Efficiënte verwerking van folliculaire helpercellen van tonsillaire T en functionele analyse door middel van hoogdimensionale flowcytometrie

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen en verwerken van amandelmonsters, fenotypering met behulp van hoogdimensionale spectrale flowcytometrie en het uitvoeren van analyses zonder toezicht.

Abstract

T folliculaire helpercellen (Tfh) zijn een subset van CD4⁺ T-helpercellen die helpen bij het omschakelen van het B-celisotype, de vorming van kiemcentra (GC), somatische hypermutatie en affiniteitsrijping, waardoor adaptieve humorale immuunresponsen in secundaire lymfoïde weefsels worden georkestreerd tijdens infectie, auto-immuniteit en vaccinatie. Inzicht in de ontwikkeling en functie van Tfh-cellen is cruciaal voor het ontwerpen van effectieve vaccins en het ontwikkelen van gerichte behandelingsstrategieën voor ziekten waarbij deze populatie betrokken is. Menselijke amandelcellen zijn toegankelijke mucosale lymfoïde organen. Ze bieden een unieke kans om verschillende immuunpopulaties zoals Tfh- en GC-cellen te profileren, cel-tot-cel-interacties te ondervragen, dynamische cellulaire functies te evalueren en hun regulerende mechanismen op orgaanniveau bloot te leggen. Bovendien zijn in vitro culturen van amandelcellen eenvoudig te verwerken en maken ze de beoordeling van Tfh-celbiologie onder verschillende omstandigheden mogelijk. Hier introduceren we een protocol voor het verzamelen, isoleren, bewaren en kweken van menselijke amandelcellen. We beschrijven ook twee geoptimaliseerde spectrale flowcytometriepanelen die zijn ontworpen voor diepgaande karakterisering van Tfh-cellen. Ten slotte demonstreren we, met behulp van een behandeling met fosfatase-eiwit 2A (PP2A)-remmer als voorbeeld, de efficiëntie en kracht van niet-gesuperviseerde analyses van hoogdimensionale flowcytometriegegevens, waardoor door de behandeling geïnduceerde verschillen op een hoogdimensionale schaal effectief worden blootgelegd.

Introduction

T folliculaire helpercellen (Tfh) zijn een afzonderlijke subset van CD4⁺ helper-T-cellen die essentieel zijn voor de vorming en functie van kiemcentra (GC's) en de productie van B-celantilichamen. Tfh-cellen zijn afkomstig van naïeve CD4⁺ T-cellen door interacties met antigeenpresenterende cellen en de integratie van intrinsieke en extrinsieke factoren, waaronder T-celreceptorsignalering, costimulatoire interacties met B-cellen, cytokines en chemokinen¹. Tfh-cellen brengen CXCR5 en PD-1 tot expressie, die hun positie binnen of nabij de GC bepalen. BCL-6 is de hoofdtranscriptiefactor die cruciaal is voor de ontwikkeling, het onderhoud en de functie^van Tfh ^1,2. Tfh-cellen zijn cruciaal voor het opbouwen van humorale immuunresponsen, met name bij vaccinresponsen en bij de verdediging tegen bacteriële en virale pathogenen. Abnormale Tfh-celreacties zijn betrokken bij verschillende aandoeningen, waaronder auto-immuunziekten, immunodeficiëntie en mogelijk sommige vormen van kanker 3,4,5,6. Inzicht in hun functie en regulatie is daarom belangrijk voor het ontwikkelen van effectieve vaccin- en therapeutische strategieën⁷.

In tegenstelling tot andere CD4⁺ T-helpercellen zoals Th1, Treg en Th17, waarvoor in vitro differentiatiesystemen goed ingeburgerd zijn⁸, zijn Tfh-cellen complexer om te bestuderen omdat hun ontwikkeling dynamische cel-tot-cel interacties en gespecialiseerde anatomische structuren met zich meebrengt⁷. Studies van Tfh-cellen zijn dus grotendeels gebaseerd op ex vivo fenotypering van menselijke perifere circulerende Tfh-cellen (cTfh) en in vivo muismodellen. Het onderzoeken van de regulatie van specifieke moleculen op Tfh-cellen is daarom een uitdaging, vooral voor menselijke Tfh-cellen⁹. Een diepgaande ex vivo studie van Tfh-cellen afkomstig van lymfoïde weefsels is dus essentieel voor het vergroten van ons begrip van menselijke Tfh-cellen.

Amandelen, als secundaire lymfoïde organen, herbergen unieke celpopulaties die niet aanwezig zijn in perifeer bloed, zoals pre-Tfh (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) en GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺) cellen, die beide een belangrijke rol spelen bij de vorming van GC's. Bovendien zijn de palatinale amandelen enkele van de meest verwijderde weefsels bij pediatrische operaties en zijn ze gemakkelijk toegankelijk, waardoor ze een onschatbare bron van menselijk weefsel zijn voor het onderzoeken van complexe immuunmechanismen waarbij Tfh-cellen betrokken zijn. Omdat ze zich in de bovenste luchtwegen bevinden, een primaire plaats voor respiratoire virale infecties, bieden de amandelen een voordelig weefsel voor het onderzoeken van immuunresponsen op dergelijke virale infecties. Ons laboratorium karakteriseerde bijvoorbeeld eerder Tfh-cellen in amandelen en adenoïden van kinderen die hersteld waren van COVID-19 en vergeleek deze weefsels met die van niet-geïnfecteerde controles¹⁰. Hier schetsen we ons protocol voor het verwerken en bewaren van amandelcellen. Met PP2A-remmer behandelde amandelen als voorbeeld, beschrijven we hoe deze cellen kunnen worden gekarakteriseerd door middel van hoogdimensionale spectrale flowcytometrie en analyseren we de gegevens met behulp van analyse zonder toezicht.

Protocol

De ethische code van de World Medical Association (Verklaring van Helsinki) werd gevolgd in al het menselijke onderzoek in deze studie. Menselijke amandelmonsters werden verkregen van patiënten met adenotonsillaire hypertrofie die slaapstoornissen in de ademhaling of obstructieve slaapapneu veroorzaakte, afkomstig van de afdeling Pediatrische KNO, Children's National Hospital, Washington, DC, VS. Deze studie kreeg goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van het Children's National Hospital (IRB-protocolnummer 00009806). Geïnformeerde toestemming werd ondertekend door de ouders of voogden van alle ingeschreven deelnemers en er werd toestemming verkregen van minderjarige deelnemers van 7 jaar en ouder.

1. Verzameling van menselijke amandelen en isolatie en opslag van één cel

1. Isolatie van tonsillaire eencellige cellen
   1. Verzameling van chirurgische monsters
      1. Verkrijg amandelen van patiënten die een tonsillectomie ondergaan en verzamel de verse weefselstukjes in de operatiekamer in een centrifugebuis van 50 ml gevuld met 25-35 ml ijskoud steriel amandelmedium: RPMI aangevuld met 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 0,05 mg/ml gentamicine, 10 mM glutamine en antibiotica-antimycotische mix (100 eenheden/ml streptomycine, 100 eenheden/ml penicilline, en 0,25 μg/ml amfotericine B).
         OPMERKING: Amandelen in het bovenstaande medium kunnen 's nachts bij 4 °C worden bewaard en de volgende dag worden verwerkt. Er werd een minimaal verlies van levensvatbaarheid van de cellen opgemerkt bij nachtelijke opslag versus verwerking op dezelfde dag (Figuur 1A). Amandelen kunnen ook 's nachts op ijs worden verzonden.
   2. Verwerking van amandelen
      OPMERKING: Alle media, buffers en chirurgische instrumenten moeten steriel zijn en de amandelcelisolatie moet worden uitgevoerd op ijs in een bioveiligheidskap.
      1. Plaats de amandelen op een plastic celkweekschaaltje van 60 mm met 5 ml gekoeld amandelmedium. Werk op ijs. Gebruik een steriel pincet en een schaar of een scalpel om voorzichtig alle zichtbare bloedstolsels, vet en bindweefsel te verwijderen (Figuur 1B,C).
      2. Verplaats de amandelen naar een nieuw celkweekschaaltje van 60 mm met 5 ml ijskoud amandelmedium. Snijd de stukjes amandel in stukjes van 3-5 mm.
      3. Bereid een nieuw celkweekschaaltje van 60 mm voor met 10 ml koud amandelmedium en plaats een celzeef van 70 μm in de schaal.
      4. Verplaats de amandelfragmenten naar de zeef en plet de amandelfragmenten met behulp van het zuigeruiteinde van een steriele spuit van 3 ml door de zeef.
      5. Verzamel het medium met cellen buiten de zeef in de schaal en breng het over naar een conische buis van 50 ml.
      6. Voeg nog eens 10 ml amandelmedium toe aan de schaal met de zeef, plet de amandelfragmenten met de zuiger en vang het medium op in de conische buis. Herhaal deze stap voor grote amandelen nog 2-3x totdat er alleen nog bindweefselfragmenten in de zeef overblijven. Doe het resterende weefsel en de gebruikte platen in een zak voor biologisch gevaarlijk materiaal en bij het medisch afval.
      7. Vul de conische tube van 50 ml tot de rand met amandelmedium.
      8. Centrifugeer 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
         OPMERKING: Als u het centrifugeren verlengt tot 20 minuten, kan de opbrengst toenemen.
      9. Verwijder het bovenstaande door voorzichtig af te zuigen of te pipetteren en suspendeer de pellet opnieuw in 5 ml ammoniumchloride-kalium (ACK) lyseringsbuffer bij kamertemperatuur (RT) om rode bloedcellen te lyseren. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en voeg dan 35 ml gekoelde PBS toe om verdere lysis te voorkomen. Centrifugeer 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
      10. Eenmaal wassen met 50 ml gekoelde PBS en centrifugeren. Resuspendeer met 10 ml PBS en zeef de cellen door een plastic zeef van 70 μm. Tel cellen.
2. Cryopreservatie van tonsillaire cellen
   1. Bereid het vriesmedium voor (90% door warmte geïnactiveerde FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO)).
      LET OP: Dit kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
   2. Centrifugeer de celsuspensie (stap 1.1.2.10) bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de celpellet opnieuw met het vriesmedium.
      OPMERKING: We raden aan om de cellen in te vriezen bij een dichtheid van 10 × 10⁶ tot 50 × 10⁶ cellen/ml vriesmedium¹¹.
   3. Aliquoot 0,5-1 ml van de celsuspensie in steriele cryovials. Vries de flacons in in vriescontainers met snelheidsregeling in een vriezer van -80 °C. Breng de injectieflacons binnen een week over in een opslagtank met vloeibare stikstof voor langdurige bewaring.
3. Bevroren cellen ontdooien
   OPMERKING: Een sequentiële verdunningsontdooiingsbenadering waarnaar wordt verwezen op basis van een monstervoorbereidingsprotocol voor eencellige RNA-sequencing wordt hieronder^{beschreven 12}. Andere ontdooimethoden kunnen ook werken, maar we vonden een grotere levensvatbaarheid van cellen met deze aanpak in vergelijking met het onmiddellijk plaatsen van cellen in een warme dooibuffer (Figuur 1D). De wasbuffer kan van tevoren worden voorbereid. De dooibuffer bestaat uit een wasbuffer plus 0,1 mg/ml DNase I (DNase I moet vlak voor het begin van de dooi worden toegevoegd). Het verlengen van de centrifugeertijd tot 1 min/ml (voor buizen van 15 ml) is optioneel om de celopbrengst te verhogen.
   1. Verwarm een waterbad tot 37 °C. Verwarm de dooi- en wasbuffer voor in het waterbad van 37 °C.
      OPMERKING: Alle celwassingen worden uitgevoerd bij RT.
   2. Ontdooi de cryovials in het waterbad van 37 °C gedurende 2-3 minuten onmiddellijk nadat u ze uit de opslag hebt gehaald. Vermijd het volledig onderdompelen van de injectieflacon in het waterbad. Haal de injectieflacon uit het waterbad terwijl er een klein ijskristal zichtbaar blijft.
   3. Breng de ontdooide cellen voorzichtig over naar een conische buis van 15 ml met behulp van een pipetpunt met brede boring in een bioveiligheidskap. Spoel de cryovial af met 0,5 ml voorverwarmde ontdooibuffer en voeg de spoeling druppel voor druppel (1 druppel om de 5 s) toe aan de conische buis van 15 ml, waarbij u de buis voorzichtig schudt om te mengen.
   4. Verdun de cellen achtereenvolgens in de conische buis van 15 ml door stapsgewijs 2 ml en vervolgens 4 ml medium toe te voegen met een wachttijd van ~1 minuut tussen de toevoegingen. Voeg elke 3-5 s medium met een snelheid van 1 ml toe aan de buis en draai voorzichtig om te mengen.
   5. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij RT.
   6. Verwijder de supernatant; resuspendeer de celpellet in 300 μL ontdooibuffer; en broeden bij RT gedurende 5 minuten.
   7. Voeg 10 ml wasbuffer toe (geen DNase I). Centrifugeer opnieuw bij 400 × g gedurende 5 minuten bij RT.
   8. Was nog een keer: verwijder het bovenstaande en suspendeer de celpellet opnieuw in 10 ml wasbuffer. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij RT.
   9. Filtreer de cellen door een zeef van 70 μm. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 400 × g bij RT en tel de cellen. Resuspenderen in kweekmedium.

2. Meting van expressie van intracellulaire cytokines en transcriptiefactoren na ex vivo behandeling

OPMERKING: Hier beschrijven we onze methode voor fenotypische karakterisering van tonsillaire Tfh-cellen met behulp van twee hoogdimensionale flowcytometriepanelen. Aangezien PP2A-activiteit essentieel is voor optimale BCL-6-eiwitexpressie en Tfh-differentiatie⁴, illustreren we onze evaluatie van het onderhoud en de functionaliteit van Tfh-cellen door het onderzoek van amandelcellen die zijn behandeld met de PP2A-remmer cantharidine (CAN).

1. Flow cytometrische kleuring
   1. Intracellulaire cytokinekleuring
      OPMERKING: Incubaties worden in het donker uitgevoerd. Reagentia, antilichamen en hun respectievelijke hoeveelheden per put die in beide panelen worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel. Om de degranulatie van T-cellen te beoordelen, wordt het anti-CD107a-antilichaam tijdens de behandelingsstap toegevoegd om vals-negatieve resultaten veroorzaakt door de internalisatie ervan te minimaliseren¹³.
      1. Plaat 2 × 10 cellen van⁶ ton met 200 μL kweekmedium (1 × 10⁷ cellen/ml) in een U-bodemplaatputje met 96 putjes met de volgende hoeveelheden PP2A-remmer CAN gedurende 16 uur: voertuigcontrole, 3 μM en 6 μM.
         OPMERKING: CAN werd gereconstitueerd bij 0,1 M met 1% DMSO.
      2. Voeg monensin (0,7 μL/ml), brefeldin (1:1.000), phorbol myristaatacetaat (50 ng/ml, PMA), ionomycine (1.000 ng/ml) en 2 μL anti-CD107a toe aan elk putje gedurende 2,5 uur in 5% CO₂ incubator bij 37 ^oC. Het totale kweekvolume is 200 μL per putje.
      3. Centrifugeer kleuringsantilichamen bij ~16.000 × g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C om antilichaamaggregaten te verwijderen. Bereid de oppervlakte-antilichaammix voor op stap 2.1.1.8, die alle oppervlakte-antilichamen omvat behalve de chemokinereceptoren, Brilliant Stain Buffer Plus en FACS-buffer (volume van elk vermeld in de materiaaltabel, totaal 112 μL mengsel per reactie).
      4. Was de cellen na 2,5 uur in cultuur 2x met 200 μL ijskoud PBS door 2 minuten te centrifugeren bij 400 × g bij 4 °C. Gooi tussen de wasbeurten het bovenstaande weg door de plaat snel om te keren. Voer de kleuring uit in dezelfde plaat.
      5. Incubeer de cellen in 100 μL/putje van 1:800 verdunde LIVE/DEAD Blue kleurstof in PBS gedurende 15 minuten bij RT. Was 2x met 200 μL FACS-buffer.
      6. Resuspendeer de cellen met True Stain Monocyte Blocker (5 μL monocytblocker + 45 μL FACS-buffer per putje) gedurende 5 minuten bij RT.
      7. Voeg achtereenvolgens chemokinereceptorantilichamen rechtstreeks toe aan de kleuringsreactie (eerst anti-CXCR3 en anti-CCR7 gedurende elk 10 minuten, gevolgd door een mix van anti-CXCR5 en anti-CCR6 samen met 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus gedurende 5 minuten bij RT). Meng goed na elke toevoeging door meerdere keren op en neer te pipetteren. Zie de Tabel met materialen voor de hoeveelheden antilichamen.
      8. Voeg de in stap 2.1.1.3 bereide oppervlakte-antilichaammix rechtstreeks toe aan de kleuringsreactie en incubeer gedurende 30 minuten bij RT. Het totale kleuringsvolume per reactie is 180 μl: 50 μl monocytenblokker in buffer (zie stap 2.1.1.6) + 18 μl anti-chemokinereceptorantilichamen (zie stap 2.1.1.7) + 112 μl oppervlakte-antilichaammix (zie stap 2.1.1.3).
      9. Was 2x met 200 μL koude FACS-buffer.
      10. Resuspendeer de cellen en incubeer gedurende 20 minuten met 80 μl/putje fixatiebuffer op basis van paraformaldehyde bij RT.
      11. Voeg 160 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elk putje, dat al een fixatiebuffer bevat. Centrifugeer de plaat bij 400 × g gedurende 2 minuten bij RT en was 1x met 200 μL permeabilisatiebuffer.
      12. Bereid een mix van intracellulaire cytokine (ICS) antilichamen voor, die anti-cytokine-antilichamen, Brilliant Stain Buffer Plus en permeabilisatiebuffer bevat (totaal volume 50 μL/putje, Materiaaltabel). Incubeer de cellen met deze intracellulaire cytokine-antilichaammix bij RT gedurende 30 minuten.
      13. Was 2x met 200 μL/well permeabilisatiebuffer. Resuspendeer met 200 μL/putje FACS-buffer.
      14. Bewaar de gekleurde cellen bij 4 °C in het donker en verzamel binnen 24 uur gegevens op een spectrale flowcytometer om verlies van kleuringsintensiteit¹⁴ te minimaliseren.
   2. Kleuring van de nucleaire transcriptiefactor
      1. Kweek de cellen met CAN zoals in stap 2.1.1.1 (zonder de cellen te stimuleren).
      2. Voeg anti-humaan CD40-antilichaam (0,5 μg/ml) toe aan het kweekmedium en kweek met cellen gedurende 15 minuten voordat u met de kleuring begint. Als cellen worden gestimuleerd, voeg dit antilichaam dan 15 minuten voor aanvang van de stimulatie toe om de internalisatie van CD40L bij activering te voorkomen ^15,16.
      3. Centrifugeer de kleuringsantilichamen en bereid de oppervlakte-antilichaammix voor op dezelfde manier als stap 2.1.1.3: oppervlakte-antilichamen in de materiaaltabel, 10 μl/putje Brilliant Stain Buffer Plus en 54,1 μl/putje FACS-buffer.
         OPMERKING: Het totale kleuringsvolume per putje is 180 μL: 50 μL monocytenblokker in buffer + 13 μL chemokinereceptorantilichamen + 117 μL oppervlakte-antilichaammix.
      4. Was de cellen en voer LIVE/DEAD Blue-kleuring en oppervlaktekleuring en wasbeurten uit zoals in de stappen 2.1.1.5-2.1.1.8.
         OPMERKING: Het anti-CXCR3-antilichaam is niet opgenomen in dit paneel.
      5. Fixeer de cellen met 80 μL nucleaire transcriptiefactorfixatiebuffer van FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
      6. Was de cellen met een permeabilisatiebuffer zoals in stap 2.1.1.11.
      7. Bereid de intracellulaire transcriptiefactor (TF)-antilichaammix voor, die anti-transcriptiefactorantilichamen bevat die worden vermeld in de materiaaltabel, 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus en 16 μL permeabilisatiebuffer (totaal volume 40 μL/putje). Incubeer de cellen met dit mengsel gedurende 1 uur bij 4 °C.
      8. Wassen en verwerven op een spectrale cytometer zoals in de stappen 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Analyse zonder toezicht van hoogdimensionale flowcytometriegegevens

OPMERKING: Software, pakketten en hun versies die voor analyse worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel. Schermafbeeldingen van stap 3.2 tot en met 3.4 bevinden zich in aanvullend bestand 1. Voorbeeldscripts van stap 3.5 tot en met 3.7 bevinden zich in Supplementair bestand 2 en aanvullend bestand 3, stappen 3.8 tot en met 3.9 bevinden zich in aanvullend bestand 4 en aanvullend bestand 5. ICS RAW-bestanden en TF RAW-bestanden voor de scripts worden respectievelijk geleverd in Aanvullend Bestand 6 en Aanvullend Bestand 7.

1. Open de werkruimte van de flowcytometrie-analysesoftware waar de ".fcs"-bestanden zijn opgeslagen en voltooi de gating zoals weergegeven in Afbeelding 1E.
2. Klik met de rechtermuisknop op het doelknooppunt (in dit geval CD4⁺ T-cellen). Kies Equivalente knooppunten selecteren.
3. Klik nogmaals met de rechtermuisknop op het doelknooppunt. Selecteer Populaties exporteren/samenvoegen.
4. Wacht tot het venster Populaties: Exporteren of Samenvoegen is geopend, kies CSV-kanaalwaarden en kies de bestemming voor geëxporteerde bestanden. Neem alle cellen op in het vak Gebeurtenissen opnemen en selecteer Alle gecompenseerde parameters in het vak Parameters . Vouw de geavanceerde opties uit, typ een voorvoegsel om de naam van de bestanden te wijzigen en klik op exporteren om de bestanden naar de doelmap te exporteren (exporteer één .csv bestand voor elk voorbeeld).
5. Lees de geëxporteerde "*.csv"-bestanden met R (één voor elk voorbeeld). Wijs een voorbeeld-ID toe aan elke cel en combineer cellen uit alle voorbeelden in één gegevensframe.
6. Voeg metagegevens (aanvullende informatie over voorbeelden) toe of voeg ze samen in het gegevensframe.
7. Downsample willekeurig een gelijk aantal cellen per monster voor de volgende analyse. Deze stap is optioneel.
   OPMERKING: In dit voorbeeld werden 8.000 CD4⁺ T-cellen gedownsampled van het totale aantal CD4⁺ T-cellen van elke aandoening, wat neerkomt op ten minste 1/7 van het totale aantal CD4⁺ T-cellen.
8. Seurat object maken: Kanaalwaarden voor antilichaammarkers interpreteren als genexpressieniveaus bij het maken van een Seurat object.
   1. Maak een Seurat-object met het gegevensframe dat is gegenereerd uit stap 3.6. Sla de stap NormalizeData over en sla ze direct op als "data"-test.
   2. Selecteer de oppervlaktemarkeringen in het stroompaneel die u wilt gebruiken als VariableFeatures in de clustering zonder toezicht.
   3. Voer ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP uit als de standaardpijplijn die is geïntroduceerd vanuit Surerat, met uitzondering van de NormalizeData-stap ¹⁷.
   4. Pas de resolutieparameter in de stap Clusters zoeken aan om het aantal clusters te wijzigen, zodat ze de onderliggende biologische context nauwkeuriger weerspiegelen.
9. Gebruik visualisatietools zoals DimPlot en FeaturePlot die compatibel zijn met het Seurat-pakket. Voor het vergelijken van groepen die meerdere steekproeven per groep bevatten, berekent u het percentage van elk cluster per proefpersoon en voert u statistische vergelijkingen uit. Gebruik vervolgens wiskundige modellen voor meer geavanceerde statistische analyses¹⁰.

Results

Om de algehele levensvatbaarheid van de cellen te vergelijken, sneden we de amandelen in drie vergelijkbare stukken en verwerkten we ze met behulp van ons protocol onder drie voorwaarden: (1) verwerking op dezelfde dag, (2) nachtelijke opslag bij 4 °C en (3) nachtelijke opslag op ijs. De levensvatbaarheid van deze drie aandoeningen was vrij gelijkaardig zonder enig significant verschil (Figuur 1A). We hebben ook de impact van het ontdooiproces op de levensva...

Discussion

In tegenstelling tot eerdere berichten dat verse amandelen binnen 3 uur na de operatie¹⁹ moeten worden verwerkt, ontdekten we dat verse amandelmonsters hun levensvatbaarheid kunnen behouden wanneer ze bij 4 °C worden bewaard en binnen 24 uur worden verwerkt. Om de levensvatbaarheid van cellen uit amandelweefsel te optimaliseren bij het ontdooien door de opslag van vloeibare stikstof, hebben we de druppelsgewijze ontdooimethode toegepast die wordt aanbevolen bij se...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Machines en instrumenten
3 mL Plastic Spuit	BD	309657
96 Well U Bodem Plaat	Thermo Scientific	163320
1.2 mL Cryogenic Vials	Corning	430487
Cel zeef 70 µm Nylon	Falcon	352350
Cel Cultuurschaal (60 mm)	VWR	10062-890
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Digital Water Bath	Benchmark	B2000-2
Fijne Schaar - Scherp	F.S.T	14060-11
Plastic Instrumentenkoffers	F.S.T	20830-05
Spectral flow cytometer, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Standaard Patroon Pincetten	F.S.T	11000-13
Standaard Patroon Pincetten	F.S.T	11000-20
Vi-cell Blu cel vitaliteitsanalyzer	Beckman Coulter	C19201
Reagentia
0.5 M EDTA pH 8.0	Quality Biology	351-027-101
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Antibiotic-antimycotic mix (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspensie, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix Fixatie Buffer	BD	554655
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set	eBioscience	00-5523-00
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634-1mg
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Paraformaldehyde 16% oplossing, EM grade (PFA)	Electron Microscopy  Science	15710	Verdund met PBS
PBS, pH 7.4	Gibco	10010072
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristaat 13-Acetaat (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Rate-controlled freezing containers	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamine)	Gibco	11875-085
Sodium Pyruvaat (100 mM)	Gibco	11360-070
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103
Buffers
Kweekmedium			10% hitte-inactiveerd FBS (VWR), 2 nM glutamine, 0.055 mM 2-mercaptoethanol, 1% penicillin/streptomycin, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM HEPES, 1% niet-essentiële aminozuren in RPMI (+L-Glutamine)
FACS buffer			2 mM EDTA en 2% hitte-inactiveerd FBS in PBS
Vriesmedium			90% hitte-inactiveerd FBS en 10% DMSO
Ontdooi buffer			Wash buffer + 0,1 mg/mL DNaseI
Tonsil medium			RPMI aangevuld met 5% hitte-inactiveerd FBS, 10 mM glutamine, 0,05 mg/mL gentamicine, 1% antibioticum-antimycoticum mix  (penicilline, streptomycine en amphotericine B).
Wash buffer			RPMI (+L-Glutamine) aangevuld met 10%  hitte-inactiveerd FBS en 10 mM HEPES
Antilichamen & andere reagentia voor cytokinepaneel
Biotin anti-human CD107a (LAMP-1) Antilichaam	BioLegend	328604	2 μL in 200 μL compleet kweekmedium per well. Dit antilichaam werd toegevoegd met cellen tijdens PMA/ionomycine stimulatie.
Live Dead kleuring	100 μL mix per well
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μL in 100 μL PBS per well.
Monocyte blok	50 μL mix per well
Monocyte blocker buffer	BioLegend	426103	5 μL True Stain monocyte blocker en 45 μL FACS buffer per well
Oppervlakte antilichamen voor cytokinepaneel
Chemokine receptoren mix			μL/well
Anti-human CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-human CCR7-BV421	BioLegend	3532