Methodenartikel

Beoordeling van antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit in kankercellen met behulp van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit Reporter Bioassay

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67077

⸱

13 september 2024

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR 61 Biopolis Drive, 2Department of Radiation Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, 3Key Laboratory of Head and Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 4Department of Thyroid Surgery of Zhejiang Cancer Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor een antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) assay met behulp van een ADCC-bioassaykit. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van het ADCC-mechanisme en het evalueren van het therapeutisch potentieel van antilichamen in kankerimmunotherapie.

Samenvatting

De methode voor antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk hulpmiddel om de werkzaamheid van therapeutische antilichamen bij kankerimmunotherapie te beoordelen. Het evalueren van ADCC-activiteit in kankercellen is essentieel voor de ontwikkeling en optimalisatie van behandelingen op basis van antilichamen. Hier stellen we een methodologische benadering voor van het gebruik van een ADCC-bioassaykit voor kwantitatieve beoordeling van de ADCC-reactie met behulp van schildklierkankercellen als effectorcellen. Het protocol omvat de co-cultuur van effectorcellen met doelwitkankercellen in verschillende verhoudingen in aanwezigheid van een therapeutisch antilichaam. De ADCC-bioassaykit die in dit experiment wordt gebruikt, bevat de genetisch gemanipuleerde effectorcellen die een luciferase-reportergen tot expressie brengen onder controle van Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) responselementen. Bij de binding van het oppervlakteantigeen op de doelcellen met de antilichamen en effectorcellen, geven de effectorcellen luciferase af, waardoor kwantificering van cytotoxiciteit mogelijk is door meting van het luminescentiesignaal. In tegenstelling tot conventionele ADCC-testen bewees deze methode de binding van doelwitantigeen met antilichamen en effectorcellen, die in korte tijd betrouwbare resultaten kunnen opleveren.

Inleiding

Antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk mechanisme waarmee antilichamen immuungemedieerde celdodende effecten uitoefenen 1,2,3. De immuuncellen worden geactiveerd door binding aan het therapeutische antilichaam, dat interageert met oppervlakte-antigenen van de doelcellen om granzymen, perforine, vrij te geven, wat leidt tot de dood van de doelcellen. Deze immuuncellen omvatten natuurlijke killercellen (NK) en neutrofielen 2,3,4,5,6,7. De ADCC-test is een belangrijk hulpmiddel geworden om de werkzaamheid van therapeutisch antilichaam te evalueren 8,9.

In de conventionele ADCC-test worden perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) of natural killer-cellen gebruikt als effectorcellen om de werkzaamheid van een therapeutisch antilichaam te bewaken door het celsterftecijfer van het doelwit te kwantificeren. Onze methode maakt gebruik van een ADCC-bioassaykit die genetisch gemanipuleerde effectorcellen bevat die een luciferase reporter-gen tot expressie brengen onder controle van Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) responselementen. Vervolgens kwantificeren we de binding van het oppervlakteantigeen op de doelcellen met het antilichaam en de effectorcellen. Deze methode is gebaseerd op de ADCC-reactie die in een korte periode optreedt zonder dat menselijke PBMC-cellen nodig zijn. De experimentele stappen omvatten de co-cultuur van effectorcellen met doelcellen in aanwezigheid van therapeutische antilichamen.

Tijdens de incubatie bindt het therapeutische antilichaam zich aan het doelantigeen op het oppervlak van de doelcellen, wat leidt tot de binding van de effectorcellen en het Fc-fragment van een antilichaam. Dit activeert het NFAT-responselement en geeft luminescentiesignalen af voor de kwantitatieve beoordeling van de ADCC-reactie.

Alvorens het experiment uit te voeren, moet de expressie van het doelwitantigeen in de doelcellen worden bevestigd door flowcytometrie of westerse blotting. Doelcellen worden gekweekt en gedurende 24 uur vóór het experiment in platen met 96 putjes geplaatst. Verschillende concentraties van een therapeutisch antilichaam worden toegevoegd samen met verschillende celtellingen van effectorcellen om de berekende effector-tot-doelcelverhouding te bereiken.

De belangrijkste stappen in deze methode zijn onder meer (1) preparatie van doelcellen en effectorcellen, (2) effector-tot-doelcelverhoudingen, (3) bereiding van verschillende concentraties van het antilichaam en (4) variërende incubatieduur. Na de incubatie worden luminescentiesignalen gemeten met behulp van een luminometer, die een kwantitatieve uitlezing van de ADCC-activiteit oplevert. In vergelijking met andere methoden voor het meten van ADCC is deze methode relatief eenvoudig te bedienen en zijn de resultaten nauwkeurig.

De ADCC-reporterbioassay geeft de binding aan van het doelantigeen, het therapeutische antilichaam en de immuuncellen in de activering van de ADCC-route. Deze binding activeert gentranscriptie via de NFAT-route in de effectorcellen-gemanipuleerde Jurkat-cellen met stabiel tot expressie brengende FcγRIIIa-receptor, de V158-variant (hoge affiniteit). Het NFAT-responselement bemiddelt de expressie van luciferase in de effectorcellen10,11. De biologische activiteit van het antilichaam in het werkingsmechanisme (MOA) van ADCC wordt gekwantificeerd door het luciferasesignaal dat wordt geproduceerd door de NFAT-route. Het luciferasesignaal in de effectorcellen - FcγRIIIa-receptor die Jurket-cellen tot expressie brengt - wordt gekwantificeerd met behulp van een luminescentielezer (Figuur 1). De signaal-ruisverhouding van de test is hoog.

Protocol

1. Detectie van EGFR- en VEGFR-expressie in doelcellen

OPMERKING: Gebruik western blotting om de expressie van het doelantigeen in de doelcellen te detecteren.

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Kweek de cellen (BHT-101 en SW-1736 menselijke schildklierkankercellijnen) in T75-kolven met behulp van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% antibiotica (penicilline-streptomycine).
    2. Oogst de cellen wanneer ze voor 80% samenvloeien door de kweekmedia te verwijderen en de cellen te wassen met PBS. Voeg 5 ml PBS toe en schraap de cellen weg met behulp van een celschraper om de cellen uit de kweekkolf te verwijderen. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml.
    3. Tel de cellen met een cellenteller.
    4. Aliquot 5 × 106 van BHT-101 en SW-1736 cellen in 15 ml conische buizen.
    5. Draai de cellen 5 minuten op 135 × g bij kamertemperatuur. Verwijder het bovenstaande PBS.
    6. Lyseer de celpellet door 100 μL RIPA lysisbuffer met protease-fosfataseremmers toe te voegen gedurende 5 minuten op ijs. Breng het lysaat over in een buis van 2 ml, centrifugeer gedurende 15 minuten bij 15.000 × g en breng het bovenstaande over in een nieuwe buis van 2 ml.
    7. Meet de eiwitconcentratie van het cellysaat met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) testkit.
    8. Van elk monster wordt 70 μg eiwit uit het cellysaat toegevoegd, 2x Laemmli-monsterbuffer aangevuld met 10% 2-mercaptoethanol en wordt de monsters gedurende 5 minuten bij 100 °C gekookt voor denaturatie van de monsters.
  2. Gelelektroforese en membraanoverdracht
    1. Bereid 8% natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegel met gedestilleerd water (4,7 ml), 30% acrylamide (2,7 ml), 1,5 m tris-buffer, pH 8,8 (2,5 ml), 10% natriumdodecylsulfaat (0,1 ml), 10% ammoniumpersulfaat (100 μl) en TEMED (10 μl).
    2. Laat 70 μg van de gedenatureerde monsters in de 8% SDS-polyacrylamidegel 20 minuten bij 80 V en 100 minuten bij 120 V draaien.
    3. Breng het eiwit op de gel over naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan bij 100 V gedurende 90 minuten.
    4. Blokkeer na het overbrengen het membraan met 7% magere melk verdund in TBS-T-buffer (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) gedurende 1 uur.
  3. Incubatie van antilichamen
    1. Incubeer het geblokkeerde membraan met anti-epidermale groeifactorreceptor (EGFR) van muizen en monoklonale antilichamen van konijnen (verdund tot 1:1.000 in 7% magere melk) 's nachts bij 4 °C.
    2. Was het membraan na incubatie grondig met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS-T) buffer (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) gedurende 7 minuten en herhaal 4x.
    3. Incubeer het membraan met het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam (verdund tot 1:4.000 in 7% magere melk (TBS-T)) gedurende 1 uur.
    4. Was het membraan na incubatie grondig met TBS-T buffer gedurende 7 minuten en herhaal 4 keer.
  4. Eiwit detectie
    1. Incubeer het membraan in chemiluminescerend HRP-substraat dat is bereid door 1 ml HRP-substraatperoxideoplossing te mengen met 1 ml HRP-substraat Luminol-reagens (beide reagentia komen uit de chemiluminescente substraatkit) gedurende 2 minuten.
    2. Visualiseer het membraan met behulp van een beeldvormingssysteem.

2. Bereiding van doelcellen

  1. Kweek de doel-T-cellen, BHT-101- en SW-1736-cellen exponentieel totdat 80% confluent in RPMI-media aangevuld met 10% FBS, 1% L-glutamine en 1% antibiotica (penicilline-streptomycine) in T-75-kolven.
  2. Was de cellen na het verwijderen van de media één keer met PBS. Incubeer de cellen met 1 ml niet-enzymatische celdissociatiebuffer gedurende 5 minuten om de aanhangende cellen los te maken. Voeg PBS toe om de reactie van de niet-enzymatische celdissociatiebuffer te stoppen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 135 × g en voeg 5 ml PBS toe.
    OPMERKING: Hier gebruiken we een niet-enzymatische celdissociatiebuffer om de integriteit van het membraanoppervlakte-eiwit te behouden.
  3. Tel de cellen en zaai ze op 15.000 cellen/putjes in witte polystyreenmicroplaten met 96 putjes en een heldere, platte bodem.

3. Preparaat van verschillende concentraties van het therapeutische antilichaam

  1. Om dit protocol te volgen, gebruikt u Cetuximab (chimeer anti-EGFR-antilichaam) om EGFR te binden en gebruikt u Bevacizumab (gehumaniseerd anti-VEGF-A-antilichaam) als negatieve controle.
  2. Bereid de ADCC-bioassaybuffer voor door 1,4 ml serum met een laag IgG-gehalte toe te voegen aan 33,6 ml RPMI-1640 (meegeleverd in de kit).
  3. Gebruik ADCC Bioassay-buffer voor de verdunning van antilichamen. Bereid 400 μl van elk antilichaam in drie verschillende concentraties: 30 μg/ml, 3 μg/ml en 0,3 μg/ml (3x concentratie) om de uiteindelijke concentratie van 10 μg/ml, 1 μg/ml en 0,1 μg/ml te krijgen voor een breedspectrumdekking om de optimale dosis te detecteren.
    OPMERKING: De uiteindelijke antilichaamconcentraties zijn gebaseerd op 25 μl gekweekte doelwitcellen, 25 μl effectorcellen en 25 μl antilichaam in elk putje van een plaat met 96 putjes.

4. Voorbereiding van effectorcellen

  1. Bewaar de effectorcellen voor gebruik bij -80 °C.
  2. Verwarm de ADCC Bioassay Buffer voor gebruik minimaal 30 minuten voor in een waterbad van 37 °C.
  3. Ontdooi de ADCC Bioassay Effector-cellen uit een koude opslag van -80 °C door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen (ongeveer 2-3 min). Schud de injectieflacon voorzichtig en inspecteer deze visueel, maar keer deze niet om tijdens het ontdooiproces.
  4. Breng 630ul Effector-cellen over naar een buis van 15 ml met 3,6 ml ADCC-assaybuffer. Meng goed door de tube 2x voorzichtig om te keren.

5. Incubatie van effectorcellen met antilichaam en doelwitcellen

  1. Verwijder na een nacht incubatie de media van de doelcellen (15.000 kankercellen per putje) en voeg 25 μL van de ADCC Bioassay-buffer en 25 μL Cetuximab (EGFR-antagonist) en Bevacizumab (VEGF-antagonist) toe om de uiteindelijke concentratie van 0,1 μg/ml, 1 μg/ml of 10 μg/ml van de doelcellen in elk putje te krijgen volgens figuur 2.
  2. Voeg 75.000 effectorcellen in 25 μL ADCC-bioassaybuffer per putje toe aan de microtiterplaat met 96 putjes die de doelcellen bevat. De putjes met het label No mAb fungeren als No antibody control (Figuur 2).
  3. Voeg de ADCC-bioassaybuffer toe aan de putjes die zijn gelabeld als AB (ADCC-bioassaybuffer) voor blancocontrole.
  4. Incubeer de plaat gedurende 6 uur.

6. Kwantitatieve uitlezing van de ADCC-activiteit

  1. Bereid het luciferase-assay-reagens 4 uur voor de meting voor door de luciferase-assaybuffer toe te voegen aan het luciferase-assaysubstraat (gevriesdroogd).
  2. Na 6 uur incubatie van doelwitcellen, antilichamen en effectorcellen voegt u 75 μL van het luciferase-assay-reagens toe aan elk putje en incubeert u gedurende 30 minuten.
  3. Meet na de incubatietijd het luminescentiesignaal in elke put met behulp van een luminometer, die een kwantitatieve uitlezing van de ADCC-activiteit geeft.
  4. Bereken voor data-analyse de vouw Inductie als volgt:
    Vouwinductie = RLU (antilichaam geïnduceerd - achtergrond) / RLU (geen antilichaamcontrole - achtergrond).
    waarbij RLU relatieve luminescentie-eenheden zijn; Door antilichamen geïnduceerde putten B3 tot B8 en C3 tot C8; Geen antilichaamcontrole = B2 en C2; Achtergrond = Gemiddelde RLU van put A2 tot A5 (Figuur 2).

Resultaten

De expressie van EGFR en VEGFR in de doelcellen BHT-101 en SW-1736 werd gedetecteerd met behulp van western blotting. EGFR-expressie werd gedetecteerd in zowel BHT-101- als SW-1736-cellen, maar geen VEGFR-expressie (Figuur 3).

Met behulp van de ADCC-bioassaykit hebben we de ADCC-reactie van het anti-EGFR-antilichaam, cetuximab, gedetecteerd met behulp van EGFR-positieve cellijnen, BHT-101 en SW-1736, als doelcellen. Bevacizumab, een VEGF-inactivator, werd gebruikt als een negatief controle-antilichaam. Verschillende concentraties antilichamen en effectorcellen werden geïncubeerd met de doelcellen. Het luminescentiesignaal werd gedetecteerd met behulp van een plaatlezer (Afbeelding 2). Een hogere frequentie van ADCC-activiteitsinductie werd gevonden in groepen met cetuximab (anti-EGFR-antilichamen), maar er werd geen ADCC-activiteit gezien in Bevacizumab (VEGF-antagonist) voor beide cellijnen. Dit toonde het ADCC-effect aan dat gericht is op EGFR extracellulaire membraanantigenen voor beide cellijnen. Door deze methode te gebruiken, werd de ADCC-reactie gevalideerd in de aanwezigheid van Cetuximab in twee anaplastische schildklierkankercellijnen (BHT101 en SW1736) (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Een schematisch diagram van de ADCC-reactie met de ADCC-bioassaykit. Antigeenbindingsplaatsen in het therapeutische antilichaam binden zich aan oppervlakte-antigenen in doelcellen. Deze binding leidt tot de binding van het Fc-gedeelte van het antilichaam aan de FcƳRIIIa-receptoren van effectorcellen, die genetisch zijn gemanipuleerd met NFAT-RE luc, waardoor een luminescentiesignaal in de effectorcellen wordt geproduceerd. Dit cijfer is met toestemming12 gewijzigd ten opzichte van de ADCC Reporter Bioassay Core kit-handleiding. Afkortingen: ADCC = Antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit; Fc = Fragment kristalliseerbaar gebied; NFAT = nucleaire factor van geactiveerde T-cel; RE = Respons element; luc = Luciferase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Luminescentiemeting en experimenteel diagram van het plaatontwerp met 96 putjes van het ADCC-cocultuursysteem. Luminescentiesignalen worden gelezen door een luminescentielezer. Rij A: 1st-9 e putjes bevatten ADCC Bioassay Buffer. Rij B: 3e-8eputjes bevatten het ADCC-reactiesysteem van BHT101 (doelcellen + antilichaam + effectorcellen). Het2e putje is zonder antilichaam. De 9eput bevat alleen ADCC Bioassay-buffer. Rij C: 3e-8eputjes bevatten het ADCC-reactiesysteem van SW-1736 (doelcel + antilichaam + effectorcellen). Het2e putje is zonder antilichaam. De 9eput bevat alleen ADCC Bioassay-buffer. Rij D: 1st-9 e putjes bevatten Assay Buffer. Afkortingen: ADCC = Antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit; AB = ADCC bioassaybuffer; VEGFR = Vasculaire epitheliale groeifactorreceptor; EGFR = epidermale groeifactorreceptor; mAb = monoklonaal antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Detectie van EGFR- en VEGFR-expressie in BHT-101 en SW-1736 schildkliercarcinoom met behulp van western blotting. Expressie van EGFR, maar niet van VEGFR, werd gedetecteerd in beide cellijnen. B-actine werd gebruikt als belastingscontrole. Afkortingen: EGFR = epidermale groeifactorreceptor; VEGFR = vasculaire epidermale groeifactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vouwinductie van ADCC-activiteit. (A) Schildklierkankercellijn BHT-101 vertoont een ADCC-effect in aanwezigheid van het anti-EGFR-antilichaam Cetuximab. (B) De schildklierkankercellijn SW-1736 vertoont een ADCC-effect in aanwezigheid van het anti-EGFR-antilichaam Cetuximab. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier hebben we de ADCC Bioassay-methode gepresenteerd voor het beoordelen van de ADCC-reactie van een therapeutisch antilichaam. De methode is eenvoudig en maakt gebruik van een eenvoudig "add-mix-read"-formaat voor meting.

Alvorens het experiment uit te voeren, moet de expressie van het doelantigeen in de doelcellen worden bevestigd door flowcytometrie of westerse blotting. Flowcytometrie zal een beter hulpmiddel zijn om het oppervlakteantigeen te detecteren. Het gebruik van flowcytometrie kan de cellen echter onder druk zetten, apoptose veroorzaken en de levensvatbaarheid van de cel en dus de algehele analyse beïnvloeden. Bovendien kost het meer dan western blotting. In dit experiment gebruikten we western blotting als een snellere en meer kosteneffectieve methode, omdat gerichte antigenen bekende antigenen op het celoppervlak zijn.

Gemanipuleerde Jurkat-cellen, die de FcγRIIIa-receptor, de V158-variant (hoge affiniteit) en een NFAT-responselement dat de expressie van vuurvliegluciferase stimuleert, stabiel tot expressie brachten, werden gebruikt als effectorcellen. Activering van de NFAT-route resulteert in de productie van luciferase en de activiteit ervan wordt gekwantificeerd in de vorm van luminescentie-uitlezing. Het signaal vertegenwoordigt ook de activiteit van ADCC.

Eerst worden doelwitcellen (T) geïncubeerd met effectorcellen (E) in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden antilichamen in platen met 96 putjes gedurende 6 uur bij 37 °C in een bevochtigde CO2 -incubator. De effector:target ratio van 5:1 wordt gebruikt om het signaal te optimaliseren. Zo werden er 75.000 effectorcellen toegevoegd aan 15.000 doelcellen. Aan het einde van de incubatie wordt aan elk putje Bio-Glo luciferase-analysereagens toegevoegd, gedurende 30 minuten geïncubeerd, en wordt de luminescentie (RLU, relatieve luciferase-eenheden) gemeten met behulp van een luminescentieplaatlezer.

De belangrijkste kritieke stappen in dit protocol zijn: (1) De omgang met effectorcellen. De injectieflacon met cellen mag tijdens het ontdooiproces niet worden omgekeerd, voorzichtig worden geschud en moet onmiddellijk na het ontdooien worden gebruikt om ongewenste celdood te voorkomen of de uitvoering van biologische detectie te beïnvloeden. (2). Het is belangrijk om witte polystyreen 96-well microplaten met een heldere, platte bodem te gebruiken voor luminescentiemetingen, omdat de luminescentie wordt opgevangen vanaf de onderkant van de lezer.

In deze studie observeerden we de sterkere en zwakkere ADCC-reacties van het anti-EGFR-antilichaam, cetuximab, afhankelijk van de hoeveelheid doelwitcellen en de antilichaamconcentratie. Enkele redenen om de kalibratie van zwakke ADCC-reacties aan te pakken: (1) De metingen van de ADCC-reporterbioassay zijn afkomstig van effectorcellen (E), met een constant aantal van 75.000 cellen per putje in het ADCC-reactiesysteem van deze studie. Daarom is het optimaliseren van de kwaliteit van doelcellen (T) een aspect dat kan worden verbeterd. De E:T-verhouding in dit onderzoek was 5:1, die kon worden aangepast tot 20:1. (2) De concentratie van antilichamen is ook een van de belangrijke factoren die van invloed zijn op de ADCC-reactie. Aanpassingen kunnen worden gemaakt door seriële verdunning van antilichamen om het optimale concentratiebereik te verkennen, waardoor een maximale respons in het ADCC-rapport wordt bereikt. (3) De incubatietijd van antilichamen, doelwitcellen en effectorcellen is ook cruciaal voor experimentele resultaten. In deze studie hebben we gedurende 6 uur geïncubeerd, wat kan worden verlengd tot 24 uur om de optimale ADCC-reactie te bereiken. (4) Daarnaast moet ook de concentratie van de bufferoplossing (laag IgG) voor de ADCC-test worden onderzocht. De optimale serumconcentratie voor ADCC-respons kan worden bereikt binnen het bereik van 1% tot 10%.

Deze experimentele methode is snel en ongecompliceerd en maakt voltooiing binnen één dag mogelijk via een eenvoudig "add-mix-read"-protocol. De resultaten zijn stabiel en vatbaar voor batchtests. Deze bioassaykit detecteert echter geen celdood zoals conventionele ADCC-methoden die PBMC- of NK-cellen als effectorcellen gebruiken12,13. In plaats daarvan gebruikt het FcγRIIIa-receptor tot expressie gebrachte Jurkat-cellen als effectorcellen, wat meer zal kosten omdat de cellen genetisch gemodificeerd zijn. In vergelijking met traditionele ADCC-experimenten13,14, elimineert het de vereiste van bloeddonaties van gezonde personen en vermijdt het het complexe proces van het extraheren van immuuncellen, waardoor individuele variaties die van invloed kunnen zijn op de resultaten worden beperkt. De gedetecteerde luminescentiesignalen zijn afkomstig van de binding van effectorcellen aan doelcellen, niet van de daadwerkelijke dood van doelcellen. Daarom kunnen er verschillen zijn in vergelijking met standaard ADCC-detectiemethoden. Bovendien wordt celdissociatiebuffer, die duurder is dan trypsine, gebruikt om de adherente cellen los te maken om de integriteit van het membraan te behouden.

ADCC-reportergenanalyse vertoont een uitstekende nauwkeurigheid en stabiliteit en dient als een werkzaamheidsanalysemethode voor de massale detectie van therapeutische antilichaamgeneesmiddelen. Het kan ook fungeren als een kritische analysemethode voor de karakterisering van therapeutische moleculen en procesontwikkeling15.

Samenvattend is ADCC een belangrijk immuunmechanisme en is de kwantitatieve detectie van ADCC van groot belang op het gebied van immunotherapie. Deze experimentele methode biedt een effectief middel voor de kwantitatieve meting van ADCC15.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We zijn Prof. Zeng (IMCB, A*STAR) dankbaar voor het ondersteunen van dit werk. Deze studie werd ondersteund door de Youth Foundation van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82202231) en het Medical and Health Science and Technology Project van de provincie Zhejiang, China (2021KY110,2024KY824).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5% Trypsin-EDTAGibco15400-054Verdunn 10x in PBS om 0,05% Trypsin te maken
1x Tris Buffer Saline (TBS)1st BASEBUF-3030-1X1LVoor het wassen van membranen in western blotting
1.5 M Tris Buffer, pH 8.81st BASEBUF-1419-1L-pH8.8Voor SDS-gel bereiding
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522-100MLVoor monsters voorbereiden voor western blotting
30% Acrylamide/Bis oplossingBio-Rad#1610158Voor SDS-gel bereiding
4x Laemmli BufferBio-Rad#1610747Voor monsters voorbereiden voor western blotting
96-well witte polystyreen microplaat met doorzichtige platte bodemCorning Incorporated3610Voor ADCC-test
ADCC Bioassay Effector cellen (0,65 mL)PromegaG7011Inbegrepen in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
ADCC reporter bioassay core kitPromegaG7010Aangeduid als ADCC bioassay kit voor ADCC-test in dit experiment
Ammonium PersulfateSigma AldrichA3678-25GVoor SDS-gel bereiding
Bevacizumab (Humanized Anti VEGF-antilichaam)MVASI-Gebruik als negatief controle-antilichaam in ADCC-test
BHT-101Leibniz Institute DSMZACC279Menselijke anaplastische papillaire schildklierkanker cellijn
Bio-Glo Luciferase Assay BufferPromegaG7941Inbegrepen in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 10 mL
Bio-Glo Luciferase Assay Substraat (Lyofilisaat)PromegaG7941Inbegrepen in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 1 vial
CelschraperGenFollowerGD00235Om cellen uit cultuurkolf te verwijderen
Cetuximab (Chimere anti-EGFR antilichaam)ERBITUX-Gebruik als therapeutisch antilichaam in ADCC-test
Chemiluminescent HRP substraatMerck MilliporeWBKLS0500Voor proteïne detectie in western blotting
Gedestilleerde waterGibco15230-162Voor SDS-gel bereiding
Fetaal bovien serum (FBS)Gibco10270-106Aanvulling voor cultuurmedium
iBright CL1500 beeldvormingssysteemThermo Scientific2462621100038Voor proteïne detectie in western blotting
L-glutamine, 200 mMGibco25030-081Aanvulling voor cultuurmedium
Laag IgG SerumPromegaG7110Inbegrepen in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 4 mL
Megafuge 8RThermo Scientific42876589Centrifuge
Muis anti-EGFR monoklonale antilichamenBD Biosciences610016Primair antilichaam in western blotting
Muis anti-VEGFR monoklonale antilichamenBD Biosciences571194Primair antilichaam in western blotting
Niet-enzymatische celdissociatie bufferSigma AldrichC5789-100MLVoor celoogst uit T75 kolf
Penicilline-StreptomycinePAN BiotechP06-07100Antibacterieel voor cultuurmedium
Fosfaat Gebufferde Saline (PBS), pH 7,2, Sterieel gefilterd1st BASECUS-2048-1x1LGebruik als wasoplossing voor cellen
Pierce BCA assay kitThermo Scientific23225Om proteïneconcentratie te meten
Protease en fosfatase remmerThermo ScientificA32959Voor proteïne vertering in monsters voorbereiden voor western blotting
PVDF membraan (Immobilin-P)Merck MilliporeIPVH00010Voor proteïne overdracht in western blotting
Konijn anti-muis IgG, Fcγ HRP-geconjugeerd secundair antilichaamJackson ImmunoResearch315-035-046Secundair antilichaam in western blotting
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediumCapricorn ScientificRPMI-XACellen cultuurmedium
RPMI-1640PromegaG7080Inbegrepen in ADCC reporter bioassay core kit (Promega G7010), 1 x 36 mL
Mager melkpoederMerck Millipore70166-500GVoor membraan blokkering in western blotting
Natrium Dodecyl Sulfaat1st BASEBIO-2050-500gVoor SDS-gel bereiding
SW-1736Cytion300453Menselijke schildklier kwaadaardige plaveiselcel canker cellijn
T75 kweekkolvenSPL Lifesciences70075Celcultuurkolf
Tecan Multimode Reader model Spark 10MTecan1607000294voor luminescente kwantificering
TEMEDBio-Rad#1610801Voor SDS-gel bereiding
Tween-20PromegaH5151Voor membraan wassen in western blotting
Vi-cell XR celvitaliteitsanalyzerBeckman CoulterAL15072Celteller

Referenties

  1. Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
  2. Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
  3. Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
  4. Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
  5. Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
  6. Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
  7. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  8. Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
  9. Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
  10. Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
  11. Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
  12. Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
  13. Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
  14. Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
  15. Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).

Herprints en machtigingen

Tags

Antilichaamafhankelijke cytotoxiciteitADCC-bioassaykankerimmunotherapietherapeutische antilichameneffectorcellentarget-kankercellenluciferase-reporterassayEGFR-antigeenluminescentiemetingcelco-cultuur
Beoordeling van antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit in kankercellen met behulp van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit Reporter Bioassay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.