Isolatie van chondrocyten en chondroprogenitoren met behulp van fibronectine-adhesie en migratoire assay

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van chondrocyten, van de fibronectine-adhesietest afgeleide chondroprogenitoren (FAA-CP's) en migrerende chondroprogenitoren (MCP's) uit menselijk gewrichtskraakbeen. Het omvat enzymatische spijsvertering, fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde assays voor het isoleren en karakteriseren van deze cellen.

Samenvatting

Chondroprogenitorcellen (CPC's), die onlangs zijn geïdentificeerd als een afzonderlijke subpopulatie, zijn veelbelovend vanwege hun mesenchymale eigenschappen, verhoogde chondrogenese en beperkte hypertrofische eigenschappen. De verrijking van voorlopercellen wordt bereikt door middel van differentiële fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde explantatietesten, waarbij van de Fibronectine-adhesietest afgeleide chondroprogenitors (FAA-CP's) en migrerende chondroprogenitors (MCP's) een superieur potentieel vertonen in vergelijking met chondrocyten. Dit artikel gaat dieper in op de details van het isoleren van cellen afkomstig van kraakbeen, namelijk chondrocyten en chondroprogenitors. Hoewel waardevolle inzichten uit onderzoek naar chondrocyten bijdragen aan ons begrip van kraakbeenherstel, zijn de voortdurende inspanningen gericht op het gebruik van chondroprogenitors en het onderzoeken van hun potentieel als alternatieve therapeutische benadering. Bovendien biedt dit methodologieartikel een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor het isoleren van drie specifieke celtypen uit kraakbeen: chondrocyten, FAA-CP's en MCP's. Door gestandaardiseerde procedures te volgen, vergemakkelijkt dit protocol de succesvolle extractie van deze celsubtypes. Het artikel is gebaseerd op uitgebreid onderzoek en richt zich op de ingewikkelde technieken die worden gebruikt bij het isoleren van de verschillende subsets en de geoptimaliseerde kweekomstandigheden die nodig zijn om hun culturen uit te breiden en te onderhouden. De methodologie omvat enzymatische isolatie van van menselijk gewrichtskraakbeen afgeleide chondrocyten, differentiële fibronectine-adhesie na sequentiële enzymatische vertering en op migratie gebaseerde explantatietesten om kraakbeencellen te verkrijgen.

Inleiding

De opkomst van celgebaseerde regeneratieve therapie vertegenwoordigt een belangrijke benadering voor de behandeling van kraakbeengerelateerde aandoeningen, zoals artrose (OA) en chondrale defecten¹. Deze aandoeningen, gekenmerkt door de afbraak of verwonding van kraakbeen in de gewrichten, vormen aanzienlijke uitdagingen tijdens de behandeling. Het zelfherstel van gewrichtskraakbeen is naar verluidt beperkt vanwege de aneurale architectuur, avasculariteit en lage mitotische activiteit².

De meest gebruikte cellen voor de regeneratie van kraakbeenweefsel zijn mesenchymale stamcellen (MSC's) en chondrocyten³. Verschillende onderzoeken hebben echter beperkingen gemeld bij het gebruik van deze cellen voor regeneratie⁴. Deze beperkingen omvatten de terminale differentiatie van chondrocyten tijdens uitgebreide in vitro expansie om het vereiste aantal cellen te bereiken en de hypertrofische neiging van MSC's. Deze factoren kunnen resulteren in de vorming van herstelweefsel met een suboptimale combinatie van fibrokraakbeen en hyaliene 5,6,7,8.

De ontdekking van chondroprogenitorcellen (CPC's) kwam voort uit de zoektocht naar alternatieve cellen in gewrichtskraakbeen⁹. Ze hebben enorme belangstelling gewekt vanwege hun gelijkenis met MSC's en hun superieure chondrogene potentieel, terwijl ze verminderde hypertrofie vertonen - een onmisbare combinatie die gewild is^10,11. In tegenstelling tot chondrocyten is gemeld dat deze voorloperpopulaties een verhoogde replicatieve en telomerase-activiteit vertonen, evenals een verhoogde expressie van neurogeen locus-notch homoloog eiwit 1 (NOTCH-1) en SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX-9)12,13,14,15. Er zijn twee standaardmethoden om CPC's te isoleren die zowel uit kraakbeen als meniscus zijn gerapporteerd, waaronder een op basis van hun integrinereceptor (CD49e/CD29)-expressie, geïsoleerd door middel van een fibronectine-adhesietesttest - Fibronectine Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors (FAA-CP's), en de andere op basis van hun verhoogde migratiepotentieel van kraakbeenexplantaten - Migrerende Chondroprogenitors (MCP's)11,13,16,17,^18,19. Talrijke in vitro studies tonen de chondrogene superioriteit en verminderde hypertrofie van zowel FAA-CPC's als MCP's aan in vergelijking met chondrocyten en beenmerg (BM)-MSC's 20,21,22,23.

Recente in-vitro-onderzoeken waarin FAA-CPC's werden vergeleken met MCP's hebben de verbeterde regeneratiecapaciteit van kraakbeencellen aangetoond Deze optimistische in vitro resultaten tonen een hyaliene-achtige regeneratie, wat verdere in vivo experimenten aanmoedigt. Desalniettemin is gemeld dat beide populaties van CPC's kraakbeen efficiënt herstellen en regenereren bij artrose en andere osteochondrale aandoeningen in diermodellen 25,26,27,28,29.

Ons laboratorium heeft actief bijgedragen aan het standaardiseren van CPC-isolatietechnieken en het vergelijken van hun fenotypische kenmerken met chondrocyten en MSC's. Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol waarin de stappen worden uitgelegd die nodig zijn bij het isoleren en kweken van kraakbeencellen, namelijk chondrocyten, FAA-CPC's en MCP's.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd en voldoet aan de toepasselijke voorschriften en richtlijnen van de Institutional Review Board (Research and Ethics Committee). Na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming worden menselijke tibiofemorale gewrichten verkregen van patiënten met artrose (OA) (Kellgren-Lawrence radiologische score 4)³⁰ die een totale knievervanging nodig hebben als onderdeel van hun behandeling. De gewrichten van patiënten met tekenen van tumoren, infecties of inflammatoire artritis (zoals reumatoïde artritis of jicht) werden uitgesloten van het onderzoek. Er wordt voor gezorgd dat alle procedures onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd, waarbij tijdens het experimentele proces wordt voldaan aan de standaard laboratoriumprotocollen.

1. Het verkrijgen van tibiofemorale gewrichten

1. Verkrijg kniegewrichten (tibiofemorale gewrichten) van menselijke donoren die amputatie boven de knie nodig hebben als onderdeel van de behandeling of van mensen met graad IV artrose³⁰ (radiologisch bewijs dat een duidelijke vermindering van de gewrichtsruimte met chondrale sclerose aantoont) die een totale knievervanging ondergaan.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat geïnformeerde toestemming wordt verkregen van patiënten volgens de principes van de Verklaring van Helsinki. Zorg ervoor dat de regels van de ethische commissie en de institutionele beoordelingsraad worden nageleefd.
2. Sluit gewrichten uit die symptomen van infectie of ontsteking vertonen.

2. Verwerking van geoogste gewrichten

1. Plaats de geoogste tibiofemorale gewrichten onder steriele omstandigheden in 1x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Bereid een steriel gebied onder de motorkap voor door een steriele onderlegger te plaatsen. Breng de geoogste gewrichten over op de onderlegger.
3. Stabiliseer de doorgesneden tibiofemorale gewrichten door het subchondrale bot vast te houden met het kraakbeen naar boven gericht.
4. Oogst met behulp van een scalpelmes (nr. 22) rechthoekig kraakbeenkrullen van de niet-dragende gebieden voor artrosepatiënten binnen 1-2 uur na het verkrijgen van het gewricht.
5. Oogst de kraakbeensecties van 8 mm x 10 mm van de oppervlakkige laag naar de diepere laag.
6. Was de plakjes kraakbeen met 1x PBS-oplossing en doe ze in een petrischaaltje met 1-2 ml gewoon DMEM-medium.
7. Hak de plakjes kraakbeen mooi fijn tot een formaat van minder dan 1 mm x 1 mm x 1 mm met een scalpelmesje (nr. 22).
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de plakjes kraakbeen of het gehakte kraakbeen niet uitdrogen; plaats ze in een kweekmedium of PBS zonder serum.

3. Isolatie van chondrocyten

1. Plaats het gehakte kraakbeen in een rechtopstaande T-25-kolf met 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) met 0,15% collagenase type II voor enzymatische spijsvertering. Laat de kolf 12-14 uur ongestoord in een CO₂ -incubator staan en zorg ervoor dat de standaardteeltomstandigheden³¹ zijn.
   OPMERKING: Gewoon DMEM-F12-medium zonder sporen van serum moet worden gebruikt, omdat serum de enzymatische werking inactiveert.
2. Na een nachtelijke spijsvertering wordt het medium met de vrijgekomen cellen overgebracht naar een verse, steriele centrifugebuis met een gelijk volume DMEM-F12 + 10% foetaal runderserum (FBS), met behulp van een celzeef om de cellen van het puin te scheiden. De vrijgekomen cellen zijn de "chondrocyten".
3. Centrifugeer de gefiltreerde cellen met een snelheid van 1200 x g gedurende 5 minuten bij 37 °C.
4. Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren. Reconstitueer de verkregen pellet in 1 ml medium en tel de levensvatbare cellen die vrijkomen met behulp van een trypanblauwe uitsluitingstest.
5. Laad de chondrocyten in een T-25-kolf met een concentratie van 10.000 cellen/cm² en breid ze uit tot het vereiste passagenummer met behulp van DMEM-F12 met 10% FBS. Extra componenten in het medium zijn onder meer ascorbinezuur (62 μg/ml), L-glutamine (2,5 mM/l), penicilline-streptomycine (100 IE/ml) en amfotericine-B (2 μg/ml).
6. Ververs het medium elke 3 dagen en oogst cellen bij subconfluentie met 0,125% trypsine bevattend ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).

4. Isolatie van van fibronectine adhesietest afgeleide chondroprogenitors (FAA-CP's)

1. Bereid 12 uur voor het vrijkomen van de chondrocyten 10 ml 1x PBS met 1 mM MgCl₂ (10 μl) en 1 mM CaCl₂ (10 μl) en 100 μl fibronectine (10 μl/ml)³².
2. Smeer het vereiste aantal putjes van een plaat met 6 putjes (1,5 ml/9,3 cm²) in met de bereide oplossing.
3. Sluit de plaat goed af en zet een nacht in de koelkast bij 4 °C.
4. Verkrijg bovendien kraakbeenkrullen op een manier die vergelijkbaar is met die uitgelegd voor de isolatie van chondrocyten (stappen 2.1-2.5).
5. Onderwerp de kraakbeenkrullen aan een opeenvolgende enzymatische digestie gedurende een nacht (0,2% Pronase gedurende 3 uur; gevolgd door 0,04% Collagenase type II gedurende 12 uur) in een schudwaterbad dat op 37 °C wordt gehouden voor het verkrijgen van individuele chondrocyten.
6. Haal de volgende dag de met fibronectine beklede plaat met 6 putjes uit de koelkast en verwijder overtollig fibronectine.
   OPMERKING: Overtollig fibronectine moet langzaam en voorzichtig worden verwijderd zonder de coating op de bodem van de put te verstoren. De aanwezigheid van MgCl₂ (10 μL) en 1 mM CaCl₂ is cruciaal om de hechting van cellen te garanderen.
7. Voeg 2-3 ml gewoon DMEM-F12-medium toe aan de gecoate putjes.
8. Zaai de vrijgekomen chondrocyten op de gecoate putjes met een belastingsdichtheid van 4000 cellen/putje en laat de plaat gedurende 20 minuten ongestoord.
9. Verwijder na de incubatie de overtollige media en niet-aanhangende cellen. Voeg 2-3 ml standaard groeimedia toe zoals gebruikt voor chondrocyten (DMEM-F12 + 10% FBS).
10. Houd de aanhangende cellen gedurende 10-12 dagen onder standaard kweekomstandigheden om CPC-klonen (kolonies van >32 cellen) te verkrijgen.
11. Isoleer met 0,125% trypsine-EDTA gedurende 180 s, herplaat de klonen in een verhouding van 1 kloon/5 cm² en breid de verrijkte polyklonale CP's uit tot de vereiste samenvloeiing. Deze verkregen cellen worden de "FAA-CPC's" genoemd.
12. Kweek de cellen verder in DMEM-F12 medium + 10% FBS + transformerende groeifactor bèta 2 (TGFβ2: 1 ng/ml) + fibroblastgroeifactor (FGF2: 5 ng/ml).
    OPMERKING: De incubatie van cellen op met fibronectine beklede platen mag niet langer duren dan 20 minuten, omdat chondrocyten ook kunnen beginnen te hechten. Tijdens de hechtingsperiode van 20 minuten moet het medium vrij zijn van serum. Vervolgens moeten de cellen die zich aan klonen hechten, worden gekweekt in een medium dat bovendien FBS bevat. De klonen mogen pas worden geïsoleerd nadat ervoor is gezorgd dat elke kloon meer dan 32 cellen heeft; Dit is om transitversterkers te vermijden. Verdere uitbreiding van de klonen na trypsinisatie zou de genoemde aanvullende groeifactoren moeten omvatten. Een belastingsdichtheid van 4000 chondrocyten/9,3^cm2 van een met fibronectine beklede plaat, na een incubatie van 20 minuten gevolgd door een wasbeurt, resulteert in de hechting van in totaal 80-100 cellen. Hiervan zullen ongeveer 20 klonen groeien en binnen 10-12 dagen een verdubbeling van de populatie van 5 bereiken.

5. Isolatie van migrerende chondroprogenitors

1. Scheer kraakbeentransplantaten (10 mm x 5 mm x 1 mm) van het geoogste gewrichtsgewricht en plaats ze in een steriele plaat met 6 putjes met DMEM-F12-media met 10% FBS en 10 mM Glutamax (2-3 explantaten/putje)³³.
2. Laat de plaat met de explantaten 48 uur ongestoord in een CO₂ -incubator die op 37 °C wordt gehouden.
3. Breng de explantaten na 2 dagen over naar een centrifugebuis met 10 ml 0,1% collagenaseoplossing voor enzymatische vertering. Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 37 °C.
   OPMERKING: De explantaten moeten worden gespoeld met 1x PBS voordat ze enzymatisch worden verteerd, omdat sporen van serum de enzymwerking kunnen inactiveren. Dompel voor het wassen de explantaten in een petrischaaltje gevuld met 2-3 ml 1x PBS; Dit is ook om ervoor te zorgen dat eventuele vrijgekomen chondrocyten niet besmet raken. De behandeling van de explantaten moet tot een minimum worden beperkt, en dit is om te voorkomen dat de voorouders die zijn begonnen te migreren onder druk komen te staan.
4. Spoel na de spijsvertering de explantaten af met 1x PBS en plaats ze terug in dezelfde putjes van de plaat met verse DMEM-F12-media met 10% FBS en 10 mM Glutamax-medium.
5. Houd de plaat in de standaard kweekomstandigheden in de broedmachine. Let op de migratie van chondroprogenitors in de daaropvolgende dagen.
6. Bij het bereiken van subconfluentie, oogst de MCP's met 0,125% trypsine die EDTA bevat.
7. Breid de MCP's uit met behulp van het standaard expansiemedium, dat DMEM-F12 bevat, dat 10% FBS en 10 mM Glutamax bevat.

6. Fenotypische karakterisering van chondrocyten, FAA-CP's en MCP's

1. Flow cytometrische analyse (FACS)
   OPMERKING: De volgende stappen worden gevolgd voor FACS-analyse van de geoogste celgroepen.
   1. Trypsiniseer de cellen volgens het standaardprotocol met 0,125% trypsine en centrifugeer bij 1200 x g, 5 min, kamertemperatuur om de celpellet te verkrijgen.
   2. Gooi het bovenstaande weg, was en suspendeer de pellet opnieuw met 1x PBS.
   3. Breng de suspensie over naar de gelabelde buisjes voor FACS.
   4. Verdeel de suspensie gelijkmatig over twee buisjes: een 'ongekleurd' buisje dat als controle fungeert (celsuspensie zonder antilichaam) en 'gekleurde' buisjes die als test fungeren (celsuspensie met antilichaam).
   5. Volg het technische gegevensblad van individuele antilichamen/Cluster of differentiatie (CD) markers voor kleuring. Antilichamen ter vergelijking zijn onder meer CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (positieve expressiemarkers); CD34-PE, CD45-FITC en CD14-FITC (negatieve expressiemarkers)^34,35; CD166-BB515 en CD146-PE (potentiële chondrogene markers)^36,37.
      OPMERKING: CD-markers zijn lichtgevoelig. Om ervoor te zorgen dat de stappen in het donker worden uitgevoerd.
   6. Incubeer de celsuspensie met antilichaam gedurende 30 minuten in het donker.
   7. Voeg na het kleuren 1 ml 1x PBS toe aan de buisjes en centrifugeer bij 1200 x g, 5 min, kamertemperatuur om de celpellet te verkrijgen.
   8. Gooi driekwart van de supernatant weg. Susmureer de pellet opnieuw in het resterende bovenstaande gehalte door zachte trituratie.
   9. Ga verder voor FACS-analyse.

7. qRT-PCR

OPMERKING: qRT-PCR-analyse van genexpressie omvat evaluatie van collageen type I (COL1A1), collageen type X (COL10A1) en runt-gerelateerde transcriptiefactor (RUNX2) voor hypertrofische expressie, en SOX-9, Aggrecan (ACAN) en collageen type II (COL2A1) voor chondrogenese.

1. Extraheer RNA uit de celgroepen met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.
2. Evalueer na extractie de A₂₆₀/A_{280-verhouding} en de RNA-concentratie.
3. Gebruik 280 ng van het geëxtraheerde RNA om complementair DNA (cDNA) te construeren.
4. Start qRT-PCR met behulp van Sybr Green, waarbij elke reactie een eindconcentratie van 7 ng cDNA op een thermocycler bevat.
5. Normaliseer de relatieve mRNA-expressie van elk gen naar het GAPDH-referentiehuishoudgen (ΔCt).
6. Bereken de relatieve expressie van elk gen met behulp van de ^{2-ΔΔCt-techniek} door de ΔCt-waarde van elk individueel gen te vergelijken met die van de FAA-CP's (ΔΔCt)³⁷.

8. Differentiatie van meerdere lijnen

OPMERKING: In de handel verkrijgbare differentiële media induceren trilineagedifferentiatie in adipogene, osteogene en chondrogene lijnen.

1. Voor adipogene differentiatie worden cellen met een laaddichtheid van 1000 cellen/^cm2 in een celkweekplaat gekweekt en gekweekt met behulp van adipogeen differentiatiemedium (mediumverandering - eens in de 3 dagen) tot een subconfluentie van 80% gedurende 3 weken.
2. Voor osteogene en chondrogene differentiatie volgt u het 28-daagse pelletkweeksysteem³⁸.
3. Centrifugeer 0,5 x 10⁶ cellen bij 400 x g gedurende 12 minuten bij 37 °C om pellets te vormen en differentiatie op gang te brengen met behulp van osteogeen en chondrogenisch differentiatiemedium.
4. Fixeer, veranker en snijd de korrels in secties voor bevestigende kleuring (stap 9).

9. Bevestigende kleuring

1. In het geval van adipogene afstammingscellen, fixeer de cellen met gebufferde formaline, wassen en bevlekken met Oil Red O (0,5%). Vlek ook de controles (gekweekt op een standaard DMEM-medium met 10% FBS).
2. Observeer onder een microscoop en verkrijg de beelden.
3. Voor de gedifferentieerde osteogene afstammingscellen, kleuring met Alizarin Rood (2%).
   OPMERKING: Er zijn meerdere bevestigende kleuringsprotocollen van toepassing op de chondrogene gedifferentieerde cellen.
4. Alcian Blue kleuring: Kleur de gefixeerde cellen gedurende 5 minuten aan met Alcian blue en ga de kleuring tegen met Neutral Red.
5. Voor het beoordelen van het glycosaminoglycaangehalte (GAG) voert u Safranin O-kleuring uit: Kleur de objectglaasjes met Wiegert's Iron Hematoxyline, gevolgd door daaropvolgende incubatie met zure alcohol (1%), snelle groene oplossing (0,05%), azijnzuur (1%) en Safranine O-oplossing (1%).
6. Toluïdine Blauwe kleuring: Kleur de objectglaasjes 5 minuten lang aan met Toluïdine Blauw (0,1%).
7. PicroSirius Red-kleuring: Kleur de objectglaasjes met Picrosirius Red (0,1%) en ga de kleuring tegen met hematoxylinekleurstof.
   OPMERKING: Na het kleuren dehydrateert u de objectglaasjes met gesorteerde alcohol en verwijdert u ze met xyleen. Monteer dia's met dibutylftalaat polystyreen xyleen (DPX) mountant, observeer ze onder een microscoop en verkrijg afbeeldingen.
8. Voor immunohistochemie (type II collageen) kleuring van de chondrogene gedifferentieerde pellet, onderwerpt u de pelletsecties aan enzymatische antigeenextractie met behulp van de enzymen pronase (1 mg/ml) en hyaluronidase (2,5 mg/ml).
9. Incubeer de secties met primair monoklonaal anticollageen type II-antilichaam van muizen, gevolgd door 1:250 secundair HRP-gelabeld geitenanti-muisantilichaam.
10. Bekleur de objectglaasjes met 3,3′-diaminobenzidine (DAB) chromogeen en ga ze tegen met hematoxyline.
11. Observeer onder een microscoop en maak beelden.

10. Bepaling van het GAG/DNA-gehalte

1. Verteer de chondrogene gedifferentieerde pellets met behulp van papaïne-cysteïneoplossing bij 65 °C gedurende 16 uur.
2. Schat de DNA-concentratie met behulp van Picrogreen-reagens³⁸ en verkrijg de fluorescentie-intensiteit bij golflengten - excitatie: 480 nm, emissie: 520 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer.
3. Evalueer het totale GAG-gehalte met behulp van de dimethylmethyleenblauwe kleurstofmethode³⁸.
4. Meet de optische dichtheid bij 525 nm met behulp van een ELISA-plaatlezer.
5. Normaliseer de GAG-waarden naar de DNA-waarden en bereken de totale GAG/DNA-ratio.

Resultaten

Van 86,9 mg plakjes kraakbeen werd een chondrocytcelopbrengst van 1,72 x 10⁵ cellen genoteerd. Bij het laden hechten chondrocyten zich onmiddellijk, waardoor ze aanvankelijk een afgerond geplaveide uiterlijk krijgen en bij verdere expansie overgaan in een fibroblastische toestand (Figuur 1 A,B). Het zaaien van deze chondrocyten op fibronectineplaten resulteert doorgaans in een adhesie van 2%, waarbij elke cel klonale groei ondergaat (Figuur 2 C,D), waardoor een populatieverdubbeling van 5 wordt bereikt op dag 10-12 (32 cellen/kloon). De klonen binnen het gebied van 10 cm² worden gecombineerd en uitgebreid tot de noodzakelijke doorgang om FAA-CP's te produceren. Kraakbeenexplantaten, die in cultuur blijven na collagenase-incubatie, vertonen extracellulaire matrixloslating en migratie wordt over het algemeen al op de 7e^{dag waargenomen} (Figuur 2E). Zowel FAA-CP's als MCP's vertonen een spoelvormige structuur, een kenmerk dat vaak wordt geassocieerd met BM-MSC's, en vertonen een honingraatachtige structuur voorafgaand aan de samenvloeiing (Figuur 1E,F).

De drie soorten geïsoleerde cellen, namelijk chondrocyten, FAA-CP's en MCP's, worden nauwlettend gevolgd met behulp van fasecontrastbeeldvorming. De FAA-CP's worden pas overgedragen na bevestiging van vijf populatieverdubbelingen.

Fenotypische karakterisering van de geïsoleerde en geëxpandeerde cellen omvat doorgaans flowcytometrische analyse voor vermeende markers van chondrogenese, namelijk CD146 en CD166, evenals genexpressieanalyse voor markers van chondrogenese (SOX-9, ACAN, COL2A1), de fibrokraakbeenmarker COL1A1 en markers van hypertrofie (RUNX2 en COL10A1). Alle drie de celgroepen vertonen een hoge expressie (>95%) van CD105, CD73 en CD90; lage tot negatieve expressie van CD34 en CD45; en hoge expressie (>98%) van CD166, met matige, donorafhankelijke expressie van CD146 (40%-75%)(Figuur 2A).

qRT-PCR-resultaten tonen een vergelijkbare en hoge expressie van SOX-9, ACAN en ook COL1A1, een fibrokraakbeenmarker, aangezien de cellen vóór evaluatie worden gekweekt (Figuur 2B). Ter bevestiging van chondrogenese wordt in alle celgroepen een positieve opname van oranjerode complexen in de GAG-bevattende gebieden na Safranin O en blauwachtige tot paarsachtige complexen na Alcian Blue en Toluïdine Blue waargenomen, met een hoger aandeel in de FAA-CP- en MCP-groepen. Immunohistochemische analyse van de chondrogenisch gedifferentieerde pellets voor collageen type II toont bruinachtige fibrillaire opname in alle drie de groepen (Figuur 3). Bovendien toonde GAG/DNA-analyse ook bevestiging van chondrogene differentiatie met FAA-CP-groepen die een hogere expressie vertoonden (Figuur 2C).

Figuur 1: Isolatie en karakterisering van chondrocyten en chondroprogenitors. Het onderzoeksalgoritme toont de isolatie van drie celgroepen en hun morfologische kenmerken onder een fasecontrastmicroscoop onmiddellijk na isolatie en na een paar dagen expansie. (A) Vers geïsoleerde chondrocyten hechten zich tijdens de eerste dagen van de kweek aan aanhangende culturen en krijgen een fibroblastisch uiterlijk met verdere expansie (B). (C) Chondrocyten die zijn onderworpen aan een fibronectine-adhesietest vertonen klonale groei en bereiken een populatieverdubbeling van 5 op dag 10 (D). (E) Chondroprogenitors migreren vanaf de rand van de explantatie op dag 10 van de teelt en vertonen een spoelvormig groeipatroon met verdere expansie (F). Fasecontrast beeldvergroting: 10x; Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Moleculaire karakteriseringsgegevens. (A) Flowcytometrische analyse voor positieve en negatieve MSC-markers en potentiële chondrogenese-markers. (B) RT-PCR-expressiegegevens voor de drie celgroepen voor genexpressieanalyse van chondrogene en hypertrofische markers. (C) Totale GAG/DNA-analyse van de chondrogene gedifferentieerde pellets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Bevestigende kleuring na chondrogene differentiatie. Safranine O en immunohistochemische analyse voor collageen type II tussen de drie celgroepen. Schaalbalken: voor 10x vergroting, 50 μm; 40x vergroting, 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De potentiële regeneratie van gewrichtskraakbeen, dat hyalien weefsel bevat, kan worden bereikt door de optimalisatie van de twee inheemse celtypen: chondrocyten en chondroprogenitors. Hoewel uitgebreid onderzoek naar chondrocyten waardevolle inzichten heeft opgeleverd in hun rol bij het herstel van kraakbeen, hebben vragen over de aard van het geregenereerde weefsel geleid tot inspanningen om hun fenotype te verbeteren en alternatieve therapieën te onderzoeken³. Chondroprogenitors, geïdentificeerd als een relatief recente cellulaire subpopulatie, zijn veelbelovend vanwege hun inherente mesenchymale eigenschappen, verhoogde chondrogenese en beperkte hypertrofische eigenschappen¹². De twee primaire technieken voor het oogsten en verbeteren van voorlopercellen zijn differentiële fibronectine-adhesie en op migratie gebaseerde explantatietest^18,32. De isolatie van menselijke FAA-CP's is ook beschreven met behulp van meniscusweefsel, waarbij een hoog proliferatief en multipotent potentieel wordt gerapporteerd^16,17. In vitro karakteriseringsstudies waarin FAA-CP's en MCP's worden vergeleken met chondrocyten, wijzen op een superieur potentieel voor FAA-CP's en MCP's om hogere chondrogene en lagere hypertrofische fenotypes te vertonen, wat een gunstig profiel weerspiegelt met verhoogde GAG-accumulatie en -productie 15,24,31,39. Beperkte in vivo studies suggereren dat chondroprogenitors de progressie van artrose kunnen verminderen en gunstige resultaten kunnen aantonen bij het herstellen van osteochondrale defecten wanneer ze worden gebruikt in combinatie met bioscaffolds. In de afgelopen jaren zijn er aanzienlijke onderzoeksinspanningen geleverd om het volledige potentieel van chondroprogenitors te verbeteren en bloot te leggen.

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de isolatie van cellen in kraakbeen. De primaire en meest voorkomende cellen die uit het kraakbeen vrijkomen, zijn de chondrocyten. Enzymatisch verteerd kraakbeen is echter een heterogene populatie van cellen die niet alleen chondrocyten bevat, maar ook voorlopercellen in een zeer lage concentratie, die verrijking onder in vitro omstandigheden vereist.

Dowthwaite et al. observeerde indirect bewijs dat wijst op de betrokkenheid van deze cellen bij het stimuleren van appositionele groei, ondernam de isolatie en karakterisering van chondroprogenitors. Deze voorlopercellen werden afgeleid van de oppervlakkige laag van gewrichtskraakbeen door het gebruik van een fibronectine-adhesietest¹⁰. Deze aparte populatie werd geëxtraheerd uit foetale kalveren via een proces met selectieve hechting aan fibronectine. Er werd aangetoond dat het fenotypische flexibiliteit en een hoog vermogen om kolonies te vormen bezit, naast de expressie van het cellotselectorgen Notch-1. Naast deze eerste onderzoeken onthulde de karakterisering van voorlopercellen uit menselijk gewrichtskraakbeen verhoogde niveaus van SOX9- en Notch1-expressie, een voorkeur voor CD49e/CD29 en verhoogde telomerase-activiteit in vergelijking met rijpe chondrocyten^12,32. Dit protocol is ook opgesteld in artrose menselijk kraakbeenweefsel, met rapporten die de aanwezigheid ervan niet alleen in het oppervlakkige kraakbeen aantonen, maar ook in de diepere lagen van het kraakbeen, waarbij veel groepen polyklonale culturen gebruiken tot monoklonale culturen^11,12.

Aan de andere kant onderzochten Koelling et al. de mogelijke betrokkenheid van chondroprogenitors bij homing en migratie als reactie op kraakbeenbeschadiging, en droeg zo bij aan weefselherstel¹⁸. Bovendien toonden Seol et al. aan dat, als reactie op kraakbeenbeschadiging, voorlopercellen een verhoogde migratie vertoonden via High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) en RAGE-gemedieerde chemotaxis¹⁹. Elsaesser et al. observeerden ook de superieure migratiecapaciteit van nasale chondroprogenitoren in vergelijking met chondrocyten en BM-MSC's²². Een studie uitgevoerd door Joos et al. wees uit dat de afgifte van bloedplaatjes-afgeleide groeifactor-BB (PDGF-BB) en insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) de migratie van chondroprogenitoren verbeterde, terwijl interleukine 1 bèta (IL-1β) en tumornecrosefactor-alfa (TNFα) de beweging van de voorlopercellen remden na letsel⁴⁰. Er is een recent rapport opgesteld waarin vier verschillende methoden van MCP-isolatie worden vergeleken in termen van hun isolatiemethoden en kweekomstandigheden, en de aanbevolen methode wordt uitgelegd in dit artikel³³. De benadering van het isoleren van voorlopercellen op basis van hun migrerende vermogen resulteerde in cellen die niet alleen een hoog chondrogenisch potentieel vertoonden, maar ook kenmerken vertoonden die vergelijkbaar waren met mesenchymale stamcellen.

In het laboratorium is, volgens gestandaardiseerde protocollen, een succesvolle isolatie van alle drie de subtypen bereikt. Bovendien hebben baanbrekende vergelijkende studies de superieure eigenschappen van FAA-CP's aangetoond in vergelijking met chondrocyten 12,15,41. Vergelijkingen tussen chondroprogenitors zijn ook onderzocht, waaruit blijkt dat MCP's een hoger potentieel vertonen²⁴. Houd er rekening mee dat, aangezien de drie subtypen uit hetzelfde weefsel zijn geïsoleerd en de voorloper in zijn oorspronkelijke vorm zeer laag aanwezig is bij de eerste afgifte van het gewrichtskraakbeen - dat voornamelijk chondrocyten bevat - er behoefte is om ze te verrijken met behulp van in vitro culturen.

Uitgebreide evaluatiemethoden omvatten fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), omgekeerde transcriptiepolymerasekettingreactie (RT-PCR), elektronenmicroscopische analyse, titratiestudies met groeifactoren, cellabelingstechnieken, immunoprofilering en beoordeling van hun therapeutisch potentieel voor de behandeling van artrose en chondrale defecten met behulp van in vivo-modellen 12,24,42.

De huidige bevindingen geven aan dat de isolatie van alle drie de subtypes haalbaar is, zelfs van artrosegewrichten, hoewel een langere expansieduur nodig is. We benadrukken met name het belang van het vermijden van de toevoeging van groeifactoren tijdens klonale groei, en benadrukken de cruciale noodzaak om extra factoren te introduceren tijdens de uitbreiding van deze cellen. Cruciale stappen, zoals timing voor incubatie op met fibronectine beklede platen, de toevoeging van groeifactoren op verschillende tijdstippen en minimale behandeling van explantaten, naast andere genoemde essentiële zaken, spelen een belangrijke rol bij de kweek en uitbreiding van de geoogste cellen. Het is ook essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen op een bepaald tijdstip een samenvloeiing van niet meer dan 75%-80% bereiken.

Het potentieel van chondroprogenitors heeft veel belangstelling gewekt vanwege hun superioriteit ten opzichte van veelgebruikte celgebaseerde therapieën op het gebied van kraakbeenherstel, namelijk BM-MSC's en chondrocyten. Deze voorlopercellen zijn veelbelovend, met verschillende in vivo experimenten die hun efficiëntie aantonen bij het vervangen van de huidige zorgstandaard. Als een recent ontdekte subgroep zijn karakterisering en informatie over hun fenotype nog steeds aan de gang, met de eerste klinische proef met FAA-CP's voor de behandeling van chondrale defecten die naar verwachting in 2024 van start zal gaan. De isolatie en expansie van van kraakbeen afgeleide cellen, met name chondroprogenitors, zijn dus cruciaal en veelbelovend voor celgebaseerd herstel op het gebied van kraakbeenregeneratie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
22-scalpel blade	GLASS VAN
6-well plate	CORNING	3516
Alcian Blue	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Alizarin Red	SIGMA	130223
Amphotericin-B (2 μg/mL).	GIBCO	15240062
Ascorbic acid (62 μg/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
BC CytoFLEX LX flow cytometer	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE	561443
CD106-APC	BD BIOSCIENCE	551147
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE	555397
CD29-APC	BD BIOSCIENCE	559883
CD34-PE	BD BIOSCIENCE	348057
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE	347463
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	MACS 130/100337
CD49e-PE	BD BIOSCIENCE	555617
CD73-PE	BD BIOSCIENCE	550257
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Cell counter	DE NOVIX	Cell Drop BF
Cell strainer	HIMEDIA	TCP024
Centrifuge	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
CO2 incubator	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagen type X (COL10A1),Runt-related transcription factor (RUNX2),SRY-Box Transcription Factor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN), and Collagen type II (COL2A1)	EUROGENTEC, BELGIUM
Collagenase type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
ELISA plate reader	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectin (10 µL/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
First-Strand synthesis system	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hematoxylin	QUALIGENS	Q39411
MgCl2	SIGMA ALDRICH	M8787
Oil Red O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Buffered Saline)	GIBCO	10010023
PCR thermocycler	APPLIED BIOSYSTEMS	Quantstudio 12K Flex thermocycler
Penicillin-streptomycin (100 IU/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Primary antibody (mouse Collagen type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen dsDNA reagent	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Refrigerator	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP conjugate)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Shaking water bath	REMI
StemPro differentiating kits	GIBCO	1007201, A1007001, and A1007101
T-25 flask	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGFβ	ABCAM	ab277760
Tissue Culture Petridish	TARSONS	960010
Toluidine Blue	QUALIGENS	2040
Tryphan blue	GIBCO	15250061
Trypsin EDTA	GIBCO	25200072