Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onthulling van xenobiotisch transport en effecten in geïsoleerde mitochondriën: inzichten uit respirometrische en enzymatische tests

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67146

⸱

7 maart 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie introduceert een methodologie voor het bestuderen van xenobiotische effecten op de mitochondriale functie via respirometrische en enzymatische testen. Het onderzoekt de modulatie van de elektronentransportketen in verschillende soorten en biedt inzichten voor de gerichte ontwikkeling van biopesticiden tegen door insectenvectoren overgedragen ziekten.

Samenvatting

Mitochondriën worden vaak de krachtpatser van de cel genoemd vanwege hun cruciale rol bij de energieproductie via de elektronentransportketen (ETC). Hun betekenis reikt echter veel verder dan energieproductie. Ontregeling van mitochondriale bio-energetica kan intracellulaire cascades veroorzaken die van invloed zijn op de gezondheid en de cellulaire functie. Gezien hun fysiologische belang is er een groeiende belangstelling voor het onderzoeken van het farmacologische potentieel van de mitochondriale functie voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën en bioproducten. Het moduleren van mitochondriale bio-energetica zou innovatieve benaderingen kunnen bieden om uitdagingen zoals neurodegeneratieve aandoeningen, stofwisselingsziekten en kanker aan te pakken, en om bioproducten te ontwikkelen voor de bestrijding van plagen en door vectoren overgedragen ziekten.

Dit werk presenteert een methode voor het beoordelen van de effecten van xenobiotica op de elektronentransportketen (ETC) met behulp van verschillende substraten, waaronder glutamaat en NADH voor complex I, succinaat voor complex II en cytochroom c (zowel geoxideerd als gereduceerd) voor complexen III en IV. Met deze methodologie kan de activering of remming van elektronentransport door mitochondriale complexen worden geëvalueerd met behulp van een respirometer en spectrofotometer. De mitochondriën kunnen afkomstig zijn van geïsoleerde mitochondriën, gefragmenteerde cellen of gehomogeniseerd weefsel van verschillende soorten.

In het laboratorium is de mitochondriale functie geanalyseerd bij Aedes aegypti - en Wistar-ratten, maar deze methode is ook toepasbaar op andere soorten, zoals Rhipicephalus microplus en Rhodnius prolixus. Deze benadering vormt de basis voor theorieën over het bestaan van ontkoppelingseiwitten en soortspecifieke oxideerbare substraatvoorkeuren die worden beïnvloed door hun unieke energetische eisen. Recente bevindingen bieden waardevolle inzichten in innovatieve ontwerpstrategieën voor bio-insecticiden die gericht zijn op de mitochondriale functie, met een aanzienlijk potentieel voor het effectief beheersen van door vectoren overgedragen ziekten en plagen.

Inleiding

Mitochondriën zijn altijd de krachtcentrale van cellen genoemd vanwege hun chemische energieopwekking tijdens het oxidatieve fosforyleringsproces 1,2. Naast hun belangrijkste metabolische kernfuncties, zijn mitochondriën ook betrokken bij vele andere cellulaire processen, variërend van intracellulaire Ca2+-regulatieniveaus, ontstekingsprocessen en productie van reactieve zuurstofsoorten tot inductieprocessen van celdood3. Mitochondriale bio-energetica en hun ontregeling zijn in verband gebracht met intracellulaire processen die de cellulaire functie en de algehele gezondheid beïnvloeden. Dit heeft geleid tot een groeiende belangstelling voor onderzoek naar het farmaceutische potentieel van het richten op de mitochondriale functie om innovatieve therapieën en veilige bioproducten te ontwikkelen 4,5,6. Bovendien is het begrijpen van het ingewikkelde samenspel van mitochondriale processen en hun impact op de cellulaire functie cruciaal voor het ontwikkelen van gerichte therapieën en het bieden van kansen voor het ontwerpen van bioproducten om door vectoren overgedragen ziekten en plagen te bestrijden 7,8.

Het richten op specifieke componenten van de elektronentransportketen met xenobiotica is naar voren gekomen als een strategie om de mitochondriale functie voor de generatie van biopesticiden te moduleren. Van natuurlijke en synthetische verbindingen in formuleringen van pesticiden, zoals op nanodeeltjes gebaseerde mitochondriën-gerichte pesticiden, is aangetoond dat ze de mitochondriale functie beïnvloeden door het mitochondriale potentieel en de ATP-synthese in S. frugiperda9 te verminderen.

Bovendien zijn de meeste carbamaten en producten op basis van pyrethroïden gerapporteerd als complex I-remmers bij muggen; hun langdurige blootstelling heeft echter geleid tot enkele pyrethroïde-resistente populaties in Anopheles gambiae, vaak gerelateerd aan verhoogde niveaus van P450's die deze substraten kunnen metaboliseren10,11. Evenzo zijn planten en hun etherische oliën, extracten en secundaire metabolieten gedocumenteerd als potentiële insecticiden met een breed scala aan mortaliteit in verschillende insectenstadia12,13. De insecticide-activiteit van deze natuurlijke verbindingen kan verband houden met de remming van het elektronentransport op een specifiek punt in de mitochondriale ademhalingsketen door de productie van reactieve zuurstofsoorten, het mitochondriale potentieel ΔΨm en de ATP-synthese te moduleren die celdoodprocessen kan veroorzaken 6,8.

Natuurlijke verbindingen, als bronnen voor de formulering van pesticiden, en hun effecten op mitochondriën spelen een cruciale rol bij het ontwerp van nieuwe en veilige biopesticiden. In deze context beschrijft dit manuscript een methodologie om het vermogen van xenobiotica te identificeren om elektronentransport door mitochondriale complexen te activeren of te remmen. Deze alomvattende benadering maakt het mogelijk om de effecten van xenobiotica op de mitochondriale functie nauwkeurig te meten met behulp van een verscheidenheid aan substraten, waarbij zowel respirometrie- als spectrofotometriemethoden worden gebruikt. Deze methodologie is toegepast om de mitochondriale functie van belangrijke vectorsoorten, waaronder Aedes aegypti, te analyseren, wat heeft geleid tot het theoretiseren van de aanwezigheid van ontkoppelingseiwitten en verschillende oxideerbare substraatvoorkeuren die specifiek zijn voor elke soort.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de ethische commissie "Comité de ética en investigación científica CEINCI": ethische commissie voor wetenschappelijk onderzoek van de Industriële Universiteit van Santander. Bovendien voldeden deze tests aan de Arrive-richtlijnen en volgden ze de Colombiaanse wet 84 van 1989 (hoofdstuk IV, art. 23-26) en resolutie 8430 (1993, titel IV, art. 83-93) die dierproeven in Colombia reguleert.

OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om het hoofdstuk over oxidatieve fosforylering van elk biochemieboek te lezen voordat u met dit protocol begint.

1. Reagentia en oplossingen

  1. Om de mitochondriën van de lever van ratten te isoleren, bereidt u 250 ml mitochondriënisolatiebuffer voor: 250 mM D-mannitol, 10 mM HEPES pH 7,2 en 1 mM EGTA. Neem 50 ml isolatiebuffer eruit (dit wordt isolatiebuffer zonder BSA genoemd) en voeg vervolgens 0.2 g BSA toe aan de andere 200 ml (dit wordt isolatiebuffer met BSA genoemd).
  2. Om de larven van Aedes aegypti te homogeniseren, bereidt u 100 ml buffer voor: 250 mM sucrose, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA pH 7,2.
  3. Bereid de reactiebuffer voor: 80 mM natriumfosfaatbufferoplossing, pH 7,4, 50 μM EDTA.
  4. Bereid een voorraad reagentia voor die worden gebruikt voor enzymatische activiteiten bij pH 7,2 zoals hieronder beschreven: 25 mM NADH (vers bereid voor elke test), 2 M natriumsuccinaat, 4 mM cytochroom c (vers bereid voor elke test), 200 μM rotenon, 0,5 mM KCN, 6 mM 2,6-dichloorfenolindofenol (DCPIP), 100 mM fenazinemethosulfaat (PMS) en 60 mM kaliumferricyanide.
    OPMERKING: Ultrapuur water met een soortelijke weerstand van 18,2 MΩ·cm bij 25 °C werd gebruikt voor alle experimenten en de bereiding van reagentia. Dit water werd gegenereerd met behulp van een Milli-Q-zuiveringssysteem, dat ervoor zorgt dat organische, anorganische en microbiële verontreinigingen worden verwijderd tot niveaus onder detecteerbare limieten, waardoor het geschikt is voor zeer gevoelige biochemische en moleculair-biologische toepassingen.

2. Leverdissectie, homogenisatie en isolatie van mitochondriën uit de lever van ratten

  1. Voordat u begint, plaatst u alle materialen en buffers op ijs en zorgt u ervoor dat alle materialen tijdens de hele test ijskoud zijn om mitochondriale schade te voorkomen.
  2. Plaats 10 ml mitochondriën isolatiebuffer in een ijskoude kegelbuis.
  3. Euthanaseer de mannelijke Wistar-rat door cervicale onthoofding, waarbij het gebruik van CO2 wordt vermeden dat de ademhalingstesten kan verstoren. Hiervoor heeft het Comité voor Ethiek in Wetenschappelijk Onderzoek van de Industriële Universiteit van Santander (CEINCI) de methoden op resolutie 13 van 2022 goedgekeurd.
    OPMERKING: Ratten mogen niet meer dan 170 g wegen; Vet kan ook invloed hebben op ademhalingsanalyses.
  4. Maak een incisie (ongeveer 4-5 cm) met een steriel scalpel door het buikgedeelte van de rat.
  5. Ontleed de lever volledig zodra de buikstreek zichtbaar is. De rattenlever is een meerlobbig orgaan, donkerrood ca. 10 cm x 5 cm.
  6. Plaats de lever voorzichtig in de ijskoude isolatiebuffer en spoel twee keer met dit medium.
  7. Hak de lever (grootte kleiner dan 1 cm) fijn met een scherpe schaar in een petrischaaltje met 10 ml isolatiemedium.
  8. Doe de oplossing in de Potter Elvehjem weefselhomogenisatorbuis en homogeniseer deze zorgvuldig ten minste tien keer, lage snelheid (~390 tpm).
  9. Breng de oplossing over in een conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 600 x g bij 4 °C.
  10. Giet het bovenstaande na het centrifugeren voorzichtig in een nieuwe conische buis. Gooi de pellet weg met een deel van het weefsel, bloed en intacte cellulaire componenten.
  11. Vul de buis met meer isolatiebuffer (~35 ml) en centrifugeer op 6000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  12. Gooi na het centrifugeren het bovenstaande weg en suspendeer de pellet (mitochondriën) voorzichtig opnieuw in een nieuwe isolatiebuffer zonder BSA.
    OPMERKING: Voor mitochondriale resuspensie wordt aanbevolen om een zachte borstel te gebruiken.
  13. Centrifugeer vervolgens bij 7000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het bovenstaande weg en suspendeer de geïsoleerde mitochondriën opnieuw in 2 ml isolatiebuffer zonder BSA.
  14. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-methode of vergelijkbaar14.

3. Homogenisatie van Aedes aegypti-kolonie en larven.

OPMERKING: Voor deze procedure werd de Ae. aegypti-kolonie gehouden in kweekkooien (40 cm × 40 cm × 40 cm) onder insectenomstandigheden zoals vochtigheid (70% ± 5%), fotoperiode (12:12) en temperatuur (27 ± 5 °C). De eieren werden verzameld op filtreerpapier.

  1. Zorg ervoor dat de eieren een week voor het experiment worden uitgebroed in trays met gefilterd en gedechloreerd water. Identificeer de instar aan de hand van het vervellingsproces in de larvencyclus. Observeer elk vervellingsproces om de status L1, L2 en L3 te controleren. Wanneer de larve L3 binnengaat, wacht dan maximaal 12 uur om het materiaal te verzamelen.
  2. Verzamel minstens 100 Ae. aegypti-larven bij instar L3-L4 in chloorvrij water (~30 ml water). Neem de larven vast met een pasteurpipet.
  3. Filtreer de larven met filtreerpapier, spoel de verzamelde larven af en suspendeer ze opnieuw in de Aedes aegypti-homogenisatiebuffer (~2 ml).
  4. Breng de oplossing met larven over in de Potter Elvehjem weefselhomogeniseerbuis en homogeniseer deze voorzichtig minstens tien keer bij ~390 tpm.
  5. Breng het gehomogeniseerde weefsel over en filtreer het door een glaswolspuit om grote exoskeletresten te verwijderen.
  6. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-methode of vergelijkbaar15.
    OPMERKING: Het is niet nodig om mitochondriën te isoleren van muggenlarven; Het is mogelijk om het effect van xenobiotica te evalueren met behulp van het eiwitextract dat in deze stap wordt verkregen.

4. Bepaling van de effecten van xenobiotica op de mitochondriale elektronentransportketen

OPMERKING: Dit protocol is ontworpen om het effect van xenobiotica op mitochondriale bio-energetica op geïsoleerde mitochondriën uit gehomogeniseerd weefsel van rattenlever en insecten te evalueren.

De testen zijn onderverdeeld in twee: polarografisch (NADH en succinaatoxidase) en spectrofotometrisch (NADH-dehydrogenase - complex I, succinaatdehydrogenase - complex II, cytochroom-c-reductase - complex III en cytochroom-c-oxidase - complex IV).

  1. Polarografische testen: Gebruik hiervoor respirometrie met hoge resolutie om de volledige oxidatie van NADH en succinaat te meten door O2-consumptie , en rapporteer resultaten als NADH- en succinaatoxidase.
    1. Kalibreer het instrument elke dag voordat u met de tests begint. Deze stap kan variëren, afhankelijk van de gebruikte oxygraaf. Volg de instructies van de fabrikant.
      1. Voeg voor Oroboros-kalibratie reactiemedium toe aan de kamers met een overmaat van ten minste 0,2 ml boven het experimentele kamervolume (2 ml), om de kamer en het injectiecapillair met medium te vullen.
    2. Schakel de roerders in na gemiddelde toevoeging.
    3. Wacht tot het signaal van de zuurstofconcentratie stabiliseert en neem het op.
    4. Voeg voor zuurstofloze kalibratie mitochondriën, celsuspensieën, bakkersgist of dithioniet (bakkersgist wordt aanbevolen) toe die de zuurstofuitputting mogelijk maken, en registreer deze. Wacht tot het signaal achtergrondniveaus bereikt (meestal ± 2 pmol/ml/s voor het O2k-systeem).
    5. Voer NADH- en succinaatoxidase-activiteiten uit door het zuurstofverbruik te bewaken bij het toevoegen van reactiebuffer, 0,1 mg eiwit (mitochondriale of gehomogeniseerde larven) en het substraat (0,17 mM NADH of 10 mM natriumsuccinaat) aan de kamer.
    6. Gebruik elektronentransporteiwitremmers om te bevestigen dat het waargenomen zuurstofverbruik te wijten is aan de mitochondriale ademhalingsketen. De meest voorkomende zijn rotenon 1 μM en KCN 1mM16. Voeg in de oxygraafcel de reagentia toe volgens tabel 1 (de volgorde is belangrijk).
  2. Spectrofotometrische testen
    OPMERKING: Om het elektronentransport door de mitochondriale complexen te beoordelen, werden enzymatische tests uitgevoerd en gemeten met behulp van een spectrofotometer en kunstmatige elektronenacceptoren zoals PMS, DCPIP en cytochroom c. Het wordt aanbevolen om één enzym per dag te meten. Bereid buffers en reagentia ten minste één dag voor de tests voor. Sommige verbindingen zijn lichtgevoelig; zien Tabel 2 voor meer aanbevelingen.
    1. Voor NADH-dehydrogenase-activiteit bevatten de reactiesystemen 50 mM fosfaatbufferoplossing pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg/ml mitochondriaal eiwit, 1 μM rotenon en 1 mM KCN. Voeg in de spectrofotometercel de reagentia toe volgens tabel 2 (de volgorde is belangrijk)17. De aanbevolen stappen zijn als volgt:
      1. Bereid 100 ml bufferfosfaat gemengd met de EDTA en controleer nogmaals of de pH niet verandert. Bewaar de buffer in de koelkast, maar het is verplicht om deze tijdens de testen op kamertemperatuur (RT; ongeveer 25 °C) te bewaren.
      2. Bereid verse voorraadoplossingen van rotenon, KCN, NADH en kaliumferricyanide (stabiel tot 4 uur). Het voorgestelde volume is 1 ml geconcentreerde oplossingen (zie de eerste kolom van de tabel).
      3. Als de geteste verbinding een lage oplosbaarheid in water heeft, neem dan een extra controle op enzymactiviteit op in het experimentele ontwerp met alleen het oplosmiddel van de verbinding.
      4. Controleer eerst de NADH-dehydrogenase-activiteit door de reductie van kaliumferricyanide bij 420 nm. Bereken de concentratie aan de hand van de molaire extinctiecoëfficiënt van 1,04 mM-1·cm-1. De spectrofotometer heeft een optie om de maximale activiteit in een reactie te berekenen; Raadpleeg de gebruikershandleiding. Deel vervolgens de gerapporteerde activiteit door de eiwitconcentratie die wordt gebruikt om de specifieke activiteit van het enzym te verkrijgen.
    2. Evalueer de activiteit van succinaatdehydrogenase door 20 mM natriumsuccinaat en 1 mM fenazinemethosulfaat (PMS) met 60 μM 2,6-dichloorfenolindofenol (DCPIP) als kunstmatige elektronenacceptoren toe te voegen. Voeg in de spectrofotometercel de reagentia toe volgens tabel 3 (de volgorde is belangrijk)17. De aanbevelingen zijn als volgt:
      1. Bereid dezelfde buffer voor als gebruikt voor NADH-dehydrogenase. Houd het in dezelfde omstandigheden.
      2. Bereid verse voorraadoplossingen van Succinate, PMS en DCPIP. Het voorgestelde volume is 1 ml geconcentreerde oplossingen. Bereid PMS- en DCPIP-oplossingen voor op dezelfde dag van de test.
      3. Als de geteste verbinding een lage oplosbaarheid in water heeft, neem dan een extra controle voor enzymactiviteit op in het experimentele ontwerp.
      4. Bewaak de succinaatoxidatie door de reductie van DCPIP bij 600 nm. Bereken de concentratie aan de hand van de molaire extinctiecoëfficiënt van 21,0 mM−1·cm−1, volgens de wet van bier. Deel vervolgens de gerapporteerde activiteit door de eiwitconcentratie die wordt gebruikt om de specifieke activiteit van het enzym te verkrijgen.
    3. Meet de activiteit van cytochroom c-reductase (complex III) met behulp van NADH of succinaat als oxideerbare substraten. Met dit enzym gaat het elektronentransport van complex I (met behulp van NADH) of complex II (met succinaat) over naar ubiquinon en vervolgens naar complex III, dat de elektronen doorgeeft aan cytochroom c. Deze reactie wordt gevolgd door de reductie van cytochroom c. Bereid het reactiesysteem voor met 50 mM fosfaatbufferoplossing pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg mitochondriaal eiwit, 50 μM NADH en 0,1 mM KCN. Voeg in de spectrofotometercel de reagentia toe volgens tabel 4 (de volgorde is belangrijk)18. De aanbevelingen zijn als volgt:
      1. Bereid dezelfde buffer voor als gebruikt voor NADH-dehydrogenase. Houd het in dezelfde omstandigheden.
      2. Gebruik dezelfde NADH en KCN uit NADH-dehydrogenase.
      3. Als de geteste verbinding een lage oplosbaarheid in water heeft, neem dan een extra controle voor enzymactiviteit op in het experimentele ontwerp.
      4. Bewaak de cytochroom c-reductie bij 550 nm en bereken de concentratie aan de hand van de molaire extinctiecoëfficiënt van 19,8 mM-1,1/cm-1, volgens de wet van Beer. Deel vervolgens de gerapporteerde activiteit door de eiwitconcentratie die wordt gebruikt om de specifieke activiteit van het enzym te verkrijgen.
    4. Meet cytochroom c-oxidase (complex IV) uitgedrukt als cytochroom c-oxidase-activiteit. Bereid hiervoor een systeemreactie voor met 50 mM fosfaatbufferoplossing, pH 7,4, 2 mM EDTA en 0,1 mg mitochondriaal eiwit (Tabel 5). Voor deze enzymatische tests wordt cytochroom c verminderd door equimolaire hoeveelheden cytochroom c en natriumdithioniet te mengen, waardoor een volledige reductie van het cytochroom c wordt gegarandeerd.
    5. Haal het resulterende mengsel vervolgens door een verknoopte dextran-gelkolom met dezelfde fosfaatgebufferde oplossing als de mobiele fase. Kwantificeer vervolgens de verzamelde fracties met behulp van een spectrofotometer bij 550 nm19. De aanbevelingen zijn als volgt:
      1. Gebruik dezelfde buffer die wordt gebruikt voor NADH-dehydrogenase. Houd het in dezelfde omstandigheden.
      2. Als de geteste verbinding een lage oplosbaarheid in water heeft, moet een aanvullende controle op enzymactiviteit in de experimentele opzet worden opgenomen.
      3. Bewaak de cytochroom c-oxidatie bij 550 nm en bereken de concentratie aan de hand van de molaire extinctiecoëfficiënt van 19,8 mM−1·cm−1, volgens de wet van Beer. Deel vervolgens de gerapporteerde activiteit door de eiwitconcentratie die wordt gebruikt om de specifieke activiteit van het enzym te verkrijgen.
        OPMERKING: Een spreadsheetbestand met het proces van het berekenen van de specifieke activiteit van enzymen, gemeten aan de hand van zuurstofverbruik en spectrofotometrie, is opgenomen als aanvullend bestand 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alvorens de resultaten van dit protocol te analyseren, is het essentieel om iets te onthouden over de biochemie van de elektronentransportketen in de mitochondriën. Eerst levert NADH een paar elektronen aan de oxidatiereductiecentra in complex I. Daar begint het transport van elektronen die van complex I naar ubiquinon gaan, vervolgens naar complex III, dat ze doneert aan cytochroom c, en ten slotte naar complex IV, waar zuurstof de uiteindelijke elektronenacceptor is en het reduceert to...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een spectrofotometrische en polarografische methode met hoge resolutie O2 werd gebruikt om de effecten van xenobiotica op de mitochondriale functie te onderzoeken. De studie beoordeelde specifiek de impact van Cymbopogon flexuosus etherische olie en carvacrol op NADH- en succinaatoxidatie, evenals elektronentransport door de mitochondriale elektronentransportketen, met behulp van twee verschillende biologische modellen: geïsoleerde mitochondriën uit rattenlever en geh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" van de Universidad Industrial de Santander voor het financieren van het subsidienummer 3739 dat overeenkomt met het project "Formulering van een ixodicide en ixoafweermiddel ontworpen in een laboratorium en gevalideerd in het veld om tekenplagen bij runderen te voorkomen."

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,6-dichloorfenol-indofenolMerck119814Bereiden op dezelfde dag van gebruik.
Bradford reagensMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochroom cMerckC2506Fotogevoelig dek af met aluminiumfolie. In oplossing moet het in de vriezer worden bewaard.
D-mannitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Ethyleendiaminetetraazijnzuur tetranatriumzout dihydraatMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178In oplossing werkt het 2 weken goed.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Scientific 51119100
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Fenazinmethosulfaat MerckP9625Bereiden op dezelfde dag van gebruik.
Kaliumferricyanide Merck244023Bereiden op dezelfde dag van gebruik.
Potter Elvehjem weefselhomogenisatiebuis
RotenonMerck557368Oplosbaar in ethanol. Fotogevoelig dek af met aluminiumfolie. In oplossing moet het in de vriezer worden bewaard.
NatriumsuccinaatMerckS9637In oplossing moet het in de vriezer worden bewaard.
SucroseMerckS0389
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, gereduceerd DinatriumzouthydraatMerckN8129Fotogevoelig dek af met aluminiumfolie. In oplossing moet het in de vriezer worden bewaard.

Referenties

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Elektronentransportketenmitochondriële bioenergeticarespirometrische assayenzymatische assayisolatie van mitochondriënzuurstofverbruikNADH-dehydrogenaseactiviteitcytochroom c oxidase
Onthulling van xenobiotisch transport en effecten in geïsoleerde mitochondriën: inzichten uit respirometrische en enzymatische tests
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.