Methodenartikel

Vasculaire organoïdegeneratie uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67125

⸱

13 december 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van vasculaire organoïden met behulp van menselijke pluripotente stamcellen.

Samenvatting

Vasculaire organoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) recapituleren de diversiteit van het celtype en de complexe architectuur van menselijke vasculaire netwerken. Dit driedimensionale (3D) model heeft een aanzienlijk potentieel voor vasculaire pathologiemodellering en in vitro screening van geneesmiddelen. Ondanks recente ontwikkelingen blijft een belangrijke technische uitdaging het reproduceerbaar genereren van organoïden met een consistente kwaliteit, wat cruciaal is voor downstream-assays en toepassingen. Hier wordt een aangepast protocol gepresenteerd dat zowel de homogeniteit als de reproduceerbaarheid van de vasculaire organoïdegeneratie verbetert. Het gewijzigde protocol omvat het gebruik van microwells en de CEPT-cocktail (chromaan 1, emricasan, polyamines en de geïntegreerde stressresponsremmer, trans-ISRIB) om de vorming van embryoïde lichamen en de overleving van cellen te verbeteren. Gedifferentieerde, volwassen vasculaire organoïden die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, worden gekenmerkt door 3D-immunofluorescentiemicroscopie om hun morfologie en complexe vasculatuur te analyseren. Dit protocol maakt de productie van hoogwaardige vasculaire organoïden op een schaalbare manier mogelijk, waardoor het gebruik ervan in toepassingen voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreening mogelijk wordt vergemakkelijkt.

Inleiding

In vitro microfysiologische modellen, waaronder organoïde en weefsel-op-een-chip-systemen, zijn de afgelopen tien jaar ontstaan 1,2,3. Deze driedimensionale (3D), van menselijke cellen afgeleide systemen pakken de beperkingen aan in conventionele tweedimensionale (2D) celkweek- en diermodellen, zoals het ontbreken van veel componenten in de fysiologische micro-omgeving en genetische verschillen tussen soorten. Ze bieden meer fysiologische inzichten en zijn geschikter voor ziektemodellering en screening van geneesmiddelen dan conventionele modellen. Van de microfysiologische modellen is bewezen dat organoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) de architecturale kenmerken van inheemse menselijke weefsels effectief samenvatten en zijn ontwikkeld om verschillende menselijke organen na te bootsen, waaronder de hersenen 4,5, nier6, lever 7,8 en netvlies9. Hier richten we ons met name op het genereren van vasculaire organoïden uit hiPSC's en schetsen we een gestroomlijnd protocol dat tot doel heeft de variaties tussen verschillende organoïdemonsters en batches te minimaliseren, waardoor de algehele reproduceerbaarheid wordt verbeterd.

Vasculatuur speelt een cruciale rol bij het handhaven van fysiologische homeostase in alle menselijke organen. De vorming van vasculatuur omvat de processen van vasculogenese en angiogenese, georkestreerd door de interacties tussen endotheel- en murale (bijv. pericyten en vasculaire gladde spiercellen) en beïnvloed door verschillende stimuli10. Penninger, Wimmer en collega's ontwikkelden de eerste vasculaire organoïde generatiemethode11,12 die deze twee processen nabootst. Met de organoïden die met deze methode zijn gegenereerd, hebben hun groep12 en us13,14 het potentieel van vasculaire organoïden aangetoond voor het modelleren van vasculaire storingen bij ziekten. In onze recente werken13,14 werden bijvoorbeeld verschillende fenotypes waargenomen, zoals variaties in het ontkiemen van bloedvaten en variaties in de samenstelling van murale cellen, tussen ziekte-nabootsende vasculaire organoïden en hun wild-type tegenhangers. Deze voorbeelden benadrukken dat het vasculaire organoïdemodel zou kunnen dienen als een platform voor het screenen van geneesmiddelen door ziektegerelateerde vasculaire storingen na te bootsen.

Voortbouwend op de initiële werking voor het genereren van vasculaire organoïden11,12, wordt een herzien protocol gepresenteerd dat het gebruik van microwell omvat om de vorming van een homogeen embryoïde lichaam (EB) te vergemakkelijken, een kritische factor bij het minimaliseren van de variaties die vaak worden gezien binnen dezelfde batch organoïdegeneratie. Daarnaast wordt de CEPT-cocktail, een combinatie van chromaan 1, emricasan, polyamines en de geïntegreerde stressresponsremmer (trans-ISRIB)15, gebruikt om de levensvatbaarheid van hiPSC's en gedifferentieerde cellen tijdens het EB-vormingsproces te verbeteren. Deze wijziging is voornamelijk bedoeld om de variaties tussen verschillende organoïdemonsters en batches te verminderen. Uniforme vasculaire organoïden kunnen worden geproduceerd met dit ongeveer twee weken durende protocol, waarbij vasculogenese wordt geïnduceerd om het endotheel te helpen zich te organiseren in primitieve buisvormige netwerken op dag 1, gevolgd door angiogenese-inductie op dag 5 om complexe vasculaire netwerken in organoïden te ontwikkelen. Op dag 12-15 moeten de gegenereerde organoïden volwassen vasculaire netwerken vertonen die zijn samengesteld uit zowel endotheel- als muurcellen.

Protocol

Figuur 1 geeft een overzicht van de stappen die in dit protocol zijn opgenomen. Gedetailleerde informatie over de reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt, wordt gegeven in de Tabel met materialen. Het wordt aanbevolen om alle media voor gebruik voor te verwarmen op 37 °C, tenzij anders aangegeven. Alle celkweekmaterialen en -benodigdheden moeten geautoclaveerd of steriel zijn, en de celbehandeling moet worden gedaan in een bioveiligheidskast. Bovendien moet de pH-waarde van het collageen I-mengsel zorgvuldig worden aangepast aan pH 7,3 om mogelijke stollingsproblemen te voorkomen.

1. Menselijk iPSC-onderhoud

  1. Ontdooi het extract van de basale membraanmatrix op ijs, schud de fles voorzichtig om de oplossing te mengen en maak 0,5 ml aliquots in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met behulp van een P1000-pipet en voorgekoelde tips. Bewaar de aliquots maximaal 1 jaar bij -20 °C.
  2. Ontdooi een aliquot matrixextract (0,5 ml) op ijs. Meng met 49,5 ml voorgekoeld DMEM/F12 medium in een tube van 50 ml. Verdeel het mengsel over elk putje (1,5 ml/putje) in platen met 6 putjes en schud het plaatje vervolgens voorzichtig om ervoor te zorgen dat de vloeibare oplossing het hele putje bedekt. Sluit de platen af met paraffinefolie en bewaar ze maximaal 1 week bij 4 °C.
  3. Bereid het hiPSC-expansiemedium voor zoals beschreven in Tabel 1. Maak aliquots van het volledige medium (40 ml/tube) en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  4. Plaats een voorgecoate plaat in de incubator van 37 °C gedurende 1 uur voorafgaand aan de hiPSC-cultuur.
  5. Verwarm hiPSC expansiemedium (40 ml) voor op 37 °C en bereid het hiPSC zaaimedium voor zoals beschreven in tabel 2.
  6. Breng de gecoate plaat over van de 37 °C-incubator naar de bioveiligheidskast. Vervang het medium in de gecoate plaat door hiPSC zaaimedium (1 ml/putje).
  7. Ontdooi een gecryopreserveerde flacon met hiPSC's uit de cryotank in een waterbad van 37 °C gedurende 1 min.
  8. Breng de cellen over in een buisje van 15 ml en voeg vervolgens 5 ml DMEM/F12-medium toe, gevolgd door centrifugeren bij 100 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te verzamelen.
  9. Aspireer het supernatans en resuspendeer de cellen met 1,5 ml hiPSC-zaaimedium. Resuspendeer de cellen voorzichtig in de tube van 15 ml.
  10. Aliquot 10 μL van de celsuspensie en meng met 10 μL trypanblauwe oplossing. Breng het mengsel van 10 μl over op het glaasje van de hemacytometer en dek het af met een dekglaasje.
  11. Monteer de schuif op de houder en plaats deze in de geautomatiseerde cellenteller. Wacht tot het instrument de scherpstelling heeft gevonden of pas de scherpstelling handmatig aan door op de scherpstelknop +/- op het scherm te drukken. Gebruik daarna de standaardinstelling en druk op de Capture knop. Gebruik de LIVE-celdichtheidsmeting als de concentratie van de hiPSC-suspensie bereid uit stap 1.9.
  12. Zaai 2 × 105 cellen in elk putje en zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn in het putje.
  13. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 en vervang het medium na 24 uur door hiPSC-expansiemedium (1,5 ml/putje).
  14. Verander het medium dagelijks totdat de cellen een samenvloeiing van 80% bereiken. Controleer de celmorfologie en koloniegrootte routinematig om er zeker van te zijn dat er geen spontane differentiatie optreedt. Gooi de cultuur weg en start opnieuw met een nieuwe batch hiPSC's als uitgebreide (>5%) spontane differentiatie wordt waargenomen.

2. EB-vorming (dag 0)

  1. Bereid op dag 0 het DMEM/F12-medium, het hiPSC-zaaimedium en de oplossing voor celloslating voor op 37 °C gedurende 20-30 minuten.
  2. Verwijder het kweekmedium van de plaat met 6 putjes en voeg de voorverwarmde oplossing voor celloslating toe (1,5 ml/putje). Incubeer de plaat 5-7 minuten bij 37 °C.
  3. Breng de plaat over naar de bioveiligheidskast, tik op de plaat om hiPSC-kolonies los te maken en breek de aggregaten.
  4. Breng de celsuspensie over in een buisje van 15 ml. Voeg 4,5 ml DMEM/F12 medium toe. Spuit het mengsel voorzichtig op en neer met behulp van een serologische pipet van 10 ml om de cellen te dissociëren tot een eencellige suspensie. Vermijd het genereren van bubbels.
  5. Centrifugeer op 100 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te verzamelen.
  6. Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen voorzichtig met 1 ml hiPSC-zaaimedium met behulp van een P1000-pipet.
  7. Meng 10 μL celsuspensie met 10 μL trypanblauwe oplossing voor het tellen van cellen. Breng 10 μL van het mengsel over op het plaatje van de hemacytometer en dek het af met een dekglaasje. Monteer de schuif op de houder en plaats deze in de geautomatiseerde cellenteller. Nadat het instrument de focus heeft gevonden, drukt u op de Capture-knop en gebruikt u de LIVE-celdichtheidsmeting om de concentratie van de hiPSC-suspensie te bepalen.
  8. Zaai de cellen in de ultra low-attachment ronde bodem microtiterplaat met een dichtheid van 2,7 × 105 cellen/putje om 500-1.000 cellen per EB te verkrijgen.
  9. Voeg 2 ml hiPSC-zaaimedium toe aan elk putje en meng de oplossing voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.
  10. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.

3. Vasculaire differentiatie (dag 1 - 5)

  1. Bereid op dag 1 het mesoderm inductiemedium (MIM) voor zoals beschreven in tabel 3 en tabel 4 en verwarm het voor op 37 °C gedurende 20 minuten. Het MIM-medium moet vers worden gemaakt.
  2. Gebruik een P200-pipet om het medium voorzichtig uit de microtiterplaat op te zuigen zonder de EB's aan de onderkant te verstoren.
  3. Voeg langzaam 2,5 ml MIM toe met behulp van een P200-pipet. Kweek de EB's in MIM bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 dagen.
  4. Vervang op dag 3 het medium voorzichtig door voorverwarmd, vers gemaakt 2,5 ml van het vasculaire differentiatiemedium 1 (VDM1, tabel 5) zonder de EB's op de bodem van de microwell te verstoren. Kweek de cellen nog 2 dagen bij 37 °C met 5% CO2 .

4. Hydrogel inbedding (dag 5)

  1. Bereid het collageen I-mengsel voor zoals beschreven in tabel 6. Plaats een tube van 50 ml op ijs en voeg vervolgens collageen I-oplossing, H2O, 10× DMEM/F12-medium, natriumbicarbonaat en HEPES toe. Meng grondig door de tube voorzichtig te schudden. Voeg druppelsgewijs 1 M NaOH-oplossing toe terwijl u de gemengde oplossing schudt om de pH-waarde in te stellen op 7,3 en controleer de pH-waarde van het mengsel met een pH-meter.
    NOTITIE: Alle oplossingen moeten voor gebruik worden voorgekoeld op ijs. Voer de procedure de hele tijd uit op ijs in de bioveiligheidskast. Het toevoegen van de NaOH-oplossing is van cruciaal belang en snelle dispersie om een homogene oplossing te maken is nodig om lokale uitharding van collageen I te voorkomen. Het volume NaOH kan variëren op basis van het lotnummer van de gebruikte collageen I-oplossing. Niet krachtig pipetteren om te mengen, omdat schuifspanning ongewenste voorharding kan veroorzaken.
  2. Bereid het collageen I-basaal membraanmatrixmengsel voor zoals beschreven in tabel 7. Voeg 1,25 ml basale membraanmatrix toe aan het collageen I-mengsel van 5 ml bereid uit stap 4.1. Meng de oplossing voorzichtig door de tube te schudden.
  3. Leg een bord met 12 putjes 2 minuten op ijs.
  4. Voeg het collageen I-basaal membraanmatrixmengsel langzaam toe aan de plaat met 12 putjes (1,5 ml/putje) met behulp van de tips met brede boring. Zorg ervoor dat het mengsel gelijkmatig wordt verdeeld.
  5. Zet de plaat 2 uur in de incubator van 37 °C om de eerste laag hydrogel te laten stollen.
  6. Bewaar het resterende collageen I-basaal membraanmatrixmengsel op ijs voor later gebruik.
  7. Breng ~60 celaggregaten over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en koel de buis 5 minuten af op ijs. Verwijder het medium voorzichtig met een P200 pipetpunt.
    LET OP: Start deze stap 1,5 uur na stap 4.5.
  8. Voeg druppelsgewijs 1,5 ml collageen I-basaal membraanmengsel toe aan de aggregaten en meng ze voorzichtig met behulp van P200-pipetpunten met brede doorlaat.
  9. Breng de plaat met de eerste laag hydrogel van de incubator (stap 4.5) over naar de bioveiligheidskast.
  10. Voeg 1,5 ml van de aggregaatsuspensie toe aan de uitgeharde laag. Schud de plaat voorzichtig om de aggregaten gelijkmatig te verdelen. Vermijd het genereren van bubbels.
  11. Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende nog 2 uur.
  12. Bereid het vasculaire differentiatiemedium 2 (VDM2; Tabel 8) en verwarm het medium voor gebruik 20 minuten voor in een waterbad van 37 °C.
  13. Voeg 2 ml VDM2 toe aan elk putje en kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 .
  14. Vervang het medium elke 3 dagen door voorverwarmde, vers gemaakte VDM2.
    OPMERKING: (Optioneel) Vasculaire organoïden kunnen uit het gelmengsel worden vrijgemaakt door de gel met een injectiespuit te verwijderen. De vasculaire organoïden die uit de gel worden gehaald, kunnen afzonderlijk worden onderhouden in een plaat met 96 putjes met VDM2 (200 μL/putje). Vervang het medium elke 2-3 dagen.

5. 3D Immunofluorescerende test

  1. Vasculaire organoïden zouden ongeveer op dag 13 volwassen moeten worden. Voor organoïden die in de hydrogel zijn ingebed, zuigt u het medium voorzichtig op en wast u het driemaal met 2 ml PBS (telkens 10 min). Voor organoïden die uit de gel zijn gehaald (na stap 4.14), verzamel 6-10 organoïden in een microcentrifugebuisje van 2 ml, zuig de media op en was ze drie keer (elk 10 minuten) met 2 ml PBS.
  2. Voeg 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan het monster en incubeer een nacht bij 4 °C met paraffinefilmafdichting.
  3. Verwijder de PFA-oplossing en was het monster vier keer met 2 ml PBS (telkens 15 min).
  4. Voeg 2 ml blokkeerbuffer toe (tabel 9) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de blokkeerbuffer en voeg 1,5 ml primaire antilichamen toe (zie de materiaaltabel voor informatie over antilichamen; antilichamen moeten in de blokkeerbuffer worden verdund). Incubeer het monster met primaire antilichamen bij 4 °C gedurende 2 dagen met zacht schudden.
    OPMERKING: Het primaire antilichaam (CD31, PDGFRβ en ERG1) wordt aanbevolen om in de blokkeerbuffer te worden verdund in een verhouding van 1:400 (zie Materiaaltabel voor meer informatie).
  6. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was zes keer met 2 ml PBST gedurende 1 uur.
  7. Voeg 2 ml secundaire antilichamen toe (zie Materiaaltabel voor de informatie over antilichamen; antilichamen moeten worden verdund in PBST) aan het monster. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer gedurende 2 dagen bij 4 °C met zacht schudden.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het secundaire antilichaam te verdunnen in PBST in een verhouding van 1:1000 (zie Materiaaltabel voor meer informatie). Houd de plaat tijdens het incuberen uit de buurt van het licht en was daarna vanaf deze stap.
  8. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was zes keer met 2 ml TBST (telkens 1 uur). Voeg DAPI (1 μg/ml) toe aan de wasbuffer die wordt gebruikt voor de laatste wasstap als kleuring van de kernen nodig is.
  9. Snijd voor deze in gel ingebedde organoïden de gel in 4 stukken en breng ze voorzichtig over in microcentrifugebuisjes van 2 ml met een spatel. Voor de opgehaalde organoïden verwijdert u de wasbuffer.
  10. Gebruik doekjes om de resterende oplossing op te nemen zonder de gel of de organoïden aan te raken.
  11. Voeg 2 ml in water oplosbaar weefselzuiverend reagens (brekingsindex = 1,49) toe aan elk buisje. Incubeer de monsters met klaringsreagens bij kamertemperatuur in het donker totdat de organoïden helder worden (meestal een nacht). Schud de monsters niet.
  12. Breng de organoïden met het klaringsreagens voorzichtig met een spatel over naar het midden van de schaal met glazen bodem.
  13. Dek de organoïden of het gelstuk af met een dekglaasje van 24 mm × 24 mm.
  14. Duw het dekglaasje voorzichtig naar beneden totdat het plat ligt en klem de monsters vast met de glazen bodem.
  15. Verwijder het overtollige klaringsreagens in de schaal en plak het dekglaasje af met nagellak.
  16. Gebruik voor 3D-beeldvorming een confocale microscoop met een 10× objectief. Gebruik tegelscan en Z-stack-scan om volledige afbeeldingen van organoïden te verkrijgen.

Resultaten

Figuur 1A geeft het schema van dit protocol weer, inclusief de belangrijkste componenten die in elke fase worden gebruikt. De differentiatie begon met de EB-vorming, gevolgd door mesoderminductie en specificatie van vasculaire afstamming (Figuur 1B-D). De aggregaten werden in de loop van de tijd groter en minder bolvormig. Organoïden begonnen op dag 5 ruwe randen te vertonen. Na ingebed in het collageen I-basale membraanmatrixmengsel, ontsproten vasculaire endotheelcellen en pericyten en ontgroeiden ze al op dag 7 om complexe vasculaire netwerken te vormen (Figuur 1E). Omdat het belangrijkste doel van deze gewijzigde methode is om de variaties tussen verschillende generatiebatches te minimaliseren, hebben we de EB-grootte van twee onafhankelijke batches gemeten, en zowel groottemetingen als de statistische analyse bevestigden de consistentie en uniformiteit met deze methode (Figuur 1F).

Om de vasculaire differentiatie te valideren, werden organoïden verzameld op dag 5 voordat ze werden ingebed en gekleurd met vasculaire markers, waaronder CD31, ERG1 en PDGFRβ. De organoïden brachten CD31, ERG1 en PDGFRβ tot expressie (Figuur 2), wat wijst op de aanwezigheid van vasculaire endotheelcellen en pericyten.

Na het opruimen van het weefsel werden de vasculaire netwerken geanalyseerd met immunofluorescentiemicroscopie op volledige schaal (Figuur 3A). Rijpe organoïden werden gekleurd met CD31, ERG1 en PDGFRβ op dag 17 (figuur 3B, monster in het gelblok) en dag 28 (figuur 3C, het monster werd individueel uit het gelblok gehaald en gekweekt in een plaat met 96 putjes; merk op dat het vasculaire netwerk aan de randen de sferoïden omwikkelde in plaats van radiaal uit te zetten nadat het uit het gelblok was gehaald).

figure-results-1
Figuur 1: Generatie van vasculaire organoïden. (A) Schema van de stappen en tijdlijn voor het genereren van vasculaire organoïden. (B-E) Representatieve heldere veldbeelden van vasculaire organoïden in verschillende stadia. Schaalbalken: 100 μm. (F) Statistische analyse in EB-grootte van twee verschillende EB-generatiebatches met behulp van de microtitermethode die in dit werk wordt gepresenteerd. Voor EB-generatie werden 1.000 cellen per microwell gebruikt en voor batches 1 en 2 respectievelijk n = 42 en n = 40. Significantie wordt weergegeven als ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Immunokleuring van vasculaire organoïden vóór het inbedden van gel. Representatieve fluorescerende beelden van organoïden gekleurd met respectievelijk de endotheelmarkers (A) CD31 (groen) en (B) ERG1 (groen) en (C) de pericytmarker, PDGFRβ (groen). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaal balken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immunofluorescerende karakteriseringen van het vasculaire netwerk in vasculaire organoïden. (A) Een representatieve afbeelding toont in gel ingebedde vasculaire organoïden in de glazen schaal na weefselopruiming. De organoïden waren transparant maar zichtbaar onder een UV-licht van 385 nm. (B) Een representatief 3D-beeld van de hele montage van een vasculaire organoïde op dag 17. De vasculaire organoïde werd gekleurd met DAPI (blauw), de vasculaire endotheelcelmarker CD31 (groen) en de perocytenmarker PDGFRβ (magenta). (C) Een representatieve 3D-beeldvorming van een opgehaalde vasculaire organoïde op dag 28, gekleurd met de endotheelmarkers CD31 (rood) en ERG1 (groen). Schaalbalken: 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

hiPSC uitbreiding medium500 ml
mTeSR Plus basaal medium400 ml
mTeSR Plus supplement100 ml
Gentamicine (50 mg/ml)1 ml

Tabel 1: Samenstelling van het hiPSC-expansiemedium.

hiPSC zaaimiddel20 ml
PSC-uitbreidingsmiddel20 ml
Chromaan 1 (100 μM)10 μL
Emricasan (1 mM)30 μL
Polyamine supplement (1000x)20 μL
trans-ISRIB (1 mM)14 μL

Tabel 2: Samenstelling van het hiPSC-zaaimedium.

N2B27 gemiddeld100 ml
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement48,6 ml
Neurobasaal medium48,6 ml
GlutaMAX supplement (100x)0,5 ml
MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (NEAA, 100x)0,5 ml
2-Mercaptoethanol (1000x)0,1 ml
Gentamicine (50 mg/ml)0,1 ml
N2 supplement (100x)0,5 ml
B27 supplement minus vitamine A (50x)1 ml
Heparine, 4 kU/ml0,1 ml

Tabel 3: Samenstelling van het medium N2B27.

Mesoderm inductie medium (MIM)3 ml
N2B27 gemiddeld3 ml
BMP4 (100 ng/μl)0,9 μL
CHIR99021 (12 mM)3 μL

Tabel 4: Samenstelling van mesoderm inductiemedium (MIM).

Vasculaire differentiatie medium 1 (VDM1)3 ml
N2B27 gemiddeld3 ml
Forsklin (12 mM)0,5 μL
VEGFA (100 ng/μl)3 μL

Tabel 5: Samenstelling van vasculair differentiatiemedium 1 (VDM1).

Collageen I mengsel5 ml
Collageen I (3,61 g/ml)2,77 ml
10x DMEM/F12 gemiddeld0,5 ml
Natriumbicarbonaat, 7,5%0,5 ml
HEPES, 1 M0,5 ml
H2O0,73 ml
NaOH, 1M75 μL

Tabel 6: Samenstelling van het collageen I-mengsel.

Collageen I - basaal membraan matrix mengsel6,5 ml
Collage I mengsel5 ml
Matrigel (10 mg/ml)1,5 ml

Tabel 7: Samenstelling van het collageen I-basaal membraanmatrixmengsel.

Vasculaire differentiatie medium 2 (VDM2)5 ml
DMEM/F-12, GlutaMAX™ supplement3,67 ml
Gentamicine (50 mg/ml)5 μL
MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (NEAA, 100X)50 μL
2-Mercaptoethanol (1000x)5 μL
Heparine, 4 kU/ml5 μL
Knock-out Serum Vervanging0,75 ml
FBS (Medische Zaken)0,5 ml
VEGFA (100 ng/μl)5 μL
FGF2 (100 ng/μl)5 μL

Tabel 8: Samenstelling van vasculair differentiatiemedium 2 (VDM2).

Buffer blokkeren50 ml
Ezel serum2,5 ml
Tween 200,25 ml
Triton X-1000,25 ml
Natriumdeoxycholaatoplossing (1%, gew./v)0,5 ml
PBS46,5 ml

Tabel 9: Samenstelling van de blokkeerbuffer voor immunokleuring.

Discussie

Het beschreven protocol omvat twee belangrijke aanpassingen voor een homogene en reproduceerbare generatie van hoogwaardige vasculaire organoïden. De eerste aanpassing is het gebruik van een microtiterplaat om een betere controle van de EB-uniformiteit mogelijk te maken. Als uitgangspunt van vasculaire differentiatie is de grootte van EB's van cruciaal belang, omdat het het lot van stamcellen en de differentiatie-werkzaamheid naar verschillende afstammingslijnen reguleert. Variaties in EB-grootte leiden meestal tot heterogene organoïden met een inconsistente structuur en organisatie16,17. De conventionele EB-generatiemethode door hiPSC-kolonies 11,12 op te tillen maakt het moeilijk om de celaantallen voor individuele EB's te controleren en resulteert meestal in heterogene EB-vorming. In dit protocol worden hiPSC's gedissocieerd in eencellige suspensie en opnieuw geaggregeerd in microwells16,18. Door het aantal zaaicellen aan te passen, kan de grootte van EB's worden geoptimaliseerd om consistente en effectieve mesodermale differentiatie te garanderen. Voor het zaaien van microtiwell worden 500-1.000 cellen gebruikt, en dit kan relatief kleine EB's opleveren (met een diameter van 100-200 μm). Deze methode zou reproduceerbaar uniforme EB's kunnen genereren met de gewenste groottes van batch tot batch (Figuur 1F) en tussen verschillende cellijnen13. Sinds dag 0 is de morfologie van de EB in de loop van de tijd veranderd tijdens de differentiatie: de vorm wordt minder bolvormig en het oppervlak wordt ruwer (Figuur 1), maar het volume neemt niet significant toe. De morfologie van het 3D-vaatstelsel is afhankelijk van de inbeddingsdichtheid en de grootte van de ingebedde organoïden. Te grote (>500 μm) organoïden resulteren meestal in onvoldoende vasculaire celdifferentiatie, terwijl te kleine organoïden vaak een onderontwikkeld vaatstelsel hebben.

De tweede aanpassing is de integratie van de CEPT-cocktail om de levensvatbaarheid van hiPSC tijdens de EB-vorming te verbeteren. De levensvatbaarheid van de cellen is cruciaal, naast de kwaliteit van hiPSC-kolonies tijdens dit proces. Wanneer hiPSC's worden gedissocieerd tot een eencellige suspensie, wordt meestal de ROCK-remmer Y27632 toegevoegd om de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. Het is echter aangetoond dat Y27632 suboptimaal is voor hiPSC's met een lage dichtheid en ongewenste membraanstress kan veroorzaken, terwijl de CEPT-cocktail (samengesteld uit chromaan 1, emricasan, polyamines en trans-ISRIB) de celstress aanzienlijk zou kunnen verminderen en de levensvatbaarheid tijdens dit EB-vormingsproces zou kunnen verbeteren met hiPSC's in een lagere dichtheid15.

Voordat de organoïde in de gel wordt ingebed, worden de organoïden in de microtiterplaat bewaard en moet de mediumverandering voorzichtig zijn om mogelijke verstoring te voorkomen. Het is beter om de eerste 5 dagen een pipet van 200 μL te gebruiken om het medium te vervangen. Alle media die worden gebruikt voor het genereren van vasculaire organoïden moeten voor gebruik worden voorverwarmd. Vooral na het inbedden van gel kan het gebruik van koude media de basale membraanmatrix gedeeltelijk vloeibaar maken en de 3D-hydrogel-niche voor vasculaire netwerkvorming beïnvloeden. De inbedding, dichtheid en gelijkmatige verdeling van de organoïden zijn ook kritische factoren voor de vorming van vasculaire netwerken. Dichte inbedding van organoïden kan mogelijk leiden tot overmatige fusie van vasculaire netwerken, terwijl een lage inbeddingsdichtheid kan leiden tot onvoldoende netwerkvorming. Door 60-80 organoïden per putje te zaaien en de plaat direct na het toevoegen aan de eerste laag van de 3D-gel voorzichtig heen en weer te bewegen, kunnen deze organoïden beter worden verdeeld.

Dit protocol kan verder worden aangepast voor verschillende toepassingen. Bloed-hersenbarrière (BBB) -signalen kunnen bijvoorbeeld worden toegepast om de vasculaire endotheelcellen verder te beperken van de vorming van de BBB-interface 19,20,21,22,23,24,25. De samenstelling van de 3D-hydrogel kan ook worden aangepast. Fibrine en vitronectine worden bijvoorbeeld vaak gebruikt voor de vorming van vasculaire netwerken in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. De basale membraanmatrix zonder collageen I kan worden gebruikt voor inbedding, wat het inbeddingsproces kan vereenvoudigen en verschillende mechanische prikkels kan geven.

Hoewel de vasculaire organoïden die uit dit protocol worden gegenereerd, mogelijk kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering of toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen, is een beperking dat deze organoïden voornamelijk het capillaire vaatstelsel recapituleren met weinig grotere bloedvaten. Voor onderzoek dat zich richt op grotere bloedvaten, kan het genereren van organoïden extra mechanische stimuli vereisen 24,31,32,33. Het verbinden van de vasculaire organoïden met recirculatie, zoals transplantatie naar dieren34 of micro-/macrofluïdische apparaten met perfusiepompen33, zou dit mogelijk kunnen verhelpen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.

Dankbetuigingen

We willen graag de technische ondersteuning erkennen van de confocale en gespecialiseerde microscopie Shared Resource van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University, gedeeltelijk gefinancierd door NIH Center Grant (P30CA013696). Dit werk wordt ondersteund door NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Mercaptoethanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152reconstitute met 0.25 mL 50% glycerol,  bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar, verdunningsverhouding voor gebruik: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147reconstitute met 0.25 mL 50% glycerol,  bewaar bij -20°C gedurende maximaal 1 jaar, verdunningsverhouding voor gebruik: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x)Gibco12587010ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C, vermijd vries-ontdooicycli
BMP4ProSpecCYT-081reconstitute met steriele ddH2O bij een concentratie van 100 ng/µL, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
CD31 antibody abcamab28364verdunningsverhouding: 1:400
CentrifugeEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10maak de voorraadoplossing bij 12 mM met DMSO, en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
Chroman 1Tocris7163/10maak de voorraadoplossing bij 100 µM met DMSO, en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
Collagen I Corning40236
Confocal MicroscopeNikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL automated cell counterThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018
DMEM/F-12, powderGibco12500062maak 10x stockoplossing met biograde ddH2O en sterilise deze met een 0.2 µm filter. Bewaar bij 4 °C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGmaak de voorraadoplossing bij 1 mM met DMSO, en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
ERG antibodyCell Singali Technology97249verdunningsverhouding: 1:400
Fetal Bovine Serum - PremiumAtlanta BiologicalsS11150ontdooi bij 4 °C  en verdeel in aliquots, bewaar bij  -20 °C gedurende maximaal vijf jaar, of bewaar bij 4 °C gedurende maximaal een maand
FGF2ProSpecCYT557reconstitute met steriele ddH2O bij een concentratie van 100 ng/µL, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099reconstitute met DMSO bij een concentratie van 12 mM, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX supplement (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUreconstitute met steriele ddH2O bij een concentratie van 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatorThermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco10828028ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -20°C, vermijd vries-ontdooicycli
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -80°C, vermijd vries-ontdooicycli
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x)Gibco11140050
Molecular Biology Grade WaterCorning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -20°C, vermijd vries-ontdooicycli
N2 supplement (100x)Gibco17502048ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -20°C, vermijd vries-ontdooicycli
NaOH solution (1 M)Cytiva HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121reconstitute met 10 mL steriele ddH2O, bewaar bij 4 °C gedurende maximaal twee weken
paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713Sverdun met PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ antibodyR&DAF385verdunningsverhouding: 1:400
polyamine supplement (1000x)Sigma-AldrichP8

Referenties

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

Herprints en machtigingen

Tags

Vasculaire organo denhumane iPSC sorgano dendifferentiatiemicrowell kweekCEPT cocktail3D immunofluorescentieweefselklaringlight sheet microscopieziektemodellering
Vasculaire organoïdegeneratie uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.