Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

Summary

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV) zijn van cellen afgeleide, door lipiden dubbellaags omsloten, niet-repliceerbare nanodeeltjes. EV krijgen momenteel aandacht in cardiovasculair onderzoek vanwege hun rol bij het reguleren van intercellulaire communicatie, en kunnen mogelijk dienen als waardevolle biomarkers voor hart- en vaatziekten. Het EV-proteoom en het potentieel ervan als biomarker in cardiovasculaire diagnostiek blijven echter slecht begrepen. Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode voor de isolatie en kwantificering van plasma-afgeleide EV en de analyse van hun eiwitlading met behulp van plasmamonsters van patiënten die zich presenteren op de afdeling Pijn op de Borst van een groot universitair ziekenhuis. Na routinematige flebotomie worden EV geïsoleerd uit plasma door differentiële ultracentrifugatie. De verrijking van specifieke EV-markereiwitten in EV-isolaten wordt gevisualiseerd door immunoblotting, en de gemiddelde grootteverdeling en plasma-EV-concentraties worden gekwantificeerd door analyse van het volgen van nanodeeltjes. Ten slotte wordt ultra-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie gebruikt voor labelvrije analyse van het EV-proteoom. Dit protocol biedt dus een alomvattende benadering om van plasma afgeleide EV te bestuderen en te gebruiken als potentiële dragers van kritieke biologische informatie, en om hun potentieel als nieuwe biomarkers te verkennen.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV), volgens de nomenclatuur niet uniform gedefinieerd, zijn nanodeeltjes omgeven door een lipidedubbellaag en vrijgegeven door verschillende celtypen, die niet in staat zijn om^te repliceren 1. Deze diverse groep omvat exosomen, een subpopulatie van EV van endosomale oorsprong, meestal variërend van ongeveer 40 nm tot 160 nm in diameter². EV's zijn detecteerbaar in tal van lichaamsvloeistoffen³ en vergemakkelijken intercellulaire communicatie door verschillende actieve biomoleculen zoals eiwitten, mRNA, microRNA en lipiden over te dragen.....

Protocol

Voor dit protocol werd een voorbeeldig patiëntencohort gerekruteerd, bestaande uit drie gezonde controlepatiënten zonder tekenen van duidelijke of onderliggende hart- en vaatziekten en twee patiënten met een niet-ST verhoogd myocardinfarct (NSTEMI). Voorafgaande goedkeuring werd verleend door de Institutional Review Board van de Medische Faculteit van de Universiteit van Heidelberg (IRB-goedkeuring #S-351/2015), en schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten voorafgaand aan de rekrutering. Patiënten werden gerekruteerd uit de afdeling Pijn op de Borst van de afdeling Cardiologie van het Universitair Ziekenhuis Heidelbe....

Results

EV werden geïsoleerd uit plasmamonsters (n = 3) van patiënten zonder openlijke hart- en vaatziekten, evenals van patiënten met een myocardinfarct zonder ST-elevatie (NSTEMI; n = 2), met behulp van het gevestigde differentiële ultracentrifugatieprotocol. Adequate scheiding van plasma EV werd bevestigd door immunoblotting van EV-verrijkte eiwitten TSG-101, annexine 5 (Anx5) en CD9 in EV-isolaten in vergelijking met EV-verarmd plasma van dezelfde patiënten (Figuur 1A

Discussion

Dit protocol biedt een real-world, stap-voor-stap, kant-en-klare methodologie voor de scheiding en karakterisering van plasma EV, evenals een inleiding tot een niet-gelabelde proteoomanalyse die geschikt is voor integratie in de routinematige klinische praktijk. Een gedetailleerde beschrijving en strikte naleving van een uniforme methodologie voor EV-isolatie uit plasmamonsters zijn belangrijk om de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten te garanderen. De huidige literatuur geef.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample bufffer	Bio-rad	1610747
10x RIPA-Buffer	Abcam	ab156034
26.3 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly for Ultracentrifugation	Beckman Coulter	355654
5810R Benchtop centrifuge	Eppendorf	5811000015
Acetonitrile (ACN)	Biosolve	0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43816-10ML
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Formic Acid 99% ULC/MS 100	Biosolve	0006914143BS
Histopaque - 1077	Sigma-Aldrich	10771
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I6125-5G
Mass Spectrometer Orbitrap Q Exactive HF	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS running buffer	Thermo Fisher	B0001
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Nanosight NTA 3.2 Software	Malvern Panalytical
NuPAGE 4 bis 12 %, Bis-Tris protein gels	Invitrogen	NP0323
Optima XPN-80 floor-standing ultracentrifuge	Beckman Coulter	521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26619
Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Cell Signaling Technology	5872S
Protein marker	Thermo Fisher	26616
Proteome Discoverer 2.5	Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Quick stain coomasssie	Serva	35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µm 1 g	Dr. Maisch	r119.aq.0001
SDS-PAGE commercial gel	Thermo Fisher	NW00100BOX
S-Monovette Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%	Sarstedt	02.1067.001
Speed vac concentrator	Savant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, June 2020) protein database	UniProt	https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma-Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) for HPLC >99%, 100 mL	Sigma-Aldrich	302031-100ML
Trypsin MS-Grade	Thermo Fisher	90058
Type 50.2 Ti Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Water	Biosolve	0023214102BS