Dit artikel introduceert een gestandaardiseerde procedure voor gecontroleerde, omkeerbare malperfusie van viscerale organen in rattenmodellen. Het doel is om deze malperfusietoestanden te induceren met een hoge mate van methodologische zekerheid en controle, met behoud van technische eenvoud en foutbestendigheid.
Methodenartikel
Gecontroleerde reversibele viscerale arteriële ischemie, veneuze congestie en gecombineerde malperfusie via laparotomie op de middellijn bij ratten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naast sepsis en maligniteit is malperfusie de derde belangrijkste oorzaak van weefselafbraak en een belangrijk pathomechanisme voor verschillende medische en chirurgische aandoeningen. Ondanks belangrijke ontwikkelingen zoals bypassoperaties, endovasculaire procedures, extracorporale membraanoxygenatie en kunstmatige bloedvervangers, blijft weefselmalperfusie, vooral van viscerale organen, een urgent probleem in de patiëntenzorg. De vraag naar verder onderzoek naar biomedische processen en mogelijke interventies is groot. Valide biologische modellen zijn van het grootste belang om dit soort onderzoek mogelijk te maken. Vanwege de multifactoriële aspecten van weefselperfusieonderzoek, die niet alleen celbiologie omvatten, maar ook vasculaire microanatomie en reologie, vereist een geschikt model een mate van biologische complexiteit die alleen een diermodel kan bieden, waardoor knaagdieren het voor de hand liggende model bij uitstek zijn. Weefselmalperfusie kan worden onderscheiden in drie verschillende aandoeningen: (1) geïsoleerde arteriële ischemie, (2) geïsoleerde veneuze congestie en (3) gecombineerde malperfusie. Dit artikel presenteert een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de gecontroleerde en omkeerbare inductie van deze drie soorten viscerale malperfusie via laparotomie op de middellijn en klemming van de abdominale aorta en cavalader bij ratten, waarbij het belang wordt onderstreept van nauwkeurige chirurgische methodologie om uniforme en betrouwbare resultaten te garanderen. Belangrijke voorbeelden van mogelijke toepassingen van dit model zijn de ontwikkeling en validatie van innovatieve intraoperatieve beeldvormingsmodaliteiten, zoals hyperspectrale beeldvorming (HSI), om malperfusie van gastro-intestinale, gynaecologische en urologische organen objectief te visualiseren en te differentiëren.
Inleiding
Hoewel de implicaties van weefselperfusiedeprivatie in de vorm van lokale of systemische weefselmalperfusieomstandigheden al lang worden erkend, blijven ze bestaan als een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in zowel de Verenigde Staten als Europa1. Deze malperfusieaandoeningen zijn de derde belangrijkste oorzaak van weefselafbraak, na maligniteit en septische ontsteking, maar hebben een veel breder spectrum van oorsprong in vergelijking met de laatste twee2.
Dit spectrum varieert van lokale mechanismen zoals boezemfibrilleren met trombo-embolische occlusie, vasoconstrictie en iatrogene of traumatische dissectie, tot systemische mechanismen zoals hartinsufficiëntie of shock, sepsis, hypovolemie en stealverschijnselen. Deze diverse mechanismen liggen ten grondslag aan een verscheidenheid aan medische en chirurgische aandoeningen. De aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit die met deze aandoeningen gepaard gaan, hebben de medische aandacht gericht op procedures voor het herstellen van de bloedtoevoer naar verkeerd doorbloede weefsels om necrose te voorkomen en de orgaanfunctie in de loop van de decennia te herstellen.
Deze onderzoeksinspanning heeft geresulteerd in een verscheidenheid aan farmaceutische, medische en chirurgische oplossingen om fysiologische orgaanperfusie te herstellen, waaronder vooruitgang in bypasschirurgie4, endovasculaire procedures5, extracorporale membraanoxygenatie 6,7, orgaanmachineperfusie tijdens transplantatie8 en kunstmatige bloedvervangers9.
Maar ondanks deze belangrijke ontwikkelingen blijft malperfusie, vooral van viscerale organen, een urgent probleem in de patiëntenzorg, en de vraag naar verder onderzoek naar biomedische processen en reddingsstrategieën is groot. Valide biologische modellen zijn van het grootste belang om dit soort onderzoek mogelijk te maken. Vanwege de multifactoriële aspecten van weefselperfusieonderzoek, die niet alleen celbiologie omvatten, maar ook vasculaire microanatomie en reologie, vereist een geschikt model een mate van biologische complexiteit die alleen een compleet modelorganisme kan bieden, waardoor knaagdieren het voor de hand liggende model bij uitstek zijn.
Weefselmalperfusie kan worden onderscheiden in drie verschillende aandoeningen: geïsoleerde arteriële ischemie, geïsoleerde veneuze congestie en gecombineerde malperfusie10. Klinisch relevante scenario's voor deze aandoeningen zijn onder meer (1) Arteriële ischemie: boezemfibrilleren met trombo-embolische occlusie, septische embolie, vasoconstrictie, iatrogene of traumatische vasculaire dissectie of klemmen, hartinsufficiëntie of shock, aortadissectie, sepsis en hypovolemie, extreme arteriële obstructie als gevolg van uitwendige vernauwing, longslagaderembolie, chronische arteriële vasculaire occlusieve ziekten of stealverschijnselen; (2) Veneuze congestie: iatrogene of traumatische vasculaire dissectie of klemming, hartfalen, leverfibrose of cirrose, veneuze obstructie als gevolg van uitwendige vernauwing, veneuze trombose, veneuze insufficiëntie en Budd-Chiari-syndroom; (3) Gecombineerde malperfusie: Combinaties van de bovenstaande aandoeningen en gevorderde stadia van de bovengenoemde aandoeningen, zoals secundaire veneuze congestie als gevolg van ischemie-geïnduceerde fibrose of secundaire arteriële ischemie als gevolg van congestie-geïnduceerde retentie, evenals specifieke orgaanaandoeningen zoals ischemische ontsteking (bijv. ischemische colitis)11,12.
Dit artikel is daarom bedoeld om een stapsgewijs model te bieden voor het induceren van gecontroleerde, omkeerbare viscerale arteriële ischemie, veneuze congestie en gecombineerde malperfusie via laparotomie op de middellijn bij ratten voor zowel overlevings- als niet-overlevingstoepassingen, zoals weergegeven in figuur 1. Het experimentele model biedt een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van de veelzijdige dynamiek van arteriële ischemie, veneuze congestie en hun gecombineerde gevolgen, waarbij klinisch relevante scenario's worden nagebootst die bij verschillende aandoeningen worden aangetroffen.
Figuur 1: Overzicht van het protocol. Schematische weergave van de anatomie van de vasculaire rat en weergave van de klemplaats (grijze pijl). (A) Fysiologische perfusie. (B) Arteriële ischemie. (C) veneuze congestie. (D) Gecombineerde malperfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Alle hier beschreven dieractiviteiten werden uitgevoerd in geaccrediteerde faciliteiten en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de regionale raad van Baden-Württemberg in Karlsruhe, Duitsland (35-9185.81/G-62/23). Proefdieren werden beheerd volgens institutionele normen, Duitse wetten voor diergebruik en -verzorging, de richtlijnen van de Europese Gemeenschapsraad (2010/63/EU) en de ARRIVE-richtlijnen. Mannelijke Sprague Dawley-ratten met een ordergewicht van 400 gram werden gebruikt nadat ze een week waren geacclimatiseerd. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Anesthesie en analgesie
- Verdoof de rat met de medicatie volgens de institutionele protocollen. Isofluraan wordt aanbevolen voor inductie van sedatie, gevolgd door een i.p.-injectie van 100 mg/kg lichaamsgewicht ketamine en 4 mg/kg lichaamsgewicht xylazine. Aanvullende analgesie kan worden bereikt met een s.c. injectie van 5 mg/kg lichaamsgewicht carprofen. Voor details verwijzen wij u naar Studier-Fischer et al.13.
- Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Garandeer de juiste analgetische diepte met behulp van de teenknijptest met een chirurgische pincet.
- Beoordeel en pas de diepte van de anesthesie tijdens de operatie regelmatig aan.
2. Voorbereiding van de procedure
- Bereid de schrobtafel voor met alle benodigde materialen en instrumenten, inclusief loslaatbare microvasculaire klemmen en de applicator (Figuur 2A-C), stompe overholtklem, fijne voorbereidingsschaar en pincet.
- Bereid de chirurgische voorbereidingshaken voor door canules in een hoek van 135° op 1 cm ten opzichte van de punt te vouwen en sluit ze aan op plastic perfusiebuizen via Luer-lock, klaar om spanning uit te oefenen met behulp van een chirurgische muggenklem (Figuur 2D,E).
- Bereid een chirurgisch blootstellingsapparaat voor knaagdieren voor, inclusief Y-vormige fixatiestaven en een verwarmingskussen, zoals gespecificeerd in Studier-Fischer et al.13.
- Zorg ervoor dat de juiste oxygenatie wordt bereikt door het inademen van 100% zuurstof met behulp van een neonataal gezichtsmasker (Figuur 2F).
Figuur 2: Experimentele en dierlijke opstelling. (A) Benodigde chirurgische instrumenten en materialen. (B,C) Loslaatbare microvasculaire klem en applicator. (D,E) Een gevouwen canule die is aangesloten op een perfusiebuis wordt gebruikt als chirurgische voorbereidingshaak. (F,G) Rattenmodel zuurstofrijk met een gezichtsmasker en geschoren. (H) Cutane incisie over de gehele buiklengte. (I-M) resectie van de xiphoid en hemostase. (N-Q) Levermobilisatie en dissectie van het falciforme ligament (pijl 1). (R) Toepassing van preparaathaken en metalen standaards voor blootstelling van organen na laparotomie. (S) Volledige viscerale blootstelling van grote abdominale bloedvaten met behulp van stompe haken (pijl 2), lussen van siliconenvaten (pijl 3) en chirurgisch kompres (pijl 4). (T,U) Abdominale aorta en cavalader. (V) Instrumenten voor de voorbereiding op atraumatische middelen. (W) Bevochtigde katoenwissel (pijl 5). (X) Bevochtigd kompres in een tang (pijl 6) en stompe overholtklemmen (pijl 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Chirurgische voorbereiding
- Scheer de chirurgische toegangsplaats voor een laparotomie op de middellijn (Figuur 2G). Voer een cutane incisie uit over de gewenste buiklengte, d.w.z. ongeveer 7 cm (Figuur 2H), ga verder met de laparotomie door de fascia te ontleden en hecht de chirurgische voorbereidingshaken met bevestigde plastic buisjes en chirurgische muggenklemmen door de huid. Leg de chirurgische situs bloot met behulp van de chirurgische voorbereidingshaken en oefen spanning uit op het weefsel.
- Zorg ervoor dat het buikvlies slechts tot enkele millimeters onder het begin van het borstbeen craniaal wordt ontleed, waarbij een deel van het buikvlies intact blijft. Plaats een deel van een chirurgisch kompres onder het borstbeen (Figuur 2I) en snijd de xiphoid weg met een schaar van sterk materiaal. Oefen druk uit op het resectiegebied met behulp van het chirurgische kompres om voldoende hemostase van dit goed doorbloede gebied te bereiken (Figuur 2I-M).
- Mobiliseer de lever dorso-caudaal om het falciforme ligament bloot te leggen (Figuur 2N) en het ligament te ontleden (Figuur 2O-Q).
- Voor hemostatische controle voert u, afhankelijk van waar de klemming van de belangrijkste bloedvaten moet worden uitgevoerd, een volledige viscerale blootstelling uit van de grote abdominale vaten (Figuur 2R) en de vaten die zijn geslingerd met siliconenvatlussen (Figuur 2S-U). Er mogen alleen atraumatische voorbereidingsinstrumenten worden gebruikt (Figuur 2V), zoals bevochtigde katoenen swaps (Figuur 2W), bevochtigd kompres in een pincet en stompe overholtklemmen (Figuur 2X).
4. Voorbereiding en klemming van de abdominale aorta voor arteriële ischemie
- Voer een linker medialisatie van de bovenste buikorganen uit met behulp van atraumatische voorbereidingsinstrumenten om toegang te krijgen tot de linker bijnierslagader (Figuur 3A-D).
- Identificeer de pulserende plaats die typisch mediaal is ten opzichte van de craniale verlenging van de linker bijnierslagader, en geef het verloop van de aorta aan (Figuur 3E). Ga door het zachte weefsel met behulp van overholtklemmen voor stompe dissectie om toegang te krijgen tot de abdominale aorta (Figuur 3F,G).
- Tunnel de abdominale aorta aan het meest craniale uiteinde met behulp van stompe overholtklemmen (Figuur 3H-L) en slinger de aorta met behulp van een lus van siliconen bloedvaten (Figuur 3M-T).
- Breng een geschikte microvasculaire klem voor het aneurysma aan met behulp van de siliconenlus om de aorta ventraal enigszins te luxeren en leid de microvasculaire klem van het aneurysma langs de siliconenlus om geïsoleerde aortaklemming te garanderen (Figuur 3U). Afhankelijk van de onderzoeksvraag kan de microvasculaire klem weer losgemaakt worden.
Figuur 3: Voorbereiding en klemming van de abdominale aorta. (A) Blootstelling van viscerale organen. (B-E) Linker medialisatie van organen in de bovenbuik met behulp van atraumatische voorbereidingsinstrumenten om toegang te krijgen tot de linker bijnierslagader. (F,G) Stompe dissectie mediaal van de linker bijnierslagader op de pulserende plaats (grijze pijl) om toegang te krijgen tot de abdominale aorta. (H-L) Tunneling van de abdominale aorta met behulp van stompe overholtklemmen. (M-T) Slingeren van de aorta met behulp van een siliconen vatlus. (U) Toepassing van een loslaatbare microvasculaire klem van het aneurysma met behulp van de siliconenlus als geleiding. (V-Z) Visualisatie van de coeliakie slagader (oranje) in relatie tot de aorta (rood) en de lus van de siliconenvaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Voorbereiding en klemming van suprahepatische abdominale cavalader voor veneuze congestie
- Mobiliseer de lever naar rechts met behulp van atraumatische voorbereidingsinstrumenten, ontleed de leverligamenten scherp en lateraliseer de lever verder (Figuur 4A-C).
- Open de retrohepatische ruimte aan de linkerkant van het diafragma met behulp van stompe overholtklemmen (Figuur 4D-G).
- Tunnel de cavalader met behulp van stompe overholtklemmen (Figuur 4H-K) en slinger de cavalader met behulp van siliconen vatlussen (Figuur 4L-O).
- Breng een geschikte microvasculaire klem voor het aneurysma aan met behulp van de siliconenlus om de cavalenader ventraal lichtjes te luxeren en leid de microvasculaire klem van het aneurysma langs de siliconenlus om een geïsoleerde klemming van de cavalader te garanderen (Figuur 4R).
Figuur 4: Voorbereiding en klemming van de suprahepatische abdominale cavalader. (A) Blootstelling van craniale viscerale organen. (B) Weefselbeschermende mobilisatie van de lever en scherpe dissectie van leverligamenten met behulp van atraumatische voorbereidingsinstrumenten. (C) Lateralisatie van de lever. (D-G) De opening van de retrohepatische ruimte en voorbereiding aan de linkerkant crus van het diafragma. (H-K) Tunneling van de cavalader (blauw) met behulp van stompe overholtklemmen. (L-O) Slingeren van de cavalader met behulp van siliconen vatlussen. (P,Q) Inspanning van spanning om de bloedstroom in de caval voorzichtig te beperken. (R) Toepassing van een loslaatbare aneurysma microvasculaire klem met behulp van de siliconenlus als geleiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Afklemming van de abdominale aorta en suprahepatische abdominale cavalader voor gecombineerde malperfusie
- Voer de bovenstaande stappen uit totdat zowel de aorta als de cavalader zijn vastgeslingerd met lussen van siliconenvaten. Ga verder met het aanbrengen van de microvasculaire klem van het aneurysma voor beide bloedvaten, opnieuw met behulp van de siliconenlus als geleiding. Het wordt aanbevolen om eerst de aorta af te klemmen en de tijd die nodig is tot de daaropvolgende cavalklemming te minimaliseren tot slechts enkele seconden.
OPMERKING: Afhankelijk van het gewenste scenario en het onderzoeksdoel kan malperfusie na een bepaalde tijdspanne worden voortgezet of vrijgegeven, en kunnen dieren ofwel worden geëuthanaseerd door middel van een scherpe cardiectomie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) voor niet-overlevingstoepassingen, of stapsgewijze abdominale sluiting krijgen met behulp van chirurgische hechtingen in geval van geplande follow-ups en overlevingsexperimenten. Voor het huidige onderzoek werden de dieren geëuthanaseerd.
Resultaten
Dit protocol werd uitgevoerd bij 10 mannelijke ratten (gemiddeld gewicht 403 g ± 26 g) in een niet-overlevingssetting. Het slagingspercentage werd bepaald door overleving gedurende 20 minuten na arteriële klemming, veneuze klemming en gecombineerd klemmen gedurende 5 minuten met 10 minuten reperfusie, die elk 100% waren. De gemiddelde duur van het preparaat vanaf de incisie in de huid tot het moment dat beide bloedvaten met siliconenlussen werden geslingerd, was 11 minuten en 45 seconden ± 3 minuten en 23 seconden.
Voor validatie van de 4 verschillende malperfusietoestanden werden indexparameters voor oxygenatie (StO2) en perfusie (NIR) gemeten met behulp van hyperspectrale beeldvorming (HSI) over 5 viscerale organen (Figuur 5).
Figuur 5: Validatie van het malperfusiemodel. (A,B) Kwantificering van HSI-oxygenatie- en perfusiewaarden over vier verschillende perfusietoestanden en vijf verschillende viscerale organen met n = 10 dieren. (C-F) RGB- en kleurgecodeerde indexfoto's van HSI-opnames met viscerale organen in 4 verschillende perfusietoestanden. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De schaalbalk geeft 5 cm weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De waarden werden verstrekt in willekeurige eenheden en vertoonden een significante afname van de malperfusietoestanden in vergelijking met de fysiologische orgaantoestand (tabel 1). De hyperspectrale resultaten waren in lijn met recente publicaties die aangeven dat levensvatbaarheid en perfusie van weefsel kunnen worden geëvalueerd met behulp van orgaanspecifieke HSI StO 2-afkapwaarden die overeenkwamen met de waarden die in deze studie werdengezien14,15. Voorbeeldig voor de maag waren dit 64,1% (±9,4%) voor fysiologische perfusie, 43,1% (±7,4%) voor arteriële ischemie, 40,5% (±5,4%) voor veneuze congestie en 39,3% (±4,5%) voor gecombineerde malperfusie.
Aangezien dit niet-overlevingsexperimenten waren, zijn er geen experimentele gegevens over de langetermijnresultaten van de dieren. Andere studies rapporteren echter een overleving van 100% en 57% gedurende 24 uur voor ratten die 30 minuten en 60 minuten superieure mesenteriale slagaderklemming16,17 ondergingen en deze met succes correleren met serumspiegels van Heat Shock Protein 70. Bijgevolg zou dit een mogelijke methode kunnen zijn om de resultaten in toekomstige overlevingsstudies te beoordelen op basis van verschillende klemtijden.
| parameter | orgel | basislijn | Arteriële ischemie | Veneuze congestie | Gecombineerde malperfusie |
| StO2 | maag | 64,1% (±9,4%) | 43,1% (±7,4%) | 40,5% (±5,4%) | 39,3% (±4,5%) |
| dunne darm | 78,4% (±5,1%) | 44,8% (±5,5%) | 38,0% (±7,9%) | 41,9% (±6,9%) | |
| dikke darm | 74,6% (±5,0%) | 56,0% (±6,3%) | 51,3% (±4,1%) | 51,8% (±2,9%) | |
| lever | 39,5% (±9,7%) | 16,9% (±2,6%) | 9,5% (±0,8%) | 9,3% (±1,1%) | |
| nier | 71,0% (±3,8%) | 26,3% (±3,0%) | 18,6% (±2,5%) | 21,2% (±2,6%) | |
| NIR | maag | 20,0% (±9,3%) | 8,3% (±6,7%) | 6,8% (±5,1%) | 7,5% (±8,1%) |
| dunne darm | 38,6% (±17,4%) | 12,9% (±11,0%) | 6,3% (±6,5%) | 5,7% (±5,9%) | |
| dikke darm | 12,6% (±13,7%) | 5,3% (±8,7%) | 3,8% (±7,5%) | 2,6% (±4,7%) | |
| lever | 40,4% (±13,1%) | 0,3% (±0,7%) | 0,0% (±0,1%) | 0,0% (±0,0%) | |
| nier | 10,4% (±5,2%) | 0,0% (±0,0%) | 0,0% (±0,1%) | 0,0% (±0,0%) |
Tabel 1: Weefselparameters. HIS StO2 oxygenatie- en NIR-perfusiewaarden in willekeurige eenheden over 5 viscerale organen en 4 verschillende perfusietoestanden.
Discussie
Hoewel perifere arteriële occlusieve ziekte (PAOD) alleen, als de meest prominente vertegenwoordiger van weefselmalperfusieaandoeningen, al een prevalentie van ongeveer 7% heeft, die alleen al in de Verenigde Staten naar schatting 8,5 miljoen volwassenen treft18, is weefselmalperfusie in het algemeen een relevant pathomechanisme bij de meeste chirurgische en medische aandoeningen. Daarom zijn geschikte en reproduceerbare diermodellen absoluut noodzakelijk om nieuwe onderzoeksvragen op dit gebied aan te pakken.
De drie vasculaire dynamische situaties die onderscheidend onderzoek vereisen, zijn arteriële ischemie, veneuze congestie en gecombineerde malperfusie. Door geïsoleerde arteriële ischemie te induceren, kunnen wetenschappers de temporele en ruimtelijke progressie van weefselhypoxie nauwkeurig afbakenen, waarbij ze de moleculaire cascades onderzoeken die betrokken zijn bij ischemie-reperfusieschade, cellulaire apoptose en ontstekingsreacties. Door veneuze drainage in gevaar te brengen, een vaak over het hoofd gezien facet van vasculaire pathologie, kunnen wetenschappers de wisselwerking tussen arteriële instroom en veneuze uitstroomdiscrepanties onderzoeken, waardoor licht wordt geworpen op de pathofysiologie van veneuze trombose, congestiegerelateerd weefseloedeem en disfunctie van de microcirculatie. Bij het combineren van beide pathologische situaties kan men het dyssynergetische milieu van gecombineerde malperfusie onderzoeken, een afspiegeling van de complexe pathofysiologie die wordt aangetroffen bij klinische syndromen zoals acute mesenteriale ischemie en ischemische colitis.
Naast het ophelderen van fundamentele pathofysiologische mechanismen, dient het vermogen om viscerale arteriële ischemie, veneuze congestie en gecombineerde malperfusie bij ratten te induceren als een onmisbaar platform voor het evalueren van de werkzaamheid van farmacologische interventies, chirurgische technieken, nieuwe therapeutische strategieën en innovatieve beeldvormingsmodaliteiten, vooral zoals HSI 14,19,20,21,22. Dit model is daarom een belangrijk onderdeel bij het leveren van de vereiste biologische weefselgrondwaarheid die nodig is om het volledige potentieel van HSI te benutten bij weefselevaluatie en identificatie van perfusietoestanden. Door gebruik te maken van deze experimentele opzet kunnen onderzoekers de vertaling van preklinische bevindingen naar klinisch levensvatbare strategieën versnellen, waardoor uiteindelijk de morbiditeit en mortaliteit die gepaard gaan met diverse vasculaire en perfusiestoornissen worden verminderd.
Ter illustratie kunnen onderzoekers dit model gebruiken om de werkzaamheid te onderzoeken van farmacologische middelen die gericht zijn op ischemie-reperfusieletselroutes, zoals antioxidanten, ontstekingsremmende middelen en vaatverwijders, waardoor hun potentiële bruikbaarheid in de klinische praktijk wordt afgebakend23,24. Bovendien vergemakkelijkt dit model de beoordeling van nieuwe chirurgische benaderingen, zoals mesenteriale revascularisatietechnieken en veneuze decompressieprocedures, en biedt het onschatbare inzichten in hun haalbaarheid, veiligheid en werkzaamheid op lange termijn25,26.
Bovendien stelt dit experimentele kader onderzoekers in staat om de ingewikkelde wisselwerking tussen vasculaire disfunctie en systemische comorbiditeiten, zoals diabetes, hypertensie en atherosclerose, te onderzoeken, waardoor het ingewikkelde web van onderling verbonden pathofysiologische routes wordt geïllustreerd die de progressie van vasculaire ziekten orkestreren27,28.
Hoewel er verschillende publicaties zijn over selectieve malperfusie van afzonderlijke organen, zoals de lever 29,30,31 of nier, bij ratten32,33, is er een gebrek aan wetenschappelijke literatuur over malperfusie van de volledige ingewanden bij ratten en is er expliciet geen methodisch protocol. Dat is dan ook de bewering van dit manuscript. Beperkingen van de gepresenteerde techniek omvatten voornamelijk de invasiviteit van de procedure en, afhankelijk van de duur van malperfusie, opeenvolgende orgaantrombose en disfunctie, mogelijk leidend tot postoperatief lijden door multi-orgaanfalen of abdominaal compartimentsyndroom 34,35,36. Zorgvuldige planning en ontwerp, afhankelijk van de onderzoeksvraag, kunnen helpen om de vereiste duur van malperfusie en de pathofysiologische gevolgen ervan in evenwicht te brengen.
Bij het oplossen van veelvoorkomende uitdagingen die zich tijdens de procedure voordoen, moet de aandacht worden gevestigd op de volgende punten en aanbevelingen: (1) Zorg voor een grondige voorbereiding van apparatuur en medicatie vooraf om onderbrekingen tijdens de procedure tot een minimum te beperken; (2) Voer hemostatische controle nauwgezet uit door avasculaire vlakken zorgvuldig voor te bereiden en te ontleden. Overweeg het gebruik van een bipolaire hemostatische pincet voor elektrische hemostase, indien beschikbaar; (3) Minimaliseer trauma aan weefsels door niet-traumatische instrumenten te gebruiken, zoals bevochtigde wattenstaafjes of bevochtigd chirurgisch kompres met een pincet bij contact met het leverparenchym; (4) Ongeveer 20% van de dieren had last van diffuse oppervlakkige leverparenchymbloedingen als gevolg van delicate weefselaandoeningen. Het bloeden stopte echter in alle gevallen met lichte compressie en geduld. Deze aanbevelingen zijn bedoeld om de procedurele efficiëntie te verbeteren en complicaties tijdens de inductie van malperfusie in rattenmodellen te minimaliseren.
Zorg er bij het resectieren van de xiphoid voor een betere toegang tot de cavalader voor dat het buikvlies dorsaal naar de overgang tussen de xiphoid en het borstbeen over een paar millimeter intact blijft. De resectieplaats van de xiphoid zal hard en scherp zijn, wat mogelijk trauma aan het oppervlakkige leverparenchym kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen om het retrosternale peritoneum caudaal te mobiliseren met een tang en effectief om de botstomp te wikkelen, deze te bedekken en hemostase te ondersteunen. De chirurgische voorbereidingshaken moeten met craniale spanning door de craniale ventrale buikwand worden gehecht, zodat de peritoneale bedekking van de xiphoid-stomp op zijn plaats blijft.
Bij het ontleden van het falciforme ligament moet ervoor worden gezorgd dat er niet per ongeluk iatrogeen letsel aan de leverader wordt veroorzaakt, aangezien dit fataal kan zijn voor het dier. Vanwege het hoge risico op bloedingen tijdens de vasculaire voorbereiding, wordt aanbevolen om het grootste deel van de chirurgische voorbereiding uit te spreiden met stompe overholtklemmen, in plaats van scherpe dissectie-instrumenten te gebruiken. Bovendien moeten de lussen van siliconenvaten vóór gebruik worden bevochtigd om oppervlaktewrijving te verminderen en het risico op weefseltrauma te minimaliseren.
Bij het aanbrengen van de microvasculaire klem van het aneurysma is het cruciaal om de exacte vasculaire anatomie in beeld te brengen. De coeliakie-slagader is bijvoorbeeld heel craniaal afkomstig van de abdominale aorta. Als coeliakie-occlusie gewenst is, zoals bij het onderzoeken van levermalperfusie, moet de coeliakie-slagader worden gevisualiseerd in verwijzing naar de aorta en de lus van het siliconenvat. Dit zorgt ervoor dat de coeliakie-slagader wordt opgenomen in het afgeklemde vaatweefsel (Figuur 2V-Z). Er was één geval waarin de klem aanvankelijk per ongeluk caudaal op de coeliakie-slagader werd geplaatst. Dit werd echter onmiddellijk herkend vanwege de ontbrekende daling van de StO2-leverwaarden, en de juiste herklemming werd met succes uitgevoerd.
De gevaarlijkste voorbereidingsstap is het tunnelen van de cavalader. Deze stap vereist zachte bewegingen en geduld, en overholtklemmen mogen alleen worden gespreid als er zeker van is dat er geen contact is met de cavalader. Het kan een uitdaging zijn om dit te beoordelen, omdat de cavalader eruitziet als dun avasculair bindweefsel wanneer lichte compressie wordt toegepast, waardoor het ingesloten bloed in beide richtingen verdwijnt. Er bestaat ook een risico op onbedoelde opening van het pleurale vlies en het ontstaan van een pneumothorax wanneer de cavalader te craniaal wordt getunneld. Dit kan een ernstige en levensbedreigende complicatie zijn, vooral omdat het dier spontaan ademt en er geen invasieve ademhalingsmaatregelen kunnen worden genomen. Het is nuttig gebleken om de voorbereidingsinstrumenten iets in te trekken en meer caudaal verder te gaan om deze complicatie te voorkomen. In gevallen van hemodynamisch relevante en zichtbare pneumothorax met uitstulping van het leverdiafragma, kan een transdiafragmatische eenmalige punctie en aspiratie van de ingesloten lucht met behulp van een naald van 30 G en een kleine spuit worden aanbevolen als reddingsstrategie. Deze techniek werd met succes toegepast bij één dier om het intraoperatief te redden.
Ten slotte moet speciale aandacht worden besteed aan het aanbrengen van de microvasculaire klemmen om te voorkomen dat het omliggende bindweefsel wordt opgenomen, wat zou kunnen leiden tot onvoldoende occlusie van het gewenste bloedvat.
Hoewel dit protocol bedoeld is als een stapsgewijze handleiding voor wereldwijde viscerale malperfusie, kan de klemplaats worden aangepast aan de specifieke onderzoeksvraag vanwege de uitgebreide vasculaire voorbereiding en mobilisatie die wordt weergegeven in figuur 1T-V. Daarom is geselecteerde malperfusie van orgaangroepen of afzonderlijke organen ook een optie bij het kiezen van de klemplaats verder distaal langs de vasculaire boom, zoals het selectief afklemmen van de coeliakiestam voor hepatische ischemie. Door een gedetailleerde en reproduceerbare methodologie aan te bieden, faciliteert dit protocol een gestandaardiseerde aanpak voor gecontroleerde omkeerbare arteriële ischemie, veneuze congestie en gecombineerde malperfusie in rattenmodellen, wat leidt tot verbeterde gegevensbetrouwbaarheid, robuustheid, onafhankelijkheid van onderzoekers en vergelijkbaarheid in toekomstige dierstudies. Bijgevolg is het een onmisbaar hulpmiddel binnen het arsenaal aan biomedisch onderzoek, dat inzicht biedt in de complexe wisselwerking tussen vasculaire compromissen, weefselbeschadiging en therapeutische interventies. Door gebruik te maken van de veelzijdigheid van deze experimentele opstelling, kunnen onderzoekers de mysteries rond vasculaire pathofysiologie onderzoeken, nieuwe grenzen smeden in translationele geneeskunde en uiteindelijk de patiëntresultaten verbeteren op het gebied van vasculaire gezondheid.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de gegevensopslagservice die SDS@hd ondersteund door het ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Kunsten Baden-Württemberg (MWK) en de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) via subsidies INST 35/1314-1 FUGG en INST 35/1503-1 FUGG. Verder zijn de auteurs dankbaar voor de steun van het NCT (National Center for Tumor Diseases in Heidelberg, Duitsland) via het gestructureerde postdoc-programma en het Surgical Oncology-programma. We erkennen ook de steun via staatsfondsen die zijn goedgekeurd door het deelstaatparlement van Baden-Württemberg voor de Innovation Campus Health + Life Science Alliance Heidelberg Mannheim vanuit het gestructureerde postdoc-programma voor Alexander Studier-Fischer: Artificial Intelligence in Health (AIH) - Een samenwerking van DKFZ, EMBL, Universiteit van Heidelberg, Universitair Ziekenhuis Heidelberg, Universitair Ziekenhuis Mannheim, Centraal Instituut voor Geestelijke Gezondheid, en het Max Planck Instituut voor Medisch Onderzoek. Bovendien erkennen we de steun via het DKFZ Hector Cancer Institute van het Universitair Medisch Centrum Mannheim. Voor de publicatiekosten erkennen we financiële steun van Deutsche Forschungsgemeinschaft binnen het financieringsprogramma "Open Access Publikationskosten" en van de Universiteit van Heidelberg.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Atraumatische preparatietang | Aesculap | FB395R | DE BAKEY ATRAUMATA atraumatische forceps, recht |
| Blunt overholt klem | Aesculap | BJ012R | BABY-MIXTER preparatie en ligatuurklem, gebogen, 180 mm |
| Canule | BD (Beckton, Dickinson) | 301300 | BD Microlance 3 canule 20 G |
| Fixatiestaven | legefirm | 500343896 | stemvorken gebruikt als Y-vormige metalen fixatiestaven |
| Verwarmingskussen | Royal Gardineer | IP67 | Royal Gardineer Verwarmingskussen Maat S, 20 Watt |
| Kunststof perfusorslang | M. Schilling GmbH | S702NC150 | verbindingsslang COEX 150 cm |
| Siliconen vaatlus | SERAG WIESSNER | SL26 | siliconen vaatlus 2,5 mm rood |
| Spraque Dawley rat | Janvier Labs | RN-SD-M | Spraque Dawley rat |
| Stalen plaat | Maschinenbau Feld GmbH | C010206 | Gegalvaniseerde plaat, 40 x 50 cm, dikte 4,0 mm |
| Yasargil clip | Aesculap | FE795K | YASARGIL Aneurysma Clip Systeem Phynox Tijdelijk (Standaard) Clip |
| Yasargil clip applicator | Aesculap | FE558K | YASARGIL Aneurysma Clip Applicator Phynox (Standaard) |
Referenties
- Carden, D. L., Granger, D. N. Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. J Pathol. 190 (3), 255-266 (2000).
- Balkwill, F., Mantovani, A. Inflammation and cancer: Back to Virchow. Lancet. 357 (9255), 539-545 (2001).
- Cruz, R. J., Garrido, A. G., Ribeiro, C. M., Harada, T., Rocha-E-Silva, M. Regional blood flow distribution and oxygen metabolism during mesenteric ischemia and congestion. J Surg Res. 161 (1), 54-61 (2010).
- Leng, G. C., Davis, M., Baker, D. Bypass surgery for chronic lower limb ischemia. Cochrane Database Syst Rev. 3, Cd002000(2000).
- Droc, I., Calinescu, F. B., Droc, G., Blaj, C., Dammrau, R. Aortic stenting. Minim Invasive Ther Allied Technol. 24 (5), 296-304 (2015).
- Le Gall, A., et al. Veno-arterial-ecmo in the intensive care unit: From technical aspects to clinical practice. Anaesth Crit Care Pain Med. 37 (3), 259-268 (2018).
- Napp, L. C., Kühn, C., Bauersachs, J. ECMO in cardiac arrest and cardiogenic. Herz. 42 (1), 27-44 (2017).
- Sousa Da Silva, R. X., Weber, A., Dutkowski, P., Clavien, P. A. Machine perfusion in liver transplantation. Hepatology. 76 (5), 1531-1549 (2022).
- Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), 1464(2017).
- Lu, D., et al. Intramuscular microvascular flow sensing for flap monitoring in a porcine model of arterial and venous occlusion. J Reconstr Microsurg. 39 (3), 231-237 (2023).
- Nguyen, G. K., et al. Novel biomarkers of arterial and venous ischemia in microvascular flaps. PLoS One. 8 (8), e71628(2013).
- Redlin, M., et al. How near-infrared spectroscopy differentiates between lower body ischemia due to arterial occlusion versus venous outflow obstruction. Ann Thorac Surg. 91 (4), 1274-1276 (2011).
- Studier-Fischer, A., et al. Endotracheal intubation via tracheotomy and subsequent thoracotomy in rats for non-survival applications. J Vis Exp. (205), e66684(2024).
- Nickel, F., et al. Optimization of anastomotic technique and gastric conduit perfusion with hyperspectral imaging and machine learning in an experimental model for minimally invasive esophagectomy. Eur J Surg Oncol. , 106908(2023).
- Barberio, M., et al. Quantitative fluorescence angiography versus hyperspectral imaging to assess bowel ischemia: A comparative study in enhanced reality. Surgery. 168 (1), 178-184 (2020).
- Doukas, P., et al. Onset of adverse abdominal events due to intestinal ischemia-reperfusion injury after aortic cross-clamping is associated with elevated hsp70 serum levels in the early postoperative phase. Int J Mol Sci. 23 (23), 15063(2022).
- Mine, Y., et al. Heat shock protein 70 messenger RNA in rat leukocytes elevates after severe intestinal ischemia-reperfusion. J Surg Res. 242, 342-348 (2019).
- Criqui, M. H., et al. Lower extremity peripheral artery disease: Contemporary epidemiology, management gaps, and future directions: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 144 (9), e171-e191 (2021).
- Seidlitz, S., et al. Robust deep learning-based semantic organ segmentation in hyperspectral images. Med Image Anal. 80, 102488(2022).
- Studier-Fischer, A., et al. Icg-augmented hyperspectral imaging for visualization of intestinal perfusion compared to conventional icg fluorescence imaging: An experimental study. Int J Surg. 109 (12), 3883-3895 (2023).
- Studier-Fischer, A., et al. Heiporspectral - the heidelberg porcine hyperspectral imaging dataset of 20 physiological organs. Scientific Data. 10 (1), 414(2023).
- Studier-Fischer, A., et al. Spectral organ fingerprints for machine learning-based intraoperative tissue classification with hyperspectral imaging in a porcine model. Sci Rep. 12 (1), 11028(2022).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Malekinejad, Z., et al. Prazosin treatment protects brain and heart by diminishing oxidative stress and apoptotic pathways after renal ischemia-reperfusion. Drug Res (Stuttg). 72 (6), 336-342 (2022).
- Feldman, Z. M., et al. Inferior mesenteric artery revascularization can supplement salvage of mesenteric ischemia. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (3), 101041(2023).
- Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
- Lejay, A., et al. Ischemia reperfusion injury, ischemic conditioning and diabetes mellitus. J Mol Cell Cardiol. 91, 11-22 (2016).
- Huang, D., et al. Macrovascular complications in patients with diabetes and prediabetes. Biomed Res Int. 2017, 7839101(2017).
- Liu, A., et al. Hmgb1 in the ischemic and non-ischemic liver after selective warm ischemia/reperfusion in rats. Histochem Cell Biol. 135 (5), 443-452 (2011).
- Koc, S., Dogan, H. O., Karatas, O., Erdogan, M. M., Polat, V. Mitochondrial homeostasis and mast cells in experimental hepatic ischemia-reperfusion injury of rats. Turk J Gastroenterol. 33 (9), 777-784 (2022).
- Chu, M. J., Vather, R., Hickey, A. J., Phillips, A. R., Bartlett, A. S. Impact of ischaemic preconditioning on experimental steatotic livers following hepatic ischemia-reperfusion injury: A systematic review. HPB (Oxford). 17 (1), 1-10 (2015).
- Chang, M. W., et al. Sitagliptin protects rat kidneys from acute ischemia-reperfusion injury via upregulation of GLP-1 and GLP-1 receptors. Acta Pharmacol Sin. 36 (1), 119-130 (2015).
- Boys, J. A., Toledo, A. H., Anaya-Prado, R., Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H. Effects of dantrolene on ischemia-reperfusion injury in animal models: A review of outcomes in heart, brain, liver, and kidney. J. Investig Med. 58 (7), 875-882 (2010).
- Orihashi, K. Mesenteric ischemia in acute aortic dissection. Surg Today. 46 (5), 509-516 (2016).
- Byard, R. W. Acute mesenteric ischemia and unexpected death. J Forensic Leg Med. 19 (4), 185-190 (2012).
- Łagosz, P., Sokolski, M., Biegus, J., Tycinska, A., Zymlinski, R. Elevated intra-abdominal pressure: A review of current knowledge. World J Clin Cases. 10 (10), 3005-3013 (2022).
Herprints en machtigingen
