Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van chondrocyten en chondroprogenitoren met behulp van fibronectine-adhesie en migratoire assay

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67160

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van chondrocyten, van de fibronectine-adhesietest afgeleide chondroprogenitoren (FAA-CP's) en migrerende chondroprogenitoren (MCP's) uit menselijk gewrichtskraakbeen. Het omvat enzymatische spijsvertering, fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde assays voor het isoleren en karakteriseren van deze cellen.

Samenvatting

Chondroprogenitorcellen (CPC's), die onlangs zijn geïdentificeerd als een afzonderlijke subpopulatie, zijn veelbelovend vanwege hun mesenchymale eigenschappen, verhoogde chondrogenese en beperkte hypertrofische eigenschappen. De verrijking van voorlopercellen wordt bereikt door middel van differentiële fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde explantatietesten, waarbij van de Fibronectine-adhesietest afgeleide chondroprogenitors (FAA-CP's) en migrerende chondroprogenitors (MCP's) een superieur potentieel vertonen in vergelijking met chondrocyten. Dit artikel gaat dieper in op de details van het isoleren van cellen afkomstig van kraakbeen, namelijk chondrocyten en chondroprogenitors. Hoewel waardevolle inzichten uit onderzoek naar chondrocyten bijdragen aan ons begrip van kraakbeenherstel, zijn de voortdurende inspanningen gericht op het gebruik van chondroprogenitors en het onderzoeken van hun potentieel als alternatieve therapeutische benadering. Bovendien biedt dit methodologieartikel een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor het isoleren van drie specifieke celtypen uit kraakbeen: chondrocyten, FAA-CP's en MCP's. Door gestandaardiseerde procedures te volgen, vergemakkelijkt dit protocol de succesvolle extractie van deze celsubtypes. Het artikel is gebaseerd op uitgebreid onderzoek en richt zich op de ingewikkelde technieken die worden gebruikt bij het isoleren van de verschillende subsets en de geoptimaliseerde kweekomstandigheden die nodig zijn om hun culturen uit te breiden en te onderhouden. De methodologie omvat enzymatische isolatie van van menselijk gewrichtskraakbeen afgeleide chondrocyten, differentiële fibronectine-adhesie na sequentiële enzymatische vertering en op migratie gebaseerde explantatietesten om kraakbeencellen te verkrijgen.

Inleiding

De opkomst van celgebaseerde regeneratieve therapie vertegenwoordigt een belangrijke benadering voor de behandeling van kraakbeengerelateerde aandoeningen, zoals artrose (OA) en chondrale defecten1. Deze aandoeningen, gekenmerkt door de afbraak of verwonding van kraakbeen in de gewrichten, vormen aanzienlijke uitdagingen tijdens de behandeling. Het zelfherstel van gewrichtskraakbeen is naar verluidt beperkt vanwege de aneurale architectuur, avasculariteit en lage mitotische activiteit2.

De meest gebruikte cellen voor de regeneratie van kraakbeenweefsel zijn mesenchymale stamcellen (MSC's) en chondrocyten3. Verschillende onderzoeken hebben echter beperkingen gemeld bij het gebruik van deze cellen voor regeneratie4. Deze beperkingen omvatten de terminale differentiatie van chondrocyten tijdens uitgebreide in vitro expansie om het vereiste aantal cellen te bereiken en de hypertrofische neiging van MSC's. Deze factoren kunnen resulteren in de vorming van herstelweefsel met een suboptimale combinatie van fibrokraakbeen en hyaliene 5,6,7,8.

De ontdekking van chondroprogenitorcellen (CPC's) kwam voort uit de zoektocht naar alternatieve cellen in gewrichtskraakbeen9. Ze hebben enorme belangstelling gewekt vanwege hun gelijkenis met MSC's en hun superieure chondrogene potentieel, terwijl ze verminderde hypertrofie vertonen - een onmisbare combinatie die gewild is10,11. In tegenstelling tot chondrocyten is gemeld dat deze voorloperpopulaties een verhoogde replicatieve en telomerase-activiteit vertonen, evenals een verhoogde expressie van neurogeen locus-notch homoloog eiwit 1 (NOTCH-1) en SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX-9)12,13,14,15. Er zijn twee standaardmethoden om CPC's te isoleren die zowel uit kraakbeen als meniscus zijn gerapporteerd, waaronder een op basis van hun integrinereceptor (CD49e/CD29)-expressie, geïsoleerd door middel van een fibronectine-adhesietesttest - Fibronectine Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors (FAA-CP's), en de andere op basis van hun verhoogde migratiepotentieel van kraakbeenexplantaten - Migrerende Chondroprogenitors (MCP's)11,13,16,17,18,19. Talrijke in vitro studies tonen de chondrogene superioriteit en verminderde hypertrofie van zowel FAA-CPC's als MCP's aan in vergelijking met chondrocyten en beenmerg (BM)-MSC's 20,21,22,23.

Recente in-vitro-onderzoeken waarin FAA-CPC's werden vergeleken met MCP's hebben de verbeterde regeneratiecapaciteit van kraakbeencellen aangetoond Deze optimistische in vitro resultaten tonen een hyaliene-achtige regeneratie, wat verdere in vivo experimenten aanmoedigt. Desalniettemin is gemeld dat beide populaties van CPC's kraakbeen efficiënt herstellen en regenereren bij artrose en andere osteochondrale aandoeningen in diermodellen 25,26,27,28,29.

Ons laboratorium heeft actief bijgedragen aan het standaardiseren van CPC-isolatietechnieken en het vergelijken van hun fenotypische kenmerken met chondrocyten en MSC's. Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol waarin de stappen worden uitgelegd die nodig zijn bij het isoleren en kweken van kraakbeencellen, namelijk chondrocyten, FAA-CPC's en MCP's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd en voldoet aan de toepasselijke voorschriften en richtlijnen van de Institutional Review Board (Research and Ethics Committee). Na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming worden menselijke tibiofemorale gewrichten verkregen van patiënten met artrose (OA) (Kellgren-Lawrence radiologische score 4)30 die een totale knievervanging nodig hebben als onderdeel van hun behandeling. De gewrichten van patiënten met tekenen van tumoren, infecties of inflammatoire artritis (zoals reumatoïde artritis of jicht) werden uitgesloten van het onderzoek. Er wordt voor gezorgd dat alle procedures onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd, waarbij tijdens het experimentele proces wordt voldaan aan de standaard laboratoriumprotocollen.

1. Het verkrijgen van tibiofemorale gewrichten

  1. Verkrijg kniegewrichten (tibiofemorale gewrichten) van menselijke donoren die amputatie boven de knie nodig hebben als onderdeel van de behandeling of van mensen met graad IV artrose30 (radiologisch bewijs dat een duidelijke vermindering van de gewrichtsruimte met chondrale sclerose aantoont) die een totale knievervanging ondergaan.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat geïnformeerde toestemming wordt verkregen van patiënten volgens de principes van de Verklaring van Helsinki. Zorg ervoor dat de regels van de ethische commissie en de institutionele beoordelingsraad worden nageleefd.
  2. Sluit gewrichten uit die symptomen van infectie of ontsteking vertonen.

2. Verwerking van geoogste gewrichten

  1. Plaats de geoogste tibiofemorale gewrichten onder steriele omstandigheden in 1x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Bereid een steriel gebied onder de motorkap voor door een steriele onderlegger te plaatsen. Breng de geoogste gewrichten over op de onderlegger.
  3. Stabiliseer de doorgesneden tibiofemorale gewrichten door het subchondrale bot vast te houden met het kraakbeen naar boven gericht.
  4. Oogst met behulp van een scalpelmes (nr. 22) rechthoekig kraakbeenkrullen van de niet-dragende gebieden voor artrosepatiënten binnen 1-2 uur na het verkrijgen van het gewricht.
  5. Oogst de kraakbeensecties van 8 mm x 10 mm van de oppervlakkige laag naar de diepere laag.
  6. Was de plakjes kraakbeen met 1x PBS-oplossing en doe ze in een petrischaaltje met 1-2 ml gewoon DMEM-medium.
  7. Hak de plakjes kraakbeen mooi fijn tot een formaat van minder dan 1 mm x 1 mm x 1 mm met een scalpelmesje (nr. 22).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de plakjes kraakbeen of het gehakte kraakbeen niet uitdrogen; plaats ze in een kweekmedium of PBS zonder serum.

3. Isolatie van chondrocyten

  1. Plaats het gehakte kraakbeen in een rechtopstaande T-25-kolf met 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) met 0,15% collagenase type II voor enzymatische spijsvertering. Laat de kolf 12-14 uur ongestoord in een CO2 -incubator staan en zorg ervoor dat de standaardteeltomstandigheden31 zijn.
    OPMERKING: Gewoon DMEM-F12-medium zonder sporen van serum moet worden gebruikt, omdat serum de enzymatische werking inactiveert.
  2. Na een nachtelijke spijsvertering wordt het medium met de vrijgekomen cellen overgebracht naar een verse, steriele centrifugebuis met een gelijk volume DMEM-F12 + 10% foetaal runderserum (FBS), met behulp van een celzeef om de cellen van het puin te scheiden. De vrijgekomen cellen zijn de "chondrocyten".
  3. Centrifugeer de gefiltreerde cellen met een snelheid van 1200 x g gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  4. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren. Reconstitueer de verkregen pellet in 1 ml medium en tel de levensvatbare cellen die vrijkomen met behulp van een trypanblauwe uitsluitingstest.
  5. Laad de chondrocyten in een T-25-kolf met een concentratie van 10.000 cellen/cm² en breid ze uit tot het vereiste passagenummer met behulp van DMEM-F12 met 10% FBS. Extra componenten in het medium zijn onder meer ascorbinezuur (62 μg/ml), L-glutamine (2,5 mM/l), penicilline-streptomycine (100 IE/ml) en amfotericine-B (2 μg/ml).
  6. Ververs het medium elke 3 dagen en oogst cellen bij subconfluentie met 0,125% trypsine bevattend ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).

4. Isolatie van van fibronectine adhesietest afgeleide chondroprogenitors (FAA-CP's)

  1. Bereid 12 uur voor het vrijkomen van de chondrocyten 10 ml 1x PBS met 1 mM MgCl2 (10 μl) en 1 mM CaCl2 (10 μl) en 100 μl fibronectine (10 μl/ml)32.
  2. Smeer het vereiste aantal putjes van een plaat met 6 putjes (1,5 ml/9,3 cm2) in met de bereide oplossing.
  3. Sluit de plaat goed af en zet een nacht in de koelkast bij 4 °C.
  4. Verkrijg bovendien kraakbeenkrullen op een manier die vergelijkbaar is met die uitgelegd voor de isolatie van chondrocyten (stappen 2.1-2.5).
  5. Onderwerp de kraakbeenkrullen aan een opeenvolgende enzymatische digestie gedurende een nacht (0,2% Pronase gedurende 3 uur; gevolgd door 0,04% Collagenase type II gedurende 12 uur) in een schudwaterbad dat op 37 °C wordt gehouden voor het verkrijgen van individuele chondrocyten.
  6. Haal de volgende dag de met fibronectine beklede plaat met 6 putjes uit de koelkast en verwijder overtollig fibronectine.
    OPMERKING: Overtollig fibronectine moet langzaam en voorzichtig worden verwijderd zonder de coating op de bodem van de put te verstoren. De aanwezigheid van MgCl2 (10 μL) en 1 mM CaCl2 is cruciaal om de hechting van cellen te garanderen.
  7. Voeg 2-3 ml gewoon DMEM-F12-medium toe aan de gecoate putjes.
  8. Zaai de vrijgekomen chondrocyten op de gecoate putjes met een belastingsdichtheid van 4000 cellen/putje en laat de plaat gedurende 20 minuten ongestoord.
  9. Verwijder na de incubatie de overtollige media en niet-aanhangende cellen. Voeg 2-3 ml standaard groeimedia toe zoals gebruikt voor chondrocyten (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Houd de aanhangende cellen gedurende 10-12 dagen onder standaard kweekomstandigheden om CPC-klonen (kolonies van >32 cellen) te verkrijgen.
  11. Isoleer met 0,125% trypsine-EDTA gedurende 180 s, herplaat de klonen in een verhouding van 1 kloon/5 cm² en breid de verrijkte polyklonale CP's uit tot de vereiste samenvloeiing. Deze verkregen cellen worden de "FAA-CPC's" genoemd.
  12. Kweek de cellen verder in DMEM-F12 medium + 10% FBS + transformerende groeifactor bèta 2 (TGFβ2: 1 ng/ml) + fibroblastgroeifactor (FGF2: 5 ng/ml).
    OPMERKING: De incubatie van cellen op met fibronectine beklede platen mag niet langer duren dan 20 minuten, omdat chondrocyten ook kunnen beginnen te hechten. Tijdens de hechtingsperiode van 20 minuten moet het medium vrij zijn van serum. Vervolgens moeten de cellen die zich aan klonen hechten, worden gekweekt in een medium dat bovendien FBS bevat. De klonen mogen pas worden geïsoleerd nadat ervoor is gezorgd dat elke kloon meer dan 32 cellen heeft; Dit is om transitversterkers te vermijden. Verdere uitbreiding van de klonen na trypsinisatie zou de genoemde aanvullende groeifactoren moeten omvatten. Een belastingsdichtheid van 4000 chondrocyten/9,3cm2 van een met fibronectine beklede plaat, na een incubatie van 20 minuten gevolgd door een wasbeurt, resulteert in de hechting van in totaal 80-100 cellen. Hiervan zullen ongeveer 20 klonen groeien en binnen 10-12 dagen een verdubbeling van de populatie van 5 bereiken.

5. Isolatie van migrerende chondroprogenitors

  1. Scheer kraakbeentransplantaten (10 mm x 5 mm x 1 mm) van het geoogste gewrichtsgewricht en plaats ze in een steriele plaat met 6 putjes met DMEM-F12-media met 10% FBS en 10 mM Glutamax (2-3 explantaten/putje)33.
  2. Laat de plaat met de explantaten 48 uur ongestoord in een CO2 -incubator die op 37 °C wordt gehouden.
  3. Breng de explantaten na 2 dagen over naar een centrifugebuis met 10 ml 0,1% collagenaseoplossing voor enzymatische vertering. Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: De explantaten moeten worden gespoeld met 1x PBS voordat ze enzymatisch worden verteerd, omdat sporen van serum de enzymwerking kunnen inactiveren. Dompel voor het wassen de explantaten in een petrischaaltje gevuld met 2-3 ml 1x PBS; Dit is ook om ervoor te zorgen dat eventuele vrijgekomen chondrocyten niet besmet raken. De behandeling van de explantaten moet tot een minimum worden beperkt, en dit is om te voorkomen dat de voorouders die zijn begonnen te migreren onder druk komen te staan.
  4. Spoel na de spijsvertering de explantaten af met 1x PBS en plaats ze terug in dezelfde putjes van de plaat met verse DMEM-F12-media met 10% FBS en 10 mM Glutamax-medium.
  5. Houd de plaat in de standaard kweekomstandigheden in de broedmachine. Let op de migratie van chondroprogenitors in de daaropvolgende dagen.
  6. Bij het bereiken van subconfluentie, oogst de MCP's met 0,125% trypsine die EDTA bevat.
  7. Breid de MCP's uit met behulp van het standaard expansiemedium, dat DMEM-F12 bevat, dat 10% FBS en 10 mM Glutamax bevat.

6. Fenotypische karakterisering van chondrocyten, FAA-CP's en MCP's

  1. Flow cytometrische analyse (FACS)
    OPMERKING: De volgende stappen worden gevolgd voor FACS-analyse van de geoogste celgroepen.
    1. Trypsiniseer de cellen volgens het standaardprotocol met 0,125% trypsine en centrifugeer bij 1200 x g, 5 min, kamertemperatuur om de celpellet te verkrijgen.
    2. Gooi het bovenstaande weg, was en suspendeer de pellet opnieuw met 1x PBS.
    3. Breng de suspensie over naar de gelabelde buisjes voor FACS.
    4. Verdeel de suspensie gelijkmatig over twee buisjes: een 'ongekleurd' buisje dat als controle fungeert (celsuspensie zonder antilichaam) en 'gekleurde' buisjes die als test fungeren (celsuspensie met antilichaam).
    5. Volg het technische gegevensblad van individuele antilichamen/Cluster of differentiatie (CD) markers voor kleuring. Antilichamen ter vergelijking zijn onder meer CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (positieve expressiemarkers); CD34-PE, CD45-FITC en CD14-FITC (negatieve expressiemarkers)34,35; CD166-BB515 en CD146-PE (potentiële chondrogene markers)36,37.
      OPMERKING: CD-markers zijn lichtgevoelig. Om ervoor te zorgen dat de stappen in het donker worden uitgevoerd.
    6. Incubeer de celsuspensie met antilichaam gedurende 30 minuten in het donker.
    7. Voeg na het kleuren 1 ml 1x PBS toe aan de buisjes en centrifugeer bij 1200 x g, 5 min, kamertemperatuur om de celpellet te verkrijgen.
    8. Gooi driekwart van de supernatant weg. Susmureer de pellet opnieuw in het resterende bovenstaande gehalte door zachte trituratie.
    9. Ga verder voor FACS-analyse.

7. qRT-PCR

OPMERKING: qRT-PCR-analyse van genexpressie omvat evaluatie van collageen type I (COL1A1), collageen type X (COL10A1) en runt-gerelateerde transcriptiefactor (RUNX2) voor hypertrofische expressie, en SOX-9, Aggrecan (ACAN) en collageen type II (COL2A1) voor chondrogenese.

  1. Extraheer RNA uit de celgroepen met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Evalueer na extractie de A260/A280-verhouding en de RNA-concentratie.
  3. Gebruik 280 ng van het geëxtraheerde RNA om complementair DNA (cDNA) te construeren.
  4. Start qRT-PCR met behulp van Sybr Green, waarbij elke reactie een eindconcentratie van 7 ng cDNA op een thermocycler bevat.
  5. Normaliseer de relatieve mRNA-expressie van elk gen naar het GAPDH-referentiehuishoudgen (ΔCt).
  6. Bereken de relatieve expressie van elk gen met behulp van de 2-ΔΔCt-techniek door de ΔCt-waarde van elk individueel gen te vergelijken met die van de FAA-CP's (ΔΔCt)37.

8. Differentiatie van meerdere lijnen

OPMERKING: In de handel verkrijgbare differentiële media induceren trilineagedifferentiatie in adipogene, osteogene en chondrogene lijnen.

  1. Voor adipogene differentiatie worden cellen met een laaddichtheid van 1000 cellen/cm2 in een celkweekplaat gekweekt en gekweekt met behulp van adipogeen differentiatiemedium (mediumverandering - eens in de 3 dagen) tot een subconfluentie van 80% gedurende 3 weken.
  2. Voor osteogene en chondrogene differentiatie volgt u het 28-daagse pelletkweeksysteem38.
  3. Centrifugeer 0,5 x 106 cellen bij 400 x g gedurende 12 minuten bij 37 °C om pellets te vormen en differentiatie op gang te brengen met behulp van osteogeen en chondrogenisch differentiatiemedium.
  4. Fixeer, veranker en snijd de korrels in secties voor bevestigende kleuring (stap 9).

9. Bevestigende kleuring

  1. In het geval van adipogene afstammingscellen, fixeer de cellen met gebufferde formaline, wassen en bevlekken met Oil Red O (0,5%). Vlek ook de controles (gekweekt op een standaard DMEM-medium met 10% FBS).
  2. Observeer onder een microscoop en verkrijg de beelden.
  3. Voor de gedifferentieerde osteogene afstammingscellen, kleuring met Alizarin Rood (2%).
    OPMERKING: Er zijn meerdere bevestigende kleuringsprotocollen van toepassing op de chondrogene gedifferentieerde cellen.
  4. Alcian Blue kleuring: Kleur de gefixeerde cellen gedurende 5 minuten aan met Alcian blue en ga de kleuring tegen met Neutral Red.
  5. Voor het beoordelen van het glycosaminoglycaangehalte (GAG) voert u Safranin O-kleuring uit: Kleur de objectglaasjes met Wiegert's Iron Hematoxyline, gevolgd door daaropvolgende incubatie met zure alcohol (1%), snelle groene oplossing (0,05%), azijnzuur (1%) en Safranine O-oplossing (1%).
  6. Toluïdine Blauwe kleuring: Kleur de objectglaasjes 5 minuten lang aan met Toluïdine Blauw (0,1%).
  7. PicroSirius Red-kleuring: Kleur de objectglaasjes met Picrosirius Red (0,1%) en ga de kleuring tegen met hematoxylinekleurstof.
    OPMERKING: Na het kleuren dehydrateert u de objectglaasjes met gesorteerde alcohol en verwijdert u ze met xyleen. Monteer dia's met dibutylftalaat polystyreen xyleen (DPX) mountant, observeer ze onder een microscoop en verkrijg afbeeldingen.
  8. Voor immunohistochemie (type II collageen) kleuring van de chondrogene gedifferentieerde pellet, onderwerpt u de pelletsecties aan enzymatische antigeenextractie met behulp van de enzymen pronase (1 mg/ml) en hyaluronidase (2,5 mg/ml).
  9. Incubeer de secties met primair monoklonaal anticollageen type II-antilichaam van muizen, gevolgd door 1:250 secundair HRP-gelabeld geitenanti-muisantilichaam.
  10. Bekleur de objectglaasjes met 3,3′-diaminobenzidine (DAB) chromogeen en ga ze tegen met hematoxyline.
  11. Observeer onder een microscoop en maak beelden.

10. Bepaling van het GAG/DNA-gehalte

  1. Verteer de chondrogene gedifferentieerde pellets met behulp van papaïne-cysteïneoplossing bij 65 °C gedurende 16 uur.
  2. Schat de DNA-concentratie met behulp van Picrogreen-reagens38 en verkrijg de fluorescentie-intensiteit bij golflengten - excitatie: 480 nm, emissie: 520 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer.
  3. Evalueer het totale GAG-gehalte met behulp van de dimethylmethyleenblauwe kleurstofmethode38.
  4. Meet de optische dichtheid bij 525 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer.
  5. Normaliseer de GAG-waarden naar de DNA-waarden en bereken de totale GAG/DNA-ratio.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Van 86,9 mg plakjes kraakbeen werd een chondrocytcelopbrengst van 1,72 x 105 cellen genoteerd. Bij het laden hechten chondrocyten zich onmiddellijk, waardoor ze aanvankelijk een afgerond geplaveide uiterlijk krijgen en bij verdere expansie overgaan in een fibroblastische toestand (Figuur 1 A,B). Het zaaien van deze chondrocyten op fibronectineplaten resulteert doorgaans in een adhesie van 2%, waarbij elke cel klonale groei onderga...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De potentiële regeneratie van gewrichtskraakbeen, dat hyalien weefsel bevat, kan worden bereikt door de optimalisatie van de twee inheemse celtypen: chondrocyten en chondroprogenitors. Hoewel uitgebreid onderzoek naar chondrocyten waardevolle inzichten heeft opgeleverd in hun rol bij het herstel van kraakbeen, hebben vragen over de aard van het geregenereerde weefsel geleid tot inspanningen om hun fenotype te verbeteren en alternatieve therapieën te onderzoeken3. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

We willen graag mevrouw Bhavini Krishnan en mevrouw Merin Mary Zachariah bedanken voor hun intellectuele inbreng en het Centre for Stem Cell Research (een eenheid van inStem Bengaluru), Department of Physiology, Christian Medical College, Vellore, voor infrastructurele ondersteuning. De lopende projecten worden ondersteund door het Department of Biotechnology (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Govt. of India, Science and Engineering Research Board (CRG/2022/004277), Govt. of India, en Fluid Research Grants, Christian Medical College, Vellore.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22-scalpel blade GLASS VAN
6-well plate CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Red SIGMA130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).GIBCO15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer BECKMAN COULTERCYTExpert Software Version 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Cell counterDE NOVIXCell Drop BF
Cell strainerHIMEDIATCP024
CentrifugeBECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2 incubator THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA plate readerMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Fetal Bovine SerumGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)SIGMA ALDRICHF1141
First-Strand synthesis systemTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Oil Red OSIGMA1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)GIBCO10010023
PCR thermocycler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex thermocycler 
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagentTHERMO SCIENTIFICP7589
RefrigeratorELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)THERMO SCIENTIFIC31430
Shaking water bath REMI
StemPro differentiating kits GIBCO1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Tissue Culture PetridishTARSONS960010
Toluidine BlueQUALIGENS2040
Tryphan blue GIBCO15250061
Trypsin EDTAGIBCO25200072

Referenties

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3 (0), (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246(2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421(2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11(2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685(2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104(2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052(2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93(2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536(2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588(2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66(2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685(2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106(2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119(2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713(2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van chondrocytenchondroprogenitorcellenkraakbeinexplantaatenzymatische digestiegewrichtskraakbeencelkweekmesenchymale eigenschappentrypsine-EDTA
Isolatie van chondrocyten en chondroprogenitoren met behulp van fibronectine-adhesie en migratoire assay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.