Method Article

Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV) zijn van cellen afgeleide, door lipiden dubbellaags omsloten, niet-repliceerbare nanodeeltjes. EV krijgen momenteel aandacht in cardiovasculair onderzoek vanwege hun rol bij het reguleren van intercellulaire communicatie, en kunnen mogelijk dienen als waardevolle biomarkers voor hart- en vaatziekten. Het EV-proteoom en het potentieel ervan als biomarker in cardiovasculaire diagnostiek blijven echter slecht begrepen. Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode voor de isolatie en kwantificering van plasma-afgeleide EV en de analyse van hun eiwitlading met behulp van plasmamonsters van patiënten die zich presenteren op de afdeling Pijn op de Borst van een groot universitair ziekenhuis. Na routinematige flebotomie worden EV geïsoleerd uit plasma door differentiële ultracentrifugatie. De verrijking van specifieke EV-markereiwitten in EV-isolaten wordt gevisualiseerd door immunoblotting, en de gemiddelde grootteverdeling en plasma-EV-concentraties worden gekwantificeerd door analyse van het volgen van nanodeeltjes. Ten slotte wordt ultra-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie gebruikt voor labelvrije analyse van het EV-proteoom. Dit protocol biedt dus een alomvattende benadering om van plasma afgeleide EV te bestuderen en te gebruiken als potentiële dragers van kritieke biologische informatie, en om hun potentieel als nieuwe biomarkers te verkennen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV), volgens de nomenclatuur niet uniform gedefinieerd, zijn nanodeeltjes omgeven door een lipidedubbellaag en vrijgegeven door verschillende celtypen, die niet in staat zijn omte repliceren 1. Deze diverse groep omvat exosomen, een subpopulatie van EV van endosomale oorsprong, meestal variërend van ongeveer 40 nm tot 160 nm in diameter2. EV's zijn detecteerbaar in tal van lichaamsvloeistoffen3 en vergemakkelijken intercellulaire communicatie door verschillende actieve biomoleculen zoals eiwitten, mRNA, microRNA en lipiden over te dragen. EV verschaffen dus informatie over hun cel van oorsprong via celspecifieke oppervlaktemarkers en biomoleculen, waarbij hun eigenschappen sterk worden beïnvloed door de toestand van de oudercel en zijn omgeving4. Deze kenmerken hebben geleid tot een groeiende belangstelling voor de mogelijke rol van EV als biomarkers, met name in de context van hart- en vaatziekten.

Talrijke in vitro en in vivo studies hebben aangetoond dat myocardiale hypoxische stress leidt tot een verhoogde afgifte van EV 5,6,7. Hedendaags onderzoek naar EV-vracht heeft zich grotendeels gericht op EV-gebonden microRNA, dat het potentieel heeft om als biomarker te dienen bij de diagnose van verschillende hart- en vaatziekten 8,9,10. Daarentegen blijft het bewijs voor het circulerende EV-proteoom relatief schaars, met nog minder studies die plasma-EV bij cardiovasculaire patiënten onderzoeken. In twee uitgebreide onderzoeken naar plasma-afgeleide EV van patiënten met een hartinfarct, identificeerden de auteurs een specifiek ischemie-geïnduceerd EV-proteoomprofiel met potentiële diagnostische relevantie 6,11.

De methodologische verwerking van EV is in het verleden een uitdaging gebleken en momenteel is er geen definitieve aanbeveling voor de optimale aanpak van EV-isolatie, karakterisering en kwantificering. Veelgebruikte methoden voor EV-isolatie zijn onder meer differentiële ultracentrifugatie, dichtheidsgradiëntcentrifugatie en filtratiemethoden zoals chromatografie met uitsluiting van grootte1. Volgens de huidige consensusrichtlijnen moet de karakterisering van EV-isolaten bewijs bevatten van ten minste drie typische EV-oppervlakte-eiwitmarkers, zoals tetraspaninen of annexines, gecombineerd met een beeldvormingsmodaliteit1. Om EV-lading op eiwitniveau te onderzoeken, worden op antilichamen gebaseerde methoden zoals Western blot of ELISA het meest gebruikt.

Gezien de methodologische uitdagingen die gepaard gaan met de isolatie en verwerking van circulerende EV, biedt dit protocol een uitgebreid traject van patiëntenwerving en monsterverzameling tot daaropvolgende EV-isolatie, karakterisering en kwantificering van plasma-EV-isolaten. Bovendien toont deze studie een workflow voor de onmiddellijke isolatie van plasma-afgeleide EV van patiënten die zich presenteren op de afdeling spoedeisende hulp (afdeling pijn op de borst) in een tertiair zorgcentrum in het zuidwesten van Duitsland, gevolgd door de labelvrije analyse van ziektespecifiek plasma EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Het doel is om een high-throughput analyse mogelijk te maken om differentieel verrijkte EV-gebonden eiwitten te identificeren in een groot cohort van patiënten met diverse ischemische, aangeboren of (auto-)immuun hart- en vaatziekten bij de initiële diagnose en tijdens ziekteprogressie en/of -resolutie. Deze proteomische screeningbenadering probeert patronen van EV-specifieke eiwitverrijking te identificeren die verband houden met verschillende ziekteroutes, met als uiteindelijk doel nieuwe EV-gebonden eiwitbiomarkers te ontdekken om de huidige diagnostiek en therapeutische monitoring bij hart- en vaatziekten te verbeteren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor dit protocol werd een voorbeeldig patiëntencohort gerekruteerd, bestaande uit drie gezonde controlepatiënten zonder tekenen van duidelijke of onderliggende hart- en vaatziekten en twee patiënten met een niet-ST verhoogd myocardinfarct (NSTEMI). Voorafgaande goedkeuring werd verleend door de Institutional Review Board van de Medische Faculteit van de Universiteit van Heidelberg (IRB-goedkeuring #S-351/2015), en schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten voorafgaand aan de rekrutering. Patiënten werden gerekruteerd uit de afdeling Pijn op de Borst van de afdeling Cardiologie van het Universitair Ziekenhuis Heidelberg op basis van de eerste klinische presentatie, medische geschiedenis en de resultaten van diagnostische tests.

Inclusiecriteria voor gezonde controlepatiënten waren onder meer atypische of niet-specifieke klinische presentatie, cardiale biomarkerniveaus binnen normale grenzen, geen voorgeschiedenis van hart- en vaatziekten en normale bevindingen bij verdere diagnostische tests. Uitsluitingscriteria waren onder meer een voorgeschiedenis van maligniteit of cytostatische therapie in de afgelopen vijf jaar, hemodialyse, familiale hyperlipidemiesyndromen en een voorgeschiedenis van hart- en vaatziekten. NSTEMI werd gediagnosticeerd volgens de huidige richtlijnen12, waarbij hemodynamisch relevante coronaire stenose werd bevestigd door coronaire angiografie. Voor elke patiënt werd via standaard aderlaten13 tot 36 ml bloed uit de antecubitale ader verzameld in met citraat aangevulde verzamelbuisjes, en bloedmonsters werden onmiddellijk bij 4 °C vervoerd voor verdere verwerking. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. EV-isolatie met behulp van differentiële centrifugatie

OPMERKING: Er werd een differentieel centrifugatieprotocol gebruikt om EV te isoleren uit menselijke plasmamonsters. Er werden twee ultracentrifugatiecycli (UC) met toenemende centrifugale kracht uitgevoerd om de zuiverheid van de resulterende EV-pellet te maximaliseren.

  1. Plasma isolatie
    1. Begin met het verwerken van volbloedmonsters, gekoeld tot 4 °C, binnen 120 minuten na afname om de integriteit van plasma-EV te garanderen. Gebruik bloedafnamebuisjes aangevuld met citraat (0,106 mol/L citraat) om stolling te voorkomen.
    2. Verdun 9 ml gecitreerd volbloed 1:1 in ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de viscositeit te verminderen. Voeg 5 ml dichtheidsgradiëntmedium (1,077 g/ml) toe voor scheiding tijdens het centrifugeren.
    3. Centrifugeer bij 600 × g gedurende 25-30 minuten bij 4 °C. Piket voorzichtig de plasmafractie vanaf de bovenkant van elke kolom af in gespecialiseerde centrifugatiebuisjes. Ga verder met de volgende stappen of vries in bij -80 °C.
  2. Verwijdering van celresten en apoptotische lichamen
    1. Centrifugeer het plasma bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C met behulp van een ultracentrifuge met een rotor met een vaste hoek, zonder te remmen. Op de bodem van de buis moet zich een zichtbare pellet van celresten en apoptotische lichamen vormen.
  3. EV-isolatie
    1. Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje. Ultracentrifugeren bij 100.000 × g gedurende 2 uur bij 4 °C, zonder te remmen, om EV te isoleren, die een zichtbare pellet op de buiswand zal vormen.
    2. Piket het bovenstaande voorzichtig af met een elektronische pipet, zodat er ongeveer 1 ml EV-verarmd plasma overblijft. Schakel over op een pipet van 1000 μl voor het resterende plasma en pipetteer langzaam om te voorkomen dat de EV-pellet wordt verstoord. Kantel de buis geleidelijk tijdens het pipetteren om ervoor te zorgen dat er geen plasma in de buis achterblijft.
  4. Voorbereiding op downstream-analyse
    1. Resuspendeer de geïsoleerde EV-pellet volgens de vereisten voor stroomafwaartse analyse: voor het volgen van nanodeeltjes, suspendeer de EV-pellet van 9 ml volbloed in 200 μl PBS; voor LC-MS/MS, resuspensie EV geïsoleerd uit 36 ml volbloed in 50 μl 1x RIPA-buffer met 1% protease/fosfataseremmer
    2. Breng de geresuspendeerde EV-pellet over in een buis van 1.5-2 ml. Bewaren bij -80 °C tot verdere analyse of ga verder indien nodig.

2. Analyse van het volgen van nanodeeltjes

OPMERKING: De kwantificering van de gemiddelde EV-grootteverdeling in menselijke plasmamonsters werd uitgevoerd met behulp van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), een op laser gebaseerde detectiemethode die de Brownse beweging van nanodeeltjes analyseert.

  1. Werkende verdunningen voor NTA
    1. Verdun de EV-stockoplossing (EV-pellet geresuspendeerd in 200 μL PBS) met ijskoude PBS in verhoudingen van 1:10, 1:50, 1:100 en 1:200. Maak verschillende werkverdunningen om de meest geschikte verdunning te bepalen voor het bereiken van een uiteindelijke telling van 10-100 nanodeeltjes per frame tijdens het volgen van nanodeeltjes.
  2. NTA uitvoeren
    1. Schakel het NTA-instrument in en start de toepasselijke software op de aangesloten computer. Plaats de kamer in de laserkist en klik op Start Camera om deze te activeren.
    2. Zuig 1 ml PBS op in een spuit. Steek de spuit in de voorste slang en spoel het slangsysteem grondig door, zodat er geen lucht in de kamer achterblijft. Houd de camera in de gaten om luchtbellen of vervuilende deeltjes te detecteren.
    3. Zuig de voorbereide EV-werkverdunning op in een spuit van 1 ml en injecteer deze in de kamer.
    4. Pas de schermversterking aan de helderheid van de monitor aan op de tabbladen Vastleggen en Verwerken . Pas het cameraniveau aan om nanodeeltjes duidelijk op het scherm te onderscheiden.
    5. Stel een geschikte detectiedrempel in op het tabblad Proces om de gevoeligheid aan te passen voor het onderscheiden van deeltjes van achtergrondgeluid. Houd deze waarde constant voor alle metingen binnen hetzelfde experiment.
    6. Stel de camera scherp met behulp van het wiel aan weerszijden van het instrument totdat de nanodeeltjes scherp op het scherm verschijnen.
    7. Stel een constante temperatuur in (idealiter 22 °C) voor alle metingen in de hardware-instellingen , aangezien de Brownse beweging temperatuurafhankelijk is.
    8. Klik op de knop Uitvoeren om de meting te starten. Voer de voorbeeld-ID en het oplosmiddel in het pop-upvenster in.
    9. Neem minimaal drie video's van 30 seconden op voor elke samplerun. Beweeg het monster tussen de metingen door om een representatief monster van de nanodeeltjesoplossing te vangen. Als er een spuitpomp beschikbaar is, stel deze dan in op een constant toerental en neem continu op.
    10. Na de opname berekent de software automatisch de concentratie en grootteverdeling van nanodeeltjes. Klik op Wijzigen om de verdunningsfactor in te voeren die voor het monster wordt gebruikt en sla de resultaten vervolgens op door op Exporteren te klikken.
  3. Gegevensanalyse
    1. Analyseer de resultaten met behulp van de uitvoerbestanden in een statistisch softwareprogramma.

Labelvrije analyse van EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)

NOTITIE: Labelvrije EV-proteoomanalyse werd uitgevoerd met behulp van initiële eiwitscheiding door middel van gelelektroforese van EV-eiwitten na membraanlysis. Na in-gel eiwitvertering met trypsine werden peptiden geanalyseerd met behulp van LC-MS/MS, waarbij individuele spectra werden vergeleken met een database met menselijk proteoom. Met name als een ongerichte analyse van EV-lysaten gewenst is, wordt shotgun-proteomics aanbevolen zonder voorafgaande selectie van een specifiek molecuulgewichtbereik, waardoor stappen 3.1.1-3.1.7 van dit protocol overbodig worden.

  1. In-gel trypsine spijsvertering
    1. Bereid een oplossing van EV opnieuw gesuspendeerd in 1x RIPA buffer door Laemmli laadbuffer toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C.
    2. Laad de EV-monsters, aangevuld met laadbuffer, samen met een eiwitladder op 4%-12% Bis-Tris-gels voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)14. Kleur de gel gedurende 1-4 uur met Coomassie Blue om eiwitbanden te visualiseren. Ontkleur de gel met water door een nacht te incuberen.
    3. Snijd met Coomassie bevlekte banden weg uit gelgebieden die interessante eiwitten bevatten met behulp van een scalpelmes.
    4. Was de gelstukken met 60 μL 1:1 (v/v) 50 mM triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB) en acetonitril (ACN), pH 8,5, gedurende 10 min. Krimp de gelstukjes drie keer gedurende 10 minuten elk in 60 μL ACN. Opnieuw wassen met 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5.
    5. Verminder de eiwitten met 10 mM dithiothreitol (DTT) in 100 mM TEAB bij 57 °C gedurende 30 minuten en dehydrateer de gelstukjes.
    6. Alkyleer de eiwitten met 10 mM jodoacetamide (IAZ) in 100 mM TEAB bij 25 °C gedurende 20 minuten in het donker.
    7. Was de gelstukjes met 60 μL 100 mM TEAB en krimp ze twee keer gedurende 10 minuten elk in 60 μL ACN.
    8. Voeg 50 mM TEAB-trypsineoplossing, dienovereenkomstig geconcentreerd, toe aan de droge gelstukjes. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C. Blus de reactie door 20 μL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen.
    9. Extraheer de resulterende peptiden door gedurende 30 minuten te incuberen met 30 μL 1:1 (v/v) 0,1% TFA en ACN. Dehydrateer de gels met 20 μL ACN gedurende 20 minuten en was vervolgens opnieuw met 30 μL 100 mM TEAB gedurende 20 min.
    10. Krimp de gel twee keer met 20 μL ACN gedurende 20 minuten elk.
    11. Concentreer het bovenstaande dat bij elke extractiestap wordt verzameld in een vacuümcentrifuge en los het monster op in 15 μl 0,1% TFA.
  2. LC-MS/MS-analyse
    1. Voer nanoflow LC-MS/MS-analyse uit met behulp van een vloeistofchromatografiemassaspectrometer met hoge resolutie die is gekoppeld aan een elektrostatische ionenvalanalysator.
    2. Gebruik 0,1% mierenzuur (FA)/1% ACN als oplosmiddel A en 0,1% FA/89,9% ACN als oplosmiddel B.
    3. Scheid de peptiden in een lineaire gradiënt van 25 minuten: begin met 3% oplosmiddel B, verhoog B tot 23% gedurende 21 minuten, vervolgens tot 38% gedurende 4 minuten en ga verder met een wash-out bij 95% B.
    4. Gebruik de massaspectrometer in data-afhankelijke acquisitiemodus, waarbij automatisch wordt afgewisseld tussen MS en MS2. Verkrijg MS-spectra (m/z 400-1600) met een resolutie van 60.000 bij m/z 400, waarbij MS2-spectra worden gegenereerd voor maximaal 15 voorlopers met behulp van een genormaliseerde botsingsenergie van 27 en een isolatiebreedte van 1,4 m/z.
  3. Zoeken in eiwitdatabase
    1. Doorzoek de MS/MS-spectra tegen de Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, juni 2020) eiwitdatabase en een op maat gemaakte contaminantendatabase (onderdeel van MaxQuant, MPI Martinsried15,16) met behulp van Proteome Discoverer 2.5 met Sequest HT.
    2. Configureer de programma-instellingen als volgt: stel de tolerantie van de fragmentionenmassa in op 0,02 Da en de tolerantie van de bovenliggende ionenmassa op 5 ppm. Specificeer trypsine als het enzym dat wordt gebruikt voor de spijsvertering en stel carbamidomethyl in als een vaste modificatie voor cysteïne, met oxidatie (methionine) en deamidatie (asparagine, glutamine) als variabele modificaties. Inclusief acetylering, methionineverlies en hun combinatie als variabele modificaties van de eiwitterminus.
    3. Kwantificeer peptiden met behulp van de precursor-ionkwantificatormodus, met behulp van de Top N Average (n = 3) methode voor de berekening van de eiwitovervloed17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV werden geïsoleerd uit plasmamonsters (n = 3) van patiënten zonder openlijke hart- en vaatziekten, evenals van patiënten met een myocardinfarct zonder ST-elevatie (NSTEMI; n = 2), met behulp van het gevestigde differentiële ultracentrifugatieprotocol. Adequate scheiding van plasma EV werd bevestigd door immunoblotting van EV-verrijkte eiwitten TSG-101, annexine 5 (Anx5) en CD9 in EV-isolaten in vergelijking met EV-verarmd plasma van dezelfde patiënten (Figuur 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een real-world, stap-voor-stap, kant-en-klare methodologie voor de scheiding en karakterisering van plasma EV, evenals een inleiding tot een niet-gelabelde proteoomanalyse die geschikt is voor integratie in de routinematige klinische praktijk. Een gedetailleerde beschrijving en strikte naleving van een uniforme methodologie voor EV-isolatie uit plasmamonsters zijn belangrijk om de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten te garanderen. De huidige literatuur geef...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG ontving honoraria voor docenten van Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; hij ontving institutionele onderzoeksbeurzen van Roche Diagnostics en Daiichi Sankyo, en fungeert als consultant voor Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis en Boehringer Ingelheim, buiten het ingediende werk. JBK ontving projectgerelateerde financiering van het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK) en Roche Diagnostics. De overige auteurs verklaren geen belangenconflict met betrekking tot het ingezonden werk.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Heidi Deigentasch, Amelie Werner en Elisabeth Mertz voor hun organisatorische ondersteuning tijdens dit project.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli sample buffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26.3 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly for UltracentrifugationBeckman Coulter355654
5810R Benchtop centrifugeEppendorf5811000015
Acetonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Formic Acid 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Mass Spectrometer Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS running bufferThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4 bis 12 %, Bis-Tris protein gelsInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 floor-standing ultracentrifugeBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Protein markerThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Quick stain coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µm 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE commercial gelThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Speed vac concentratorSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, June 2020) protein databaseUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA) for HPLC >99%, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsin MS-GradeThermo Fisher90058
Type 50.2 Ti Fixed-Angle RotorBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367, 6478(2020).
  3. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).
  4. Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).
  5. Ontoria-Oviedo, I., et al. Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility. Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).
  6. Zara, M., et al. Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest. Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).
  7. Anselmo, A., et al. Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release. Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).
  8. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review. Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).
  9. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).
  10. Deddens, J. C., et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).
  11. Gidlof, O., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone. Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).
  12. Byrne, R. A., et al. ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).
  13. Garcia-Castrillo, L., et al. Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase. Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment. J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  16. Cox, J., Mann, M. Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Blein-Nicolas, M., Zivy, M. Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics. Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).
  18. Lacroix, R., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop. J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  19. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  20. Lacroix, R., et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol. J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).
  21. Coumans, F. aW., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  22. Clayton, A., et al. Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).
  23. Lucien, F., et al. Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).
  24. Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions. PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).
  26. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).
  27. Davidson, S. M., et al. Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles. Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).
  28. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  29. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  30. Palviainen, M., et al. Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery. PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).
  31. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  32. Gemoll, T., et al. Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation. J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).
  33. Kreimer, S., et al. Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics. J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Bateman, N. W., et al. Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda). Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).
  36. Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries. Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles