Methodenartikel

Visualisatie van de DNA-schaderespons in Purkinje-cellen met behulp van cerebellaire organotypische culturen

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 december 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerebellaire Purkinje-cellen (PC's) zijn bijzonder gevoelig voor tekortkomingen in de DNA-schaderespons. Er wordt een protocol gepresenteerd voor de visuele evaluatie van de dynamiek van PC-respons op DNA-schade, waarbij eiwitgebonden poly(ADP-ribose) ketens worden gekleurd binnen cerebellaire organotypische culturen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerebellaire Purkinje-cellen (PC's) vertonen een uniek samenspel van hoge stofwisselingssnelheden, specifieke chromatine-architectuur en uitgebreide transcriptionele activiteit, waardoor ze bijzonder kwetsbaar zijn voor DNA-schade. Dit vereist een efficiënte DNA-schaderespons (DDR) om cerebellaire degeneratie te voorkomen, vaak geïnitieerd door PC-disfunctie of -verlies. Een opmerkelijk voorbeeld is het genoominstabiliteitssyndroom, ataxie-teleangiëctasie (A-T), gekenmerkt door progressieve PC-depletie en cerebellaire achteruitgang. Het onderzoeken van DDR-mechanismen in pc's is van vitaal belang voor het ophelderen van de routes die leiden tot hun degeneratie bij dergelijke aandoeningen. De complexiteit van het isoleren en cultiveren van pc's in vitro heeft de onderzoeksinspanningen echter lang belemmerd. Cerebellaire organotypische (plak)culturen van muizen bieden een haalbaar alternatief, waarbij de in vivo weefselomgeving nauw wordt nagebootst. Toch is dit model beperkt tot DDR-indicatoren die vatbaar zijn voor microscopische beeldvorming. We hebben het organotypische kweekprotocol verfijnd en aangetoond dat fluorescerende beeldvorming van eiwitgebonden poly(ADP-ribose) (PAR)-ketens, een snelle en vroege DDR-indicator, effectief de DDR-dynamiek in pc's binnen deze culturen onthult, als reactie op genotoxische stress.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De integriteit van cellulair DNA wordt voortdurend bedreigd door DNA-beschadigende stoffen, voornamelijk metabolische bijproducten zoals reactieve zuurstofsoorten, die dagelijks tienduizenden DNA-laesies per cel veroorzaken. Het aanhoudende behoud van genoomstabiliteit is essentieel voor cellulaire homeostase 2,3. De hoeksteen van dit onderhoud is de DNA-schaderespons (DDR) - een ingewikkeld, gelaagd signaleringsnetwerk dat specifieke DNA-herstelroutes initieert en tegelijkertijd vele andere cellulaire processen zorgvuldig aanpast 4,5. Tekorten in de DDR manifesteren zich vaak als 'genoominstabiliteitssyndromen', gekenmerkt door chromosomale instabiliteit, progressieve weefselverslechtering, verminderde groei of ontwikkeling, een aanleg voor kanker en verhoogde gevoeligheid voor bepaalde DNA-beschadigende stoffen 6,7,8,9. Met name neurodegeneratie, die vaak cerebellaire atrofie omvat, is een duidelijk kenmerk van veel genoominstabiliteitssyndromen 7,10,11,12.

De autosomaal recessieve aandoening, ataxie-teleangiëctasie (A-T), is een goed gedocumenteerd voorbeeld van een genoominstabiliteitsstoornis 13,14,15. Deze aandoening komt voort uit nulmutaties in het ATM (A-T, gemuteerde) gen, dat verantwoordelijk is voor het coderen van het cruciale eiwitkinase, ATM, dat voornamelijk bekend staat als een DDR-mobilisator als reactie op DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's)16,17. A-T manifesteert zich als een multisysteemaandoening, voornamelijk gekenmerkt door progressieve cerebellaire degeneratie, wat leidt tot acute motorische stoornissen, immunodeficiëntie, gonadale atrofie, aanleg voor kanker en extreme gevoeligheid voor ioniserende straling. Gekweekte cellen van personen met A-T vertonen chromosomale instabiliteit en verhoogde gevoeligheid voor genotoxische middelen, vooral die welke DSB's veroorzaken 15,18,19. Belangrijk is dat ATM ook een rol speelt bij het repareren van andere DNA-laesies, wat het brede belang ervan voor het handhaven van genoomstabiliteit onderstreept 20,21,22.

Ondanks grondig onderzoek naar de talrijke rollen van ATM, blijft het specifieke mechanisme dat leidt tot cerebellaire degeneratie bij ATT een onderwerp van actief debat, met verschillende modellen voorgesteld om dit proces op te helderen 23,24,25,26,27,28,29,30. Ons model28 suggereert dat cerebellaire degeneratie bij AT-patiënten begint met de disfunctie en uiteindelijk verlies van Purkinje-cellen (PC's). Gezien de cruciale rol van ATM bij het behoud van de stabiliteit van het genoom in het licht van aanhoudende DNA-schade, zijn pc's bijzonder kwetsbaar voor de afwezigheid van ATM. We schrijven deze kwetsbaarheid toe aan de combinatie van hun hoge metabolische activiteit, kenmerkende chromatinestructuur en uitgebreide transcriptionele activiteit. Uiteindelijk wordt gesuggereerd dat het verlies van de PC-functie, en dus hun degeneratie, te wijten is aan de stochastische, functionele inactivatie van genen, een gevolg van het produceren van defecte transcripten28.

De studie van PC-biologie in het laboratorium wordt belemmerd door uitdagingen bij het cultiveren van geïsoleerde PC's, aangezien deze cellen sterk afhankelijk zijn van hun natuurlijke omgeving en naburige cellen voor overleving en functie, waardoor ze onverenigbaar zijn met gedissocieerde cultuurgroei. Desalniettemin kunnen PC's gedurende langere perioden levensvatbaar blijven in weefselplakculturen. Cerebellaire organotypische culturen, dit zijn weefselplakjes die typisch zijn afgeleid van cerebella van knaagdieren, behouden de structurele organisatie van het weefsel en ondersteunen verschillende experimentele manipulaties die analoog zijn aan die mogelijk zijn met gekweekte cellen. Daarom maken deze culturen cerebellaire studies mogelijk binnen een gecontroleerde setting 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Met name in de context van ATT hebben cerebellaire organotypische culturen van muizen bewezen een belangrijke rol te spelen bij het onderzoeken van de DDR in ATM-deficiënte pc's 40,41,42,43. Hoewel ATM-deficiënte muizen slechts een subtiel cerebellair fenotype 44,45,46,47 vertonen, vermoedelijk als gevolg van verschillen tussen de cerebellaire fysiologie van mens en muis, is de veronderstelling dat de rollen van ATM grotendeels behouden blijven bij deze soorten. Dit idee wordt ondersteund door onze observaties dat de deficiënte respons op DNA DSB's in ATM-/- muizen-pc's overeenkomt met die waargenomen in andere muizen en menselijke ATM/Atm-deficiënte celtypen 40,41,42,43.

Een beperking bij het analyseren van PC-reacties op verschillende stimuli of spanningen binnen organotypische culturen is de noodzaak om te vertrouwen op microscopische beeldvorming voor uitlezingen. De DDR wordt meestal bestudeerd met behulp van biochemische uitlezingen in bulk, hoewel ook gemeenschappelijke immunofluorescerende markers worden gebruikt, zoals het volgen van de dynamiek van vorming en resolutie van nucleaire foci van gefosforyleerd histon H2AX (γH2AX) en het 53BP1-eiwit, die worden beschouwd als indicatoren van DSB's48,49. Een bredere maatstaf is de fluorescerende beeldvorming van poly(ADP-ribose) (PAR) ketenvorming op eiwitten, een snelle en robuuste vroege DNA-schaderespons, met name op strengbreuken 7,50. We hebben het protocol van Komulainen et al.51 aangepast voor PAR-kleuring in cerebellaire organotypische culturen. We zagen een uitgesproken PAR-respons in de omvangrijke kernen van PC's. Hier wordt ons verfijnde protocol gepresenteerd voor het vaststellen van cerebellaire organotypische culturen van muizen en voor het visualiseren van de PAR-respons onder genotoxische stress.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zie Tabel met materialen voor meer informatie over materialen, apparatuur en antilichamen. Dierproeven werden na goedkeuring toegepast volgens de ethische richtlijnen van de ethische commissie van de Universiteit van Tel Aviv. De procedure wordt uitgevoerd op muizenpups van 10 dagen oud, ongeacht hun geslacht. Indien nodig wordt genotypering de dag ervoor uitgevoerd met behulp van een staartbiopsie en standaardmethoden. Oplossingen zijn steriel en worden bewaard bij 4 °C, tenzij anders aangegeven; zie tabel 1.

1. Bereiding van culturen

NOTITIE: Voer de procedure uit in een steriele omgeving en desinfecteer het werkoppervlak vooraf met 70% ethanol.

  1. Voeg 1 ml BME toe aan elk putje met 6-wells platen. Plaats met een steriele tang een inzetstuk voor een enkele celcultuur in elk putje en incubeer de platen in een incubator van 37 °C/5% CO 2 in een incubator van 37 °C/5% CO2 gedurende minimaal 2 uur voorafgaand aan de dissectieprocedure.
  2. Stel een dissectiegebied in een biologische kap in, met daarin de weefselhakselaar, 30 mm kweekplaten, een binoculaire microscoop en een lichtbron.
  3. Dompel de chirurgische instrumenten gedurende het hele proces onder in 70% ethanol. Gebruik een urinebeker gevuld met 70% ethanol voor onderdompeling en een aparte urinebeker met 1x PBS om de ethanol voor gebruik af te wassen.
  4. Bereid voor elke dissectie (d.w.z. voor elk cerebellum) twee kweekplaten van 30 mm gevuld met koud dissectiemedium voor en laat ze op ijs liggen.
  5. Besproei het dier met 70% ethanol.
  6. Onthoofd het dier met een scherpe schaar snel. Om de hersenen bloot te leggen, maakt u een kleine incisie met een schaar weg van het cerebellum. Gebruik een pincet met afgeronde uiteinden om de schedel voorzichtig af te pellen. Verwijder de schedel in kleine stukjes om beschadiging van het cerebellaire weefsel te voorkomen.
  7. Breng de hersenen onmiddellijk over naar een koud dissectiemedium of verwijder het cerebellum direct uit de schedel. Om dit te doen, legt u het cerebellum bloot en scheidt u de cerebellaire cortex van de hersenstam door de drie paar steeltjes los te koppelen met behulp van een fijn gebogen irisspatel. Om de steeltjes te identificeren, kijk van rostraal naar caudaal: de gepaarde superieure cerebellaire steeltjes verbinden de middenhersenen met elke kant van het cerebellum; de gepaarde middelste cerebellaire steeltjes verbinden de pons met elke kant van het cerebellum; en de gepaarde inferieure cerebellaire steeltjes verbinden met de medulla aan weerszijden van het cerebellum. Zodra het cerebellum zichtbaar is, scheidt u het van de grote hersenen met dezelfde spatel: schuif de spatel tussen het cerebellum, de superieure colliculus en de hersenstam.
    OPMERKING: Doe geen speciale moeite om de hersenvliezen te verwijderen, omdat ze gemakkelijk loskomen nadat het cerebellum is gesneden.
  8. Stel de weefselhakmolen in op een plakdikte van 350 μm.
  9. Voordat u het cerebellum op de basis van de hakmolen plaatst, verwijdert u overtollige ontleedbuffer uit het weefsel. Dit zal de hechting van het weefsel aan de basis van de hakmolen verbeteren.
  10. Plaats het cerebellum in verticale richting op het snijplatform en voer parasagittale slicing uit met een plakdikte van 350 μm. Scheid de plakjes voorzichtig met een fijne irisspatel en leg ze in koud dissectiemedium.
  11. Breng het gesneden weefsel terug over naar een verse koude dissectiebuffer. Gebruik een punt van 1.000 μL om de weefselplakjes voorzichtig in de schaal met koudedissectiebuffer te leiden.
  12. Gebruik onder de verrekijker twee gebogen irisspatels om de weefselplakjes voorzichtig van elkaar te scheiden. Gebruik voor culturen plakjes die zijn afgeleid van de cerebellaire vermis die zich in de mediale cortico-nucleaire zone van het orgaan bevinden.
  13. Breng elk plakje weefsel over op een kweekinzetstuk met een brede spatel en verplaats elk inzetstuk met een plakje weefsel in een kuiltje in de platen met 6 putjes met het voorverwarmde medium. Laat de borden in de couveuse liggen.
  14. Vervang het medium om de dag: zuig het gebruikte medium op met een steriele glazen pipet en voeg met een serologische pipet van 5 ml 1 ml verse MBE toe met de punt van de pipet leunend tegen de wand van het putje. Zorg ervoor dat de mediumstroom niet op het weefsel wordt gericht.
    OPMERKING: Het weefselplakje zal de eerste 5-7 dagen in de kweek een ontstekingsachtig uiterlijk vertonen en zal klaar zijn voor experimenten zodra dit fenomeen verdwijnt en tot 2 weken na het opzetten van de kweek.

2. Behandeling met DNA-beschadigende middelen, fixatie, kleuring en microscopische beeldvorming

  1. Voeg DNA-beschadigende chemicaliën rechtstreeks toe aan het kweekmedium in de juiste eindconcentraties, gedurende een vooraf bepaalde duur. Verwijder na de blootstellingsperiode de chemicaliën door het medium te vervangen door vers kweekmedium.
  2. Als de DDR-uitlezing PAR-kleuring inhoudt, voeg dan 30 minuten vóór de fixatie een remmer van poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) toe aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 10 μM.
    OPMERKING: Deze behandeling is van cruciaal belang omdat de PAR-modificatie van korte duur is en continu wordt afgebroken door PARG.
  3. Zuig het medium onmiddellijk voor de fixatie op en vervang het door 1 ml 0,1 M fosfaatbuffer bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Koude buffer kan leiden tot losraken van de weefselplakjes van het inzetstuk.
  4. Fixeer de plakjes onmiddellijk door de buffer te vervangen door een voorgekoeld (-20 °C) aceton:methanolmengsel (1:1) zodat het weefselplakje in dit mengsel wordt ondergedompeld en laat 20 minuten bij -20 °C staan.
    OPMERKING: Het is mogelijk om in dit stadium te stoppen en later door te gaan met immunokleuring. Was hiervoor de tissues 3x met 0,1 M fosfaatbuffer voorgekoeld tot 4 °C, zorg ervoor dat het weefsel in de buffer wordt ondergedompeld. Weefsels kunnen nu tot 2 weken worden bewaard in een fosfaatbuffer van 0,1 M bij 4 °C.
  5. Breng de weefselplak over in een kuiltje in een plaat met 48 putjes.
  6. Gebruik een scalpel en een snijplank om de marges van het inzetstuk te verwijderen en snijd rond het weefselplakje. Leg elk plakje in een kuiltje met een bord van 48 putjes. Voeg 100 μL fosfaatbuffer van 0,1 M toe.
  7. Voor permeabilisatie zuigt u de buffer op, voegt u aan het putje 100 μL 0,1 M fosfaatbuffer met 1% Triton X-100 toe en laat u 5 minuten op kamertemperatuur staan.
  8. Zuig de oplossing op en voeg 100 μl blokkeringsoplossing (zie tabel 1) per putje toe. Schud zachtjes op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  9. Verdun tijdens de blokkeringsstap het primaire antilichaam of anti-PAR-reagens (1:800) in de blokkeringsoplossing.
  10. Verwijder de blokkerende oplossing (wassen is niet nodig) en voeg 100 μL primaire antilichaammix toe aan elk putje. Breng voorzichtig schudden aan gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  11. Verdun de secundaire antilichamen in een fosfaatbuffer van 0,1 M met 0,2% Triton X-100 (1:500) terwijl de blootstelling aan licht tot een minimum wordt beperkt.
  12. Zuig de primaire antilichaamoplossing op en was de plakjes 3 x 5 minuten met 0,1 M fosfaatbuffer met 0,2% Triton X-100, bij kamertemperatuur, met voorzichtig schudden.
  13. Vervang de wasoplossing door 100 μL secundaire antilichaamoplossing (verdunning 1:500). Blijf 2 uur zachtjes schudden bij kamertemperatuur in het donker (dek de platen af met aluminiumfolie).
  14. Om een DAPI-oplossing te bereiden, verdunt u de stockoplossing (2 mg/ml) tot 1 μg/ml in 1x PBS.
  15. Voeg twintig minuten voor het einde van de incubatie van 2 uur met het secundaire antilichaam 20 μl van de uiteindelijke DAPI-oplossing toe aan elk putje en blijf 20 minuten schudden. Zuig de vloeistof op en was met de wasoplossing gedurende 3 x 5 minuten met zacht schudden.
  16. Plaats voor de montage het weefsel op een microscoopglaasje met het weefsel naar boven gericht, voeg montagemedium toe en dek af met een afdekglas. Leg de objectglaasjes op een vlakke ondergrond en laat ze een nacht drogen in het donker, bij kamertemperatuur (vermijd het gebruik van montagemedium met DAPI om wazigheid te voorkomen).
  17. Bewaar de objectglaasjes bij 4 °C in een lichtdichte doos.
  18. Leg microscopische beelden vast met behulp van een confocale microscoop en geschikte filters.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 illustreert het algemene uiterlijk van de cerebellaire organotypische culturen. De bovenste rij in figuur 1A toont de cerebellaire foliatie, die in cultuur wordt gehouden, terwijl de onderste rij de PC's toont die zijn gekleurd voor Calbindin D-28k (groen) en de neuronale kernen die zijn gekleurd voor NeuN (rood). In figuur 1B zijn de astrocyten in de PC's (rood) gekleurd voor GFAP (groen), een intermediair filament type III-eiwit. Figuur 2 en Figuur 3 tonen de PAR-kleuring die is waargenomen na behandeling van deze culturen met twee DNA-beschadigende middelen, die beide sterke oxidanten zijn: kaliumbromaat (een eindconcentratie van 10 mM gedurende 12 uur) en paraquat. De PAR-respons was gemarkeerd in de behandelde PC's in het cerebellaire folium in vergelijking met de controlegroep.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van cerebellaire culturen bij muizen. (A) De bovenste rij illustreert de cerebellaire foliatie, die in cultuur wordt gehandhaafd. De onderste rij richt zich op de pc-laag. PC's worden gemarkeerd door Calbindin D-28k (groen). NeuN-kleuring (rood) identificeert neuronale kernen in de lagen. (B) PC's onder de loep (rood). GFAP (groen), een intermediair filament type III-eiwit, dat astrocyten benadrukt. Schaalbalken = 968,8 μm (A, bovenste rij), 42,1 μm (A, tweede rij), 72,7 μm (B, bovenste rij), 18,2 μm (B, tweede rij). Afkortingen: PC = Purkinje cellen; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: PAR-kleuring in een cerebellaire plak behandeld met kaliumbromaat. De cerebellaire plak werd behandeld met kaliumbromaat (KBrO3) - een krachtig oxidatiemiddel, in een eindconcentratie van 10 mM gedurende 12 uur. Schaal balken = 775 μm. Afkortingen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: PAR-respons in cerebellaire plakjes blootgesteld aan paraquat, een sterke producent van superoxide-anionen. (A) Een algemeen beeld van een cerebellair folium. Let op de robuuste PAR-respons, vooral bij pc's, in vergelijking met de controle. (B) Een nader onderzoek toont de PAR-respons in PC's en andere celtypen. Schaal balken = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Afkortingen: PAR = poly(ADP-ribose); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Oplossingen en buffers
Oplossing  Ingrediënten
Dissectie mediumHank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met 0,5% D-glucose. Voeg 0,5 ml 50% D-glucoseoplossing toe aan 50 ml HBSS zonder Mg2+ en Ca2+.
BME cultuur mediumMeng 100 ml Basal Medium Eagle (BME) met fenolrood maar geen L-glutamine of HEPES, met 50 ml HBSS met fenolrood, 50 ml warmte-geïnactiveerd paardenserum, 2 ml 50% D-glucose en 1 ml 200 mM L-glutamine. Meng en filtreer door een filter van 0,22 μm in een steriele omgeving. Bewaren bij 4 °C
Blokkerende oplossing voor immunokleuringin 0,1 M Fosfaatbuffer: voeg 0,5% Triton X-100, 10% Geitenserum toe
Secundaire antilichaamverdunningsbuffer0,1 M fosfaatbuffer, 0,2%Triton X-100
Buffer voor wassen0,1 M fosfaatbuffer, 0,2%Triton X-100
Fixerende oplossingActenoe:methanol (1:1 v:v)
Permeabilisatie-oplossing0,1 M fosfaatbuffer, 1%Triton X-100
DAPI-oplossingStockoplossing (2 mg/ml) verdund tot 1 μg/ml in 1x PBS
Fosfaat bufferBereid twee soulutions A en B voor (zie hieronder). Meng oplossingen volgens de onderstaande verhoudingen om een fosfaatbuffer van 0,2 M te maken. Verdun vervolgens de 0,2M-oplossing met DDW (1:1) om 0,1 M fosfaatbuffer (werkoplossing) te maken.
oplossing A (voor 0,2 M)12 g natriumfosfaat monobasisch watervrij (Na2HPO4 FW 141.96)
500 ml DDW
Oplossing B (voor 0,2 M)14,2 g natriumfosfaat diabasisch watervrij (Na2, HPO4 , FW 141,96)
500 ml DDW
Gemengde oplossingen om 0,2 M te makenBereid 1 L voor: 230 ml oplossing A en 770 ml oplossing B
0,1 M fosfaatbufferVerdun de gemengde oplossing met DDW (1:1)

Tabel 1: Oplossingen en hun samenstelling.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algemene opmerkingen
Het grote voordeel van het organotypische kweeksysteem is dat het studies met behulp van het cerebellaire cortexweefsel vergemakkelijkt, waardoor de structurele organisatie gedurende enkele weken in de opstelling van de kweekschaal behouden blijft. Dit systeem is nuttig voor het uitvoeren van diepgaande morfologische analyses van Purkinje-cellen (PC's), inclusief gedetailleerd onderzoek van dendritische stekels en ultrastructurele kenmerken 52,53,54,55,56,57,58,59. Onze observaties geven aan dat de DNA-schaderespons (DDR) met name actief is in pc's binnen deze culturen. De belangrijkste beperkingen van dit systeem zijn echter de beperkte duur van het gebruik ervan en de afhankelijkheid van microscopische beeldvorming om cellulaire processen te volgen, wat de voortdurende noodzaak benadrukt om geschikte beeldvormingstechnieken te ontwikkelen of aan te passen.

Een ander woord van waarschuwing heeft betrekking op het cerebellaire gedeelte dat wordt ontleed voor het bereiden van de weefselplakjes. We hebben gezien dat verschillende cerebellaire kwabben culturen kunnen opleveren met een duidelijk verschillende interne organisatie en algehele kwaliteit. Daarom geven we er de voorkeur aan om culturen te maken van plakjes die zijn verkregen via midsagittale secties van de cerebellaire vermis. In deze plakjes zijn de folia van de cerebellaire cortex goed zichtbaar.

Het is raadzaam om weefselplakjes te gebruiken die zijn verkregen uit de cerebellaire vermis, die de karakteristieke foliatie van de cerebellaire cortex vertonen. Deze segmenten behouden hun organisatiestructuur in cultuur gedurende enkele weken. Bovendien wordt aanbevolen om ongeveer 7-12 dagen na vestiging met experimentele procedures met de culturen te beginnen. Een typisch experiment dat is ontworpen om de reactie op DNA-schade in deze culturen te beoordelen, omvat het initiëren van schade door bestraling of door de toevoeging van DNA-beschadigende chemicaliën aan het kweekmedium. Vervolgens worden weefselfixatie en kleuring met verschillende tijdsintervallen uitgevoerd. Om het herstel van door chemicaliën veroorzaakte schade te beoordelen, is een incubatieperiode in vers medium opgenomen. Het is raadzaam om zo snel mogelijk langdurige experimenten te starten, idealiter ongeveer 7 dagen na de oprichting van de cultuur.

De cerebellaire organotypische culturen worden bewaard in een medium zonder antibiotica; Het is dus absoluut noodzakelijk om tijdens hun vestiging een steriele omgeving te behouden. De leeftijd van de pups waaruit de cerebella worden geoogst is van cruciaal belang, met een aanbevolen bereik van 9-12 dagen. Deze leeftijdscategorie is optimaal omdat de cerebellaire cortex voldoende ontwikkeld is om in secties te worden ingedeeld. Met name bij oudere dieren hebben de weefsels de neiging om zich aan het mes te hechten. Het is van cruciaal belang om het cerebellum ondergedompeld te houden in een koude dissectieoplossing totdat het is ontleed.

Tijdens de eerste 5-7 dagen in kweek kunnen de weefselplakjes tekenen vertonen die doen denken aan een ontsteking, gekenmerkt door zwelling en melkachtige verkleuring. Deze eigenschappen kunnen mogelijk van invloed zijn op de meting van fysiologische parameters en de effectiviteit van immunokleuringstechnieken.

Het wordt ten zeerste aanbevolen om het cerebellum niet dunner dan 350 μm te snijden om inconsistentie in dikte tijdens het snijden te voorkomen. Houd er rekening mee dat een weefsel van 350 μm na 7 dagen in kweek veel dunner wordt tot ongeveer 90 μm (op basis van de meting van de Z-stapel).

Hier introduceren we PAR-kleuring 7,50 in de toolkit die wordt gebruikt om de DDR in pc's te onderzoeken. Deze uitlezing is snel, gevoelig en geeft de dynamische aard van de DDR weer, wat vooral nuttig blijkt te zijn bij onze analyse van de DDR in wild-type en ATM-deficiënte pc's. De hier beschreven protocollen zouden vooral nuttig moeten zijn voor onderzoekers die genomische instabiliteitssyndromen bestuderen die het cerebellum aantasten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot deze studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door de Dr. Miriam en Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation en de Israëlische Vereniging voor de Bestrijding van de A-T Ziekte.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens en apparatuur
150 x 30 cm Petri schotelCorning Inc.3261
35 x 10 mm Petri schotelCorning Inc.3294
AcetonInvitrogen25030081
AcetonSigma-Aldrich270725-1L
Zelfklevende microscoopglaasjesMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Messen voor chopperTED PELLAModel TC752-1 Style Razor Blades
BMEGIBCO41010-026 500ml. Geen L-Glut
Celcultuur insertsMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS zonder fenol roodSigma-AldrichH-1138-500LGeen Ca+, Geen Mg+
HBSS met fenol roodSartorius02-015-1A
Paarden serum GIBCO26050088hitte geïnactiveerd
Iris forcepsCellPathGZX-0100-00A130mm stomp gekarteld
Iris spatelF.S.T10092-12
L-Glutamine (200 mM)Gibco41010026
MethanolSigma-Aldrich322412-1L
Methanol Sigma-AldrichG5767
MicroscoopOlympus
Montage medium zonderGRIGENE. Ltd, IsraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat tweechloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase remmerTocris Bioscience, United KingdomPDD 00017273licht gevoelig 
Fosfaat bufferBiological Indo.02-018-1A
Schaar, huid-weefsel
Zes-well platenCorning incorporatedCLS3516
Reserve snijschijven TED PELLAModel 10180-01
Weefsel chopperMcIlwainModel TC75210180-220
Pincet, puntig
Urinaire bekers
Antilichamen
Alexa fluor 488 ezel anti Konijn IgG 
Invitrogen		A212061:500; secundair ab; Secundaire dilutiebuffer;  Incubatie gedurende 2 h bij kamertemperatuur
Anti glial fibrillair zuur proteïneMilliphoreMAB34021:1500; primair ab; blokkering; Host:muis
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; primair ab; blokkering; host: konijn 
Anti-calbindin-D-28KSwantCB-38a1:2000; primair ab; blokkering 
Anti-pan-ADP-ribose reagensMilliphoreMABE10161:800; primair ab; blokkering; incubatie gedurende 2 h bij kamertemperatuur
DAPI (4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydrochloride)Cell signaling40841:1000; secundaire dilutiebuffer; incubatie gedurende 20 min bij kamertemperatuur

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ataxie telangiectasieATM defici ntiefluorescentie imagingpoly ADP ribosegenoominstabiliteitprote necorrelatiecalbindine kleuring

Gerelateerde artikelen