30. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  31. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).
  32. Cromer, M. K., et al. Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells. Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9circularisatie van genomisch DNAin vitro splitsingIllumina sequencingge nduceerde pluripotente stamcellengenoombrede splitsingsplaatsenlibrary preparatienext generation sequencing

Gerelateerde artikelen