Methodenartikel

Acute single-unit multi-elektrode-opnames van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie

DOI:

10.3791/67205

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om in vivo opnames van één neuron met hoge dichtheid te verkrijgen van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie. Deze benadering wordt gebruikt om het afvuren van het actiepotentiaal van neuronen in het ventrolaterale periaqueductale grijs te meten - een hersenstamgebied dat inactief is tijdens de Rapid Eye Movement (REM)-slaap - voor en tijdens algemene anesthesie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opnames op basis van silicium met meerdere elektroden worden steeds populairder voor het bestuderen van neuronale activiteit bij de temporele resolutie van actiepotentialen in veel hersengebieden. Het registreren van neuronale activiteit van diepe caudale structuren zoals de hersenstam met behulp van meerkanaalssondes blijft echter een uitdaging. Een belangrijk punt van zorg is het vinden van een traject voor het inbrengen van de sonde dat grote bloedvaten vermijdt, zoals de superieure sagittale veneuze sinus en de transversale veneuze sinus. Het verwonden van deze grote aderen kan uitgebreide bloedingen, schade aan het onderliggende hersenweefsel en mogelijk de dood veroorzaken. Deze benadering beschrijft het richten op hersenstamstructuren door voorste coördinaten te koppelen aan een schuine benadering, waardoor de opnamesonde de hersenen kan binnendringen onder vasculaire structuren met een hoog risico. Vergeleken met een strikt verticale benadering, maximaliseert de schuine benadering het aantal hersengebieden dat kan worden aangevallen. Met behulp van deze strategie kan het ventrolaterale periaqueductale grijs (vlPAG), een hersenstamgebied dat verband houdt met REM-slaap, reproduceerbaar en betrouwbaar worden benaderd om single-unit, multi-elektrode-opnames te verkrijgen bij muizen met een hoofdfixatie voor en tijdens sevofluraan-anesthesie. De mogelijkheid om neuronale activiteit in de vlPAG en omliggende kernen met hoge temporele resolutie vast te leggen, is een stap voorwaarts in het bevorderen van het begrip van de relatie tussen REM-slaap en anesthesie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opnames op basis van silicium met meerdere elektroden worden steeds populairder om neuronale activiteit te meten in veel hersengebieden met een resolutie van één actiepotentiaal 1,2,3,4. In het afgelopen decennium is de opnametechnologie met hoge dichtheid aanzienlijk gegroeid. De huidige op silicium gebaseerde opname-elektroden zijn geschikt vooropnameapparaten met een hoog aantal kanalen, optische vezels en elektrocorticografie (ECoG) 5,6. Bovendien maakt chronische implantatie van deze elektroden langdurige opnames mogelijk 7,8.

Ondanks recente technologische ontwikkelingen blijft het een uitdaging om diepe caudale structuren zoals de hersenstam te richten met meerkanaalssondes. Bij het richten op hersenstamstructuren zoals het ventrolaterale periacqueductale grijs (vlPAG), is een belangrijk obstakel het identificeren van een sondetraject dat grote bloedvaten vermijdt, bijvoorbeeld de superieure sagittale veneuze sinus en de transversale veneuze sinus. Letsel aan deze grote aderen kan uitgebreide bloedingen, schade aan het onderliggende hersenweefsel en zelfs de dood veroorzaken 9,10. We stellen voor om hersenstamstructuren van voorste coördinaten onder een hoek te richten, zodat de opnamesonde de hersenen kan binnendringen onder dergelijke risicovolle vasculaire structuren (zie figuur 1). Deze schuine benadering, vergeleken met een verticale, maximaliseert het aantal hersengebieden dat toegankelijk is voor opname. Bovendien, in experimentele omstandigheden waarin ECoG-opnames gewenst zijn, biedt de schuine anterieure benadering meer schedeloppervlak beschikbaar voor implantatie van de ECoG-headset, aangezien het craniotomievenster voor het inbrengen van de sonde meer naar voren is gepositioneerd10,11.

Het identificeren van de specifieke celgroepen en circuits die verantwoordelijk zijn voor door anesthesie geïnduceerde REM-slaapveranderingen blijft een belangrijk doel van anesthesieonderzoek. Het doel hier was dus om reproduceerbaar en betrouwbaar toegang te krijgen tot de vlPAG - een hersenstamgebied dat geassocieerd is met de REM-slaap - om opnames met meerdere elektroden uit één stuk te verkrijgen bij muizen die op het hoofd zijn gefixeerd voor en tijdens sevofluraananesthesie12,13. Eerdere studies hebben elektrofysiologische lokale veldpotentiaalmetingen (LFP) van de vlPAG bij wakkere muizen gebruikt om neurale toestandsveranderingen te identificeren die verband houden met anesthesie14,15. LFP-metingen zijn echter voornamelijk gevoelig voor synaptische activiteit, niet voor actiepotentialen, binnen het geregistreerde gebied16. Bijgevolg blijft er een beperkt begrip van hoe anesthetica de neurale activiteitspatronen die door vlPAG-neuronen worden geproduceerd, rechtstreeks beïnvloeden. Hier wordt een methode beschreven om opnames van één neuron met hoge dichtheid te verkrijgen uit de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie. Deze methode kan ook worden aangepast om de activiteit van één neuron van verschillende andere diepe en achterste hersenstamstructuren vast te leggen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia (Charlottesville, Virginia). Vijf mannelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 3-7 maanden, met een gewicht van 25-30 g, werden gebruikt. De details van de reagentia en de apparatuur die hier worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Implantatie van hoofdplaat en headset

  1. Maak een ECoG-headset door perfluoralkoxy (PFA) gecoate roestvrijstalen draad te solderen aan een 3-pins connectorheader (Figuur 2A).
  2. Identificeer de invoegcoördinaten op basis van een stereotaxische atlas17 van muizen. Het gebruik van de stelling van Pythagoras om de hoek en diepte van het inbrengen van de sonde te berekenen - vooral wanneer er weinig informatie in de literatuur is - is een redelijk uitgangspunt (Figuur 1)18.
    LET OP: Uiteindelijk zullen de coördinaten met vallen en opstaan worden aangepast. Om de vlPAG te targeten werden de volgende coördinaten gebruikt bij volwassen muizen: anteroposterior (AP) -3,6 mm, mediolateraal (ML) +0,5 mm, dorsoventraal (DV) -4 mm. De sonde werd in een hoek van 20° (AP) ingebracht.
  3. Induceer algemene anesthesie door de muis in de inductiekamer te plaatsen (1,5%-3% isofluraan in zuurstof). Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis in het stereotaxische frame, plaatst u de neus van het dier in de neuskegel en stabiliseert u het hoofd met hoofdstaven.
  4. Breng oogzalf aan op de ogen om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen. Gebruik een temperatuurregelsysteem om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.
  5. Breng ontharingscrème of scheervacht aan op de hoofdhuid en desinfecteer vervolgens met povidonjodium en 70% alcohol. Gebruik de 'tips only' aseptische techniek om een steriel operatieveld te onderhouden.
  6. Voer een teenknijptest uit om de diepte van de anesthesie te controleren.
  7. Analgesie toedienen: carprofen 2,5 mg/kg, subcutaan toegediend in de rug.
  8. Maak een incisie van 5 mm in de hoofdhuid om een cirkelvormig stukje huid boven de pariëtale en occipitale botten te verwijderen. Verwijder de hersenvliezen voorzichtig door ze met het scalpelmesje te schrapen.
  9. Gebruik het scalpelmesje om spieraanhechtingen door te snijden en de pariëtale en occipitale botten bloot te leggen19. Breng indien nodig waterstofperoxide aan om het bloeden onder controle te houden en het schedeloppervlak te drogen. Het is van cruciaal belang om tandheelkundig cement en hars op een droge schedel aan te brengen om een sterke hechting te bereiken.
  10. Identificeer eerst de bregma- en lambda-oriëntatiepunten op de schedel20. Pas vervolgens de positie van de neuskegel aan om de voorste-achterste positie van de schedel waterpas te zetten, en zorg ervoor dat er niet meer dan 100 μm hoogteverschil bestaat tussen de twee oriëntatiepunten.
  11. Om de mediaal-laterale positie van de schedel waterpas te zetten, kiest u twee tegenovergestelde punten tussen bregma en lambda, elk op 1 mm van de sagittale hechting en controleert u hun niveau. Als er meer dan 100 μm hoogteverschil tussen hen is, pas dan de mediaal-laterale positie van de schedel aan door de hoofdstaven te manipuleren.
  12. Meet de afstand tussen bregma en lambda en vergelijk deze met de afstand gerapporteerd in de stereotaxische atlas van Franklin-Paxinos (meestal 4,2 mm)17. Gebruik het verschil tussen de gemeten en gerapporteerde afstanden om uw AP-coördinaat proportioneel te schalen. Markeer craniotomiecoördinaten op de schedel met een gesteriliseerd potlood.
    OPMERKING: Als de gemeten bregma-lambda-afstand afwijkt van 4,2 mm, moeten de coördinaten proportioneel worden geschaald. Alle AP-coördinaten die in een stereotaxische atlas worden gerapporteerd, komen overeen met een gestandaardiseerde bregma-lambda-afstand. Omdat de grootte van een muizenschedel variabel is, is het belangrijk om je coördinaten hierop aan te passen.
  13. Plaats met behulp van een stereotaxische micromanipulator de kopplaat direct op de lambdahechting en bevestig deze aan de schedel door tandheelkundig cement op de kopplaat en eromheen aan te brengen (Figuur 3A,B). Laat het cement minstens 10 minuten drogen.
  14. Boor braamgaten (diameter van 0,5 mm) voor twee corticale elektroden (frontale en pariëtale cortex) en voor één die als referentie-elektrode zal dienen (cerebellum). Plaats de gestripte uiteinden (0,5 mm) van gecoate zilverdraadelektroden in de braamgaten en zet ze vast met ultraviolet licht-geactiveerde hars.
  15. Bedek de gecoate roestvrijstalen draden volledig met tandheelkundig cement zodat er geen draad bloot komt te liggen. Bedek de onderkant en zijkanten van de headset met tandheelkundig cement zodat deze stevig op zijn plaats zit. Zorg ervoor dat bregma- en lambdahechtingen zichtbaar blijven zodra de headset op zijn plaats is vastgezet (Figuur 2B).
  16. Laat de muis minimaal 7 dagen herstellen, onderzoek het dier en de operatieplaats dagelijks op eventuele onregelmatigheden. Dien indien nodig pijnstillers (Carprofen 2,5 mg/kg, SC) toe.

2. Plaatsing en opname van de siliciumsonde

  1. Wen de muis aan de opname-installatie en hoofdfixatie (ten minste 1,5 uur op twee afzonderlijke dagen) (Figuur 2D).
  2. Plaats de muis op de dag van de opname in de anesthesiekamer (isofluraan 1,5%-3% in zuurstof).
  3. Plaats de muis in een stereotaxisch frame, pas de neuskegel en de hoofdbalken aan zoals beschreven in 1.3. Handhaaf de anesthesie (isofluraan 1,5%-3% in zuurstof) tijdens de stereotaxische operatie. Voer een teenknijptest uit om de diepte van de anesthesie te controleren.
  4. Breng oogzalf aan op de ogen en zorg voor voldoende lichaamstemperatuur.
  5. Identificeer bregma en lambda en zorg ervoor dat er niet meer dan 100 μm hoogteverschil bestaat tussen de twee anatomische oriëntatiepunten.
  6. Zoek en markeer de berekende coördinaten op de schedel met een steriel potlood en maak vervolgens een omtrek van het craniotomievenster van 2 mm x 2 mm rond de coördinaten.
  7. Voer een teenknijptest uit om de diepte van de anesthesie te controleren.
  8. Gebruik een hogesnelheidsboor om een craniotomievenster van 2 mm x 2 mm te maken. Breng 0,5-1 ml normale zoutoplossing aan om te voorkomen dat het hersenoppervlak uitdroogt. Verwijder de dura met behulp van een injectiespuit en een fijne pincet.
    OPMERKING: Let op grote bloedvaten (superieure sagittale sinus, transversale sinus) om overmatig bloeden te voorkomen (Figuur 3).
  9. Gebruik een hogesnelheidsboor om een apart braamgat te maken voor de referentie-elektrode van de siliciumsonde, meestal ~1-2 mm van het schedelvenster.
  10. Breng 0,2 ml siliconenlijm met lage toxiciteit aan op de schedel om de craniotomie volledig af te dichten, met behulp van de bijgevoegde applicator.
  11. Laat de muis ongeveer 1 uur herstellen.
  12. Bevestig de kop van de muis aan de elektrofysiologische opname-installatie met behulp van de kopplaat en schroeven (Figuur 2D).
  13. Smeer de silicium sondeschacht in met de fluorescerende kleurstof DiI (1:4 DiI:Ethanol) zodat de sondebaan na het experiment kan worden gereconstrueerd.
  14. Monteer de sonde op de manipulator en stel de gewenste hoek in. Om de vlPAG te richten, werd een AP-hoek van 15-20° toegepast.
  15. Laat de opnamesonde zakken naar het hersenoppervlak in het midden van het schedelvenster. Plaats eerst de sonde handmatig tot een diepte van ~300 μm. Eenmaal op deze diepte ingebracht, laat u de sonde langzaam automatisch (bijv. 200 μm/min) zakken tot de beoogde diepte om weefselbeschadiging te minimaliseren21 (Figuur 2C).
    NOTITIE: Handmatig inbrengen van de sonde wordt in eerste instantie aanbevolen. Het handmatig inbrengen van de sonde zorgt ervoor dat de sonde kan worden gestopt en ingetrokken als deze buigt bij de eerste inbreng. Zodra de sonde volledig in het weefsel is doorgedrongen, is het over het algemeen veilig om de sonde in de automatische modus te blijven afdalen.
  16. Breng minerale olie aan op het hersenoppervlak in het craniotomievenster om uitdroging te voorkomen.
  17. Laat de opnamesonde 10 minuten na het inbrengen bezinken.
  18. Neem gegevens op van de siliciumsonde en ECoG op 30kHz met behulp van een Intan Recording Controller.
  19. Gebruik 1-2 uur na de opname de transcardiale perfusietechniek om de hersenen te fixeren in 4% paraformaldehyde22.
    OPMERKING: Vanwege het cement kan het moeilijk zijn om het rostrale deel van de schedel te verwijderen. Daarom verdient het de voorkeur om de hersenen weg te snijden door de dorsale delen van de schedel te verwijderen.
  20. Onthoofd de muis, snijd de huid langs de middellijn aan de dorsale zijde, van de nek tot de onderkaak. Verwijder spieren en weefsel dat aan de schedel is bevestigd, snijd de onderkaak af voor gemakkelijkere toegang tot de hersenen.
  21. Als de perfusie correct wordt uitgevoerd, zouden de hersenen een beetje moeten krimpen, waardoor er voldoende ruimte overblijft om een fijne schaar in het dorsale deel van het foramen magnum te plaatsen. Maak een mediale snede, een laterale en een contralaterale snede, ongeveer 1 mm groot, in het achterhoofdsbeen.
  22. Verwijder voorzichtig het dorsale deel van de schedel met behulp van een oogheelkundige pincet. Begin bij het achterhoofdsbeen, verwijder alle schedelfragmenten totdat het hele dorsale deel van de hersenen bloot ligt.
  23. Schuif een microspatel onder de hersenen, beginnend bij de reukbollen om de hersenen eruit te scheppen.
  24. Eenmaal geperfundeerd en verwijderd, kunnen de hersenen 24-48 uur worden opgeslagen in 4% paraformaldehyde bij 4 °C.

3. Histologie voor reconstructie van het sondetraject

  1. Verdeel de hersenen in coronale secties van 70 μm met behulp van een vibratoom.
  2. Monteer de secties op objectglaasjes met behulp van een DAPI-montagemedium dat de celkernen kleurt. Dekglaasje en verzegel de dia's met doorzichtige nagellak.
  3. Bekijk de objectglaasjes met een fluorescentiemicroscoop. Pas het contrast/de helderheid aan zodat de sondesporen duidelijk zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de resulterende tiff-afbeeldingsbestandsgroottes kleiner zijn dan 10 MB, zodat MATLAB-codes soepel werken. Reconstrueer de sondesporen met behulp van een MATLAB-code23.

4. Analyse van elektrofysiologische gegevens

  1. Analyseer geregistreerde neurale signalen van de siliciumsonde met behulp van een offline detectie- en automatische sorteersoftware (Kilosort)24.
  2. Detecteerde clusters handmatig classificeren met Phy als multi- of enkele eenheden25. Classificeer clusters als afzonderlijke eenheden wanneer ze een fysiologische spike-golfvormvorm hebben, een refractaire periode in het cross-correlogram vertonen en een normale verdeling van de amplitudeweergave.
  3. Importeer gegevens van één eenheid naar MATLAB en analyseer23.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aan vijf mannelijke C57BL/6J werd een ECoG-headset en kopplaat geïmplanteerd (Figuur 4A). Na herstel waren de muizen gewend aan hoofdfixatie en de elektrofysiologische opnameopstelling gedurende twee sessies van 1,5 uur op afzonderlijke dagen (Figuur 4B). Vervolgens werd een craniotomievenster van 2 mm x 2 mm gemaakt (Figuur 4C) en werd een siliciumsonde ingebracht met de muis wakker en met het hoofd vast (Figuur 4D). Er werden twee soorten silicium UCLA-sondes gebruikt: (1) 64 M: een sonde met één schacht en 64 elektroden; en (2) 256 ANS: een sonde met vier schachten en 256 elektroden. Sevofluraan en zuurstof werden toegediend met behulp van een neuskegel die aan de elektrofysiologische installatie was bevestigd. De niveaus van zuurstof en sevofluraan werden elke 5 minuten gecontroleerd met behulp van een inline gasanalysator. Na transcardiale perfusie werden de hersenen geoogst (Figuur 4E) en geëvalueerd op sondetraject (Figuur 4F). Geregistreerde actiepotentialen werden vervolgens gecureerd in gegevens van één eenheid (figuur 4G).

Er werden vijf opnames gemaakt waarbij de plaatsing van de sonde werd gevalideerd met beschikbare algoritmen voor sondereconstructie die waren ontwikkeld in MATLAB23. Met behulp van deze algoritmen werd elke elektrode van de siliciumsonde gelokaliseerd in een specifieke hersenstructuur, zodat een driedimensionaal perspectief van de plaatsing van de sonde in de hersenen werd verkregen (Figuur 5). Deze reconstructiealgoritmen werden gekoppeld aan immunohistochemische markers om sondetrajecten verder te valideren (Figuur 6). De gegevens werden vervolgens gematcht met gecureerde afzonderlijke eenheden (Figuur 7).

In totaal werden 64 afzonderlijke neuronen vastgelegd, waarvan er 13 zich in de vlPAG bevonden. De overige 51 neuronen bevonden zich in nabijgelegen kernen: middenhersenen, reticulaire kern middenhersenen, paratrochleaire kern, spijkerschriftkern, laterodorsdal tegmentale kern, parabrachiale kern en superieure cerebellaire steeltjes. De vuuractiviteit van neuronen in elke muis wordt weergegeven als heatmaps (Figuur 7). Muis 3 werd uitgesloten van de analyse vanwege de slechte kwaliteit van de single-unit recording. De meeste geregistreerde neuronen verminderden hun vuren tijdens sevofluraan-anesthesie.

Het gemiddelde vuren van vlPAG-neuronen werd voor elke muis vergeleken na 5 minuten bij aanvang (d.w.z. 10-15 minuten na de opname) en 5 minuten tijdens sevofluraan (d.w.z. 40-45 minuten na de opname). Het vlPAG-vuren was significant verminderd (Figuur 8A) en bovendien was deze toename consistent over alle vlPAG-neuronen (Figuur 8B).

figure-results-1
Figuur 1: Berekening van stereotaxische coördinaten voor het inbrengen van de sonde. Linkerpaneel: Geometrie gebruiken om de hoekbenadering voor het inbrengen van de sonde te berekenen. De volgende componenten van een rechthoekige driehoek werden geïdentificeerd: (a) DV-diepte van de doelstructuur vanaf het hersenoppervlak (verkregen met behulp van de stereotaxische atlas), (b) afstand tussen de AP-coördinaat uitgaande van een strikt verticale afdaling en de AP-coördinaat van de doelstructuur. Rechterpaneel: Met (a) en (b) kan men de stelling van Pythagoras gebruiken om de AP-hoek (β) en lengte (c) van het inbrengen van de sonde te berekenen. De volgende coördinaten werden gebruikt om de vlPAG te targeten: (AP) -3,6 mm, (ML) +0,5 mm, (DV) -4 mm. Er werd een AP-hoek (β) van 20° gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Implantatie van de kopplaat en opname van één eenheid. (A) Plaatsing van de ECoG-headsetdraad tijdens de implantatie. (B) Bovenaanzicht van de schedel van de muis na implantatie van de ECoG-headset en de kopplaat. (C) Siliciumsondeschachten die in de hersenen worden ingebracht. (D) Muis met het hoofd vast tijdens een opname van een siliciumsonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Plaatsing van het schedelvenster, ten opzichte van de belangrijkste bloedvaten. Schematische weergave van het vaatstelsel op het oppervlak van de muizenhersenen met superieure sagittale sinus en transversale sinus gemarkeerd. Het witte vierkant geeft de locatie van het schedelvenster aan en de rode stip vertegenwoordigt het invoegpunt van de sonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Experimenteel ontwerp. Vijf mannelijke C57BL/6J-muizen werden geïmplanteerd met een ECoG-headset en kopplaat (A). Na herstel waren ze gewend aan de hoofdfixatie en de opname-installatie (B). Vervolgens werd een craniotomie uitgevoerd (C) en werd een siliciumsonde ingebracht terwijl de muis wakker was en zich in een hoofdvaste positie bevond. Vluchtige anesthetica en zuurstof werden toegediend met behulp van een neuskegel (D). Na opname werden de hersenen geoogst (E) en geanalyseerd met behulp van immunohistochemische technieken om het traject van de sonde te reconstrueren (F). Geregistreerde actiepotentialen werden vervolgens gecureerd in gegevens van één eenheid (G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: 3D-model van de hersenen met gereconstrueerde sondesporen. Elke rechte gekleurde lijn vertegenwoordigt het traject van een sonde. Elke stip markeert de locatie van DiI-kleurstof die zichtbaar is op coronale hersenplakjes. De baan van de sonde wordt gereconstrueerd voor elke schacht van de siliciumsonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Post hoc reconstructie van de plaatsing van de sonde binnen de vlPAG. Representatief coronaal hersenplakje voor elke geregistreerde muis (1-5) gekleurd met DAPI (blauw) met sondesporen ((DiI, rood, gemarkeerd door groene pijlen) met een omtrek van hersengebieden. Schaal balk: 500 μm. Muis 1-3 werden opgenomen met siliciumsondes met één schacht (d.w.z. 64 kanalen), terwijl muis 4 en 5 werden opgenomen met siliciumsondes met vier schachten (d.w.z. 256 kanalen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Binned vuuractiviteit voor en tijdens sevofluraan-anesthesie. Heatmaps geven het aantal afgevuurde actiepotentialen weer door 64 afzonderlijke neuronen met tussenpozen van één minuut. Individuele neuronen kregen een structuur van oorsprong toegewezen op basis van de reconstructie van het sondetraject. De witte stippellijn geeft het begin van de toediening van sevofluraan aan, n = 4 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Afgevuurd vuren van vlPAG-neuronen tijdens sevofluraan-anesthesie. (A) Gemiddeld aantal actiepotentialen afgevuurd voor en tijdens de anesthesie voor elke muis. (B) Aantal actiepotentialen afgevuurd door elk vlPAG-neuron (B). Gepaarde t-student-test, **P = 0,0036, P = 0,0053 respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Afbeelding 9: Voorbeeld van hoe een ongelijke plaatsing van de kopplaat het traject van de sonde kan beïnvloeden. (A) Ongelijke plaatsing van de kopplaat op de kop van de muis. (B,C) 3D-reconstructie van de muizenhersenen met gerenderde sondebaan waarbij er een onbedoelde mediolaterale hoek is veroorzaakt door ongelijke plaatsing van de kopplaten op het hoofd van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hersenstamkernen bemiddelen fundamentele functies zoals ademhaling, bewustzijn en slaap 26,27,28. De locatie van de hersenstam (diep en posterieur) vormt een uitdaging bij het bestuderen van de neuronale activiteit in vivo met behulp van standaardtechnieken. Hier wordt een schuine anterieure benadering gepresenteerd om reproduceerbare opname van één eenheid mogelijk te maken in muizen met een hoofdfixatie.

Zorgvuldige inbrenging van de siliciumsonde met meerdere elektroden is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de hersenstamstructuren die verband houden met de REM-slaap consistent worden aangepakt, terwijl schade aan belangrijke bloedvaten wordt voorkomen. Een aanzienlijke mate van finesse, concentratie en geduld zijn vereist om de beste coördinaten en het traject van binnenkomst13 te bepalen.

Vanwege de schuine baan van de sonde en de afstand die nodig is om diepe structuren te richten, zullen zelfs kleine inconsistenties in coördinaten en positionering van de kopplaat waarschijnlijk leiden tot het missen van de doelstructuur. Het is absoluut noodzakelijk dat Bregma en Lambda zich tijdens de implantatie van de kopplaat op hetzelfde niveau bevinden en dat de afstand tussen beide nauwkeurig wordt gemeten. Met name omdat operaties worden uitgevoerd op een stereotaxisch frame en opnames worden uitgevoerd op een aparte elektrofysiologie-installatie, is het van cruciaal belang dat de hoofdplaten op een genivelleerde schedel worden bevestigd. Het introduceren van extra hoeken (d.w.z. een gekanteld hoofd) verhoogt het risico op fouten, dat vooral hoog is voor kleine, diepe hersenstructuren (Figuur 9).

Omdat siliciumsondes kwetsbaar zijn, is het belangrijk om de dura van het oppervlak van de hersenen te verwijderen en ervoor te zorgen dat er geen botfragmenten het schedelvenster blokkeren. Lichte bloedingen kunnen optreden na het verwijderen van dura, dus het is van cruciaal belang om het craniotomieoppervlak vrij te maken van gestold bloed waardoor de sonde kan buigen. Als het inbrengen van de siliciumsonde in de hersenen moeilijk blijkt te zijn (bijv. de sonde buigt), is het belangrijk om te controleren of er nog iets aan de hand is of dat het oppervlak van de hersenen is opgedroogd, omdat er een dun membraan kan ontstaan als er weinig tot geen vloeistof is. Bij mensen27 hebben gebieden in de buurt van bloedvaten een dikkere dura, en een soortgelijk probleem wordt gevonden bij muizen, waar het verwijderen van de dura zonder bloedvaten te scheuren een uitdaging kan zijn. Hoewel zorgvuldige verwijdering van de dura meestal resulteert in een soepele inbrenging van de sonde, kunnen grotere insteekhoeken extra problemen opleveren.

De opbrengst van opnames kan sterk verschillen tussen dieren en is afhankelijk van tal van variabelen. Een belangrijke factor is de dichtheid van neuronen in de beoogde structuur; Gebieden met een lage neuronendichtheid (bijv. Cortex) hebben over het algemeen een lagere opbrengst van geregistreerde afzonderlijke neuronen. Bovendien kan weefselbeschadiging, zoals het scheuren van een vat onder het hersenoppervlak, leiden tot neuronale dood of letsel, waardoor de opbrengst verder afneemt 21,29. De kwaliteit van de opnames is ook cruciaal, omdat opnames van hogere kwaliteit het gemakkelijker maken om afzonderlijke neuronen te onderscheiden. Een off-target sondetraject kan ook resulteren in lagere opbrengsten. Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor opnames in de vlPAG, kan het worden gebruikt om op te nemen van nabijgelegen structuren in de hersenstam.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten op grond van dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1, Figuur 3, Figuur 4, Figuur 8 en Figuur 9 zijn gemaakt met BioRender.com. We willen Scott Kilianski bedanken voor de hulp bij MATLAB-code en het delen van zijn scripts. We danken Anna Grace Carns voor haar hulp bij de reconstructie van het sondetraject.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1024 channel RHD Recording ControllerIntan Technologies, Los Angeles, California, USAC3008Silicon probe recording; recording hardware en software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, USA48393-081Histologie
4% PFA in PBSThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAJ61899.AKHistologie; perfusieoplossing
C&B metabondPatterson Dental, Richmond, Virginia, USApoeder: 5533559, snelle basis: 5533492, katalysator: 55335007Headplate &Headset Implantatie
C57/6J muizen 4-6 weken, mannetjesThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA000664
Capnomac UltimaDatex, Helsinki, FinlandULT-SVi-27-07Gas Analyzer; uit productie; alternatieve gas analyzer kan worden gekocht bij Bionet America
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAV22888Rode fluorescente kleurstof voor het coaten van de silicium sonde
Connector HeaderDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA1212-1788-NDECoG Headset
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA0100-20Histologie
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Virginia, USA044-1113Headplate &Headset Implantatie; voor  het bevestigen van roestvrijstalen draden op de schedel
Low toxicity siliconen lijmWorld Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAKWIK-SILHeadplate
Micro-Manipulator SysteemNew Scale Technologies, Victor, New York, USAMulti-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring voor MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Silicone probe recording; het inbrengen van de sonde in de hersenen
MicroprobesUCLA, Los Angeles, California, USA256 ANS, 64MUit productie; alternatieve silicium sondes kunnen worden gekocht bij Neuropixels
MineralolieSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLSilicone probe recording; het voorkomen dat het weefsel uitdroogt tijdens de opname
Normale zoutoplossingThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAZ1376Headplate &Headset Implantatie; het voorkomen dat de hersenen uitdrogen tijdens de operatie
PFA-Coated roestvrijstalen draad-Diameter 0,008 inch bedekt met gestreepte uiteindenA-M systems, Sequim, Washington, USA791400ECoG Headset & referentie-elektrode voor ECoG
Platinum draad 24AWGWorld Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAPTP201Referentie-elektrode voor de silicium probe opname
Shandon Colorfrost Plus microscoopglazenThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA99-910-01Histologie
Roestvrijstalen HeadplateStar Rapid, Chinaop maat gemaakt onderdeelHeadplate &Headset Implantatie; ontwerp beschikbaar op aanvraag
Stereotactisch apparaatKOPF, Tujunga, California, USAModel 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display ConsoleHeadplate &Headset Implantatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Gerelateerde artikelen