Beeldvorming van initiële Ca2+ microdomeinen in primaire T-cellen

Samenvatting

Hier bieden we een uitgebreid protocol om initiële lokale Ca^2+- signalen, bekend als Ca^2+- microdomeinen, in primaire muizen- en menselijke T-cellen op te lossen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers die Ca^2+- signaleringsroutes in immuuncellen onderzoeken en hun functie verder ontrafelen.

Samenvatting

Lokale Ca²⁺ -signalen van minder dan een seconde, genaamd Ca²⁺ -microdomeinen, zijn zeer dynamische en kortstondige Ca²⁺ -signalen, die resulteren in een globale [Ca²⁺]_i-verhoging en mogelijk al het lot van een T-cel bepalen. Bij activering van de T-celreceptor wordt NAADP snel gevormd, dat zich bindt aan NAADP-bindende eiwitten (HN1L/JPT2, LSM12) en hun respectieve receptoren (RyR1, TPC2) die op intracellulaire^{Ca 2+-} voorraden zitten, zoals de ER en lysosomen, en wat leidt tot daaropvolgende afgifte en verhoging van [Ca²⁺]_i. Om deze snelle en dynamisch optredende Ca²⁺ -signalen op te vangen, ontwikkelden we een beeldvormingstechniek met hoge resolutie met behulp van een combinatie van twee Ca²⁺ -indicatoren, Fluo-4 AM en FuraRed AM. Voor de nabewerking werd een open-source, semi-geautomatiseerde Ca²⁺ microdomeindetectiebenadering ontwikkeld op basis van de programmeertaal Python. Met behulp van deze workflow zijn we in staat om op betrouwbare wijze Ca^2+- microdomeinen op subcellulair niveau te detecteren in primaire muizen- en menselijke T-cellen in fluorescentievideo's met hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Deze methode kan ook worden toegepast op andere celtypen, zoals NK-cellen en neuronale cellijnen van muizen.

Inleiding

De gepresenteerde fluorescentiemicroscopietechniek maakt de visualisatie mogelijk van lokale, temporele initiële calciumsignalen (Ca²⁺) in primaire T-cellen van muizen, de zogenaamde Ca^2+- microdomeinen. Ca²⁺ -microdomeinen vertegenwoordigen zeer dynamische en kortstondige Ca²⁺ -signaleringsgebeurtenissen, wat een uitdaging vormt voor effectieve beeldvorming^{en analyse van} levende cellen.

T-cellen zijn een uitdaging voor beeldvorming van levende cellen vanwege de relatieve verschillen in centrale en perifere fluorescentie-intensiteit, die kunnen worden toegeschreven aan hun bolvorm en hun kleine diameter van ~6-8 μm. Bij stimulatie en vorming van immuunsynapsen ondergaan T-cellen morfologische veranderingen, waardoor de beeldvorming van^{T-cellen verder} wordt bemoeilijkt. Daarom wordt het gebruik van een ratiometrische analyse noodzakelijk, bereikt door ofwel twee afbeeldingen op te nemen die verschillende eigenschappen van een Ca²⁺ kleurstof vertegenwoordigen, ofwel een combinatie van twee Ca²⁺ kleurstoffen te gebruiken. De veeleisende kenmerken van Ca²⁺ microdomeinen omvatten hun snelle, tijdelijke en ruimtelijk beperkte aard. Om dit vast te leggen, moeten de gebruikte Ca²⁺ -kleurstoffen zowel een hoge basale helderheid als een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) hebben om de hoogst mogelijke temporele en ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Optimale resultaten zijn bereikt met een combinatie van de dual-wavelength kleurstof Fura Red en de single-wavelength kleurstof Fluo-4. Co-loading cellen met Fluo-4 en Fura Red verminderen de uitdagingen van sterke fotobleking van kleurstoffen met dubbele emissiegolflengte en de tijdsvertraging die gepaard gaat met kleurstoffen met dubbele excitatie, waardoor ze geschikt zijn voor snelle beeldacquisitie. Deze aanpak vergemakkelijkt verder de visualisatie van vormveranderingen en subtiele bewegingen. Er worden ook speciale eisen gesteld aan het beeldvormingssysteem op het gebied van ruimtelijke resolutie om de visualisatie mogelijk te maken van Ca^2+- signalen die afkomstig zijn van het openen van kleine clusters van kanalen of zelfs enkele kanalen¹.

Ca^2+-signalering speelt een cruciale rol bij het activeren van immuunfuncties in T-cellen, waaronder synapsvorming en cytokineproductie en -afgifte ^2,3. Het specifieke lot van de cel wordt gereguleerd door de verschillend uitgesproken en lokaal verdeelde Ca²⁺ signalen, de Ca²⁺ microdomeinen³. Met name die lokale Ca^2+-signalen gaan vooraf aan een wijdverbreide stijging van intracellulaire Ca^2+-niveaus in T-cellen en de vorming van Ca^2+-microdomeinen hangt af van zowel Ca^2+-invoer als afgifte ^1,4,5. Bij stimulatie van de T-celreceptor (TCR)/CD3 wordt de vorming van Ca²⁺-afgevende tweede boodschappers, zoals nicotinezuur adenine-dinucleotidefosfaat (NAADP), D-myo-inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP₃) en cyclisch ADP-ribose (cADPR) geactiveerd, wat leidt tot stijgende intracellulaire Ca²⁺-niveaus tot 1 μM ^6,7. Vroege Ca^2+-signaleringsgebeurtenissen zijn gekoppeld aan de afgifte van Ca²⁺ uit intracellulaire Ca^2+-voorraden zoals het endoplasmatisch reticulum (ER), waarbij kanalen zoals de ryanodinereceptor 1 (RyR1) en de IP_3-receptor (IP₃R) voornamelijk verantwoordelijk zijn voor deze signalering. Dit activeert vervolgens extracellulaire Ca²⁺ instroom en resulteert in een wereldwijd Ca²⁺ signaal via store-operated Ca²⁺ entry (SOCE)⁸. Daarnaast zijn er andere kanalen die betrokken zijn bij Ca²⁺-signalering tijdens T-celactivering⁹, bijv. P2X4- en P2X7-kanalen zorgen voor adenosinetrifosfaat (ATP)-afhankelijke kationeninstroom, wat bijdraagt aan de stijging van intracellulaire Ca²⁺. Opmerkelijk is dat initiële adhesie-afhankelijke Ca²⁺ microdomeinen (ADCM's) al vóór TCR-stimulatie worden gevormd, maar met lagere Ca²⁺ amplitudes en frequenties. Deze initiële TCR-onafhankelijke Ca²⁺-signalen dienen hoogstwaarschijnlijk voor de migratie van de T-cel naar de plaats van ontsteking en bereiden de T-cellen voor op restimulatie op de plaats van infectie^10,11.

Door de beschreven methode voor lokale^{Ca 2+} beeldvorming te ontwikkelen, hebben we een extra hulpmiddel in handen gekregen voor het onderzoeken van de oorsprong en betekenis van vroege Ca²⁺ signalen bij T-cel activatie. Deze methode stelt de gebruiker in staat om kleinere, kortstondige en sneller optredende Ca²⁺ -signalen te detecteren dan voorheen mogelijk was. Bovendien maakt Deconvolution, Analysis, Registration, Tracking, and Shape normalization (DARTS), de op Python gebaseerde analysepijplijn, het mogelijk om de analysetools te delen met een breder publiek¹².

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de dierenwelzijnsrichtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf.

1. Isolatie van primaire T-cellen van muizen uit lymfeklieren en milten

1. Oogst de milt/lymfeklieren onder steriele omstandigheden volgens de ethische richtlijnen en plaats ze in een tube met ijskoud Clicks medium (10% Foetaal Kalfsserum (FCS), 2 mM L-Glutamine, Penicilline/Streptomycine (P/S) 100 E/ml, 50 nM β-Mercaptoethanol).
   OPMERKING: Wildtype en KO muis T-cellen worden op dezelfde manier geïsoleerd.
2. Koel de centrifuge af tot 4 °C.
3. Plaats de milt en lymfeklieren in een celzeef van 70 μm in een steriele petrischaal en voeg miltisolatiemedium (RPMI-medium + 7,5 % NCS + 1% P/S) toe tot een totaal volume van 20 ml.
4. Verbreek de milt grondig maar voorzichtig met een plastic vijzel. Breng de cellen daarna over in een centrifugebuis van 50 ml.
   OPMERKING: Een totaal volume van 20 ml moet nu in de centrifugebuis van 50 ml zitten. Milt en lymfeklieren moeten volledig worden verstoord. Werk vanaf dit punt op het ijs. Door de cellen op ijs te houden, wordt hun metabolisme vertraagd en wordt celdood voorkomen, zodat ze levensvatbaar en functioneel intact blijven. Dit helpt om hun fysiologische toestand voor een langere periode te behouden, wat vooral belangrijk is voor nauwkeurige stroomafwaartse experimenten.
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
6. Gooi het supernatans weg en zorg voor resuspensie van de resulterende pellet in 2 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (zonder Ca²⁺ en Mg²⁺). Breng over naar een nieuwe centrifugebuis van 12 ml.

2. Negatieve selectie van CD4⁺ T-cellen

OPMERKING: Voor de negatieve selectie van CD4⁺ T-cellen wordt een T-celisolatiekit gebruikt met een FcR-blokker, gebiotinyleerde antilichamen tegen niet-CD4⁺ T-cellen en met streptavidine gecoate magnetische deeltjes.

1. Voeg 20 μL/ml muis-FcR-blokker uit de T-celisolatiekit toe aan de celsuspensie.
2. Voeg verder 100 μL van de muis CD4⁺ T-celisolatiecocktails toe in een concentratie van 50 μL/ml, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Vortex-streptavidine-gecoate magnetische deeltjes gedurende 30 s, voeg 150 μL toe aan de celsuspensie, meng goed en incubeer gedurende 2 minuten en 30 s bij RT.
4. Voeg DPBS toe aan de celsuspensie en vul deze tot een totaal volume van 7 ml. Zorg ervoor dat u voorzichtig op en neer pipeteert en incubeer vervolgens 2 minuten en 30 s in de magneet bij RT.
5. Verzamel vervolgens de verrijkte T-cellen voorzichtig in het supernatans en breng ze over in een nieuwe centrifugebuis van 12 ml.
6. Centrifugeer cellen bij 300 x g bij RT gedurende 5 min.
7. Gooi het supernatant weg.
8. Resuspendeer de geïsoleerde en verrijkte CD4⁺ T-cellen in 1 ml DPBS en pipetter grondig op en neer. Incubeer het mengsel gedurende 2 min 30 s in de magneet bij RT om ervoor te zorgen dat de parels niet worden verontreinigd.
9. Verzamel het supernatant, breng het over in een nieuwe centrifugebuis en tel de verrijkte T-cellen.
10. Om de cellen te tellen, kleurt u de cellen met trypanblauw en telt u met behulp van een geautomatiseerde cellenteller.
    OPMERKING: Het is het beste om de geïsoleerde CD4⁺ T-cellen direct te laden en ze op dezelfde dag van isolatie af te beelden. Primaire Muizen-T-cellen kunnen echter zonder enige stimulatie 's nachts in een incubator bij 37 °C worden gekweekt met 5 % CO₂ in een isolatiemedium (RPMI 1640 + 10% FCS + P/S).

3. Laden van primaire muis CD4⁺ T-cellen

OPMERKING: Om vrije cytosolische Ca²⁺ -concentraties te meten, worden fluorescerende en membraanpermeabele kleurstoffen gebruikt in de Ca²⁺ -beeldvormingsexperimenten. Een combinatie van Fluo-4-acetoxymethylester (AM) en de ratiometrische kleurstof Fura Red-AM dient als indicator voor snelle detectie van lokale Ca²⁺ signalen. Zorg ervoor dat u in het donker werkt terwijl u fluorescerende kleurstoffen gebruikt.

1. Centrifugeer 2-5 x 10⁶ cellen gedurende 5 minuten, 300 x g, gooi het supernatans weg en resuspendeer in 480 μL T-celmedium (RPMI 1640, 10% FCS) met 10 μM Fluo-4-AM (Voorraad: [1 mM]) en 20 μM Fura Red-AM (Voorraad: [4 mM]).
2. Incubeer in eerste instantie 20 minuten bij RT onder de bank in het donker en bedek de valk met aluminiumfolie.
   OPMERKING: Overschrijd de eerste incubatietijd niet, aangezien de Ca^2+- indicatoren worden verdund in DMSO, wat schadelijk kan zijn voor de cellen bij een langere blootstellingstijd in het lage totale volume. Houd de cellen na het laden afgeschermd van licht vanwege de lichtgevoeligheid van de kleurstoffen.
3. Voeg aan het einde van de eerste incubatie van 20 minuten 2 ml T-celmedium toe aan de cellen en ga door met de incubatie gedurende nog eens 30 minuten in het donker bij RT.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
5. Gooi het supernatans weg en reinig de pellet door deze te wassen met 2 ml Ca²⁺ maatbuffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂, 20 mM HEPES, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM glucose, pH 7,4) gevolgd door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
6. Gooi ten slotte het supernatans weg en suspendeer het opnieuw met de Ca²⁺ meetbuffer. Pas het celaantal aan naar ~100.000 cellen per 10 μL.
   OPMERKING: Voor één meting wordt een volume van 10 μL gebruikt. Vermijd oververdunning van de cellen, omdat men mogelijk het celgetal onder de microscoop verder moet aanpassen om een optimum voor de meetomstandigheden te bereiken.
7. Laat de cellen ~20 minuten incuberen om volledige celinfiltratie en ontestering van de kleurstoffen te garanderen. Bewaar cellen op ijs en in het donker tot de meting.
   OPMERKING: Geladen primaire muizen T-cellen kunnen tot ~4 uur na het laden worden gebruikt.

4. Lokale Ca²⁺ beeldvorming

1. Voorbereiding van dia's
   1. Smeer de dekglaasjes van de microscoop (24 mm x 46 mm) in met runderserumalbumine (BSA, 5 mg/ml) en poly-L-lysine (PLL, 0,1 mg/ml) (figuur 1A). Laat BSA ~20 minuten intrekken voordat u PLL aanbrengt.
      OPMERKING: Coating vergemakkelijkt de celhechting. Voor een goede celhechting verdeelt u zowel BSA als PLL nauwkeurig totdat er geen strepen meer zichtbaar zijn.
   2. Om reactiekamers te maken, lijmt u herbruikbare rubberen O-ringen op de objectglaasjes met behulp van een siliconenpasta (Figuur 1B,C).
      OPMERKING: Andere objectglaasjes/kamers of platen zoals objectglaasjes van 35 mm, herbruikbare metalen kamers of platen met 8, 24 of 48 putjes kunnen worden gebruikt voor beeldacquisitie.
2. Coating van Proteïne G magnetische kralen (10 μm in diameter) met antilichamen
   1. Meng voorzichtig de magnetische kralensuspensie van eiwitten en breng 12,5 μL over in een nieuwe buis.
   2. Plaats de buis op een magnetische standaard om de opslagbuffer te verwijderen en laat de kralen naar de magneet migreren. Verwijder de opslagbuffer voorzichtig door deze aan de andere kant van de magneet te pipetteren.
   3. Om eventuele resterende opslagbuffer te verwijderen, wast u de korrels door 500 μL PBS-T (PBS, 0,1% Tween) toe te voegen en gedurende 10 s te vortexen. Plaats de buis weer in de magnetische standaard en verwijder de buffer.
   4. Om de korrels met antilichamen te bedekken, resuspendeert u ze in 7,5 μl PBS-T en voegt u respectievelijk 5 μl anti-CD3 (0,5 mg/ml) en anti-CD28 (0,5 mg/ml) toe. Incubeer gedurende 30-60 minuten met continu mengen bij RT.
   5. Was de gecoate korrels drie keer met 500 μL PBS-T, gevolgd door één keer wassen met 500 μL Ca²⁺ meetbuffer met behulp van de magnetische standaard.
   6. Resuspendeer de korrels in 200-400 μL Ca²⁺ meetbuffer.
      OPMERKING: Controleer de dichtheid van de parel tijdens de metingen, verdun indien nodig verder.
3. Lokale Ca²⁺ beeldvormende microscopie
   OPMERKING: Beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een helderveldlichtmicroscoop met een vergroting van 100 graden, uitgerust met een xenonbooglamp als lichtbron. Frames worden vastgelegd in 14-bits modus met tweevoudige binning met behulp van een elektronenvermenigvuldigende ladinggekoppelde camera. Om de emissiegolflengten van beide kleurstoffen te registreren en te splitsen, wordt een dual-view-module gebruikt, met de volgende filters in nm (bijv. 480/40; bs, 495; em1, 542/50; em2, 650/57). De beeldvormingsopstelling omvat een acquisitiehub en beeldvormingssoftware voor beeldacquisitie.
   1. Plaats 10 μL van de geladen cellen op het voorbereide objectglaasje en laat ze 3-5 minuten aan het glaasje hechten.
   2. Voeg voorzichtig 80 μL Ca²⁺ meetbuffer toe aan het objectglaasje.
   3. Selecteer de 100x olie-immersielens en breng een klein druppeltje immersieolie aan. Plaats het objectglaasje op de microscooptafel.
   4. Pas de scherpstelling aan in de helderveldmodus, selecteer zorgvuldig een gezichtsveld met maximaal 10 cellen die niet met elkaar in contact staan en maak een afbeelding.
      OPMERKING: Overlappende en aanrakende cellen zullen later moeilijk te analyseren zijn.
      1. Zet de lamp aan, controleer de fluorescentie en de belasting van de T-cellen en vergelijk de cellen in beide kanalen om te controleren of ze niet vooraf zijn geactiveerd.
      2. Zorg ervoor dat u voor en na de meting foto's maakt van het gezichtsveld voor zowel helderveld- als fluorescentiekanalen om te controleren op celbeweging en -belasting.
   5. Begin met meten en leg de basale activiteit gedurende 1 minuut vast met een acquisitiesnelheid van 1 frame per 5 s.
   6. Voeg na 1 minuut 10 μL verbinding/stimulerend middel (kraal of stimulator/remmer) toe en meet in totaal 3 minuten met 40 frames per s of de maximaal mogelijke framesnelheid.
      OPMERKING: Het toevoegen van kralen is de cruciale stap; Zorg ervoor dat de kralen dicht bij het opwindingslicht op de dia worden aangebracht terwijl u de dia niet beweegt. Representatieve voorbeelden van Ca²⁺ microdomeinen in primaire CD4⁺ T-cellen bij contact met de kraal van WT en P2x4-/- en P2x7-/- muizen worden getoond in figuur 2.

5. Nabewerking/ data-analyse

OPMERKING: Voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt de op Python gebaseerde open-source pijplijn DARTS gebruikt. Het is ontwikkeld door Woelk et ^al.12 op basis van werk van Diercks et ^al.13.

1. Installatie van de DART-pijpleiding
   1. Installeer Python 3.10.0¹⁴, anaconda¹⁵ en git¹⁶ en kloon de GitHub-repository met behulp van de terminalopdracht git clone: https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS.git
   2. Creëer een conda-omgeving met conda create --naam DARTS en installeer alle benodigde Python-pakketten met pip install <package>.
      OPMERKING: Volg de installatie-instructies in de DARTS GitHub-repository ^17,18 voor meer gedetailleerde informatie.
   3. Voordat u Bioformats gebruikt, moet u ervoor zorgen dat een Java Runtime-omgeving correct is geïnstalleerd¹⁹.
2. Gebruik van de DART-pijplijn
   OPMERKING: Eenmaal geïnstalleerd, kan DARTS worden gestart vanuit het terminalvenster.
   1. Navigeer naar de lokale kopie van de DART-repository (cd path/to/DARTS) die het main.py bestand bevat. Zorg ervoor dat de conda-omgeving is geactiveerd (conda activeer DARTS).
   2. Voer DARTS uit door python main.py in het terminalvenster te typen en op Enter te drukken.
   3. Specificeer in de grafische gebruikersinterface (GUI) de bron- en resultatendirectory, evenals het afbeeldingsformaat in het gedeelte linksboven (zie afbeelding 3).
   4. Definieer de eigenschappen van de meting, zoals de schaal (pixels per micrometer), framesnelheid, celtype, enz. De verwerkingspijplijn kan worden samengesteld op basis van de specifieke beeldgegevens en onderzoeksvraag.
      OPMERKING: Lees meer over de deconvolutieparameters, bijvoorbeeld in de bijbehorende documentatie²⁰.
   5. Sla de instellingen op de computer op voordat u op Start klikt. Een meer gedetailleerde beschrijving van de GUI is te vinden in de DARTS documentatie.
3. Ca²⁺ microdomein beeldvorming en kraalcontacten
   OPMERKING: Voor lokale beeldvorming en stimulatie met kralen en de daaropvolgende beeldanalyse moeten de celspecifieke kraalcontacten door de gebruiker worden gedefinieerd om het startpunt (t = 0) van de betreffende meetperiode te identificeren (zie figuur 4). Een kraalcontact wordt gedefinieerd als de contactplaats van een (stimulerende) kraal met een cel van belang. Het bestaat uit de specificatie van (1) de contacttijd van de kraal, bijv. frame 300, en (2) de contactpositie van de kraal ten opzichte van het midden van de cel, bijv. 1 uur of 12 uur. Met de huidige DART-versie moet de gebruiker de informatie voor elk kraalcontact handmatig definiëren en invoeren. Gebruik de volgende procedure om kraalcontacten te definiëren:
   1. Gebruik de schuifregelaar om de contacttijd tussen een kraal en een interessante cel te bepalen.
   2. Selecteer in het keuzemenu aan de rechterkant kraalcontact: x, y, t.
   3. Selecteer de plek aan de linkerkant van de afbeelding waar de cel en de kraal contact maken.
   4. Selecteer Cel kiezen door op een punt in de cel te klikken. Klik op de cel die door deze kraal wordt gestimuleerd, bij voorkeur in het midden.
   5. Klik op VOEG kraalcontact toe.
   6. Herhaal de stappen 5.3.1 - 5.3.5 voor elk extra kraalcontact in dit bestand. Zodra alle kraalcontacten zijn gedefinieerd, klikt u op de knop Doorgaan .
   7. Ga verder met extra bestanden. Nadat het laatste bestand is bereikt, start het script automatisch de analyse van alle bestanden.
4. Gegevensanalyse
   1. Vind de bewerkte verhoudingsafbeeldingen, microdomeingegevens voor elke cel in de loop van de tijd (incl. lokalisatie, amplitude, grootte), brongegevens voor de dartbordprojectie en andere bronnen in de resultatenmap.
   2. Om dartborden te maken, navigeer je naar de map /src/analysis/ in de DARTS-map (patroon: cd path/to/DARTS/src/analysis) die het script DartboardPlotGUI.py. Typ vervolgens python DartboardPlotGUI.py en druk op enter.
   3. Zorg ervoor dat de benodigde informatie wordt verstrekt en dat de spreadsheetbestanden uit de resultatenmap nauwkeurig zijn geselecteerd als de bronbestanden voor het genereren van dartborden.

Resultaten

In dit protocol hebben we een bijgewerkte methode geschetst om initiële Ca^2+-microdomeinen in primaire muis-T-cellen af te beelden en te analyseren op basis van eerder werk van onze groep ^1,13. Deze benadering speelde een belangrijke rol bij het ontrafelen van de betrokkenheid van CRAC-kanalen zoals ORAI1, STIM1 en STIM2, evenals intracellulaire Ca^2+-afgiftekanalen zoals RyR1 bij vroege Ca^2+-signaleringsgebeurtenissen⁴.

Om dit te doen, onderzochten we spontane vorming van Ca²⁺ microdomeinen door niet-gestimuleerde primaire muis Orai1^-/-, Stim1^-/-, Stim2^-/-, en Ryr1^-/- af te beelden en vergeleken met WT primaire muis T-cellen. De analyse van de vorming van Ca²⁺ microdomeinen omvatte de aanvangssnelheid van het signaal, de amplitude van Ca²⁺ en het aantal signalen per confocaal vlak. Met name met uitzondering van Stim2^{-/- T-cellen} vertoonden alle KO T-cellen een significante afname van lokale Ca^2+-signalen en een verminderde basale vrije cytosolische^{Ca 2+-}concentratie in vergelijking met WT-cellen. Dit bracht ons tot de conclusie dat de vorming van Ca²⁺ microdomeinen nauw verbonden is met de interactie van ORAI1, STIM1 en RyR1⁴. Daarnaast hebben we met succes spontane Ca²⁺ microdomeinen op het plasmamembraan geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Deze Ca²⁺ microdomeinen werden gekenmerkt door een Ca²⁺ amplitude van 290 nm ± 12 nm. Door gebruik te maken van een kleurgecodeerde benadering voor Ca²⁺-signalen, konden Ca²⁺-microdomeinen in de cel worden gevisualiseerd. De resultaten benadrukten verder het snelle begin van Ca^2+-microdomeinen, zichtbaar binnen milliseconden, en het vermogen van deze methode om Ca^2+-signalen te detecteren met een levensduur van enkele^{milliseconden4}. Deze spontane Ca²⁺ microdomeinen werden later geïdentificeerd als adhesie-afhankelijke Ca²⁺ microdomeinen (ADCM), die niet alleen afhankelijk zijn van SOCE, maar ook werken via de FAK/PLC-γ/IP 3-signaleringscascade¹⁰ en betrokkenheid van P2X4⁹. Bovendien was deze techniek van fundamenteel belang bij het bevestigen van dubbele oxidasen 1 en 2 (DUOX1/2) als NAADP-producerende enzymen²¹ en HN1L/JPT2²² als een van de nieuw ontdekte NAADP-bindende eiwitten²³.

Figuur 2 toont representatieve voorbeelden van Ca²⁺ microdomeinen in primaire CD4⁺ T-cellen bij contact met de kraal van WT en P2x4^-/- en P2x7^-/- muizen. Cellen werden geladen met de Ca²⁺ kleurstoffen Fluo-4 AM en Fura Red AM en afgebeeld met een acquisitiesnelheid van 25 ms (40 frames/s). Om de vorming van T-celsynapsen na te bootsen, werden cellen gestimuleerd met anti-CD3/anti-CD28 gecoate kralen. De initiële vorming van Ca²⁺ microdomeinen werd 1 s voor en tot 15 s na contact met de kraal geanalyseerd met behulp van de DART-pijplijn. Bij contact met de kraal vertoonde de WT-cel een snelle vorming van Ca²⁺ microdomeinen in de eerste seconde na stimulatie op de contactplaats van de kraal (Figuur 2A). Deze Ca²⁺ microdomeinen breidden zich verder uit door de cel in de volgende 15 s na contact met de parel. In tegenstelling tot de ^WT-cel vertoonden de P2x4-/- en P2x7^-/- cellen (Figuur 2B) een verminderde vorming van Ca²⁺ microdomeinen bij stimulatie van de parel, evenals voor het P2x4^-/-een lager basaal niveau vóór het contact met de parel. Deze representatieve bevindingen zijn in lijn met de eerder gepubliceerde resultaten van Brock et ^al.9, die wijzen op Ca²⁺ microdomeinvorming in WT T-cellen direct na kraalcontact gedurende 15 s en lagere signalen per frame in P2x4^-/- en P2x7^-/- cellen. Bovendien werd de amplitude in P2x4^-/-cellen significant verminderd, wat de rol van purinerge signalering in adhesie-afhankelijke Ca²⁺ microdomeinen verder aantoonde.

Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt om initiële Ca²⁺ microdomeinen te visualiseren in primaire menselijke CD4⁺ T-cellen (Figuur 3). In lijn met primaire Muizen T-cellen worden initiële Ca²⁺ microdomeinen opgeroepen op de contactplaats van de kraal. De algehele Ca^2+- respons lijkt echter op een andere tijdschaal op te treden in vergelijking met muizen CD4⁺ T-cellen.

De handmatige analyse van lokale Ca^2+- signalen is niet haalbaar omdat het vrij arbeidsintensief en subjectief is voor de individuele onderzoeker. Daarom hebben we eerder een algoritme ontwikkeld in MATLAB Simulink met behulp van zijn beeldverwerkings- en optimalisatietoolboxen voor nabewerking¹³ voor het analyseren van lokale Ca²⁺ microdomeinen.

Onlangs hebben we een nieuwe, open-source, postprocessing-pijplijn ontwikkeld, DARTS genaamd, voor Ca²⁺ -microdomeinanalyse in live-celbeeldvorming met hoge resolutie met behulp van het softwareplatform Python¹². Hier kunnen verschillende deconvolutiealgoritmen worden geselecteerd, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker, een celvormnormalisatie die wordt uitgevoerd om morfologische celvormveranderingen te compenseren, en microscoop- en meetspecifieke parameters worden gedefinieerd (bijv. schaal, framesnelheid, gemeten tijd) (Figuur 4).

Na het selecteren van parameters voor Ca²⁺ microdomeinanalyse, wordt een tweede pop-upvenster geopend voor elke individuele meting om het kraalcontact te definiëren (Figuur 5). Om het kraalcontact te definiëren, kan de gebruiker met behulp van de schuifregelaar handmatig door het tiff-bestand scrollen en het kraalcontactframe afzonderlijk selecteren. Het kraalcontact wordt geselecteerd door te klikken op de plaats van het hielcontact (Figuur 5, kraal en kraalcontact aangegeven door een gele ring en pijl) en op de celselectie. Deze stap moet worden herhaald voor elke cel die van belang is. Ten slotte wordt de geautomatiseerde beeldnabewerking toegepast en worden de resultaatgegevens samengevat en opgeslagen in een spreadsheet.

Figuur 1: Workflow van de voorbereiding van objectglaasjes voor beeldvorming. (A) Voeg zowel BSA als PLL toe en verdeel ze over het objectglaasje met behulp van een tweede glazen afdekglaasje. (B,C) Om een kamer te bouwen, lijmt u de rubberen o-ringen met siliconenvet op de glijbaan. Zorg ervoor dat de hele ring bedekt is met een dunne laag vet om de kamer goed te isoleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve cellen van T-celreceptorafhankelijke Ca²⁺ microdomeinen in een primaire muizen wildtype (WT) (A), P2x4^-/- of P2x7^-/-(B) CD4⁺ T-cel. CD4⁺ T-cellen werden negatief geïsoleerd en geladen met Fluo-4 AM en Fura Red, zoals hierboven beschreven. T-cellen werden geanalyseerd met behulp van de DART-pijplijn, wat resulteerde in vergelijkbare celbeelden als eerder gepubliceerde resultaten⁹. (A) WT primaire T-cel 1 s vóór stimulatie met anti-CD3/anti-CD28 gecoate kralen en tot 15 s na stimulatie (schaalbalk 5 μm), evenals 3D-oppervlakteplot van een zoom-in van 0 s tot 0,65 s in het kraalcontactgebied (schaalbalk 1 μm). (B) Bovenste rijstrook: representatieve P2x4^{-/- primaire T-cel} 1 s voor en tot 15 s na hielstimulatie. Onderste rijstrook: representatieve P2x7^{-/- primaire T-cel} 1 s voor en tot 15 s na hielstimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Ca²⁺ microdomeinen in een representatieve primaire menselijke T-cel na TCR-stimulatie. Primaire menselijke CD4⁺ T-cellen werden geïsoleerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uit buffy coats en geladen met Fluo-4 AM en Fura Red, zoals hierboven beschreven. De figuur toont een primaire menselijke T-cel 1 s vóór stimulatie met anti-CD3 gecoate kralen en tot 15 s na stimulatie (schaalbalk 5 μm), evenals 3D-oppervlakteplot van een zoom-in van 6,25 s tot 7,5 s in het kraalcontactgebied (schaalbalk 1 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De grafische gebruikersinterface (GUI) van DAARTS. De GUI is onderverdeeld in vier gebieden. In het gebied Invoer/uitvoer moet u informatie verstrekken over de onbewerkte gegevens, inclusief de bronmap en de afbeeldingsconfiguratie (twee kanalen per bestand of afzonderlijke kanalen), evenals de resultatenmap. In het gebied Eigenschappen van meting moet het experiment worden beschreven met alle relevante informatie, zoals schaal (micron per pixel), framesnelheid en meetinterval ten opzichte van het later bepaalde startpunt. Vervolgens kan een verwerkingspijplijn worden samengesteld die bestaat uit nabewerkingsstappen, vormnormalisatie en de daadwerkelijke analyse (microdomeindetectie en accumulatie van dartbordgegevens). Ten slotte kunnen de instellingen worden opgeslagen op of geladen vanaf de computer. Zodra de analyse is ingesteld, klikt u op Start om verder te gaan. Ga voor meer informatie over de installatie naar https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Handmatige definitie van hielcontacten. Als tijdens het experiment kralen aan de cellen worden toegevoegd, moeten de eerste contacttijd van de kraal met een cel van belang en de contactlocatie handmatig worden gedefinieerd. Dit doe je door met de schuifregelaar door de frames te scrollen en een positie (x,y) te vinden op een tijdstip t. Om het veld met de contactinformatie van de kraal automatisch in te vullen, klikt de gebruiker op de linkerhelft van het microscoopbeeld op de contactpositie van de kraal. Om vervolgens een cel aan het kraalcontact te koppelen, klikt de gebruiker op een positie binnen de cel die een kraalcontact heeft. De informatie moet worden bevestigd door KRAAL TOEVOEGEN te selecteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We hebben een uitgebreid protocol beschreven voor hoge-resolutie live celbeeldvorming van lokale Ca²⁺ microdomeinen in primaire muizen en menselijke T-cellen getriggerd door TCR/CD3-stimulatie via antilichaam-gecoate korrels. Bovendien hebben we een gebruiksvriendelijk en open-source Python-gebaseerd algoritme geïmplementeerd om lokale Ca²⁺-signalen te identificeren en te analyseren. Het protocol is met name niet beperkt tot de detectie van Ca²⁺ microdomeinen in het kader van TCR/CD3-stimulatie, maar kan worden aangepast aan andere (immuun)celtypen zoals NK-cellijnen (KHYG-1)¹² of TCR-onafhankelijke Ca²⁺ microdomeinen^10,11.

Een cruciale stap binnen het protocol is de grootte en het aantal van de stimulerende kralen. Om een immuunsynaps na te bootsen, moeten de kralen qua grootte vergelijkbaar zijn met de cellen. Daarom gebruiken we zowel voor primaire muizen- en menselijke T-cellen als voor cellijnen (Jurkat en KHYG1) magnetische kralen met een diameter van 10 μm. Bovendien moet elke cel slechts door één enkele kraal worden gestimuleerd. Daarom zou het aantal kralen dat aan elke dia wordt toegevoegd enerzijds voldoende moeten zijn, maar als er te veel kralen in het gezichtsveld zijn, neemt de achtergrond toe en is het niet mogelijk om een enkel activeringstijdstip en contactzijde te detecteren.

Het protocol maakt gebruik van de fluorescerende Ca²⁺ kleurstoffen Fluo-4 AM en FuraRed AM op een ratiometrische manier, waardoor kalibratie van de gegevens mogelijk is¹³. Bovendien kan het protocol worden aangepast aan andere Ca^2+- indicatorparen, maar voorzichtigheid is geboden bij het selectieproces wat betreft Ca^2+- bindingskinetiek, subcellulaire distributie en fotobleken¹. Bovendien moeten de belastingscondities voor elk afzonderlijk celtype worden ontwikkeld en geoptimaliseerd, maar de hier aangegeven concentraties zijn een goed uitgangspunt. Om Ca²⁺ microdomeinen te visualiseren, moet de Kd van de Ca²⁺ kleurstoffen in het bereik van 300-1200 nM liggen en moet de acquisitietijd per frame ≤60 ms zijn. Als de fluorescentie-intensiteit te laag is, moet de filterset worden gecontroleerd, maar het is ook mogelijk om een dubbele hoeveelheid^{Ca 2+} kleurstof in T-cellen te laden. De Ca^2+- kleurstof kan echter mislokaliseren naar andere organellen of zich sekwestreren naar blaasjes, maar het kan ook fungeren als een^{Ca 2+-} buffer en de Ca^2+- reacties beïnvloeden.

Een beperking van het analyse-algoritme is dat wordt uitgegaan van een bolvorm van de cel; Daarom kunnen celtypen met verschillende morfologieën een aanpassing van de analysetoolbox nodig hebben. Het algoritme is gebruikt om lokale Ca²⁺-microdomeinen in primaire muizen-T-cellen te analyseren, evenals Jurkat T-cellen en een NK-cellijn (KHYG-1)¹² en was succesvol in de analyse van Ca²⁺-microdomeinen voor een neuronale cellijn van muizen (N2a, niet-gepubliceerde gegevens). In principe zou het protocol en de analysetoolbox kunnen worden gebruikt om niet-sferische celtypen zoals HEK293- of HeLa-cellen te analyseren, maar voor deze celtypen kan de dartbordprojectie niet worden aangepast omdat deze is gebaseerd op een ronde structuur en vormnormalisatie van de cellen. Bovendien kan het protocol voor het detecteren van gelokaliseerde initiële Ca^2+-microdomeinen bij stimulatie van de parel worden aangepast om lokale Ca²⁺-signalen te analyseren die zijn afgeleid van andere stimuli, zoals oplosbare activerende of remmende verbindingen, evenals adhesie-afhankelijke en TCR/CD3-onafhankelijke Ca²⁺-microdomeinen^10,11. Merk op dat het gemakkelijker is om een enkel hielcontact te definiëren in termen van tijd en locatie dan om het startpunt van activering na oplosbare verbindingen te bepalen.

Een algemene beperking voor de detectie van de vorming van Ca²⁺ microdomeinen ligt in de vereiste hoge temporeel-ruimtelijke resolutie en de noodzakelijke hoge signaal-ruisverhouding (SNR). Momenteel bereikt de resolutie die is afgeleid van onze opstelling een berekende ruimtelijke resolutie van ~0,368 μm en een tijdelijke resolutie van ~40 frames per seconde (fps)¹. Recente ontwikkelingen in de ontwikkeling van camera's en detectoren, evenals de verbetering van fluorescerende kleurstoffen, kunnen leiden tot de mogelijkheid om optische eenkanaalsopnames te maken, zoals ze zijn beschreven voor ORAI-GECI (genetisch tot expressie gebrachte Ca^2+- indicatoren)^{constructen 24} voor live celbeeldvorming met behulp van Ca^2+- indicatoren met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie in de toekomst.

Alles bij elkaar kunnen het hier beschreven protocol en analyse-instrument voor hoge-resolutie Ca²⁺ -microdomeinbeeldvorming niet alleen worden gebruikt om initiële lokale Ca²⁺ -signalen in T-cellen te analyseren, maar kunnen ze ook worden aangepast aan andere celtypen om het belang van lokale Ca²⁺ -signalering in deze cellen te ontcijferen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
α-CD3	BD Pharmingen	553058
α-CD28	BD Pharmingen	553295
Anaconda	Anaconda	https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Cell strainer	Biofil	CSS-013-070	70 µm diameter
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	A49865
Cover slips	Paul Marienfeld GmbH	101202
DARTS	GitHub	https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS
Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco, Thermo Fisher	14190144
EasySep CD4+ T cell Isolation Kit	Stemcell	19852
EasySep Magnetic Multistand	Stemcell	18010
Fluo 4-AM	Invitrogen	F14201
Fura Red-AM	Invitrogen	F3020
Gibco RPMI 1640 medium	Gibco, Thermo Fisher	11875093
Git	GitHub	https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git
immersion oil	Leica	11513859
Newborn calf serum	Sigma-Aldrich	N4637
Oracle	Oracle	https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/
Penicillin/Streptamycin	Gibco, Thermo Fisher	15240062
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Protein G magnetic beads	Merck	LSKMAGG02	10 µM diameter
Python	Python	https://www.python.org/downloads/
Silicon grease (basylone)	Bayer	291-1220
Time-Dependent Entropy Deconvolution	GitHub	https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters
Tween	q-biogene	TWEEN201