Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67200

⸱

3 januari 2025

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Samenvatting

Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie heeft het gezicht van de behandeling van kanker hervormd, wat heeft geleid tot recordremissiepercentages bij voorheen ongeneeslijke hematologische kankers. Deze successen hebben de interesse gewekt om het CAR-platform aan te passen aan een kleine maar cruciale subset van CD4+ T-cellen die voornamelijk verantwoordelijk zijn voor het reguleren en remmen van de immuunrespons, regulerende T-cellen (Tregs). Het vermogen om de immunosuppressieve activiteit van Tregs om te leiden naar elk extracellulair doelwit heeft enorme implicaties voor het creëren van celtherapieën voor auto-immuunziekten, afstoting van orgaantransplantaties en graft-versus-host-ziekte. Hier beschrijven we in detail methodologieën voor bonafide Treg-isolatie van humaan perifeer bloed, genetische modificatie van menselijke Tregs met behulp van lentivirus of CRISPR/Cas9-ondersteunde knock-in met behulp van adeno-geassocieerde virus-gemedieerde homologe gerichte reparatie (HDR) sjabloonafgifte, en ex vivo uitbreiding van stabiele menselijke CAR Tregs. Ten slotte beschrijven we de beoordeling van de fenotypische stabiliteit van de menselijke CAR Treg en de in vitro onderdrukkende functie, die inzicht geeft in hoe de menselijke CAR Tregs zich zullen gedragen in preklinische en klinische toepassingen.

Inleiding

Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën hebben een revolutie teweeggebracht in de behandeling van hematologische maligniteiten, waarbij opmerkelijk hoge remissiepercentages zijn bereikt bij voorheen onbehandelbare kankers 1,2. Bemoedigende vroege resultaten met het gebruik van CAR T-cellen voor de behandeling van glioblastoom 3,4,5 benadrukken de veelzijdigheid en het toekomstige potentieel van CAR-technologie om een breed scala aan maligniteiten aan te pakken. Terwijl het veld verdere toepassingen van CAR's onderzoekt, zijn regulerende T-cellen (Tregs) naar voren gekomen als een veelbelovend celtype. Tregs spelen een cruciale rol bij het handhaven van de immuunhomeostase en het reguleren van immuunresponsen via verschillende mechanismen, waaronder het sekwestreren van IL-2, het afscheiden van immunosuppressieve cytokines en het moduleren van antigeenpresenterende cellen 6,7.

Met CAR-technologie kunnen Tregs worden gebruikt voor de behandeling van afstoting van orgaantransplantaten, auto-immuunziekten en ontstekingsaandoeningen zoals allergieën en astma 6,8,9. CAR Tregs kan leiden tot aanzienlijke verbeteringen in de patiëntresultaten en de kwaliteit van leven door het gebruik van immunosuppressiva te verminderen, die het immuunsysteem als geheel remmen en in verband worden gebracht met schadelijke bijwerkingen10,11. Preklinische modellen hebben veelbelovende resultaten laten zien bij het vertalen van CAR-technologie naar Tregs, met succesvolle toepassingen bij ziekten zoals diabetes type 1, multiple sclerose, graft-versus-host-ziekte en inflammatoire darmaandoeningen 9,12,13,14,15. In de kliniek worden momenteel CAR Tregs onderzocht om afstoting van solide orgaantransplantaties te voorkomen16.

Dit artikel presenteert een gedetailleerde methodologie voor het genereren van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs). Dit protocol omvat het isoleren van Tregs uit menselijk perifeer bloed en het genetisch modificeren ervan met behulp van technieken zoals lentivirale transductie en nauwkeurige genknock-in met behulp van CRISPR/Cas9-genbewerking en adeno-geassocieerd virus (AAV) vectoren. We beschrijven ook de beoordeling van de fenotypische stabiliteit en onderdrukkende functie van deze gemanipuleerde Tregs, die cruciale stappen zijn om hun therapeutisch potentieel te valideren 17,18,19. Deze benadering stroomlijnt het ontwerp en het vroege testen van CAR Treg-therapieën, die het potentieel hebben om de transformatieve impact van CAR T-celtherapie om het immuunsysteem te reguleren uit te breiden. Door onze methodologie te delen, hopen we verder onderzoek en innovatie te inspireren in de snelgroeiende CAR Treg-therapieruimte 9,20.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Menselijke Treg-isolatie

  1. Leukopak verwerking
    1. Breng de inhoud van de leukopak over in een conische buis van 50 ml. Voeg een gelijk volume Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) +2% foetaal runderserum (FBS) toe door voorzichtig te mengen met een pipet.
    2. Centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Aspireer voorzichtig het bovenliggende op. Reconstitueer de celpellet in 2 ml DPBS + 2% FBS. Voeg 8 ml ammoniumchlorideoplossing met een pipet toe aan de celsuspensie in een verhouding van 4:1, meng door zachte inversie en laat de lysis van de resterende rode bloedcellen op ijs gedurende 15 minuten plaatsvinden.
    3. Draai gedurende 10 minuten op 300 × g bij RT. Zuig de supernatant voorzichtig op. Voeg 30 ml DPBS + 2% FBS toe om de cellen te wassen. Met de rem eraf, centrifugeer de gewassen cellen op 150 × g gedurende 10 minuten op RT. Zuig de supernatant voorzichtig op. Resuspendeer de celpellet in 30 ml DPBS + 2% FBS.
    4. Tel de nu geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met trypanblauw in een verhouding van 1:1.
      1. Vanwege de hoge celconcentratie verdunt u in eerste instantie 10 μL cellen 1:100 met DPBS; meng vervolgens 10 μl van de 1:100 verdunde cellen met 10 μl trypanblauwe oplossing voor die laatste 1:1 verdunning. Wanneer u een geautomatiseerde cellenteller gebruikt, corrigeert u het aantal cellen om de 200-voudige verdunning weer te geven door de gerapporteerde concentratie te vermenigvuldigen met 100, aangezien de meeste tellers uitgaan van een 2-voudige verdunning. Verwacht een opbrengst van 1-2,5 × 109 PBMC van een 1/10 leukopak.
  2. CD4+ T-celisolatie (negatieve selectie)
    1. Draai 108-10 9 PBMC's af bij 500 × g gedurende 5 minuten bij RT en suspendeer opnieuw in celscheidingsbuffer (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) bij 5 × 107 cellen/ml.
      OPMERKING: Om voldoende menselijke Tregs voor genetische modificatie te verkrijgen, raden we aan om te beginnen met 1 × 109 PBMC's.
    2. Voer de magnetische scheiding uit volgens de instructies van de fabrikant voor de CD4+ T-celverrijkingskit.
    3. Bepaal de hoeveelheid geïsoleerde CD4+ T-cellen door te tellen met trypanblauw (10 μL cellen + 10 μL trypanblauw).
  3. CD8+ T-cel isolatie (negatieve selectie)
    1. Draai 5 × 107 PBMC's bij 500 × g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer in celscheidingsbuffer (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) bij 5 × 107 cellen/ml.
      OPMERKING: We raden aan om te beginnen met 5 × 107 PBMC om 2-5 × 106 CD8+ T-cellen te verkrijgen.
    2. Voer magnetische scheiding uit volgens de instructies van de fabrikant voor de CD8+ T-celverrijkingskit.
    3. Bepaal het aantal geïsoleerde CD8+ T-cellen door te tellen met trypanblauw (10 μL cellen + 10 μL trypanblauw).
  4. Treg fluorescentie-geassisteerde celsortering (FACS)
    1. Isoleer CD4+ T-cellen zoals beschreven in stap 1.2 en bewaar ze 's nachts in DPBS met 2% FBS bij 4 °C (minimaal verlies in celaantal en levensvatbaarheid) voor FACS de volgende dag. Bepaal het aantal CD4+ T-cellen uit stap 1.2 door te tellen met trypanblauw (10 μL cellen + 10 μL trypanblauw).
    2. Draai CD4+ -cellen gedurende 5 minuten op 500 × g . Reconstitueer cellen in 200 μL DPBS.
    3. Voeg per 1 × 106 cellen 1 μL anti-humaan CD4 FITC, 1 μL anti-humaan CD25 APC en 1 μL anti-humaan CD127 PE toe. Draai voorzichtig en plaats 30 minuten in de donkere koelkast van 4 °C.
    4. Was de cellen met 10 ml DPBS met 2% FBS. Draai 5 minuten op 500 × g . Resuspendeer de gekleurde cellen voorzichtig bij 1,5 × 107 cellen/ml in DPBS met 2% FBS. Dit is de aanbevolen celconcentratie om te sorteren via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
    5. Leid de gekleurde celsuspensie door een filterdop van 40 μm in FACS-buisjes en houd de buisjes vervolgens op ijs.
    6. Bereid 15 ml opvangbuisjes voor met 3 ml RPMI10 medium en plaats op ijs.
      OPMERKING: Dit medium bestaat uit RPMI1640 basaal medium, 10% FBS, 1x penicilline-streptomycine, 1x L-alanyl-L-glutamine, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x natriumpyruvaat en 1x HEPES.
    7. Sorteer CD4+CD25hogeCD127-regulerende T-cellen (Tregs) en CD4+CD25lageCD127+ conventionele T-cellen (Tconv) met behulp van FACS zoals weergegeven in figuur 1A.
    8. Bepaal de celopbrengst en levensvatbaarheid; ga vervolgens verder met stroomafwaartse analyse of T-celactivering.

2. Activering van T-cellen

  1. Tel geïsoleerde T-cellen met trypanblauw (10 μL cellen + 10 μL trypanblauw).
  2. Was 25 μL anti-CD3/CD28 kralen (106 kralen) voor elke 1 × 106 T-cellen verkregen, met behoud van een verhouding van 1:1 van kralen tot T-cellen. Was anti-CD3/CD28-kralen door DPBS toe te voegen, 3 minuten op een magneet te incuberen en de nu verdunde anti-CD3/CD28-kralenbuffer te verwijderen, die giftig kan zijn voor cellen.
  3. Verwijder de tube van de magneet en suspendeer de gewassen kralen opnieuw in RPMI10-medium om 1 × 106 kralen/1 ml RPMI10 te hebben.
  4. Resuspendeer T-cellen met anti-CD3/CD28-korrels in RPMI10-medium in een concentratie van 1 × 106 T-cellen/ml. Voeg vervolgens 1.000 IE/ml IL-2 toe aan Treg-cellen, 100 IE/ml IL-2 aan CD4+ Tconv-cellen en 300 IE/ml IL-2 aan CD8+ T-cellen.
  5. Kweek T-cellen op 1 × 106 cellen per putje van een plaat met 24 putjes met verschillende hoeveelheden anti-CD3/CD28-korrels en IL-2. Plaats de plaat met 24 putjes in een weefselkweekincubator met 5% CO2 van 37 °C.
  6. Verleng geactiveerde T-cellen gedurende 9-12 dagen in aanwezigheid van IL-2 totdat ze worden gebruikt voor experimenten of re-activering met anti-CD3/CD28-kralen voor extra expansie. Vervang de media elke 2-3 dagen en voeg IL-2 toe elke keer dat vers medium wordt toegevoegd. Houd de celdichtheid van de Tregs tijdens de expansie op 5 × 105 tot 1 × 106 cellen per ml door de cellen te tellen of door visuele inspectie voordat ze worden gesplitst.

3. Menselijke Treg lentivirale transductie

  1. Resuspendeer en tel Tregs 48 uur na activering. Draai 5 minuten bij 500 ×g bij RT. Resuspendeer Tregs in RPMI10 bij 1,25 × 106 cellen/ml met 1.000 IE/ml IL-2.
  2. Verwarm de centrifuge voor op 32 °C.
  3. Ontdooi het lentivirus-bevattende CAR-construct op ijs.
    OPMERKING: We bewaren lentivirusaliquots voor eenmalig gebruik met voldoende lentivirus om 2,5 × 105 cellen te transduceren bij een MOI van 1 bij -80 °C.
  4. Voeg elk aliquot lentivirus toe aan 2,5 × 105 Tregs in 200 μl in een microcentrifugebuisje, waarbij elk buisje een reactie aangeeft. Spinoculaat bij 1.000 × g gedurende 1 uur bij 32 °C.
  5. Verplaats elke reactie van 200 μl naar een plaat met 24 putjes. Zorg ervoor dat de media de hele put bedekken. Incubeer de plaat met 24 putjes met de getransduceerde Tregs een nacht (16-18 uur) in een weefselkweekincubator. Vul elk putje bij tot 2 ml met RPMI10-medium, waarbij de uiteindelijke IL-2-concentratie 1.000 IE/ml is.
  6. Ga 9-12 dagen na activering door met het uitbreiden van getransduceerde Tregs door de cellen te splitsen en indien nodig aan te vullen met vers voorverwarmd RPMI10 en IL-2 (elke 2-3 dagen). De ideale concentratie van cellen is 5 × 105-1 × 106 cellen/ml.
  7. Beoordeel de efficiëntie van genmodificatie met behulp van flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 2.
    OPMERKING: Onze lentivirale CAR-constructen bevatten een Myc-tag op de N-terminus van het CAR-gen en een GFP-reportergen dat is gekoppeld aan het CAR-gen door een 2A-peptide, waardoor de transductie-efficiëntie kan worden gekwantificeerd zonder antilichaamkleuring (GFP) en bevestiging van CAR-oppervlakte-expressie (Myc-tag). We beoordelen de efficiëntie van genmodificatie 5 dagen na transductie. De transductie-efficiëntie kan variëren tussen 30% en 70%, afhankelijk van de donor en het gebruikte CAR-construct. CAR+- cellen kunnen desgewenst worden gesorteerd.
  8. Zorg ervoor dat de gemodificeerde Tregs hun activeringscyclus voltooien (9-12 dagen) en 24 uur rusten in afwezigheid van IL-2 voordat ze in experimenten worden gebruikt.

4. CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-knock-in in menselijke Tregs

  1. Resuspendeer Tregs en breng over naar een conische buis van 15 ml 48 uur na activering. Incubeer de celsuspensie gedurende 3 minuten in een magneet.
  2. Terwijl ze in de magneet zitten, breng je de cellen in het medium via een pipet over naar een nieuwe buis. De anti-CD3/CD28 kralen blijven aan de buiswand vastzitten. Laat de geparelde Tregs 2 uur rusten in RPMI10 na het verwijderen van de parel om te herstellen van de onmiddellijke stress van het debeaden, waardoor de toekomstige transductie-efficiëntie en het herstel van elektroporatie worden verbeterd.
  3. Tel de gevlekte Tregs met trypanblauw.
  4. Verwarm het medium met verlaagd serum zonder FBS voor op 37 °C.
  5. Bereid een bord met 6 putjes voor met 2,5 ml RPMI10-medium zonder antibiotica (penicilline-streptomycine) en met 1.000 IE/ml IL-2 per putje. Verwarm de plaat voor op 37 °C in een weefselkweekbroedmachine.
  6. Ontdooi de adeno-geassocieerde virus (AAV)-bevattende CAR homologie-gerichte reparatie (HDR) sjabloon op ijs.
    OPMERKING: We bewaren aliquots voor eenmalig gebruik met voldoende AAV om 4 × 106 cellen te infecteren bij een MOI van 20.000 bij -80 °C.
  7. Draai Tregs op 500 × g gedurende 5 min. Resuspendeer na het decanteren van het supernatant cellen in voorverwarmd gereduceerd serummedium bij 4 × 107 cellen/ml.
  8. Aliquot-cellen in 100 μL in centrifugebuisjes van 1,5 ml met een lage eiwitbinding. Voeg CAR AAV met een MOI van 20.000 toe aan elk monster en suspendeer opnieuw. Incubeer de reactiebuisjes in de weefselkweekincubator gedurende 1 uur.
  9. Bereid en assembleer tijdens de incubatie van 1 uur CRISPR/Cas9-ribonucleoproteïne (RNP)-complexen door langzaam 8,3 μL Cas9-eiwit (1 mg/ml voorraad) toe te voegen aan 2,5 μL sgRNA gericht op de TRAC-genlocus (100 μM aanleg) voor een molaire verhouding van Cas9 tot sgRNA van 1:1 en een totaal RNP-volume van 10,8 μL per monster. Pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Incubeer het RNP-mengsel gedurende 15 minuten bij 37°C in de weefselkweekincubator.
    OPMERKING: RNP-complexen kunnen daarna op RT blijven totdat ze klaar zijn voor gebruik.
  10. Vul een nieuwe elektroporatiebuis (E-buis) met 3 ml elektroporatiebuffer met hoge osmolariteit. Steek de gevulde E-buis in het pipetstation van het elektroporatiesysteem totdat u een klik hoort. Stel de elektroporatievoorwaarden in op 2.200 V, 20 ms, 1 puls in het elektroporatiesysteem.
  11. Wanneer de incubatie van 1 uur met AAV is voltooid, centrifugeert u de cellen met AAV bij 300 × g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig het bovenstaande voorzichtig op en resusinfecteer de celpellet in 100 μL van de celresuspensiebuffer die door het elektroporatiesysteem per monster wordt geleverd.
    OPMERKING: Werk snel en laat cellen niet langer dan 15 minuten in de buffer staan. Vermijd het creëren van bubbels.
  12. Voeg 10,8 μL RNP-complex per monster toe. Meng goed met een pipet zonder bubbels te creëren.
  13. Plaats een elektroporatietip van 100 μl door de pipet naar de tweede aanslag te duwen om de klem te openen. Plaats de bovenste kop van de pipet in de elektroporatiepunt totdat de clamp stevig vastklikt in de montagesteel van de zuiger. Laat de knop geleidelijk los terwijl u neerwaartse druk op de pipet uitoefent om ervoor te zorgen dat de punt goed aansluit zonder openingen.
  14. Druk de pipet tot de eerste stop en dompel de elektroporatiepunt onder in het cel-RNP-mengsel. Trek het monster voorzichtig omhoog in de pipet zonder luchtbellen.
    OPMERKING: Er mogen geen luchtbellen in de punt aanwezig zijn tijdens elektroporatie.
  15. Steek de pipet met de gemonteerde elektroporatiepunt met het monster verticaal in de E-buis totdat u een klikgeluid hoort. Vermijd het creëren van luchtbellen.
  16. Controleer of de optimale instellingen voor menselijke Tregs zijn ingevoerd (2.200 V, 20 ms, 1 puls) en druk op start op het touchscreen om de cellen te elektroporeren.
  17. Wacht tot het touchscreen Voltooid weergeeft na voltooiing van de elektroporatie. Verwijder voorzichtig de pipet en breng het monster onmiddellijk over in de voorbereide plaat met 6 putjes met 2,5 ml voorverwarmd, antibioticavrij RPMI10-medium met 1.000 IE/ml IL-2 per putje. Herhaal met de resterende samples. Schud de plaat voorzichtig in lineaire bewegingen (van links naar rechts, van boven naar beneden) om een gelijkmatige verdeling van de cellen in elk putje te garanderen en plaats deze in de weefselkweekincubator.
    OPMERKING: Het hergebruiken van een elektroporatietip is tot 3x acceptabel als dezelfde cellen en hetzelfde RNP-complex in gebruik zijn. Wacht een herstelperiode van 30 minuten voordat u de cellen telt of ze op enigerlei wijze verstoort, zoals het toevoegen van een HDR-verbeteraar indien gewenst.
  18. Vervang de volgende dag, 16-18 uur later, de media door antibioticahoudende media, tel de geëlektropoleerde Tregs met trypanblauw en kweek op 106 cellen/ml met 1.000 IE/ml IL-2. Ga door met het uitbreiden van geëlektropoleerde Tregs door de cellen te splitsen en verse RPMI10 en IL-2 aan te vullen, zoals beschreven in stap 2.6.
  19. Bewaar monsters op ijs voor analyse door middel van flowcytometrie.
    1. Stel compensatieregelaars voor één kleur in en pas deze toe op het experimentbestand.
    2. Lees eerst de ongekleurde steekproef om de FSC- en SSC-winsten aan te passen, zodat de lymfocytenpopulatie zich in het midden van de puntdiagram 'Alle gebeurtenissen' bevindt.
    3. Stel een poortstrategie in van lymfocyten in niet-puin/afzonderlijke cellen in levensvatbare cellen in CD4+ -cellen, zoals weergegeven in figuur 3C.
  20. Beoordeel de efficiëntie van genmodificatie met behulp van flowcytometrie.
    OPMERKING: Onze AAV CAR-constructen bevatten, naast de TRAC-locushomologiearmen, een afgekapt epidermale groeifactorreceptor (EGFRt) reportergen dat is gekoppeld aan het CAR-gen door een 2A-peptide, zoals weergegeven in figuur 3. De efficiëntie van het gen knock-in wordt bepaald door oppervlaktekleuring voor CD3, waarvan het verlies duidt op verlies van TCR-oppervlakte-expressie en, dus, succesvolle targeting van de TRAC-locus met CRISPR/Cas9 en EGFRt, waarvan de expressie wijst op succesvolle integratie van het CAR-transgen. CAR knock-in Tregs zijn CD3-EGFRt+ cellen. We beoordelen de efficiëntie van genmodificatie 5 dagen na elektroporatie.
  21. Zorg ervoor dat gemodificeerde Tregs hun activeringscyclus voltooien (9-12 dagen) en 24 uur rusten in afwezigheid van IL-2 voordat ze in experimenten worden gebruikt.

5. Activering van de menselijke CAR Treg

  1. Co-cultuur opzet (Dag 0)
    1. Verzamel de doelcellijn van het CAR-antigeen in een conische buis.
      OPMERKING: We gebruiken K562-cellen, een menselijke myeloïde leukemiecellijn die geen HLA-, CD80- en CD86-expressie heeft als doelcellen voor CAR Treg-activering. Ouderlijke K562-cellen worden gebruikt als negatieve controle en CAR-antigeen-expressie K562 worden gebruikt om CAR Tregs17,21 te activeren.
    2. Bestraal doelcellijnen met 4.000 rad in een cesium-137- of röntgenbestraling. In het geval van gebrek aan toegang tot een bestralingsradiator, voer dan een mitomycine C-behandeling uit om de celproliferatie te stoppen met behoud van de expressie van het oppervlakteantigeen in de doelcellen22.
    3. Als je dit nog niet hebt gedaan, laat de Tregs dan parelen door de Tregs gebonden aan de anti-CD3/CD28 kralen opnieuw te suspenderen en ze over te brengen naar een conische buis van 15 ml. Incubeer de celsuspensie in een magneet gedurende 3-5 minuten. Terwijl ze nog in de magneet zitten, breng je de cellen in het medium via een pipet over naar een nieuwe buis; de anti-CD3/CD28 kralen blijven aan de buiswand vastzitten.
    4. Bepaal de concentraties van de doorstraalde doelwitcel en de CAR Treg met trypanblauw.
    5. Centrifugeer bestraalde doelwitcellen en CAR Tregs bij 500 × g gedurende 5 min. Resuspendeer met voorverwarmd RPMI10 bij 106 cellen/ml in hun afzonderlijke buisjes. Voeg IL-2 toe aan CAR Tregs voor een concentratie van 2.000 IE/ml.
      OPMERKING: Deze hoeveelheid IL-2 wordt 2-voudig verdund zodra de CAR Tregs zijn gecombineerd met de doelcellen voor een uiteindelijke IL-2-concentratie van 1.000 IE/ml.
    6. Co-cultuur 1 × 105 CAR Tregs (100 μL) met 1 × 105 (100 μL) CAR-antigeen-negatieve, bestraalde doelwitcellen (negatieve controle voor activering), 1 × 105 (100 μL) CAR-antigeen-positieve, bestraalde doelwitcellen (experiment), of 2,5 μL anti-CD3/CD28-kralen (positieve controle voor activering) en 97,5 μL RPMI10-medium in een ronde bodemplaat met 96 putjes. Plaats de plaat gedurende 48 uur in een weefselkweekmachine van 37 °C 5 % CO2 .
      OPMERKING: Het uiteindelijke volume per putje is 200 μL. Zorg ervoor dat elke toestand drie replicaten heeft.
  2. Uitlezing van flowcytometrie
    1. Tenzij u een plaatlezer gebruikt, suspendeert u de inhoud van elk putje opnieuw van de plaat met ronde bodem met 96 putjes en brengt u deze over in een FACS-buis. Centrifugeer 5 minuten op 500 x g. Decanteer het bovenstaande en draai de celpellet voorzichtig.
    2. Bereid de mastermix van flowcytometrie-antilichamen voor: 100 μL/monster met DPBS, anti-humaan CD4 PE/Cy7 1:200, anti-humaan CD71 PE 1:100 en Ghost Viability Dye BV510 1:2000.
      OPMERKING: Dit paneel werkt goed als het CAR-reportergen GFP is. Als een reportergen codeert voor een oppervlakte-eiwit dat antilichaamkleuring vereist, zoals EGFRt, kan bijvoorbeeld een FITC-geconjugeerd antilichaam worden gebruikt.
    3. Pipetteer 100 μl van het antilichaammastermengsel in elk monster, meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten in de koelkast van 4 °C.
    4. Wassen met 500 μL DPBS door 500 × g gedurende 5 minuten te centrifugeren. Resuspendeer de celpellet in 200 μL DPBS.
    5. Bewaar monsters op ijs voor analyse door middel van flowcytometrie.
      1. Stel compensatiebesturingselementen voor één kleur in en pas deze toe op het experimentstroombestand.
      2. Lees ongekleurde monsters om de SSC- en FSC-winsten aan te passen, zodat de lymfocytenpopulatie zich in het midden van de puntplot 'Alle gebeurtenissen' bevindt.
      3. Stel een poortstrategie in van lymfocyten in niet-puin/afzonderlijke cellen in levensvatbare cellen in CD4+ -cellen, zoals weergegeven in figuur 3C (verschillende gebruikte fluoroforen).
      4. Lees voorbeelden met een gebeurtenissnelheid van ongeveer 1.500 gebeurtenissen/s om Treg-activering te beoordelen.
        OPMERKING: Het verwachte resultaat is opregulatie van CD71-oppervlakte-expressie in CAR Tregs in aanwezigheid van CAR-antigeen, zoals weergegeven in figuur 4. Als opregulatie niet wordt gezien in aanwezigheid van CAR-antigeen, kan tonische signalering aanwezig zijn.

6. Menselijke CAR Treg stabiliteit

  1. Co-cultuur opzetten en uitbreiden (dagen 0-9)
    1. Stel co-culturen in om CAR Tregs te activeren zoals beschreven in stap 5.1.
    2. Breng na 48 uur de co-cultuur over van elke plaat met 96 putjes met ronde bodem in een putje met 24 putjes met voorverwarmde 2 ml RPMI10 met 1.000 IE/ml IL-2 om celexpansie mogelijk te maken.
    3. Voeg vers voorverwarmd RPMI10 toe met 1.000 IE/ml IL-2 en verdeel indien nodig in extra platen met 24 putjes.
  2. Uitlezing van flowcytometrie
    1. Resuspendeer en breng de inhoud van elk duplicaat over in een conische buis van 15 ml of 50 ml. Bepaal de celconcentraties.
    2. Breng tussen 5 × 105 en 1 × 106 cellen over naar een FACS-buisje voor elke replicaat. Draai 5 minuten op 500 × g .
    3. Bereid de mastermix van flowcytometrie-antilichamen voor oppervlaktekleuring: 100 μL/monster met DPBS, anti-humaan CD4 PE/Cy7 1:200, anti-humaan CD25 APC 1:200 en Ghost Viability Dye BV510 1:2000. Voeg indien nodig FITC-geconjugeerd antilichaam voor CAR-reportereiwit toe.
    4. Decanteer het bovenstaande uit stap 6.2.2 en draai de celpellet voorzichtig om. Pipetteer 100 μL van het hoofdmengsel van oppervlaktekleurende antilichamen op elke FACS-buis. Kort vortex en plaats in een koelkast van 4 °C gedurende 30 minuten in het donker.
    5. Gebruik een set transcriptiefactorkleuringsbuffers om de fixatie-/permeabilisatiebuffer voor te bereiden door 3 volumes fixatie-/permeabilisatieverdunningsmiddel toe te voegen aan 1 volume fixatie-/permeabilisatieconcentraat. Elk monster vereist 100 μL fixatie-/permeabilisatiebuffer.
    6. Was de met het oppervlak bevlekte cellen met 500 μL DPBS. Draai 5 minuten op 500 × g en decanteer de supernatant. Pipetteer 100 μL voorbereide fixatie-/permeabilisatiebuffer op elke buis. Kort vortex en laat fixatie plaatsvinden bij 4 °C gedurende 30-60 minuten in het donker.
    7. Gebruik een transcriptiefactorkleuringsbufferset om 1x permeabilisatiebuffer voor te bereiden door 9 volumes gedestilleerd water toe te voegen aan 1 volume permeabilisatiebuffer 10x concentraat. Elk monster vereist 1.000 μL permeabilisatiebuffer voor het wassen en 100 μL permeabilisatiebuffer voor het kleuren met antilichamen gericht op intracellulaire eiwitten.
    8. Was de gefixeerde/gepermeabiliseerde cellen door 500 μL 1x permeabilisatiebuffer toe te voegen. Draai 5 minuten op 500 × g bij RT.
    9. Bereid een mastermix voor intracellulaire kleuringsantilichamen met 1x permeabilisatiebuffer, anti-humaan FOXP3 eFluor 450 1:50, anti-humaan HELIOS PE 1:50 en anti-humaan CTLA-4 PerCP-e710 1:50. Voor elk monster is 100 μL antilichaammastermix nodig.
      OPMERKING: Dit paneel werkt als het CAR-reportergen GFP is of als het CAR-reportereiwit (bijv. EGFRt) is gekleurd met een FITC-geconjugeerd antilichaam.
    10. Decanteer het bovenstaande uit stap 6.2.8. Voeg 100 μL van de intracellulaire kleuringsantilichaammastermix toe, draai kort en incubeer 30 minuten in het donker bij RT.
    11. Was de gekleurde gefixeerde/permeabiliseerde cellen door 500 μL 1x permeabilisatiebuffer toe te voegen. Draai 5 minuten op 500 × g . Decanteer het supernatant, suspendeer de celpellet in 300 μL DPBS en bewaar deze op ijs.
    12. Analyseer door middel van flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 5. Het verwachte resultaat is dat de meeste CAR Tregs FOXP3+HELIOS+ cellen zullen zijn. Gebruik CD4+ Tconv-cellen als negatieve controle voor FOXP3- en HELIOS-kleuring.

7. Onderdrukking van menselijke CAR Treg

  1. Responder T-cel (Tresp) kleurstofkleuring en nachtelijke activering
    1. Verzamel de geëxpandeerde CAR Treg-cellen, vers geïsoleerde CD4+ Tconv-cellen en vers geïsoleerde CD8+ T-cellen in afzonderlijke conische buisjes van 15 ml en debead anti-CD3/CD28-kralen als je dat nog niet hebt gedaan.
    2. Bereid bestraalde doelcellen met CAR-antigeenexpressie voor zoals beschreven in stap 5.1.
    3. Bepaal de concentraties van niet-geactiveerde T-cellen en doorstraalde doelcellen.
    4. Combineer 5 × 106 CD4+ Tconv-cellen met 5 × 106 CD8+ T-cellen (verhouding 1:1). Dit zijn de responder-T-cellen (Tresp) die moeten worden geremd door CAR Tregs in de test. Draai de Tresp-cellen gedurende 5 minuten bij 500 × g bij RT. Zuig het bovenstaande voorzichtig op en suspendeer de Tresp-cellen opnieuw in 1 ml DPBS.
    5. Voeg 1 ml 5 ml CellTrace Violet (CTV) kleurstof gereconstitueerd in DMSO toe aan de 107 Tresp-cellen in 1 ml DPBS voor een uiteindelijke concentratie van 5 μM CTV. Plaats 20 minuten in een waterbad van 37 °C. Draai op 10 minuten zachtjes om de bezonken CTV te herverdelen.
    6. Wassen met 9 ml voorverwarmd RPMI10 compleet medium. Draai 5 minuten op 500 × g . Resuspendeer in 5 ml voorverwarmd RPMI10 compleet medium.
    7. Bepaal de CTV-gelabelde Tresp-celconcentratie. Voeg 5 × 104 CTV-gelabelde niet-geactiveerde Tresp-cellen toe in 200 μL RPMI10-medium in 3-6 putjes van een ronde bodemplaat met 96 putjes als minimale proliferatiecontroles.
    8. Activeer CTV-gelabelde Tresp-cellen met anti-CD3/CD28-kralen in een verhouding van 1:10 tussen kraal en Tresp-cellen zonder IL-2 in RPM10-medium. Doseer 's nachts 106 CTV-gelabelde Tresp-cellen in 1 ml RPMI10-medium per putje van een plaat met 24 putjes in de weefselkweekincubator.
    9. Verkrijg tegelijkertijd 106 CAR+ Tregs. Deze hoeveelheid omvat drievouden van vier CAR Treg:Tresp-verhoudingen, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, bij 5 × 104 doelcellen per ronde bodemput met 96 putjes, als 5 × 104 × 3 + 2,5 × 104 × 3 + 1,25 × 104 × 3 + 0,625 × 104 × 3 = 2,81 × 105 CAR Tregs, verdeeld over twee CAR Treg-activeringsomstandigheden: bestraalde CAR-antigeen-negatieve doelwitcellen (negatieve controle, geen activering), en bestraalde CAR-antigeen-positieve doelwitcellen (experiment, CAR-activering).
    10. Combineer 3 × 105 CAR Tregs met 3 × 105 bestraalde CAR-antigeen-negatieve cellen (verhouding 1:1) en 3 × 105 CAR Tregs met 3 × 105 bestraalde CAR-antigeenpositieve doelwitcellen (verhouding 1:1), in twee afzonderlijke conische buisjes van 15 ml en draai gedurende 5 minuten bij RT bij 500 × g . Zuig het supernatant voorzichtig op.
    11. Resuspendeer de pellet in elke buis vanaf stap 7.1.10 in 600 μl voorverwarmd RPMI10-medium. Dit resulteert in 200 μL voor elk van de 1:1 Treg: Tresp drievouden. Voer de seriële verdunning als volgt uit op een plaat met ronde bodem met 96 putjes:
      1. Pipetteer van de bereide 600 μl Treg + doelcelsuspensie 200 μl celsuspensie in elk van de 3 putjes met een verhouding van 1:1.
      2. Voeg 100 μL voorverwarmd RPMI10 volledig medium toe aan elk van de lege putjes met een verhouding van 1:2, 1:4 en 1:8.
      3. Piket voor elk van de drievouden 100 μL van de celsuspensie uit de 1:1-putjes in de bijbehorende 1:2-verhoudingsputjes.
      4. Piket voor elk van de drievouden 100 μL van de celsuspensie uit de 1:2 putjes in de bijbehorende 1:4 verhouding putjes.
      5. Piket voor elk van de drievouden 100 μL van de celsuspensie uit de 1:4-putjes in de bijbehorende 1:8-verhoudingsputjes.
      6. Pipetteer de resterende 100 μL van de celsuspensie uit de verhouding 1:8 in een afvalcontainer.
        OPMERKING: Elk putje moet 100 μL van de celsuspensie bevatten met ofwel 5 × 104 (1:1), 2,5 × 104 (1:2), 1,25 × 104 (1:4) of 0,625 × 104 (1:8) CAR Tregs en een gelijk aantal bestraalde doelwitcellen.
  2. Co-incubatie van CAR-cellen Treg en Tresp
    1. Verzamel 16-18 uur na activering geactiveerde Tresp-cellen van de plaat met 24 putjes in een conische buis en verwijder de anti-CD3/CD28-kralen via een magneet.
    2. Bepaal het aantal CTV-gelabelde Tresp-cellen met kralen .
    3. Was en centrifugeer 2 × 106 Tresp-cellen op 500 × g gedurende 5 min. Aspireer voorzichtig het bovenliggende op. Resuspendeer de cellen in 4 ml RPMI10 volledig medium.
    4. Voeg 100 μL van de T-celsuspensie (5 × 104 T-cellen) toe aan elk putje met CAR Tregs, evenals aan 3-6 putjes met 100 μL RPMI10-medium alleen voor maximale proliferatiecontroles. Plaats de plaat gedurende 72 uur in een weefselkweekcouveuse van 37 °C 5% CO2 .
      OPMERKING: De plaat met ronde bodem met 96 putjes heeft nu 3-6 putjes met alleen niet-geactiveerde Tresp-cellen (minimale proliferatiecontrole), 3-6 putjes met alleen geactiveerde Tresp-cellen (maximale proliferatiecontrole) en geactiveerde Tresp-cellen in aanwezigheid van afnemende aantallen CAR Tregs.
  3. Uitlezing van flowcytometrie
    1. Resuspendeer en breng de inhoud van elke ronde bodemplaat met 96 putjes over in een gelabelde FACS-buis. U kunt ook overbrengen naar een V-bodemplaat met 96 putjes als er een flowcytometer met plaatafleesmodus beschikbaar is. Draai 5 minuten op 500 × g .
    2. Bereid in de tussentijd een antilichaammastermix voor met DPBS, anti-humaan CD4 PE/Cy7 1:200 en anti-humaan CD8 PerCP 1:200. Voor elk monster is 100 μL antilichaammastermix nodig.
    3. Draai de celpellet voorzichtig voort. Pipetteer 100 μL antilichaammastermix in elke FACS-buis. Kort vortex en incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten in het donker.
    4. Wassen met 500 μL DPBS. Was 2x met 100 μL DPBS bij gebruik van een 96-well V-bodem. Draai 5 minuten op 500 × g . Decanteer de supernatant, suspendeer de celpellet in 200 μL DPBS en bewaar de buisjes op ijs in het donker.
    5. Analyseer door middel van flowcytometrie zoals weergegeven in figuur 6. Het verwachte resultaat is dat niet-geactiveerde Tresp-cellen alleen (minimale proliferatie) een uniforme hoge CTV-fluorescentiepiek vertonen, geactiveerde Tresp-cellen alleen meerdere CTV-intensiteitspieken vertonen, één overeenkomend met elke celdeling (maximale proliferatie), en geactiveerde CD4+ - en CD8+ -T-cellen in aanwezigheid van geactiveerde CAR-tregs die een vermindering van het aantal en de hoogte van CTV-pieken vertonen, vandaar in proliferatie.
    6. Bereken Treg-celgemedieerde onderdrukking als volgt:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Als u FlowJo-software gebruikt, is het ook mogelijk om celproliferatiemodellering te gebruiken om de delingsindex (DI) voor elk monster te berekenen en de procentuele onderdrukking te berekenen met behulp van DI in plaats van het percentage prolifererende cellen in de bovenstaande formule.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven protocol biedt een gestroomlijnde en gestandaardiseerde pijplijn om nieuwe chimere antigeenreceptoren (CAR)-constructies in menselijke regulerende T-cellen (Tregs) te beoordelen, met als doel levende therapieën te creëren voor auto-immuunziekten, graft-versus-host-ziekte, afstoting van orgaantransplantaties en allergie. Figuur 1 laat zien hoe we zeer zuivere menselijke Tregs verkrijgen uit perifeer bloed met behulp van FACS (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een gestroomlijnde en uitgebreide methodologie voor het genereren en evalueren van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs). Het succes van CAR-technologie bij de behandeling van hematologische kankers heeft de toepassing ervan op de immunosuppressieve subset van T-cellen, Tregs, geïnspireerd. In tegenstelling tot conventionele T-cellen, remmen Tregs immuunresponsen en bieden ze potentiële behandelingen voor aandoeningen die het gevolg zijn v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

LMRF is een uitvinder en heeft royalty's ontvangen van patenten op gemanipuleerde immuuncellen en adviseert voor Guidepoint Global en McKesson. De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

LMRF wordt gefinancierd door Human Islet Research Network (HIRN) Emerging Leader in Type 1 Diabetes Grant U24DK104162-07, American Cancer Society (ACS) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, South Carolina Clinical and Translational Research (SCTR) Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01, Diabetes Research Connection (DRC) Grant IPF 22-1224 en Swim Across America Grant 23-1579. RWC wordt ondersteund door de Cellular, Biochemical and Molecular Sciences training grant T32GM132055 en Hollings Cancer Center Lowvelo Graduate Fellowship. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Flow Cytometry and Cell Sorting Shared Resource, Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina (P30 CA138313). Speciale dank aan Dr. Qizhi Tang van de Universiteit van Californië, San Francisco (UCSF) voor het vriendelijk schenken van de CAR-mutante plasmiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adeno-associated virus (AAV)Charles River Laboratories
CAR target-expresserende K562 cellenbijv. CD19-K562
Cesium-137 bestralingsinstallatie
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend344708
Anti-human CD4 PE/Cy7 (clone SK3)Biolegend344612
DynaMag-15 magneetThermoFisher12301D
Ghost BV510 levensvatbaarheidskleurstof TONBO13-0870-T100
K562 cellenAmerican Type Culture CollectionCCL-243
0,5 M EDTA, pH 8,0Gibco 15575020
1 M HEPESGibco15630080
Ammoniumchloride oplossingSTEMCELL Technologies7850
Anti-human CD127 PE (clone hIL-7R-M21)BD Biosciences557938
Anti-human CD25 APC (clone BC96)Biolegend 302610
Anti-human CD4 FITC (clone SK3)Biolegend 344604
Anti-human CD71 PE (clone SK1)Biolegend334106
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend 344707
Anti-human CTLA-4 PerCP-e710ThermoFisher46-1529-42
Anti-human EGFR APC (clone AY13)Biolegend352905
Anti-human FOXP3 eFluor 450ThermoFisher48-4776-42
Anti-human HELIOS PEBiolegend137216
Ca2+ en Mg2+ vrije Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco14190144
Celteller (TC20 Automated Cell Counter)Bio-Rad1450102
CeltellingsglazenBio-Rad1450016
CellTrace Violet Celproliferatie KitThermoFisherC34571
DNA LoBind BuizenEppendorf22431021
Easy 50 EasySep magneet STEMCELL Technologies18002
EasySep Human CD4+ T cel verrijkingskitSTEMCELL Technologies19052
EasySep Human CD8+ T cel verrijkingskitSTEMCELL Technologies19053
EasySep magneet STEMCELL Technologies18000
eBioscience Foxp3 transcriptiefactor kleursetThermoFisher00-5523-00
Falcon Ronde-Bodem Polystyreen Testbuisjes met Celfilter Snap Cap, 5 mLFisher Scientific08-771-2340μm
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
Fluorescentie-geactiveerde celsorteerderBD BiosciencesFACS Aria III Cel Sorteerder
GlutaMAXGibco35050061
Human CD3/28 T Cel Expansie en Activerings DynabeadsGibco11131D
Invitrogen Neon Transfectie SysteemThermoFisher10431915
Invitrogen Neon Transfectie Systeem 100 μL KitThermoFisher10114334
LentivirusVectorBuilder
MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossing Gibco11140050
Myc Tag antilichaam A647 (clone 9B11)Cell Signaling Technologies2233S
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Penicilline-Streptomycine oplossingGibco15140122
Recombinant human interleukin-2 (rhIL-2)Peprotech200-02
RPMI 1640 medium, geen glutamine Gibco11875093
NatriumpyruvaatGibco11360070
Spectral Flow CytometerCytekNorthern Lights
TRAC gRNASynthegoSequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoFisherA36496
Trypan Blauw oplossing Sigma T8154-100ML
1/10 LeukopakSTEMCELL Technologies200-00921-2 miljard PBMC

Referenties

  1. Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Choi, B. D., et al. Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma. N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).
  4. Brown, C. E., et al. Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial. Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).
  5. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  6. Ghobadinezhad, F., et al. The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease. Front Immunol. 13, 1075813(2022).
  7. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  8. Sakaguchi, S., et al. Regulatory T cells and human disease. Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).
  9. Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. Next-generation regulatory T cell therapy. Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).
  10. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).
  11. Sawitzki, B., et al. Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials. Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).
  12. Spanier, J. A., et al. Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice. J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).
  13. Muller, Y. D., et al. Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance. Front Immunol. 12, 686439(2021).
  14. MacDonald, K. G., et al. Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor. J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).
  15. Boardman, D. A., et al. Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD. J Autoimmun. 134, 102961(2023).
  16. Schreeb, K., et al. Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation. Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).
  17. Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors. Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).
  18. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  19. Bender, C., et al. A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes. Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).
  20. Ferreira, L. M. Conference report: Advanced Therapies Week 2023. Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).
  21. Cochrane, R. W., et al. How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy. Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).
  22. Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures. J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).
  23. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  24. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  25. Velasco Cardenas, R. M., et al. Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells. Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).
  26. Boomer, J. S., Green, J. M. An enigmatic tail of CD28 signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).
  27. Suhoski, M. M., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).
  28. Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. Transduction of human T cell subsets with lentivirus. Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).
  29. Bailey-Bucktrout, S. L., et al. Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response. Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).
  30. Nakagawa, H., et al. Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).
  31. Dawson, N. A. J., et al. Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells. Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).
  32. Rana, J., et al. CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII. Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).
  33. Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin. Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).
  34. Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal. J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).
  35. Samarasinghe, S., et al. Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy. Blood. 115 (2), 396-407 (2010).
  36. Voss, K., et al. FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death. Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).
  37. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CAR TregsTreg-isolatielentivirale transductieCRISPR Cas9-editingadeno-geassocieerd virusex vivo expansieflowcytometrieimmuunsuppressie
Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.