Hybride ensemble en single-molecule assay om de beweging van volledig gereconstitueerde CMG in beeld te brengen

Samenvatting

We rapporteren een hybride ensemble- en single-molecule-assay om de beweging van fluorescerend gelabelde, volledig gereconstitueerde Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase op lineaire DNA-moleculen die op hun plaats worden gehouden in een optische val, direct in beeld te brengen en te kwantificeren.

Samenvatting

Eukaryoten hebben één replicatieve helicase die bekend staat als CMG, die het replisoom centraal organiseert en aandrijft, en de weg wijst aan de voorkant van replicatievorken. Het verkrijgen van een diepgaand mechanistisch begrip van de dynamiek van CMG is van cruciaal belang om op te helderen hoe cellen de enorme taak volbrengen om hun volledige genoom eenmaal per celcyclus efficiënt en nauwkeurig te repliceren. Single-molecule technieken zijn bij uitstek geschikt om de dynamiek van CMG te kwantificeren vanwege hun ongeëvenaarde temporele en ruimtelijke resolutie. Desalniettemin zijn studies met één molecuul van CMG-beweging tot nu toe gebaseerd op voorgevormd CMG dat als een complex uit cellen is gezuiverd, wat de studie van de stappen die leiden tot de activering ervan uitsluit. Hier beschrijven we een hybride ensemble en een enkelvoudige molecuultest die beeldvorming op het niveau van één molecuul van de beweging van fluorescerend gelabeld CMG mogelijk maakte na volledige reconstructie en activering van 36 verschillende gezuiverde S. cerevisiae-polypeptiden . Deze test is gebaseerd op de dubbele functionalisatie van de uiteinden van een lineair DNA-substraat met twee orthogonale hechtingsgroepen, en kan worden aangepast om vergelijkbare complexe DNA-verwerkingsmechanismen op het niveau van één molecuul te bestuderen.

Inleiding

DNA-replicatie in eukaryoten wordt uitgevoerd door een dynamisch eiwitcomplex dat bekend staat als het replisoom¹. Een belangrijk onderdeel van dit complex is de eukaryote replicatieve helicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), die het replisoom aanstuurt en centraal organiseert, en voorop loopt aan de voorkant van replicatievorken ^1,2. Het verkrijgen van een diepgaand kwantitatief begrip van de dynamiek van CMG is daarom van cruciaal belang om de dynamiek van het replisoom te begrijpen. Een dergelijk begrip zou kunnen worden verkregen met technieken met één molecuul, die bij uitstek geschikt zijn om moleculaire motoren, zoals CMG, te bestuderen vanwege hun ongeëvenaarde ruimtelijke en temporele resolutie, en die ons een ongeëvenaard kwantitatief begrip kunnen verschaffen van hun functie, stochasticiteit en dynamiek 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo wordt CMG op een tijdelijk gescheiden manier geladen en geactiveerd om ervoor te zorgen dat replicatie slechts één keer per celcyclus plaatsvindt ^1,10,11. Ten eerste, in de G1-fase van de celcyclus, laadt een reeks eiwitten die bekend staan als belastingsfactoren het eerste bestanddeel van CMG, het Mcm2-7 hexamere complex, op dsDNA 12,13,14,15,16 in de vorm van dubbele hexameren met een head-to-head configuratie 15,17,18. In het specifieke geval van gist vindt dit eerste proces plaats bij specifieke DNA-sequenties die bekend staan als de oorsprong van replicatie¹. Hoewel Mcm2-7 de motorkern is van de replicatieve helicase, is het op zichzelf niet in staat om DNA¹⁹ af te wikkelen zonder de twee helicase-activerende factoren Cdc45 en GINS, die moeten worden gerekruteerd voor de geladen Mcm2-7 om aanleiding te geven tot volledig actieve CMG 11,19,20,21. Het proces van helicase-activering vindt plaats in de S-fase van de celcyclus en begint met de selectieve fosforylering van Mcm2-7 dubbele hexameren door het celcyclusgereguleerde kinase DDK 22,23,24. Deze fosforyleringsgebeurtenissen vergemakkelijken de rekrutering van Cdc45 en GINS naar de Mcm2-7 dubbele hexameren 10,22,23,24,25,26 door een tweede set eiwitten die bekend staan als vuurfactoren 10,11,26. De binding van Cdc45 en GINS geeft aanleiding tot twee zuster-CMG-helicases, die aanvankelijk beide strengen van het ouderlijke DNA omsluiten en zich nog steeds in een head-to-head-configuratie bevinden^11,27. In de laatste activeringsstap katalyseert de vuurfactor Mcm10 de ATP-hydrolyse-afhankelijke extrusie van één DNA-streng van elke zuster-CMG¹¹. Na de extrusie van de strengen omzeilen en scheiden zuster-CMG-helicasen zich van elkaar door langs ssDNA te transloceren op een ATP-hydrolyse-afhankelijke manier 11,20,21,28, waarbij DNA wordt afgewikkeld door de niet-translocatiestreng²⁹ sterisch uit te sluiten. Dit hele proces is in vitro volledig gereconstrueerd uit een minimale set van 36 gezuiverde S. cerevisiae polypeptiden^10,11.

Ondanks de voortreffelijke in vivo regulatie van CMG-assemblage en -activering zoals hierboven beschreven, zijn in vitro gereconstitueerde bewegingsstudies van één molecuul van CMG 2,30,31,32,33,34 tot nu toe gebaseerd op vooraf geactiveerd CMG gezuiverd als een complex uit cellen ^20,21, waarbij alle stappen voorafgaand aan de activering en de bidirectionele aard van de beweging worden gemist. Deze vooraf geactiveerde CMG-benadering is de gouden standaard geweest op het gebied van één molecuul, deels vanwege de biochemische complexiteit van de volledig gereconstitueerde CMG-assemblagereactie^10,11. Deze biochemische reactie is om verschillende redenen een uitdaging geweest om te vertalen van het bulkbiochemische niveau naar het niveau van één molecuul. Ten eerste, om de reactie-efficiëntie te maximaliseren, zijn de belastings- en ontstekingsfactoren die nodig zijn voor CMG-assemblage en -activering vereist in concentraties in het bereik van 10-200 nM 10,11,27. Deze concentratiebereiken komen overeen met de bovenkant van wat de meeste technieken met één molecuul kunnen verdragen, vooral bij gebruik van fluorescerend gelabelde componenten³⁵. Ten slotte is CMG geëvolueerd om door duizenden basenparen in een cel te cruisen 36,37,38,39. Om de beweging ervan op een biologisch relevante ruimtelijke schaal te bestuderen, heeft men daarom lange DNA-substraten nodig (meestal met een lengte in de orde van tientallen kilobasen)30,31,34,40,41,42. Het gebruik van dergelijke lange DNA-substraten vormt de extra uitdaging dat hoe langer het DNA-substraat is, hoe meer potentiële niet-specifieke bindingsplaatsen voor eiwitten en eiwitaggregaten het heeft. In het geval van CMG is dit laatste punt bijzonder belangrijk, aangezien verschillende van de belastings- en vuurfactoren die betrokken zijn bij de assemblage en activering van CMG intrinsiek ongeordende gebieden bevatten⁴³ en vatbaar zijn voor aggregatie.

Hier rapporteren we een hybride ensemble en een enkelvoudige molecuultest die de observatie en kwantificering van de beweging van CMG mogelijk maakte na volledige reconstructie van de assemblage en activering ervan uit 36 gezuiverde S. cerevisiae-polypeptiden ²⁸. Deze test is gebaseerd op de dubbele functionalisatie van beide uiteinden van een DNA-substraat met twee orthogonale hechtingsgroepen: desthiobiotine en digoxigenine² (Figuur 1A). Het eerste deel, desthiobiotine, wordt gebruikt om het DNA-substraat omkeerbaar te binden aan met streptavidine beklede magnetische kralen⁴⁴ (Figuur 1B). Hierna wordt fluorescerend gelabeld CMG geassembleerd en geactiveerd op het kraalgebonden DNA, en een magnetisch rek wordt gebruikt om de resulterende magnetische kraalgebonden DNA:CMG-complexen te zuiveren en te wassen (Figuur 1C). Daarbij wordt het overtollige eiwit verwijderd dat zich anders op het DNA-substraat zou ophopen; dit zorgt voor vrijwel aggregatievrije DNA:CMG-complexen. Intacte complexen worden vervolgens geëlueerd uit de magnetische kralen door de toevoeging van een molaire overmaat aan vrije biotine, die de interactie tussen desthiobiotine en streptavidine kan overtreffen (Figuur 1D). Individuele DNA:CMG-complexen worden vervolgens gebonden tussen twee optisch ingesloten polystyreenkorrels bedekt met anti-digoxigenine-antilichaam (anti-Dig); voor deze stap wordt het tweede deel van het DNA, digoxigenine, gebruikt, omdat het zelfs in een bufferoplossing met een overmaat aan vrije biotine aan anti-Dig kan binden (Figuur 1E). Zodra het DNA:CMG-complex op zijn plaats wordt gehouden in de optische val, wordt de beweging van fluorescerend gelabeld CMG in beeld gebracht met een confocale scanlaser (Figuur 1F). We verwachten dat deze test gemakkelijk kan worden aangepast voor de studie op het niveau van één molecuul van vergelijkbare complexe DNA:eiwitinteracties.

Protocol

1. Synthese van dubbel gefunctionaliseerd lineair DNA-substraat en binding aan magnetische kralen

1. Dubbele functionalisatie van DNA-substraat met desthiobiotine- en digoxigeninegroepen
   1. Lineariseer 20 μg 23,6 kb plasmide pGL50-ARS1 (met een natuurlijke ARS1-oorsprong van replicatie, intern gekloond en op aanvraag verkrijgbaar) met 200 eenheden restrictie-enzym AflII gedurende 16 uur bij 37 °C in een eindvolume van 200 μl 1x buffer (50 mM kaliumacetaat, 20 mM Tris-acetaat, 10 mM magnesiumacetaat, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).
      OPMERKING: Deze stap kan worden teruggebracht tot 4 uur zonder de opbrengst te verminderen, als dit handiger is.
   2. Inactiveer AflII door de reactie gedurende 20 minuten bij 65 °C te incuberen. Maak de resulterende 4-nucleotide TTAA-overhangen af door de linearisatiereactie van 200 μl aan te vullen met 60 eenheden Klenow-fragment (3' tot 5' exo-) polymerase, 17 μL 10x buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotine-7-dATP, 33 μM Digoxigenine-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, en ultrapuur water tot een eindvolume van 370 μM. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: In deze stap stompt het Klenow-fragment de uitsteeksels aan beide uiteinden van het gelineariseerde DNA af door aan elk uiteinde twee D-Desthiobiotine-7-dATP- en twee Digoxigenine-11-dUTP-nucleotiden op te nemen.
   3. Vul de reactie aan met 10 mM EDTA en inactiveer het Klenow-fragment door de reactie gedurende 20 minuten bij 75 °C te incuberen. Breng het reactievolume naar 400 μL met ultrapuur water.
   4. Neem vier S-400 spinkolommen, draai ze minstens 30 s om de hars opnieuw te suspenderen en centrifugeer ze vervolgens gedurende 1 minuut op 735 x g om de opslagbuffer te verwijderen. Breng de kolommen over naar schone buisjes van 1,5 ml.
   5. Voeg onmiddellijk 100 μL van de DNA-oplossing toe aan elke kolom en centrifugeer ze gedurende 2 minuten op 735 x g. Het DNA zit nu in de doorstroom, en de kolommen kunnen worden weggegooid.
   6. Bundel de doorstroming van de vier kolommen, meet het volume met een pipet en meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Dit wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA te berekenen die aan de kralen is gebonden.
2. Binding van dubbel gefunctionaliseerd lineair DNA aan met streptavidine gecoate magnetische kralen
   1. Vortex M-280 met streptavidine gecoate magnetische kralen gedurende 30 s om ze opnieuw te suspenderen.
   2. Breng 4 mg geresuspendeerde M-280 met streptavidine gecoate magnetische kralen over in een schone buis van 1,5 ml. Plaats de buis in een magnetisch rek, wacht 1 minuut totdat de kralen zijn verzameld en verwijder de opslagbuffer.
   3. Voeg 1 ml 1x buffer A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA en 1 M NaCl) toe aan de korrels en resuspendeer door middel van vortexen gedurende 5 s. Incubeer de kralen 5 minuten op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Alle buffers moeten steriel gefilterd zijn. Maak vooraf een groot volume van 2x buffer A, 1x buffer B (zie hieronder) en 1x buffer C (zie hieronder) om tijd te besparen (aanbevolen). Deze buffers worden aanbevolen door de fabrikant van de magnetische kralen en kunnen worden bewaard bij - 20°C.
   4. Plaats de buis in een magnetische houder, wacht 1 minuut totdat de kralen zijn verzameld en verwijder buffer A.
   5. Resuspendeer de korrels in 400 μL 2x buffer A door te pipetteren en voeg vervolgens 400 μL gefunctionaliseerde DNA-oplossing toe (merk op dat dit de 2x buffer A verdunt tot een eindconcentratie van 1x, wat optimaal is voor DNA-binding aan de kralen). Meng voorzichtig door te pipetteren.
   6. Incubeer het mengsel van de kraal en het DNA een nacht bij 4 °C met end-over-end rotatie om het gefunctionaliseerde DNA aan de kralen te laten binden.
   7. Gebruik het magnetische rek om het supernatans te verwijderen (gooi het niet weg voordat u het volume met een pipet en de concentratie van ongebonden DNA met een spectrofotometer hebt gemeten) en was de kralen 2x met 500 μL buffer B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA en 1 M KOAc) om niet-specifiek gebonden DNA te verwijderen. Was de korrels 2x met 500 μL buffer C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 en 1 mM EDTA), dit is de door de fabrikant aanbevolen opslagbuffer.
      1. Bereken de totale hoeveelheid DNA die aan de magnetische kralen is gebonden door de totale hoeveelheid DNA die aan de kralen is toegevoegd te vergelijken met de hoeveelheid DNA die nog in de supernatant zit. De opbrengst moet in het bereik liggen van 2,3-2,9 mg DNA (~150-190 fmol) per mg magnetische kralen. Als er een lager rendement wordt behaald, controleer dan of de S400-kolommen niet droog zijn voordat u ze gebruikt. Controleer voortdurend de DNA-integriteit door middel van gelelektroforese om ervoor te zorgen dat het initiële plasmide-DNA-substraat niet wordt afgebroken.
   8. Resuspendeer de korrels in 300 μl buffer C en bewaar bij 4 °C. Om inkervingen te voorkomen, maakt u 4 aliquots voor eenmalig gebruik van 1 mg magnetische kralen en bewaart u het DNA niet langer dan 2 weken.

2. Hybride ensemble- en single-molecule assay om de beweging van volledig gereconstitueerde CMG in beeld te brengen en te kwantificeren met correlatieve dual-beam optische pincet en confocale microscopie

1. Ensemble-assemblage en activering van fluorescerend gelabeld CMG op magnetisch kraalgebonden DNA (Figuur 1C).
   OPMERKING: CMG-assemblage en activeringsreacties werden in twee fasen uitgevoerd: Mcm2-7 laden en fosforyleren, en CMG-assemblage en activering. Tenzij anders aangegeven, werden alle stappen voor het uitwisselen van buffers uitgevoerd met behulp van een magnetisch rek door de kralen gedurende 1 minuut door de magneet te laten verzamelen en vervolgens de supernatant te verwijderen. Alle incubaties werden uitgevoerd in een temperatuurgecontroleerd warmteblok met een deksel om fotobleking van fluorescerende eiwitten te voorkomen. Als er geen deksel beschikbaar is, moeten de buizen worden afgedekt met aluminiumfolie. De zuivering en fluorescerende etikettering van alle eiwitten die in dit protocol worden gebruikt, zijn uitgevoerd zoals eerder beschreven^10,11,28.
   1. Mcm2-7 laden en fosforylering
      1. Neem 1 mg DNA-gebonden magnetische kralen met streptavidinecoating en verwijder de opslagbuffer (buffer C).
      2. Was de korrels met 200 μL laadbuffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutamaat, 10 mM MgOAc, 0,02% NP40 vervanger, 10% glycerol, 2 mM DTT, 100 μg/ml BSA en 5 mM ATP).
      3. Verwijder de laadbuffer en resuspendeer de korrels in 75 μL laadbuffer. Meng voorzichtig door te pipetteren.
      4. Voeg ORC in een eindconcentratie van 37,5 nM toe aan het kraalgebonden DNA en incubeer de reactie gedurende 5 minuten bij 30 °C met 800 rpm agitatie.
      5. Voeg Cdc6 toe in een eindconcentratie van 50 nM en incubeer de reactie gedurende 5 minuten bij 30 °C met 800 rpm roeren.
      6. Voeg Mcm2-7/Cdt1 (of fluorescerend gelabeld Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3}/Cdt1) toe in een eindconcentratie van 100 nM en incubeer de reactie gedurende 20 minuten bij 30 °C met 800 rpm agitatie.
      7. Voeg DDK toe in een eindconcentratie van 100 nM en incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 30 °C met 800 rpm roeren.
      8. Verwijder het supernatans en was het kraalgebonden DNA (dat nu gefosforyleerde Mcm2-7-hexameren bevat) met 200 μl hoogzoutwasbuffer (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02% NP40-vervanger, 10% glycerol, 1 mM DTT en 400 μg/ml BSA). Meng door te pipetteren, zorg ervoor dat de korrels volledig in de buffer worden geresuspendeerd en er geen klonten zichtbaar zijn.
      9. Verwijder de HSW-buffer en was de korrels één keer met 200 μL CMG-buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K glutamaat, 10 mM MgOAc, 0,02% NP40-vervanger, 10% glycerol, 1 mM DTT en 400 μg/ml BSA).
   2. Assemblage en activering van fluorescerend gelabelde CMG
      1. Verwijder de CMG-buffer en resuspendeer de DNA-gebonden korrels in 50 μL CMG-buffer aangevuld met 5 mM ATP.
      2. Voeg 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45^LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 en 10 nM Mcm10 toe aan het kraalgebonden DNA. Meng voor deze stap alle eiwitten in één buisje direct voordat je ze aan het DNA toevoegt en plaats het op ijs. Voeg het geresuspendeerde parelgebonden DNA toe aan de eiwitmix. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij 30 °C met 800 rpm roeren.
      3. Was de korrels 3x met 200 μL HSW buffer. Was de korrels één keer met 200 μL CMG buffer.
   3. Elutie van intact DNA:CMG-complexen van magnetische kralen (Figuur 1D)
      1. Verwijder CMG-buffer en elute DNA:CMG-complexen van de magnetische kralen door de CMG-bevattende DNA-gebonden magnetische kralen te resuspenderen in 200 μL elutiebuffer (CMG-buffer aangevuld met 10 mM biotine). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met 800 rpm roeren.
      2. Plaats de tube in een magnetisch rek en laat de kralen 5 minuten verzamelen. Verzamel voorzichtig het supernatans (dat nu de geëlueerde DNA:CMG-complexen bevat) zonder de bezonken kralen te verstoren en breng het over naar een nieuw buisje.
      3. Om ervoor te zorgen dat er geen parels in de oplossing achterblijven (aangezien magnetische kralen die in de oplossing achterblijven het optische vanggedeelte van de test kunnen verstoren), plaatst u het verzamelde supernatans opnieuw in een magnetisch rek en laat u de resterende kralen nog 5 minuten verzamelen. Verzamel het supernatans voorzichtig en breng het over in een nieuwe buis.
      4. Voeg 1400 μL CMG-buffer toe aan de 200 μL supernatant. Het monster is nu klaar voor beeldvorming met één molecuul.
2. Enkelvoudige beeldvorming van volledig gereconstitueerde CMG met een correlatief optisch pincet met dubbele bundel en confocale microscopie (Figuur 1E-G).
   OPMERKING: Het enkelvoudige molecuulgedeelte van de test wordt uitgevoerd in een commerciële opstelling die een optisch pincet met dubbele straal combineert met confocale microscopie en microfluïdica^45,46 (Figuur 1E-G), maar kan ook in een zelfgebouwde opstelling worden uitgevoerd. De commerciële opstelling die hier wordt gebruikt, is uitgerust met een microfluïdische flowcel met vijf inlaten (respectievelijk kanalen 1-5 genoemd) en één uitlaat (Figuur 1E). In de onderstaande stappen zijn alle knop- en/of paneelnamen specifiek voor de software die bij deze commerciële opstelling wordt geleverd.
   1. Gebruik de vijf inlaten in de commerciële opstelling als volgt: Injecteer kanalen 1-3 van links en gebruik ze voor het vangen van kralen (kanaal 1), DNA-eiwitcomplexbinding (kanaal 2) en het controleren op de aanwezigheid van CMG (kanaal 3). Gebruik de kanalen 4 en 5 als eiwitreservoirs en bufferuitwisselingslocaties. Passiveer de microfluïdische flowcel vóór elk experiment gedurende ten minste 30 minuten met 1 mg/ml runderserumalbumine, gevolgd door 0,5% pluronic F-127 opgelost in ultrapuur water.
      1. Zorg ervoor dat de inhoud van elk kanaal in elk experiment is zoals beschreven (Figuur 1E):
         Kanaal 1: Anti-digoxigenine-gecoate polystyreenkorrels (2,06 μm diameter) verdund 1:50 in PBS;
         Kanaal 2: DNA:CMG-complexen geëlueerd uit magnetische kralen;
         Kanaal 3: Beeldvormingsbuffer (CMG-buffer aangevuld met 2 mM 1,3,5,7 cyclooctatetraeen, 2 mM 4-nitrobenzylalchohol en 2 mM Trolox);
         Kanalen 4 en 5: Imaging Buffer aangevuld met 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 en ofwel 5 mM ATP, 5 mM ATPγS, ofwel geen nucleotide.
   2. Pas vóór het experiment het vermogen van de vanglaser aan om een stijfheid van 0.3 pN/nm in beide vallen^33,46 te bereiken door op de knop Opnieuw kalibreren in het Power Controls-paneel van de software te klikken. Stel de confocale pixelgrootte in op 50 x 50 nm, de afbeeldingsgrootte op 160 x 18 pixels, de verlichtingstijd per pixel op 0.2 ms en de framesnelheid op 5 s in het Image Scan-paneel van de software. Stel de temperatuurregelaar in op 30 °C in het paneel Temperatuur.
      OPMERKING: Daarnaast raden we aan om de maximale podiumsnelheid (gebruikt om tussen kanalen te bewegen) in te stellen op 0.2 mm/s om CMG-dissociatie van het DNA door de sleepkracht te minimaliseren.
   3. Vloei alle oplossingen in de flowcel met een constante druk van 0,5 bar in de injectiepoort (die kan worden ingesteld in het Pressure Bar-paneel van de software). Schakel vervolgens de stroom in kanalen 4 en 5 uit. Nadat u alle oplossingen in eerste instantie hebt laten stromen, verlaagt u de druk tot 0,2 bar.
   4. Verplaats de vanglasers naar kanaal 1 totdat er één kraal in elke optische val is gevangen. Verplaats ingesloten kralen naar kanaal 2 door de joystick te bewegen terwijl u de trekker indrukt. Vis vervolgens een DNA:CMG-complex door de rechterkraal naar en weg van de linkerkraal te bewegen met behulp van de joystick zonder de trekker over te drukken, totdat een DNA-ketting vastzit (die bekend is door de krachtuitbreidingscurve van het gevangen DNA⁴⁷ in het FD Viewer-paneel van de software te volgen).
      1. Zorg er voor DNA-tethering voor dat u de DNA-lengte en de juiste temperatuurwaarde invoert in het Reference Model-paneel, dat automatisch een theoretisch uitbreidbaar wormachtig ketenmodel van het DNA-construct in het FD Viewer-paneel zal plotten. Als een enkel DNA-molecuul tussen de twee kralen wordt gevangen, moet het krachtuitbreidingsgedrag van het DNA nauw aansluiten bij het uitgezette uitbreidbare wormachtige ketenmodel. Zorg ervoor dat dit het geval is door de experimentele kracht-uitbreidingscurve te volgen, die de software automatisch bovenop de theoretische zal plotten.
         OPMERKING: Afwijkingen van het theoretische model kunnen wijzen op de aanwezigheid van meerdere DNA-moleculen die tussen de kralen zijn gebonden en/of de aanwezigheid van eiwitaggregaten die aan het DNA zijn gebonden en het DNA verdichten. Om de krachtgemedieerde dissociatie van eiwitten van het DNA te voorkomen, mag u tijdens deze eerste test een spanning van 10 pN niet overschrijden.
   5. Verplaats de kralen naar kanaal 3 en stop onmiddellijk de stroom in alle kanalen. Voer een testscan van één frame uit in kanaal 3 om de aanwezigheid van CMG te bevestigen, verlicht met een laser van 561 nm met een vermogen van 4 μW zoals gemeten bij het objectief. Pas de beeldvormingslaservermogens aan in het deelvenster Excitatielasers. Indien aanwezig, zal CMG verschijnen als tweedimensionale diffractie-beperkte vlekken, zoals weergegeven in figuur 1G en figuur 2A.
      1. Als er geen DNA kan worden gevangen, controleer dan kanaal 2 op belletjes, die de stroming in kanaal 2 kunnen vertragen (vergeleken met kanalen 1 en 3). Als er luchtbellen aanwezig zijn, verhoog dan de druk in kanaal 2 tot 1 bar om te proberen de bellen door te spoelen.
   6. Als CMG aanwezig is, verplaats dan de DNA-ketting naar kanaal 4 of 5 voor beeldvorming; Zet anders de stroom weer aan, gooi de kralen weg en ga terug naar stap 2.2.4.
   7. Pas in kanaal 4 of 5 de afstand tussen de kralen aan om een beginspanning van 2 pN in de DNA-ketting te bereiken. Voer hiervoor 2 pN in het paneel Krachtspectroscopie in en klik op de knop Inschakelen om een krachtklem te starten. Zodra de aanvankelijke spanning 2 pN bereikt, schakelt u de kracht uit clamp voordat u beeldvorming maakt door op de knop Inschakelen in het paneel Krachtspectroscopie te klikken.
   8. Afbeelding CMG^Cdc45-LD555 elke 5 s met een laser van 561 nm met een vermogen van 4 μW zoals gemeten bij het objectief (Figuur 1F). Klik hiervoor op de knop Scan starten in het deelvenster Afbeeldingenscan. In dergelijke scans wordt CMG weergegeven als tweedimensionale diffractie-beperkte vlekken, zoals het voorbeeld in figuur 1G.
      1. Als CMG wordt waargenomen, maar het lijkt niet te bewegen voordat het bleekt, test dan alle eiwitten die worden gebruikt voor nuclease-activiteit, aangezien inkepingen op het DNA ervoor zorgen dat CMG dissocieert van DNA⁴¹, waardoor de schijnbare processiviteit ernstig wordt verminderd.
         OPMERKING: Een laservermogen van 4 μW zou consistente resultaten moeten geven als u de hier gebruikte commerciële microscoop gebruikt. Als u een zelfgebouwde opstelling gebruikt, raden we aan om het optimale laservermogen empirisch in te schatten. Een optimaal laservermogen moet voldoende signaal van de fluorofoor geven om het met de gewenste precisie te lokaliseren, en een fluorofoorlevensduur die dicht bij het gewenste tijdsbereik van het experiment ligt.
         OPMERKING: Hoewel deze publicatie zich richt op de hybride ensemble- en single-molecule-test, hebben we eerder een uitgebreide beschrijving gepubliceerd van de analyse van de gegevens die met deze test zijn gegenereerd⁴⁸.

Resultaten

Als het hier wordt beschreven, zou het hier beschreven protocol vrijwel aggregaatvrije DNA:CMG-complexen moeten opleveren. Een aggregatievrije reactie mag geen van de kanalen in de microfluïdische flowcel verstoppen, en het moet mogelijk zijn om de gevangen DNA-moleculen uit te rekken tot een end-to-end extensie binnen 10% van de contourlengte zonder het DNA te breken. Omgekeerd, als er aggregatie in de reactie is, kunnen DNA-moleculen soms worden verdicht door de aggregaten, waardoor DNA-breuk vaak ontstaat als ze worden uitgerekt. Een goede manier om eiwitaggregaten te herkennen is door te kijken naar de 2D-scans van het DNA. In een aggregatievrije reactie verschijnt CMG als discrete, symmetrische, diffractie-beperkte vlekken die het DNA schaars verdringen, zoals die in de scans die worden getoond in figuur 2A. Integendeel, aggregaten zijn minder discrete, soms asymmetrische klodders die een grotere lengte van het DNA bevolken, zoals die in de scans die in figuur 2B worden getoond. Bovendien, als de test met succes wordt uitgevoerd en een hoge zuiverheid van de gezuiverde eiwitten wordt bereikt, zal de langeafstandsbeweging van CMG in aanwezigheid van ATP worden gezien, zoals waargenomen in de kymograaf weergegeven in figuur 2C.

Figuur 1: Picturale beschrijving van een hybride ensemble en een enkelvoudige molecuultest om de beweging van volledig gereconstitueerd CMG in beeld te brengen en te kwantificeren. (A) Een lineair DNA van 23,6 kb dat een natuurlijk voorkomende ARS1-oorsprong van replicatie bevat, is aan beide uiteinden dubbel gefunctionaliseerd met desthiobiotine- en digoxigeninegroepen. (B) Dubbel gefunctionaliseerd DNA is gebonden aan met streptavidine beklede magnetische kralen door zijn destiobiotine-groepen. (C) CMG wordt stapsgewijs geassembleerd en geactiveerd op het magnetische parelgebonden DNA met verschillende wasstappen om overtollig ongebonden eiwit en eiwitaggregaten te verwijderen. (D) Intact DNA: CMG-complexen worden vervolgens geëlueerd uit de magnetische kralen door de toevoeging van een overmaat aan vrije biotine, die de interactie tussen desthiobiotine en streptavidine overtreft. (E) Individueel DNA: CMG-complexen worden gebonden tussen twee anti-digoxigenine-gecoate optisch gevangen polystyreenkorrels met behulp van een microfluïdische stroomcel. Merk op dat de Dig-anti-Dig-interactie orthogonaal is ten opzichte van biotine-avidine-interacties, dus het wordt niet beïnvloed door de aanwezigheid van vrije biotine. (F) Eenmaal op hun plaats gehouden door het optische pincet, worden DNA:CMG-complexen overgebracht naar verschillende bufferomstandigheden, waar het DNA-vlak vervolgens wordt gescand met een confocale scanlaser om de beweging van CMG langs het DNA in de loop van de tijd af te beelden. (G) Het bovenste paneel toont een diagram van een DNA:CMG-complex dat op zijn plaats wordt gehouden tussen twee optisch gevangen anti-Dig-gecoate polystyreenkorrels die worden gescand door een confocale scanlaser. Het onderste paneel toont een voorbeeld van een 2D-scan van CMG gebonden aan een DNA dat op zijn plaats wordt gehouden met een optische val. Het DNA is in deze experimenten niet gelabeld, maar het kan worden gezien als een horizontale lijn die door het midden van het beeld loopt. Dit cijfer is gewijzigd van²⁸. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeelden van gegevens van een succesvol en een mislukt experiment. (A) Voorbeeld 2D-scans van een CMG-bevattend DNA in een aggregatievrij monster. In beide scans vertoont CMG symmetrische en discrete diffractie-beperkte vlekken die schaars verspreid zijn langs het DNA. (B) Voorbeeld van 2D-scans van een CMG-bevattend DNA in een monster dat aggregaten bevat. In beide scans vormt CMG minder symmetrische klodders die het DNA verdringen. (C) Kymograaf die de positie op het DNA van CMG-diffractiebeperkte vlekken in de tijd weergeeft in aanwezigheid van ATP, waarbij de langeafstandsbeweging van CMG-complexen wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen en belangrijke kwaliteitscontroles van reagentia
De kritieke stappen en kwaliteitscontroles van biologische reagentia in de test worden hier belicht. Ten eerste is de zuiverheid van de gebruikte eiwitten belangrijk omdat DNA-afbraak veroorzaakt door zelfs kleine nucleaseverontreinigingen in de eiwitmonsters de gegevens nadelig zal beïnvloeden. Dit komt omdat alleen intacte (of gedeeltelijk gekapte) DNA-moleculen kunnen worden opgesloten in het optische pincet met dubbele straal. Wat nog belangrijker is, is dat inkepingen in het DNA ervoor zorgen dat CMG⁴¹ dissocieert, wat de observatie van CMG's langeafstandsbeweging bemoeilijkt. We raden ten zeerste aan om elk gezuiverd eiwit te testen op nuclease-activiteit en om constant de integriteit van het startplasmidesubstraat te controleren om ervoor te zorgen dat inkepingen tot een minimum worden beperkt. De tweede belangrijke stap is de zorgvuldige verwijdering van de magnetische kralen na de elutie van DNA:CMG-complexen. Het verwijderen van het bovendrijvende middel in deze stap moet langzaam worden uitgevoerd om de verzamelde korrels niet te verstoren. Als er magnetische kralen achterblijven in het monster dat in het optische pincet wordt gevlogen, zullen ze vaak de optisch gevangen polystyreenkorrels raken, waardoor ze uit de optische val ontsnappen en de gegevensverzameling wordt bemoeilijkt. Ten slotte moeten DNA:CMG-complexen voorzichtig worden behandeld in het optische pincet. Daartoe raden we aan om de spanning van het DNA niet boven 10 pN te verhogen, omdat de toepassing van kracht CMG van het DNA kan loskoppelen. Bovendien moet het bewegen tussen kanalen in de microfluïdische flowcel zo langzaam mogelijk gebeuren (~ 0,2 mm/s) om te voorkomen dat de resulterende sleepkrachten CMG van het DNA dissociëren.

Wijzigingen van de methode
Er zijn verschillende stappen van de test die kunnen worden gewijzigd. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de elutietijd kan worden teruggebracht van 60 minuten naar 30 minuten zonder de elutieopbrengst significant te beïnvloeden. Daarnaast raden we aan om de elutiebuffer aan te vullen met een lage (minder dan 1 mM) concentratie van ATP of ATPγS om te voorkomen dat CMG van de DNA-uiteinden diffundeert en om CMG in het algemeen te stabiliseren²⁸. Verder, hoewel de buffersamenstellingen en eiwitconcentraties die we hier rapporteren gebaseerd zijn op die welke zijn gebruikt in eerder biochemisch ensemble- en single-molecule werk^11,18, is de test die we beschrijven volledig compatibel met andere protocollen om CMG^26,27 te assembleren. Daarom kan en moet elke biochemische vooruitgang die wordt gerapporteerd om de efficiëntie van CMG-assemblage of -activering te verhogen, worden geïmplementeerd in het grootste deel van de test om de opbrengst te verhogen. Ten slotte verhoogt het verlengen van de tijd tussen frames de totale tijd waarin CMG kan worden afgebeeld, waardoor de observatie van CMG-bewegingen op lange afstand vóór het bleken van fluorofoor wordt vergemakkelijkt.

Beperkingen van de methode
De hybride methode die we beschrijven is beperkt in die zin dat men CMG alleen kan afbeelden na de activering ervan in bulk. Er zal verder werk nodig zijn om de activering van CMG in realtime te observeren. Een andere belangrijke beperking is dat, hoewel we verwachten dat CMG in paren 17,26,27 wordt geassembleerd, het totale aantal CMG-complexen per DNA dat we waarnemen meestal één²⁸ is, wat suggereert dat CMG, of op zijn minst Cdc45, zich dissocieert van het DNA tijdens de behandeling van de gevoelige DNA:CMG-complexen. Het verminderen van het aantal hanteringsstappen voorafgaand aan de beeldvorming met één molecuul, evenals het ontwikkelen van betere passiveringsstrategieën voor de plastic slangen en het glas van de microfluïdische flowcel, zijn klaar om deze opbrengst te verhogen.

Betekenis van de methode
Single-molecule bewegingsstudies van CMG hebben tot nu toe gebruik gemaakt van vooraf geactiveerde CMG die als een complex uit cellen is gezuiverd. Hoewel relatief eenvoudiger, is deze vooraf geactiveerde CMG-benadering beperkt in die zin dat het een van de stappen mist die leiden tot CMG-activering, evenals de bidirectionele aard van CMG en reagerende beweging. Aan de andere kant heeft de volledige reconstructie van CMG-assemblage en -activering het potentieel om eventuele pre-activeringsstappen te bestuderen, evenals om CMG-beweging op een bidirectionele manier te bestuderen. Desalniettemin is deze benadering moeilijker te vertalen van het bulk biochemische niveau naar het niveau van één molecuul, omdat er veel meer gezuiverde eiwitfactoren en stappen bij betrokken zijn. De test die we hier beschrijven, heeft geholpen om deze uitdagingen te overwinnen door ons in staat te stellen de beweging van volledig gereconstitueerd CMG op het niveau van één molecuul in beeld te brengen, waardoor we toegang krijgen tot een aantal eerder gemiste pre-activeringsdynamieken²⁸. Bovendien, hoewel we meestal één CMG per DNA zien, waren we in staat om verschillende gevallen van twee CMG-complexen die in tegengestelde richting bewegen waar te nemen, en we konden zelfs de initiële scheiding van zuster-CMG's van elkaar vastleggen²⁸, wat enig inzicht gaf in de oprichting van bidirectionele replicatie.

Een ander voordeel van deze test in vergelijking met eerdere CMG-bewegingen ligt in de volledig dubbelstrengs aard van het DNA-substraat dat we gebruiken (Figuur 1A). In eerder voorgeactiveerd CMG-werk is de meest gebruikelijke manier om CMG aan het DNA-substraat te binden via een 3' ssDNA-flap. Dit resulteert in een DNA-construct dat niet gemakkelijk torsioneel kan worden beperkt en dus de studie van de rol van supercoiling in replisoomprogressie verbiedt. Omgekeerd zou de nieuwe benadering die we hier beschrijven het potentieel kunnen hebben om te worden aangepast om de rol van koppel in dit proces te bestuderen, aangezien het gebruikte DNA-substraat volledig dubbelstrengs is.

Bredere toepassingen van de methode
De beschreven hybride test zal de weg vrijmaken voor de volledige reconstructie van een volledig eukaryotisch replisoom, waardoor wij en anderen de belangrijke dynamiek kunnen observeren en kwantificeren die het replisoom in staat stelt om te slagen in al zijn verschillende taken. Afgezien van DNA-replicatie, vertegenwoordigt de test die we rapporteren een belangrijke vooruitgang in het vertalen van een gecompliceerde biochemische reactie van het bulkbiochemische naar het niveau van één molecuul. We verwachten dat deze test gemakkelijk kan worden aangepast om vergelijkbare complexe DNA:eiwit-interacties te bestuderen die betrokken zijn bij verschillende DNA-verwerkingsmechanismen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AflII	NEB	R0520L
Anti-digoxigenin gecoate polystyreenkralen	Spheroteck	DIGP-20-2
ATP-oplossing	Thermo Fisher	R0441
ATPγS	Roche	11162306001
BSA	NEB	B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Buffer	NEB	B6004S	Meegeleverd met AflII
dCTP	Promega	U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP	Jena Bioscience	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigenin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetische kralen	Invitrogen	11205D
Klenow Fragment (3'→5' exo-)	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR spinkolommen	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S	Meegeleverd met Klenow Fragment
Nonidet P 40 Vervanger	Sigma	74385
Pluronic F-127	Sigma	P2443