Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67110

⸱

23 augustus 2024

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is ontworpen om de omvang van DNA-schade te onderzoeken die optreedt tijdens DNA-replicatie. Onder neutrale omstandigheden kan de inductie van DNA-breuken gemakkelijk binnen een kort tijdsbestek worden beoordeeld. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan andere celtypen en verschillende replicatiestressreagentia.

Samenvatting

DNA-replicatie wordt voortdurend uitgedaagd door een breed scala aan endogene en exogene stressoren die DNA kunnen beschadigen. Dergelijke laesies die tijdens genoomduplicatie worden aangetroffen, kunnen replisomen vertragen en replicatievorken omzetten in dubbelstrengsbreuken. Als ze niet worden gerepareerd, kunnen deze giftige DNA-breuken chromosomale herschikkingen veroorzaken, wat leidt tot verhoogde genoominstabiliteit en een verhoogde kans op cellulaire transformatie. Bovendien vertonen kankercellen aanhoudende replicatiestress, waardoor het aanpakken van replicatievorkkwetsbaarheden in tumorcellen een aantrekkelijke strategie voor chemotherapie is. Een zeer veelzijdige en krachtige techniek om DNA-breuken tijdens replicatie te bestuderen, is de komeettest. Deze gelelektroforesetechniek detecteert op betrouwbare wijze de inductie en reparatie van DNA-breuken op het niveau van één cel. Hierin wordt een protocol geschetst waarmee onderzoekers de omvang van DNA-schade kunnen meten in mitotisch delende menselijke cellen met behulp van vorkaftrekmiddelen over meerdere celtypen. Door dit te koppelen aan geautomatiseerde komeetscores wordt een snelle analyse mogelijk en wordt de betrouwbaarheid bij het bestuderen van inductie van DNA-breuken verbeterd.

Inleiding

De komeettest is een gelelektroforesemethode die wordt gebruikt om DNA-breuken op celniveau te detecteren. Het is gebaseerd op het principe dat DNA-breuken met een open einde migreren onder elektroforetische omstandigheden, terwijl intact DNA grotendeels statisch blijft. Gebroken DNA migreert omdat breuken resulteren in de ontspanning van supercoiled DNA, waardoor het geleidelijk ruimtelijk verplaatst naar de anode in de elektroforetische kamer, wat resulteert in een komeetachtig uiterlijk dat wordt waargenomen door immunofluorescentie 1,2. De omvang van DNA-schade wordt vervolgens gemeten door de hoeveelheid gebroken DNA te kwantificeren die is gemigreerd ten opzichte van het compacte DNA.

De twee meest gebruikte komeettestmethoden zijn de alkalische komeet (AC) test en de neutrale komeet (NC) test. De AC-test wordt uitgevoerd onder denaturerende omstandigheden met behulp van een oplossing met een hoge alkalische pH, terwijl de NC-test wordt uitgevoerd in een oplossing met een neutrale pH. Zowel NC- als AC-assays kunnen op betrouwbare wijze DNA-breuken detecteren die in de kern optreden. De alkalische versie is echter ook voordelig voor het detecteren van alkali-labiele plaatsen3. Beide formaten van de test vereisen het gebruik van lysisvoorwaarden om ervoor te zorgen dat DNA vrij is van eiwitten voorafgaand aan elektroforese.

Deze test is een eenvoudige methode voor het detecteren van DNA-breuken en biedt verschillende unieke voordelen voor het bepalen van cellulaire DNA-schade. De methode is relatief eenvoudig in te stellen en vereist reagentia die in het laboratorium kunnen worden bereid of bij commerciële leveranciers kunnen worden gekocht. Omdat het een techniek is met een resolutie van één cel, vereist de test zeer weinig uitgangsmateriaal. Met name de NC-test kan breuken met hoge gevoeligheid meten, naar verluidt tussen de 50 en 10.000 breuken per celdetecteren 4. De veelzijdigheid van deze techniek wordt aangetoond door het brede scala aan toepassingen, waaronder ecotoxicologie5, menselijke biomonitoring6 en genotoxiciteitsstudies7. De test kan ook op betrouwbare wijze worden gebruikt in verschillende celtypen en worden aangepast voor high-throughput-assays8 en voor het beoordelen van breuken in specifieke genomische regio's9. Deze test dient dus als een snelle en betrouwbare techniek voor het onderzoeken van breukvorming op het niveau van één cel.

Het proces van DNA-replicatie wordt voortdurend uitgedaagd door verschillende endogene en exogene stressoren10,11. Het vastlopen van replisomen als gevolg van dergelijke laesies kan DNA-breuken veroorzaken en resulteren in verhoogde genoominstabiliteit. DNA-breuken ontstaan ook vaak als replicatietussenproducten om DNA-herstel te vergemakkelijken12. Bovendien induceren verschillende chemotherapeutische middelen replicatieafhankelijke dubbelstrengsbreuken (DSB's), zoals camptothecine (CPT)13,14,15 en PARP-remmers 16,17. Deze test dient dus als een krachtige methodologie om de aard van DNA-laesies te bestuderen, de verwerking van replicatievorken te beoordelen en het therapeutisch potentieel van DNA-beschadigende middelen te onderzoeken. Aanpassingen van de test waarbij nieuw gesynthetiseerd DNA met BrdU wordt gelabeld, zijn nuttig geweest voor het bestuderen van replicatie-geassocieerde stressfenotypes 18,19,20,21. Met name de NC-test is een betrouwbare methode voor het bestuderen van DNA-breukinductie in de context van replicatie, zoals aangetoond in onderzoeken met de karakterisering van vorkeiwitten22,23, analyse van replicatietussenproducten24,25 en onderzoek naar transcriptie-replicatieconflicten bij genoomonderhoud26,27. Hierin schetsen we een NC-testprotocol met als doel DNA-breuken tijdens replicatie in menselijke cellen te kwantificeren. Dit protocol kan gemakkelijk worden geïmplementeerd door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van replicatiestressgerelateerde schade in een breed scala aan delende menselijke cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol (Figuur 1) maakt voornamelijk gebruik van aanhangende U2OS-kankercellijnen, maar kan worden aangepast aan een breed scala aan aanhangende en suspensiecellen die in weefselkweek worden gekweekt. De oplossingen en buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Plaats voorafgaand aan de dag van het experiment de meegeleverde fles met agarose met een laag smeltend gehalte (1% agarose met een laag smeltend alcoholgehalte in PBS) 5-10 minuten in een warmwaterbad om er zeker van te zijn dat de agarose volledig is gesmolten.
    NOTITIE: Verwarm de fles niet in de magnetron.
  2. Eenmaal gesmolten, voer dan snel 100 μl van de agarose uit tot 1,5 ml centrifugebuisjes naar behoefte en bewaar de buisjes bij 4 °C. De gestolde agarose kan maximaal 1 jaar bij 4 °C worden bewaard.
  3. Verwijder op de dag van het experiment het benodigde aantal centrifugebuisjes uit de opslag van 4 °C. Smelt de agarose door de buisjes in een warmteblok of waterbad van 42 °C te plaatsen.
    OPMERKING: Plaats de buisjes op 42 °C voordat de cellen worden geoogst om ervoor te zorgen dat de agarose volledig is gesmolten voor resuspensie (stap 3.7).
  4. Bereid op de dag van het experiment verse lysisbuffer en TAE-buffer en bewaar ze bij respectievelijk kamertemperatuur en 4 °C tot gebruik. Voeg daarnaast 1x PBS toe in een conische buis van 15 ml en plaats deze in de koelkast om te gebruiken in de resuspensiestap (stap 3.5).
  5. Markeer de monsteridentificaties op het matte uiteinde van de komeetglaasjes met 2 putjes en bewaar ze bij kamertemperatuur tot ze klaar zijn voor gebruik.

2. Bereiding van de monsters

  1. Zaai de cellen voorafgaand aan de dag van het experiment in een schaal met 6 putjes en kweek ze een nacht bij 37 °C met 5% CO2 . Voor U2OS-cellen werden voor elk monster ongeveer 2-3 x 105 cellen gezaaid.
    OPMERKING: Celnummers moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het celtype dat voor analyses wordt gebruikt.
  2. Behandel op de dag van het experiment cellen met de omstandigheden volgens het experimentele ontwerp. Als positieve controle om replicatie-afhankelijke breukinductie aan te tonen, behandelt u cellen met 1 μM CPT gedurende 1 uur. CPT is een topoisomerase-1-remmer die dubbelstrengsbreuken induceert op een replicatie-afhankelijke manier14.

3. Celresuspensie en lysis

  1. Zuig celkweekmedia op en spoel twee keer met 1x PBS.
  2. Voeg 300 μL trypsine toe aan elk putje. Incubeer de schaal in een weefselkweekincubator gedurende 2-3 minuten.
    OPMERKING: Langdurige incubatie in trypsine kan valse resultaten opleveren tijdens komeetanalyses.
  3. Voeg 700 μL celkweekmedia toe aan elk putje. Resuspendeer voorzichtig en breng de monsters over in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om in deze stap cellen te tellen om in stap 3.6 de juiste celdichtheid te verkrijgen om de frequentie van overlappende staarten tijdens de analyse te verminderen.
  4. Centrifugeer de celsuspensie bij 2400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Zuig de media op en resuspendeer de cellen in 1 ml koude 1x PBS.
  6. Herhaal stap 3.4 en stap 3.5 twee keer en resuspendeer de cellen in koude 1x PBS met een celdichtheid van 2 x 105 cellen per ml.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de levensvatbaarheid van cellen in deze stap te beoordelen om er zeker van te zijn dat er voldoende levensvatbare cellen aanwezig zijn. Een levensvatbaarheid van ten minste 90% wordt aanbevolen.
  7. Resuspendeer 10 μL van de celsuspensie in 100 μL aliquot gesmolten agarose, meng met dezelfde pipetpunt voorzichtig en verdeel het mengsel gelijkmatig over een kuiltje van het objectglaasje. Herhaal deze stap indien nodig voor alle monsters.
    OPMERKING: Verwijder niet alle aliquots in één keer uit het waterbad van 42 °C om te voorkomen dat de agarose stolt. Deze stap moet bij voorkeur worden uitgevoerd door het waterbad en elk monster wordt geresuspendeerd en op een gespreide manier verspreid. Vermijd het introduceren van luchtbellen tijdens het verspreiden van de agarose op de glijbaan, aangezien de luchtbellen de migratie van de komeetstaarten tijdens elektroforese beïnvloeden (stap 4.5) en scheuren veroorzaken in de droogstap (stap 5.3)
  8. Bewaar de objectglaasjes 15-20 minuten in het donker bij 4 °C om er zeker van te zijn dat de agarose volledig is gestold (Figuur 2A).
  9. Plaats de objectglaasjes in Coplin-potjes en dompel de glaasjes 1 uur onder in lysisbuffer bij kamertemperatuur.
  10. Spoel de objectglaasjes één keer af met koude TAE-buffer en dompel de glaasjes 30 minuten onder in koude TAE-buffer bij 4 °C.

4. Elektroforese

  1. Plaats de elektroforetische kamer op een vlakke ondergrond en zet het systeem waterpas met behulp van de vier nivelleringsknoppen aan de randen van het apparaat. Plaats koude kompressen in de onderste kamer om de oplossing koud te houden tijdens elektroforese.
  2. Giet ongeveer ~850 ml koude 1x TAE-buffer in het apparaat.
  3. Verwijder de objectglaasjes van 4 °C en plaats ze op de elektroforesebak in de juiste richting om de migratie van gebroken DNA mogelijk te maken.
    OPMERKING: De lade biedt plaats aan tien objectglaasjes met 2 putjes. Plaats de objectglaasjes in het midden van de lade als u met minder monsters werkt. Als u met een oneven aantal dia's werkt, voeg dan een lege dia toe, zodat elke put plaats biedt aan 2 dia's.
  4. Plaats de meegeleverde overlay van de dialade voorzichtig op de lade om de dia's te bedekken.
    NOTITIE: Voor een goede werking van het apparaat mag het volume van de TAE-buffer niet lager zijn dan het onderoppervlak van de overlay en niet groter zijn dan het bovenoppervlak van de overlay.
  5. Stel na het aansluiten van de kabels het vermogen in op 21 V en voer elektroforese (1 V/cm) uit gedurende 40 minuten.
    OPMERKING: De elektroforesetijd moet mogelijk worden aangepast, afhankelijk van het celtype dat voor analyses wordt gebruikt. Lange staarten in onbehandelde monsters duiden op een te lange looptijd. Omgekeerd kunnen korte staarten in positieve controlemonsters duiden op onvoldoende runtime.

5. Vlekken

  1. Verwijder na voltooiing van de elektroforese de objectglaasjes uit het apparaat en dompel ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder in een DNA-precipitatieoplossing.
  2. Gooi de DNA-precipitatieoplossing weg en dompel de objectglaasjes 30 minuten onder in een 70% ethanoloplossing bij kamertemperatuur.
  3. Gooi de 70% ethanoloplossing weg. Verwijder de glaasjes en droog ze 30 minuten in het donker in een hybridisatieoven op 45 °C (figuur 2B).
    NOTITIE: Objectglaasjes kunnen een nacht op een donkere, droge plaats worden bewaard voor de droogstap.
  4. Incubeer de putjes met 100 μL 1x SYBR Green oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  5. Decanteer de SYBR Green-oplossing door de glaasjes te kantelen en verwijder het overtollige door de rand van het putje voorzichtig te deppen met een pluisvrij doekje.
  6. Leg de glaasjes in een lade en laat ze 30 minuten drogen.
  7. Ga verder met het maken van de dia's.

6. Beeldvorming en analyses

  1. Stel de microscoop in voor beeldvormingsdoeleinden.
    OPMERKING: Alle beelden zijn verkregen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. 10x vergroting met 0,45 numerieke apertuur werd gebruikt met een belichtingstijd van 1/40s en een versterking van +6dB. De opnamemodus van monochroom 8bit werd gebruikt met 2 x 2 binning en zwartbalanscorrectie.
  2. Plaats de objectglaasjes op de microscooptafel en begin met beeldvorming met behulp van het FITC-filter.
    NOTITIE: Gebruik eerst het onbehandelde monster om de belichtingstijd te testen. De meeste cellen vertonen geen komeetstaarten, omdat DNA compacter is. Schakel over naar de put met met sonde behandelde cellen en maak beeld met dezelfde belichtingstijd. Komeetstaarten met verhoogde lengtes zullen in dit monster worden waargenomen vanwege de migratie van gebroken DNA-uiteinden.
  3. Verkrijg beelden van ten minste 100 kometen per monster met dezelfde belichtingstijd voor drie technische replicaten.
    OPMERKING: Komeetstaarten aan het einde van dekglaasjes hebben de neiging om ongelijk te migreren en fungeren als uitschieters in de monsterverdeling. De meeste kometen die voor analyses zijn vastgelegd, bevinden zich dicht bij het midden van het dekglaasje (figuur 3).
  4. Exporteer afbeeldingen en scoor de kometen handmatig (met behulp van afbeelding J) of met behulp van gratis beschikbare komeetscoresoftware. Kometen die individueel te onderscheiden zijn en volledig in het gezichtsveld liggen, worden geselecteerd voor de score. Overlappende of gedeeltelijk zichtbare kometen worden niet in aanmerking genomen voor verdere analyses (Figuur 4).
    OPMERKING: Gebruikers kunnen kometen scoren op Image J met behulp van de volgende plug-in: https://cometbio.org/index.html. Details voor het scoren van kometen met behulp van CometScore-software zijn opgenomen in figuur 5.
  5. Plot staartmomenten verkregen uit de analyses als doos- en snorhaarplots die 10-90 percentielwaarden weergeven. Voer normaliteitstests uit om te bepalen of parametrische of niet-parametrische tests moeten worden gebruikt voor statistische analyses.
    OPMERKING: In de meeste gevallen worden niet-parametrische tests toegepast met behulp van de Mann-Whitney-test als alleen twee monsters worden vergeleken of de Kruskal-Wallis-test met de meervoudige vergelijkingen van Dunn als ze drie of meer monsters vergelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Analyse van breukinductie door replicatiestressreagentia
U2OS-cellen werden behandeld met DMSO, 4 mM-hydroxyureum (HU) of 100 nM CPT gedurende 4 uur en geanalyseerd op breukaccumulatie door de NC-test (Figuur 6A). Terwijl CPT pauzes induceert tijdens de S-fase door topoisomerase-113 te blokkeren, blokkeert HU-geïnduceerde uitputting van nucleotidepools replicatievorken die geleidelijk worden omgezet in DSB's28. De gegevens g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol schetst een NC-test voor het beoordelen van DNA-breuken in menselijke cellen die actieve replicatie ondergaan. Het protocol is relatief eenvoudig uit te voeren en onderzoekers kunnen het gemakkelijk aanpassen aan hoge pH-omstandigheden voor alkalische analyses8. Het omvat twee kritieke stappen, zoals beschreven in de stappen 3.7 en 4.5. In stap 3.7 is het essentieel om de gesmolten agarose met cellen gelijkmatig over de put te verspreiden om te voorkomen dat kometen elkaar overlappen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

We danken de leden van het Dungrawala-lab voor hun input en feedback. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidie R35GM137800 aan HD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R&D systems4250-050-02
CometAssay Electrophoresis System IIR&D systems4250-050-ESInclusief elektroforesetank, veiligheidsdeksel, kabels, 2/20 welplaten en platenoverlay
CometScore softwareTriTekopen-sourced
CometSlideR&D systems4250-050-03
DMEM, hoge glucoseGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
EpifluorescentiemicroscoopKeyenceBZ-X810
Fetaal Runderserum - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), fenol roodGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T cellenATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 cellenATCCCRL-4000
HydroxyureumMillipore SigmaH8627
PARP-remmer OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Sterile weefselkweekschaal met oppervlaktebehandelingFisherSciFB012927
SYBR Green I Nucleïnezuur Gel Stain (10.000x)FisherSciS7567
U2OS cellenATCCHTB-96
UVP HB-1000 Hybridisatie-incubatorFisherSciUVP95003001

Referenties

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180(2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391(2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860(2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Replicatiestressgenoominstabiliteitdetectie van DNA-schadereplicatievorkenchromatineremodellersenkelstrengse DNA-gapsmenselijke celdelinggelelektroforese
Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.