Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Samenvatting

Chemische communicatie is van vitaal belang voor de gezondheid, de voortplanting en het algehele welzijn van het organisme. Het begrijpen van de moleculaire routes, neurale processen en berekeningen die deze signalen beheersen, blijft een actief onderzoeksgebied. De nematode Caenorhabditis elegans biedt een krachtig model voor het bestuderen van deze processen, omdat het een vluchtig seksferomoon produceert. Dit feromoon wordt gesynthetiseerd door maagdelijke vrouwtjes of sperma-verarmde hermafrodieten en dient als lokstof voor mannetjes.

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor het isoleren van het vluchtige seksferomoon uit verschillende C. elegans-stammen (WT-stam N2, daf-22 en fog-2) en C. remanei. We bieden ook een protocol voor het kwantificeren van de mannelijke chemotaxisrespons op het vluchtige seksferomoon. Onze analyse maakt gebruik van metingen zoals de chemotaxis-index (CI), aankomsttijd (AT) en een trajectplot om mannelijke reacties onder verschillende omstandigheden nauwkeurig te vergelijken. Deze methode maakt robuuste vergelijkingen mogelijk tussen mannen met verschillende genetische achtergronden of ontwikkelingsstadia. Bovendien is de hier geschetste experimentele opstelling aanpasbaar aan het onderzoeken van andere chemo-aantrekkingschemicaliën.

Inleiding

De wisselwerking tussen chemische communicatie en reproductief succes is een fundamenteel principe in het dierenrijk 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Seksferomonen veroorzaken een breed scala aan seksueel dimorf gedrag dat essentieel is voor het vinden van partners, het coördineren van de stappen die betrokken zijn bij het vinden en aantrekken van een partner, en uiteindelijk het bevorderen van de voortplanting van een soort 11,12,13,14,15,16,17. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van feromoonsignalering, maar de moleculaire mechanismen, neurale circuits en computationele processen die deze interacties beheersen, blijven vaak onvolledig gedefinieerd 18,19,20,21,22,23,24,25,26.

De nematode Caenorhabditis elegans biedt een krachtig model om deze vragen te ontleden. Met name C. elegans vertoont een ongebruikelijke voortplantingsstrategie - hermafrodieten kunnen zichzelf bevruchten, maar ook uitkruisen met mannetjes 27,28,29,30,31,32,33. Deze flexibiliteit vereist een robuust communicatiesysteem om de voortplantingsstatus te signaleren. C. elegans staat bekend om zijn goed gekarakteriseerde wateroplosbare feromonen, de ascarosiden, die verschillende rollen spelen bij ontwikkeling, gedrag en sociale interacties. Recente ontdekkingen hebben een aparte klasse van vluchtige seksferomonen onthuld die door nematoden worden gebruikt. Deze feromonen worden specifiek geproduceerd door geslachtsrijpe C. elegans en C. remanei maagdelijke vrouwtjes en sperma-verarmde hermafrodieten, en dienen als lokstof voor volwassen mannen 29,34,35. Deze lokstof vertoont een opmerkelijk seksueel dimorfisme in zijn productie en perceptie. De vrouwelijke somatische geslachtsklier regelt de synthese van dit vluchtige seksferomoon, en de productie weerspiegelt dynamisch de voortplantingsstatus, stopt bij het paren en wordt enkele uren later hervat^29,34.

Inzicht in de communicatie van nematodenseksferoomen geeft inzicht in de evolutie van chemische communicatiesystemen, de wisselwerking tussen voortplantingstoestand en gedrag, en de mechanismen die ten grondslag liggen aan seksueel dimorfe neurale verwerking 24,26,36,37,38,39. Studies impliceren dat het amfideneuron AWA bij mannen cruciaal is voor de detectie van feromoonen, waarbij de G-eiwitgekoppelde receptor SRD-1 een sleutelrol speelt bij de detectie van feromonen bij mannen²⁴. C. elegans is zeer geschikt voor het bestuderen van chemische communicatie bij dieren, met name seksferomoonsignalering, vanwege zijn afhankelijkheid van het olfactorische systeem voor het zoeken naar partners. Hoewel er veel bekend is over ascaroside-signalering, biedt het vluchtige seksferomoonsysteem unieke vergelijkingsmogelijkheden 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50^,
51,52,53,54,55,56,57. Bovendien is C. elegans een krachtig genetisch modelorganisme vanwege zijn volledig gesequencede genoom, duidelijk gedefinieerde cellulaire afstamming en goed gekarakteriseerde olfactorische mutanten.

Het volledige neurale circuit dat betrokken is bij de verwerking van dit feromoon, de berekeningen die de perceptie vertalen in gericht partnerzoekend gedrag en de biosyntheseregulatie moeten echter nog volledig worden opgehelderd. Verder onderzoek naar deze processen is cruciaal voor het begrijpen van de diverse mechanismen die de communicatie en het voortplantingsgedrag van dieren bepalen. De identificatie van sleutelgenen die betrokken zijn bij feromoonsynthese, secretie en perceptie belooft nieuwe moleculaire spelers in de communicatie met dieren te onthullen. De hier beschreven analyses bieden een basis om deze vragen te beantwoorden.

Protocol

1. Ruwe geslachtsferomoonextractie van vrouwen en hermafrodieten

1. Protocol voor synchronisatie van C. elegans
   1. Preparaat van volwassen vrouwtjes of hermafrodieten
      1. Controleer dagelijks de kweekplaten totdat er een grote populatie volwassen vrouwelijke/hermafrodieten bestaat en de voedselbron OP50 uitgeput raakt. Gebruik fog-2 C. elegans en WT C. remanei vrouwtjes voor ruwe seksferomoonextractie, bereid gesynchroniseerde eieren van de gepaarde vrouwtjes.
         OPMERKING: In dit protocol worden C. elegans fog-2 mutant XX-dieren, die geen zelfsperma produceren, aangeduid als C. elegans-vrouwtjes .
   2. Wormen wassen en pilleren
      1. Was volwassen wormen van een gemengde populatieplaat met M9-buffer. Verzamel de wormsuspensie in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Centrifugeer bij 1.500 × g gedurende 0,5-1 min om de wormen te pelleteren.
         OPMERKING: Voorreiniging bij zware vervuiling (optioneel): Laat de wormen zich in de buis nestelen als deze sterk vervuild is. Pipeteer het supernatans eruit om bacteriën te verwijderen en herhaal dit totdat het supernatans helder wordt.
   3. Bleken
      1. Voeg 200 μL M9-buffer toe aan de wormenkorrel. Bereid lysisbuffer voor door huishoudbleekmiddel en 1 M NaOH te mengen in een verhouding van 1:1. Voeg 500 μL van deze lysisbuffer toe aan het mengsel, draai gedurende 10 s en pauzeer dan om de lysistoestand onder een ontleedmicroscoop te controleren. Herhaal dit proces van 10 s vortexen gevolgd door observatie totdat de volwassen wormen volledig zijn gelyseerd.
   4. Stoppen met bleken en pilleren van de embryo's
      1. Wanneer volwassen wormen in kleine fragmenten worden gelyseerd (maar niet volledig zijn opgelost), voeg dan onmiddellijk 500 μL M9-buffer toe om de reactie te vertragen. Centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 30-60 s om de embryo's te pelleteren.
         OPMERKING: Overmatige lysis kan de embryo's beschadigen. Stop de reactie wanneer de volwassen wormlichamen in kleine fragmenten zijn afgebroken. De lysis gaat door tijdens de centrifuge- en wasstappen totdat alle lysisbuffer is verwijderd.
   5. Was de embryo's 5x met 1 ml M9-buffer en centrifugeer bij 15.000 × g gedurende 30-60 s na elke wasbeurt. Verwijder het supernatans na het centrifugeren.
   6. Synchronisatie
      1. Resuspendeer de embryo's in 800 μL M9-buffer in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Draai de buis gedurende 12-15 uur bij 20 °C voor het uitkomen van L1 en het stoppen van wormen in het L1-stadium omdat er geen voedselvoorziening is. Laat de wormen 3 dagen los en kweek ze bij 20° C totdat ze het L4-stadium bereiken.

2. Ruwe seksferomoonextractie van maagdelijke vrouwtjes van één dag oud (figuur 1A)

OPMERKING: We nemen een eerder vastgesteld protocol²⁴ aan om seksferomonen te extraheren uit eendags oude virgin fog-2 (feminisatie van de kiembaan) mutante vrouwtjes van C. elegans en WT-vrouwtjes van C. remanei.

1. Voorbereiding van volwassen vrouwtjes
   1. Selecteer en isoleer ongeveer 200 L4 stadium fog-2 vrouwtjes 1 dag voor de feromoonextractie. Om ervoor te zorgen dat alleen maagdelijke vrouwtjes worden verzameld, scheidt u deze L4 fog-2 vrouwtjes zorgvuldig op geslacht en verdeelt u ze over drie afzonderlijke OP50 NGM-platen van 6 cm. Plaats een kleine hoeveelheid OP50-bacteriën in het midden van elk bord.
      OPMERKING: Verdeel 200 vrouwelijke wormen van L4 over drie afzonderlijke platen om het risico te voorkomen dat er per ongeluk een mannelijke worm op de plaat komt. Als een mannetje wordt geplukt, zal het waarschijnlijk met veel vrouwtjes paren, waardoor de meeste vrouwtjes de volgende dag, wanneer ze volwassen worden, worden bevrucht. Bevruchte vrouwtjes zenden geen vluchtige seksferomonen uit totdat het sperma is uitgeput, wat de extractieresultaten beïnvloedt. De beperkte voedselbron beperkt de hermafrodieten tot een kleiner gebied in het midden van het bord, waardoor de kans op ontsnapping van het bord tijdens de isolatieperiode wordt geminimaliseerd.
2. Extractie proces
   1. Op de extractiedag (dag 1 van de reproductieve volwassenheid, 3 dagen nadat de wormen zijn vrijgelaten uit L1-arrestatie), pluk en isoleer 100 maagdelijke, 1 dag oude fog-2-vrouwtjes in een microcentrifugebuis met 1 ml M9-buffer. Was de vrouwtjes 5x met M9-buffer om bacteriële besmetting te minimaliseren en incubeer ze gedurende 6 uur bij 20 °C in 100 μL M9-buffer om feromoonproductie en accumulatie in de media mogelijk te maken.
   2. Voer een soortgelijk extractieproces uit voor vrouwtjes van C. remanei , waarbij alleen vrouwtjes van 15-20 L4 worden geïsoleerd die de dag voor de extractie op drie platen zijn geïsoleerd, en de volgende dag vijf maagdelijke vrouwtjes uitbroeden in 100 μl M9-buffer gedurende 6 uur bij 25 °C (optimale groeitemperatuur voor C. remanei)⁵⁸.
      OPMERKING: C. remanei vrouwtjes produceren een grotere hoeveelheid vluchtige seksferomonen in vergelijking met C. elegans vrouwtjes. Daarom zijn slechts vijf vrouwtjes voldoende om 100 μL ruw vluchtig seksferomoon te extraheren.
3. Opslag
   1. Centrifugeer monsters bij 15.000 × g gedurende 30-60 s om de wormen te pelleteren. Breng het supernatans (dat feromonen bevat) voorzichtig over in een schone buis en gooi de buis met de wormkorrel weg. Bewaar het geïsoleerde supernatans voor volgende chemo-aantrekkingstests.
      OPMERKING: Het ruwe vluchtige seksferomoonextract kan ten minste 1 jaar bij -80 °C worden bewaard in een microcentrifugebuis omwikkeld met parafilm om verdamping te minimaliseren.
4. Kwaliteitscontrole
   1. Voordat u het extract gebruikt, voert u een kwaliteitscontroletest uit met N2-mannetjes of -2-5 mannetjes om de chemoaantrekkelijkheid te verifiëren (zie rubriek 4).

3. Een grote hoeveelheid ruwe seksferomoonextractie van 6 dagen oude maagdelijke hermafrodieten (Figuur 1A)

1. De cultuur van de worm
   1. Om ongeveer 20 ml ruw C. elegans-seksferomoon te verkrijgen, synchroniseert u twintig NGM-platen van 10 cm met gezonde volwassen C. elegans-wormen (N2 - of daf-22-mutant ) met behulp van het eerder genoemde bleekprotocol en wast u ze vervolgens 5x met M9-buffer.
      OPMERKING: Dit proces bereidt voldoende embryo's voor op feromoonextractie. N2: De standaard WT C. elegans-stam die zowel in water oplosbare ascaroside-feromonen als niet-ascaroside vluchtige seksferomonen produceert. daf-22-mutant : Een mutant die niet in staat is om veel ascaroside-feromonen te produceren, waardoor ze nuttig zijn bij het bestuderen van niet-ascaroside vluchtige seksferomonen in isolatie.
   2. Om wormen in het L1-stadium te synchroniseren, roteert u de embryo's in de M9-buffer gedurende 12-15 uur om de ontwikkeling te stoppen. Breng de gearresteerde L1-wormen over naar NGM-kweekplaten van 10 cm die zijn ingezaaid met OP50-bacteriën voor groei en ontwikkeling.
   3. Om de aanwezigheid van mannetjes op hermafrodiete platen tot een minimum te beperken, controleert u de platen 2 dagen na het loslaten van de worm, in het L4-stadium, en verwijdert u alle waargenomen mannetjes (zeer zelden).
   4. Zoek na drie dagen ontwikkeling naar het verschijnen van embryo's die aangeven dat de wormen reproductief volwassen volwassenen zijn geworden.
      OPMERKING:fog-2-mutante vrouwtjes van C. elegans en WT-vrouwtjes van C. remanei zijn ongeschikt voor bulkextractie van vluchtige seksferomoonen. mist-2 mutant C. elegans en C. remanei hebben een hoog percentage mannetjes in hun populaties, en mannetjes paren continu met vrouwtjes. Bevruchte vrouwtjes produceren geen vluchtige seksferomonen. De aanwezigheid van mannen bemoeilijkt de extractie van deze verbindingen.
2. Wormen wassen en embryo's scheiden
   1. Was de embryo's herhaaldelijk met M9-buffer en laat ze bezinken (1 g bezinking) totdat de meeste volwassenen zich op de bodem van de buis bevinden; Herhaal 5-7x. Laat de microcentrifugebuisjes enkele minuten ongestoord in een rek bezinken om de bezinking van volwassen wormen te vergemakkelijken en de scheiding van de volwassen wormpopulatie van de embryo's, die in de bovenliggende embryo's blijven hangen, mogelijk te maken.
   2. Pipeteer de gescheiden volwassenen en breng ze over naar nieuwe NGM-platen met OP50-zaad.
   3. Herhaal dit wasproces gedurende 5-6 dagen om het zelfsperma uit te putten.
      OPMERKING: Gebruik voor de extractie van vluchtige seksferomonen hermafrodieten die 5-6 dagen oud zijn. Deze timing zorgt ervoor dat hun zelfsperma waarschijnlijk uitgeput raakt, aangezien hermafrodieten met beschikbaar zelfsperma geen vluchtige seksferomonen produceren. Talrijke dode of niet-uitgekomen embryo's op de plaat op dag 5 of 6 geven een geschikt moment aan om met feromoonextractie te beginnen.
3. Sex feromoon extractie
   1. Extraheer het seksferomoon zoals beschreven in rubriek 1 met aanpassingen.
   2. In plaats van 100 C. elegans vrouwtjes per 100 μL toe te voegen, voeg je M9-buffer toe op basis van het uiteindelijke volume van de wormkorrel. Voeg 1 ml M9-buffer toe per 50 μL verpakte wormen.
4. Kwaliteitscontrole en homogenisatie
   1. Testbatches voor kwaliteitscontrole van geëxtraheerd feromoon met behulp van de chemoaantrekkelijkheidstest met N2-mannetjes of hem-5-mannetjes (zie rubriek 4).
   2. Meng alle batches om een homogeen ruw vluchtig seksferomoon te creëren voor experimenten die een grote hoeveelheid feromoon nodig hebben, zoals screening of microfluïdische experimenten. Bewaar het ruwe seksferomoonextract minimaal 1 jaar bij -80 °C in buisjes van 50 ml omwikkeld met parafilm om verdamping te minimaliseren.
5. Op chemo-aantrekkingstest gebaseerde titratiemethode voor standaardisatie van ruw seksferomoonextract
   1. Voer een titratietest uit door seriële verdunningen van elk feromoonextract te testen op zowel WT N2 als him-5 mannelijke C. elegans. Bepaal de hoogste verdunning (laagste concentratie) die consequent een robuuste en reproduceerbare chemotaxisrespons opwekt bij controlestammen.
   2. Bereid een reeks verdunningen van elk ruw extract (bijv. 1:2, 1:4, 1:8, enz.) in M9-buffer.
   3. Chemotaxis assays
      1. Voer gestandaardiseerde chemotaxistests uit (zie rubriek 4) met behulp van elke verdunning op de referentiestam van mannetjes. Voer drie replicaties uit om reproduceerbaarheid te garanderen. Vergelijk de optimale verdunningen over verschillende extractiebatches om de consistentie in feromoonconcentratie te beoordelen.
         OPMERKING: Dit stelt een referentiepunt vast voor het evalueren van de bioactiviteit van elk extract. In de standaard chemomolumon-chemoaantrekkelijkssay zullen de originele onverdunde extracten worden gebruikt voor volgende experimenten, waarbij de titratie dient als een kwaliteitscontrolestap om een consistente feromoonactiviteit tussen batches te garanderen. De verdunningsreeksen kunnen worden aangepast op basis van specifieke experimentele behoeften. Aangezien het standaard extractieprotocol consequent verzadigde ruwe feromoonextracten oplevert, is een titratietest om het extract te standaardiseren voor de meeste experimenten misschien niet nodig. Het wordt aanbevolen om dezelfde partij ruw seksferomoon te gebruiken in een reeks gerelateerde experimenten om de consistentie te behouden en de variabiliteit in feromoonactiviteit te minimaliseren.

4. Vluchtige chemomolumon-chemoaantrekkelijkheidstest

OPMERKING: De chemoattractiontest met vluchtige seksferomoon is aangepast van eerder vastgestelde methoden die in andere chemoattractionstudies worden gebruikt 24,29,59,60,61. Deze aanpassingen werden geïmplementeerd om de gevoeligheid en specificiteit van de test te optimaliseren voor het detecteren van reacties op vluchtige seksferomonen. Deze op maat gemaakte aanpak verbetert de toepasbaarheid van de test op specifieke onderzoeksbehoeften.

1. Observeer de kweekplaten dagelijks totdat er volop volwassen vrouwtjes/hermafrodieten zijn. De gezondheid van de wormen beïnvloedt hun reactie op het seksferomoon.
2. Voorbereiding van hem-5 mannen
   1. Gebruik het standaard bleekprotocol om hem-5 wormen te synchroniseren. Was de wormen na synchronisatie 5x met M9 buffer. Isoleer L4-mannetjes de dag voor de test; Breng vervolgens volwassen mannelijke wormen van een dag oud over van hun gezaaide platen en spoel ze vóór de test af in de M9-buffer. Plaats ze voorafgaand aan de test op niet-gezaaide NGM-platen om resterende bacteriën te elimineren en interferentie van voedsel tijdens de test te voorkomen.
      OPMERKING: Laat de wormen niet langer dan een uur voor de test uithongeren, omdat dit hun interne toestand kan veranderen en de resultaten van de seksferomoonchemoattractietest kan beïnvloeden. Daarom, als u van plan bent om meer dan 10 tests op één dag uit te voeren, vervang dan de wormmonsters elk uur. Wissel bovendien herhaaldelijk af tussen één experimentele test en één controletest.
3. Bereiding van chemo-aantrekkings-agar-analyseplaten
   1. Bereid chemo-aantrekkingstestplaten voor met 1,5% agar, 25 mM NaCl, 1,5 mM Tris-base en 3,5 mM Tris-Cl zoals beschreven in relevante literatuur²⁴.
   2. Verwarm de agar in de chemoattractie-oplossing met behulp van een magnetron tot deze volledig is opgelost. Laat de oplossing 5 minuten afkoelen bij kamertemperatuur.
   3. Gebruik een pipethulpmiddel om de chemo-aantrekkingsagar-oplossing gelijkmatig over petrischaaltjes te verdelen: giet 30 ml in elk schaaltje van 10 cm en 20 ml in elk schaaltje van 6 cm.
   4. Nadat u de chemo-aantrekkingsagar-oplossing in de petrischaaltjes hebt gegoten, laat u de deksels minstens 40 minuten open op een schone plaats om het oppervlak van de agar enigszins te laten drogen. Zodra het oppervlak op de juiste manier is opgedroogd, sluit u de deksels.
      OPMERKING: Deze droogtijd kan variëren afhankelijk van de vochtigheid en temperatuur van de laboratoriumomgeving.
4. Opslag van de plaat en voorbereiding vóór de test
   1. Verpak en bewaar de voorbereide testplaten maximaal 1 week in een koelcel. Haal de platen voor gebruik uit de koelcel en laat ze meer dan een uur op kamertemperatuur komen. Open de deksels om eventueel restvocht uit de agar te laten verdampen 20 minuten voor de test in een schone ruimte, zorg ervoor dat er geen duidelijk water op het oppervlak is voordat de test wordt uitgevoerd.
5. Experimenteel ontwerp en chemo-aantrekkingstest
   1. Om de chemo-aantrekkingstest uit te voeren, markeert u drie verschillende plekken op het deksel en de onderkant van de petrischaal of gebruikt u een sjabloon gedrukt op transparant plastic papier dat onder de schaal wordt geplaatst of aan de ontleedmicroscoop is bevestigd. Deze markeringen omvatten een middelste stip (•) als startpunt voor de wormen, een plusteken (+) voor de experimentele plek (2 μL seksferomoon op het deksel en 2 μL 1 M natriumazide op de plaat) en een minteken (-) voor de controleplek (2 μL M9-buffer op het deksel en 2 μL 1 M natriumazide) (Figuur 2A). Pas de afstand tussen deze markeringen aan op basis van de grootte van het gerecht en specifieke experimentele behoeften. Stel voor petrischaaltjes van 6 cm doorgaans een vaste afstand van 1,5 cm in vanaf het startpunt tot elke teststof voor de positieve controletests.
6. Gedetailleerde stappen om de test uit te voeren (Figuur 2)
   1. Breng 2 μL 1 M natriumazide aan op elke experimentele en controleplek op de plaat.
   2. Pluk 20 gezonde en vrij bewegende mannelijke wormen met een wormenprikker. Laat tegelijkertijd 20 mannelijke wormen los op het startpunt onder een ontleedmicroscoop.
   3. Voeg snel 2 μL seksferomoon en 2 μL M9-buffer toe aan respectievelijk de experimentele en controleplekken op het deksel.
   4. Sluit het deksel voorzichtig en plaats de testplaat op een rustige, temperatuurstabiele plaats naast de microscoop.
   5. Scoor na 30 minuten de test door het aantal wormen op elke plek te tellen.
      OPMERKING: Het proces van het plukken van 20 wormen mag niet langer duren dan 1-2 minuten om te voorkomen dat de vroeg geplukte wormen uitdrogen en ongezond worden, wat de resultaten kan beïnvloeden. Het hele proces, van het kiezen van de mannetjes tot het sluiten van het deksel, duurt tussen de 2 en 5 minuten.
7. Screening op positieve controle
   1. Test de mannelijke wormen op een 1.000-voudige verdunde oplossing van diacetyl (opgelost in 10% ethanol en 90% M9-buffer) om hun chemotaxis-responsiviteit te bevestigen. Evalueer de resultaten van de chemo-aantrekkingstest 30 minuten na het starten van de test. Scoor wormen die verlamd zijn op de aangewezen plekken op basis van hun locatie: 'C' voor degenen op de controleplek en 'E' voor degenen op de experimentele plek. Snijd wormen op geen van beide plekken als 'N' (Figuur 2C).
   2. Gebruik de volgende formule om de chemo-aantrekkingsindex (CI) te berekenen:
      
   3. Selecteer alleen mannelijke monsters met een chemotaxis-index ≥ 0,4 (C.I., zie figuur 2C). Gebruik het mannetje uit dezelfde batch voor de daaropvolgende seksferomoontest.
      OPMERKING: Voer drie afzonderlijke tests uit, elk met 20 wormen, om de consistentie en betrouwbaarheid van de experimentele resultaten te garanderen. Drie testen zijn doorgaans voldoende om consistentie af te leiden.

5. Richtlijnen voor timing en scores voor chemo-aantrekkingstest

1. Evalueer de chemo-aantrekkingskracht van de wormen op basis van hun uiteindelijke locaties. Scoor het aantal wormen op elke plek aan het einde van de test, meestal 30 minuten na het begin.
   OPMERKING: Het gebruik van natriumazide op experimentele en controleplekken verlamt aankomende wormen, waardoor een nauwkeurige score mogelijk wordt. De meeste WT N2 en him-5 mannetjes zijn in staat om de feromoonbron binnen 6-8 minuten te lokaliseren in een plaat van 6 cm met een afstandsopstelling van 1,5 cm.
2. Om defecten op de chemotaxis-efficiëntie vast te leggen, vooral om subtiele defecten te detecteren, kunt u overwegen de test met regelmatige tussenpozen van 3-5 minuten te controleren.
   OPMERKING: Deze frequente observatie maakt het mogelijk om de tijden te documenteren waarop wormen op de testplekken aankomen. Een dergelijke gedetailleerde tracking kan gevallen aan het licht brengen waarin wormen een verminderde chemotaxis-efficiëntie vertonen, maar er toch in slagen de testplek binnen het onderzoeksvenster te bereiken.

6. Optionele wijzigingen

1. Voor een verbeterde beoordeling van chemotaxis gebruikt u een camera die boven de plaat is geplaatst om de banen van de wormen tijdens de test vast te leggen.
   OPMERKING: Deze wijziging maakt een uitgebreide analyse van hun bewegingspatronen mogelijk, waardoor een dieper inzicht wordt verkregen in het gedrag en het traject van chemo-aantrekkingskracht (Figuur 3).

7. Analyse van de gegevens

1. Scoren en berekenen van de chemo-aantrekkingsindex (C.I.)
   1. Volg de stappen 4.7.1 en 4.7.2.
2. Aankomsttijd plot
   1. Voor een uitgebreidere analyse van chemo-aantrekkingstesten kunt u overwegen de test met tussenpozen van 3-5 minuten te controleren of een camera boven de plaat te gebruiken om de banen van de wormen tijdens de test vast te leggen.
      OPMERKING: Deze benaderingen maken het niet alleen mogelijk om de aankomsttijden van de wormen op de ontwerpplekken te scoren, maar ook om de gemiddelde aankomsttijden te vergelijken en de verdeling van deze tijden te analyseren.
3. Videogebaseerde trajectanalyse en datavisualisatie
   OPMERKING: Om de bewegingspatronen van C. elegans Tijdens chemoattraction-tests, registreer en extraheer trajecten (zie de Tabel met materialen) en verdere analyse (Figuur 3).
   1. Stel het opnamesysteem in.
   2. Start een nieuwe opname en open het venster met opname-instellingen .
   3. Definieer de gewenste opnameparameters:
      1. Bestandsvoorvoegsel: Kies een beschrijvende naam voor de videobestanden (bijvoorbeeld 'experiment1_').
      2. Frame Rate (FPS): Selecteer de juiste frames per seconde om de beweging van de worm vast te leggen (bijv. 7,5 FPS voor wormen op de agarplaat en 30 FPS voor zwemmende wormen).
      3. Duur: Stel de lengte van de opname in seconden in (bijv. 1.800 s [30 min] voor bulkchemo-aantrekkingstest).
   4. Optimaliseer de beeldkwaliteit: Pas de verlichtingsintensiteit aan om ervoor te zorgen dat de wormen duidelijk zichtbaar zijn tegen de achtergrond en verfijn de scherpstelling om een scherp beeld van de wormen te krijgen.
   5. Om de analyseplaat voor te bereiden, doseert u eerst de controlevloeistof op de daarvoor bestemde controleplek. Pak vervolgens de worm(en) voorzichtig op en laat ze voorzichtig los op het midden van de plaat. Zodra de worm(en) zich hebben gevestigd, brengt u de seksferomoonoplossing aan op de aangewezen experimentele plek.
   6. Plaats de plaat: Plaats de plaat met de wormen voorzichtig in het midden van het opnameveld om het opnamegebied te maximaliseren.
   7. Om de stress op de wormen tijdens chemotaxis-assays te verminderen, kunt u de volgende twee benaderingen overwegen.
      1. Voor een enkelvoudige wormtest plaatst u de worm op de testplaat en laat u deze 5 minuten acclimatiseren voordat u de seksferomoonoplossing op de aangegeven afstand introduceert (de positie op basis van de huidige locatie van de worm).
         OPMERKING: Dit minimaliseert het hanteren en geeft de worm de tijd om zich aan te passen aan zijn nieuwe omgeving.
      2. Bulk chemo-aantrekkingstest: Laat de wormen zich gedurende 5 minuten op natuurlijke wijze op de plaat nestelen en verspreiden. Breng na deze gewenningsperiode de feromoonoplossing in op de aangewezen vaste positie. Meet tijdens de post-video-analyse de startafstand van elke worm tot het feromoon en groepeer ze dienovereenkomstig voor verdere analyse.
   8. Procedure voor videoanalyse
      1. Importeren en instellen: Importeer de opgenomen video in de software. Configureer de sequentie-informatie (bijv. framesnelheid); Specificeer de beeldschaal (pixels per meeteenheid).
      2. Beeldaanpassing: Om de detectie van wormen te optimaliseren, past u de detectiedrempel aan totdat het groene label de wormen strak omlijnt zonder achtergrondruis of artefacten vast te leggen. Pas bovendien algoritmen voor het gladmaken van de achtergrond toe om ruis en oneffenheden in de afbeelding te verminderen, waardoor het contrast tussen de wormen en de achtergrond wordt verbeterd. Experimenteer met verschillende afvlakkingsniveaus om de optimale balans te vinden tussen ruisonderdrukking en behoud van wormdetails.
         OPMERKING: De ideale drempel moet het grootste deel van het lichaam van elke worm bedekken, terwijl externe elementen worden uitgesloten.
      3. Optimalisatie van detectieparameters: selecteer een representatieve worm om automatisch detectieparameters te genereren. Controleer de nauwkeurigheid van de detectie door 5-10 willekeurige frames visueel te inspecteren. Als de detectie niet bevredigend is, verfijnt u de detectieparameters handmatig, controleert u indien nodig de instellingen voor beeldaanpassing opnieuw en gaat u verder met volgen zodra de detectie betrouwbaar is.
      4. Proeflezen en repareren van volgtrajecten: Nadat het geautomatiseerde volgproces is voltooid, voert u een handmatige proeflezing uit van de gegenereerde trajecten. Als er tijdens het proeflezen inconsistenties worden gevonden, gebruikt u de reparatiefunctie om het traject te corrigeren en voert u de volgende bewerkingen uit: Deelnemen: Verbind trajectsegmenten waaraan ten onrechte verschillende ID's zijn toegewezen, maar die tot dezelfde persoon behoren. Splitsen: afzonderlijke trajectsegmenten waaraan ten onrechte dezelfde ID is toegewezen, maar die tot verschillende personen behoren.
         OPMERKING: Het doel is ervoor te zorgen dat elke unieke ID (nummer) gedurende de gehele trackingperiode consequent aan dezelfde persoon wordt toegewezen.
         Voorbeeld: Als een worm gedurende een bepaalde periode als "3" wordt gelabeld en vervolgens voor een volgende periode ten onrechte als "7" wordt gelabeld, voegt de reparatiefunctie deze twee segmenten samen onder de identifier "3". Omgekeerd, als twee wormen beide gedurende een bepaalde periode als "12" worden gelabeld, zou de reparatiefunctie dit segment opsplitsen in twee afzonderlijke trajecten, elk met een unieke identificatiecode. Door zorgvuldig te proeflezen en de nodige reparaties uit te voeren, kan de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de trackinggegevens aanzienlijk worden verbeterd.
      5. Visualisatie en export van resultaten: Gebruik software voor visualisatie en basisanalyse. Exporteer gegevens als CSV-bestanden voor verdere analyse met de gewenste tools of code. Deze methode biedt een basiscode (zie https://github.com/edmondztt/pheromone-traj-analysis.git) om het bewegingstraject van de worm te visualiseren op basis van vijf belangrijke parameters (Figuur 3). Tijd: De progressie van het traject, kleurgecodeerd om het verstrijken van de tijd aan te geven sinds het begin van het experiment. Afstand tot feromoon: De afstand tussen de worm en de feromoonbron op elk tijdstip. Snelheid: De snelheid van de worm op elk punt, die ook de draai- en stopgebeurtenissen aangaf. Rechtheid: Hoe recht het pad van de worm is. Richtingscorrectheid: Hoe uitgelijnd is de beweging van de worm met de richting van het feromoondoelwit? Deze code biedt een fundamentele visualisatie voor het begrijpen van wormgedrag en kan worden aangepast en uitgebreid voor diepere analyse.
         OPMERKING: Deze geavanceerde benadering biedt een uitgebreid alternatief voor de traditionele chemoattraction-index door het navigatietraject van wormen in reactie op seksferomonen in detail te beschrijven. Het maakt het mogelijk om bewegingspatronen te begrijpen zonder te vertrouwen op willekeurige eindpunten van de navigatie en tijdvensterbepaling, en biedt diepere inzichten in de gedragsdynamiek van de test. De gegevens werden gemiddeld over 20 frames, die kunnen worden aangepast op basis van specifieke experimentele behoeften, om beweging veroorzaakt door het draaien van het lichaam uit te filteren.

Resultaten

Trajectanalyse van vluchtige seksferomoonperceptie defecte stam in chemoattractietest
Deze chemo-aantrekkingstest maakt op betrouwbare wijze onderscheid tussen wildtype en mutante stammen van C. elegans in hun reactie op vluchtige seksferomonen. Succesvolle experimenten met hem-5 mannetjes tonen consequent robuuste chemotaxis aan in de richting van de feromoonbron. Dit komt tot uiting in een hoge chemotaxis-index (C.I.) (Figuur 2), vaak meer dan 0,5, wat wijst op een sterke voorkeur voor de feromoonbron. Omgekeerd leveren experimenten met de feromoonreceptormutant srd-1 consequent negatieve resultaten op. De CI voor srd-1-mannetjes ligt meestal rond de nul²⁴. Dit bevestigt het vermogen van de test om de afwezigheid van een chemotactische respons te detecteren.

In suboptimale experimenten kunnen tal van factoren de resultaten beïnvloeden. Onvoldoende feromoonconcentratie kan bijvoorbeeld leiden tot zwakke reacties bij him-5 mannetjes, terwijl besmetting of onjuiste behandeling onvoorspelbare bewegingen in beide stammen kan veroorzaken. Deze scenario's resulteren in lagere CI-waarden voor hem-5-mannen en mogelijk misleidende niet-nulwaarden voor srd-1-mannen . Daarom wordt de succesvolle implementatie van dit protocol gekenmerkt door een duidelijk onderscheid in de chemotaxis-indices tussen wildtype en mutante stammen, ondersteund door de trajectanalyse die de gedragsverschillen visueel bevestigt (Figuur 3). De gegevensanalyse moet statistische vergelijkingen van C.I.-waarden omvatten om ervoor te zorgen dat de waargenomen verschillen significant zijn.

Demonstratie van de op video gebaseerde analyse en visualisatie van chemoattraction-assay
Succesvolle testresultaten: Figuur 3 toont de robuuste chemotactische respons van him-5 mannetjes op een vluchtig seksferomoon. De kleurgecodeerde trajecten onthullen (A) tijdkosten, (B) afstand: toenemende nabijheid van de feromoonbron in de loop van de tijd, wat de aantrekkingskracht van de wormen bevestigt. (C) snelheid: variërende snelheden langs de trajecten, die inzicht geven in de dynamiek van chemotactische reacties. (D) rechtheid: hoe direct de wormen naar de feromoonbron bewegen. Hoe rechter het pad, hoe efficiënter en gerichter hun beweging is als reactie op de chemische lokstof. (E) Richtingscorrectheid: Dit toont het vermogen van de wormen om zich nauwkeurig te oriënteren en zichzelf te verplaatsen naar de bron van het feromoon, de chemische lokstof. Het meet in wezen hoe goed de wormen de chemische gradiënt kunnen waarnemen en erlangs kunnen navigeren om hun doel te bereiken.

Een daling van de snelheid naar nul geeft meestal een stop of bocht aan. Het combineren van snelheidsinformatie met rechtlijnigheidsgegevens kan helpen bij het identificeren van bochten. Concreet wordt een draaigebeurtenis aangegeven wanneer de snelheid tot nul daalt en de rechtheid ook erg laag is. Daarentegen kunnen experimenten met sensorisch defecte mutanten of experimenten die worden uitgevoerd onder suboptimale omstandigheden (bijv. lage feromoonconcentratie, ongeschikte wormdichtheid) verschillende resultaten opleveren.

Door trajecten te vergelijken en parameters zoals richtingsgevoeligheid, snelheid en rechtheid te kwantificeren, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de onderliggende mechanismen van chemotaxis. Succesvolle experimenten met duidelijke, gerichte banen naar de feromoonbron valideren het vermogen van de test om aantrekkelijke stimuli te detecteren. Omgekeerd bevestigt de afwezigheid van dergelijke patronen in negatieve controles of mutante stammen de specificiteit van de test en het vermogen om sensorische defecten te identificeren. De op video gebaseerde bulkchemo-aantrekkingstest, zoals geïllustreerd in figuur 3, biedt een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de details van het gedrag van wormchemotaxis. Door individuele trajecten te analyseren, kunnen onderzoekers niet alleen de aan- of afwezigheid van aantrekkingskracht ontdekken, maar ook het verschil in de respons, waardoor een beter begrip wordt geboden van de onderliggende genetische en neurale mechanismen die chemotaxis regelen.

Figuur 1: Workflow van ruwe seksferomoonextractie. Ruw seksferomoon wordt geëxtraheerd uit gesynchroniseerde eendagsoude maagdelijke mist-2-mutante vrouwtjes van C. elegans en WT-vrouwtjes van C. remanei, waar wormen worden gesynchroniseerd, gewassen, geïsoleerd en geïncubeerd in M9-buffer voor feromoonproductie. Het geëxtraheerde feromoonbevattende supernatans wordt maximaal 1 jaar bewaard bij -80 °C voor gebruik in chemoattraction-assays, waarbij kwaliteitscontroletests worden uitgevoerd met behulp van N2- of him-5-mannetjes om de aantrekkelijkheid te verifiëren. Voor grootschalige extractie van 6 dagen oude maagdelijke C. elegans hermafrodieten, worden wormen gesynchroniseerd en herhaaldelijk gewassen gedurende 6 dagen, waarbij seksferomoon op dezelfde manier wordt geëxtraheerd, maar gemodificeerd op basis van het volume wormpellets en homogeen gemengd voor experimenteel gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De chemoaantrekkelijke-chemoaantrekkelijke-test van het vluchtige geslacht en de berekening van de chemo-aantrekkingsindex. (A) Deze test omvat het voorbereiden van WT N2 - of him-5-mannetjes met een gestandaardiseerd bleeksynchronisatieprotocol, waarbij hun reactie op een positieve controlestof wordt getest vóór de chemoaantrekkelijke-test van vluchtige seksferomoonen. Het experiment omvat het markeren van de platen voor controle- en testplekken en het gebruik van natrium opzij om wormen op deze plekken te immobiliseren voor een nauwkeurige score. De resultaten worden doorgaans 30 minuten na het starten van het experiment gescoord (aangegeven door het deksel te sluiten). (B) Zijaanzicht van de opstelling van de chemo-attractietest met twee verschillende afstanden. (C) C.I. berekening en de interpretatie. C.I. is een kwantitatieve maat voor de aantrekkelijkheid of afstoting van een teststimulus. De CI varieert van 1, wat wijst op sterke aantrekkingskracht, tot -1, wat wijst op sterke afstoting. Een lage C.I.-waarde kan ontstaan uit twee scenario's: ofwel een klein aantal wormen op zowel de experimentele als de controleplekken, of een gelijke verdeling van wormen over de twee plekken. (D) Chemo-aantrekkingsindices voor hem-5 en srd-1 C. elegans mannetjes als reactie op vluchtige seksferomonen van C. remanei en C. elegans vrouwtjes. Mannen met verschillende genetische achtergronden reageren anders op de seksferomoonstimulus. him-5 mannetjes vertonen een respons op beide feromonen, met een opmerkelijk hogere index voor feromonen van C. remanei vrouwtjes. Daarentegen vertonen de mannetjes van de chemoreceptormutante stam srd-1 in deze analyse geen respons op beide feromoons. p < 0,01. Afkortingen: WT = wildtype; C.I. = chemo-aantrekkingsindex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Trajectanalyse van hem-5 mannetjes als reactie op vluchtig seksferomoon. Deze figuur illustreert de bewegingspatronen van hem-5 mannelijke wormen tijdens een chemoattractietest met een vluchtige seksferomoonstimulus. Individuele trajecten hebben een kleurcode om (A) Tijd weer te geven: Progressie van het traject in de loop van het experiment. De kleur geeft de tijd weer die is verstreken sinds het begin van de test. (B) Afstand tot feromoon: Nabijheid van de feromoonbron op elk tijdstip. (C) Snelheid: Wormsnelheid op elk punt. (D) Rechtheid: Directheid van het pad dat de worm aflegt. (E) Richtingscorrectheid: Uitlijning van de beweging met de richting van de feromoonbron. In alle drie de voorbeelden bereikten de mannelijke wormen met succes de locatie van het feromoon. De gegevens werden gemiddeld over 20 frames om beweging veroorzaakt door het draaien van het lichaam uit te filteren. De experimenten worden uitgevoerd op een petrischaal van 10 cm en volgen de op video gebaseerde bulkchemo-atroattractietestmethode (zie protocolparagraaf 7.3.7.2) die in dit protocol wordt vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een robuuste methodologie voor de extractie van vluchtige seksferomonen uit C. elegans, samen met het opzetten van een robuuste chemo-aantrekkingstest om mannelijke chemo-aantrekkingsreacties te meten. Aanvullende informatie is te vinden in de gebruikershandleiding van WormLab (zie de Tabel met materialen); Voor een basiscode om het bewegingstraject van de worm te visualiseren, zie protocolsectie 7.3.8.5. Een aantal cruciale stappen in het protocol zijn belangrijk voor de uitkomst. Ten eerste is zorgvuldige synchronisatie van wormpopulaties essentieel om de leeftijd en de voortplantingstoestand onder controle te houden, waardoor de succesvolle extractie van vluchtige seksferomonen van maagdelijke vrouwtjes of sperma-verarmde hermafrodieten wordt^{gegarandeerd29,34}. Ten tweede zijn herhaalde wasstappen nodig om bacteriën grondig te verwijderen, waardoor besmetting tot een minimum wordt beperkt die de feromoonsignalering in daaropvolgende chemotaxis-assays zou kunnen verstoren. Vervolgens kan de keuze van de testparameters, zoals de concentratie van de lokstof, de plaatgrootte en de duur van de test, allemaal van invloed zijn op de resultaten en moet deze worden afgestemd op de specifieke experimentele doelen.

Nauwkeurige droogtijden en een consistente afstand tussen de testplekken zijn van cruciaal belang voor betrouwbare chemotaxis-testresultaten. Natte platen hebben een aanzienlijke invloed op de chemotaxis-index. Als er een laag water op het agaroppervlak achterblijft, kunnen capillaire krachten de wormen bij het startpunt vast komen te zitten. Dit kan hun beweging belemmeren, wat leidt tot vals-negatieve resultaten in de test. Verder vormen langere droogtijden een andere uitdaging voor degenen die later worden vrijgelaten. Naarmate de plaat droogt, verdampen en diffunderen vluchtige feromooncomponenten, waardoor een minder duidelijke concentratiegradiënt ontstaat. Dit maakt het moeilijk voor later vrijgelaten wormen om het doelferomoon te lokaliseren, zelfs als ze later vrij zijn om te bewegen. Zorg er daarom voor dat de platen voldoende droog zijn om eventueel oppervlaktevocht te verwijderen dat de resultaten van het experiment zou kunnen beïnvloeden.

Het volume agar-oplossing dat aan de platen wordt toegevoegd, moet worden aangepast aan de specifieke vereisten van het experiment, zodat optimale analyseomstandigheden worden gegarandeerd. De dikte van de agarlaag, aangepast door de hoeveelheid agar-oplossing die in de schaal wordt gegoten te variëren. Doorgaans leidt een kortere afstand tussen de lokstof en de agarplaat tot robuustere resultaten. Omgekeerd kan een langere afstand helpen de effecten van niet-vluchtige componenten te elimineren, waardoor de invloed van de vluchtige lokstof duidelijker kan worden beoordeeld. De dikte van de agar kan worden aangepast aan de specifieke experimentele behoeften, zoals weergegeven in figuur 2B.

Het proces van het plukken van 20 wormen mag niet langer duren dan 1-2 minuten om te voorkomen dat de vroeg geplukte wormen uitdrogen en ongezond worden, wat de resultaten zou kunnen beïnvloeden. Zorg ervoor dat de wormen tegelijkertijd op de testplaat worden losgelaten om te voorkomen dat de vroeg vrijgelaten wormen willekeurig te ver van het startpunt lopen. Vertragingen in deze stap kunnen leiden tot variabele startposities tussen de steekproeven, wat resulteert in oneerlijke vergelijkingen. Het hele proces, van het kiezen van de mannetjes tot het sluiten van het deksel, duurt tussen de 2 en 5 minuten.

Pas de afstand tussen de experimentele/controleplekken en het startpunt op de testplaat aan op basis van de plaatgrootte en de specifieke doelstellingen van het experiment. Het vergroten van de afstand tussen de vlekken kan de test uitdagender maken, wat gunstig is voor het detecteren van subtiele effecten. Omgekeerd zorgt het verkleinen van de afstand voor een robuustere testtest die ernstige defecten aan het licht brengt.

Op verschillende punten in het protocol kan het nodig zijn om problemen op te lossen. Als het geëxtraheerde feromoon geen chemotaxis-respons induceert, controleer dan zorgvuldig de leeftijd en voortplantingsstatus van de bronvrouwtjes en hermafrodieten. Alleen maagdelijke vrouwtjes of sperma-arme hermafrodieten zullen het doelferomoon produceren. Vanwege de hoge paringsefficiëntie van C. elegans-mannetjes , kan de aanwezigheid van zelfs maar een enkel mannetje op de L4-vrouwtjesisolatieplaat de resultaten drastisch beïnvloeden. Zorg er bovendien voor dat bacteriële besmetting tijdens het extractieproces onder controle wordt gehouden. Hoewel dit extractieprotocol een eenvoudige manier biedt om ruwe vluchtige seksferomonen te verkrijgen, heeft het bepaalde beperkingen. Het ruwe feromoonextract kan sporen van andere signaalmoleculen bevatten, waardoor het moeilijk is om de specifieke effecten van het seksferomoon zelf definitief te isoleren. De functionele componenten van het vluchtige seksferomoon zijn nog niet geïdentificeerd. Hoewel er geen functioneel verschil is gerapporteerd tussen de seksferomonen van maagdelijke vrouwtjes van één dag oud en hermafrodieten van zes dagen oud, kan de mogelijkheid van een subtiel verschil niet worden uitgesloten.

In de chemo-aantrekkingstest kan een lage chemotaxis-index duiden op een probleem met de gezondheids- of ontwikkelingsfase van de geteste mannen. Gebruik voor een optimaal resultaat gezonde volwassen mannetjes van een dag oud die bij 20 °C worden gekweekt op een schone OP50-plaat zonder verontreiniging. Abrupte temperatuurveranderingen van lagere opslagtemperaturen (zoals 15 °C) tot 20 °C kunnen het chemo-aantrekkingsgedrag tot drie generaties lang negatief beïnvloeden. Voor de beste praktijk is het mogelijk om stammen die onlangs zijn ontdooid of bij lagere temperaturen zijn bewaard, meer dan drie generaties lang aan te passen aan 20 °C voordat ze worden gebruikt. Hoewel het isoleren van testmannetjes in het L4-stadium op de dag voor de testdag wordt aanbevolen, is dit niet strikt noodzakelijk. Blootstelling vóór blootstelling aan volwassen hermafrodieten heeft geen significante invloed op de resultaten van de chemo-aantrekkingstest. Hermafrodieten van een dag oud produceren geen vluchtige seksferomonen vanwege het bestaan van zelfsperma. Daarom kan de L4-mannelijke isolatie worden overgeslagen bij het uitvoeren van grootschalige screening. Voor onderzoeken die specifiek de effecten van eerdere paringservaringen of andere gerelateerde onderzoeken onderzoeken, is het echter noodzakelijk om mannetjes 1 dag voor de testdag in het L4-stadium te isoleren.

De him-5-mutatie in C. elegans veroorzaakt een hoge incidentie van mannen als gevolg van een verhoogde snelheid van X-chromosoom non-disjunctie tijdens meiose in de ouder van de mannen. Het chemosensorische systeem van de mannetjes dat nodig is voor chemotaxis is dus nog steeds intact. Dit maakt het gemakkelijker om een groot aantal mannetjes voor analyse te verkrijgen. Bijgevolg vertonen him-5-mannetjes robuuste chemotaxis die vergelijkbaar is met WT N2-mannetjes, waardoor ze een geschikte controle zijn bij seksferomoon-chemotaxis-assays.

Aanvullende overwegingen:
Vervanging van natriumazide: Natriumazide dat wordt gebruikt om wormen te verlammen tijdens video-opnamen, kan worden vermeden. Gebruik in plaats daarvan een druppel M9-oplossing om wormen tijdelijk te immobiliseren, hoewel oppervlaktespanning voldoende is voor een op video gebaseerde test.

Worm dichtheid: Beperk het aantal wormen per bord om overbevolking te voorkomen en optimale omstandigheden te behouden. Overbevolking zal van invloed zijn op de analyse na de video, omdat het programma moeite zal hebben om wormen te identificeren als ze elkaar overlappen. Voor een petrischaaltje van 6 cm wordt maximaal 20 wormen aanbevolen en voor een schaaltje van 10 cm 100 wormen.

Traditionele chemo-aantrekkingstesten bieden een eenvoudige aanpak, waarbij minimale inspanning nodig is voor het verzamelen van gegevens. Hoewel deze tests een snel overzicht geven van de chemotaxis-respons, leggen ze alleen het eindpunt van een complexe gedragsrespons vast. Dit beperkt hun vermogen om de details van feromoonperceptie en locomotorische respons te onthullen. De geavanceerde trajectanalyse geeft daarentegen inzicht in individuele en collectieve bewegingspatronen. Deze aanpak brengt verschillen aan het licht die alleen door op eindpunten gebaseerde maatregelen over het hoofd worden gezien. Door de gedetailleerde kinetische patronen en responsvariabiliteit binnen testpopulaties in detail te verkennen, verbetert deze methode ons begrip van chemosensorische mechanismen aanzienlijk. Dit benadrukt de toepasbaarheid van de test op diverse onderzoeksvragen en onderstreept het belang van het overwegen van individuele variabiliteit in experimenteel ontwerp.

Deze methodologie biedt een kader voor het bestuderen van vluchtige seksferomonen in C. elegans. Het kan de ontdekking van genen vergemakkelijken die verband houden met de synthese, secretie en perceptie van vluchtige seksferomoonen, waardoor ons begrip van chemische communicatie op moleculair en neuraal circuitniveau wordt bevorderd. Bovendien kunnen de chemo-aantrekkingstest en de analyse van trajectgegevens worden gebruikt om andere chemo-lokstoffen in C. elegans te onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriologische Petri-schaal 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriologische Petri-schaal 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Elk merk mag werken.
Chemoattractie assay platen	Zelf gemaakte oplossing	N/A	1,5% agar, 25 mM NaCl, 1,5 mM Tris-base en 3,5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissectiemicroscoop	Leica	LeicaMZ75	Elk merk mag werken.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Huishoudbleek	Clorox Germicidal bleek geconcentreerd		Bleekmiddel
M9 buffer	Zelf gemaakte oplossing	N/A	3 g KH2PO4, 11,3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O tot 1 L. Steriliseer door autoclaven. Voeg 1 mL 1 M MgSO4 toe nadat het is afgekoeld tot kamertemperatuur.
Magnesiumsulfaat, watervrij, poeder	Macron	M1063-500GM-EA
Microgolfoven	TOSHIBA	N/A	Elk merk mag werken.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM platen oplossing	Zelf gemaakte oplossing	N/A	2,5 g Pepton, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O tot 1 L.Steriseer door autoclaven. Wacht tot de temperatuur van het medium 65 °C is gedaald (2 u). Zet op een hotplate op 65 °C en roer. Voeg vervolgens het volgende toe, 5 minuten wachten tussen elk om kristallisatie te voorkomen: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratoriumwikkelfilm
Pepton	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Elk merk mag werken.
Kunststofpapier	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Kaliumchloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Kaliumfosfaat	Spectrum	7778-77-0
Pipet	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, elk merk mag werken.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller met tweerichtingsrotator. Elk merk mag werken.
Natriumchloride	VWR	7647-14-5
natriumfosfaat dibasisch	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Trypton	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Elk merk mag werken.
WormLab systeem	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Zelf gemaakt	N/A	gemaakt met platina en glazen pipet tips