Evaluatie van het effect van groeifactoren op de productie van chlorofyl A en B uit microalgen

Samenvatting

De huidige studie benadrukt de voordelen van het gebruik van de methode die door Jeffrey en Humphrey is ontwikkeld voor het extraheren en kwantificeren van vetoplosbare pigmenten uit microalgen. Deze methode dient als een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van de invloed van groeifactoren op de chlorofylproductie en de cellulaire inhoud in deze organismen.

Samenvatting

Microalgen bevatten twee hoofdgroepen pigmenten: chlorofylen en carotenoïden. Chlorofyl is een groen pigment dat lichtenergie absorbeert en omzet in chemische energie om de synthese van organische verbindingen te vergemakkelijken. Dit pigment dient als een waardevolle primaire bron voor biotechnologische inputproducten in de voedings-, farmaceutische en cosmetische industrie vanwege de hoge antioxiderende eigenschappen en kleureigenschappen. Het doel van dit onderzoek was om het effect van groeifactoren (CO₂ -concentratie, lichtkleur en lichtintensiteit) te evalueren door middel van een Taguchi L₄ experimenteel ontwerp op celgroei en de cellulaire inhoud van chlorofyl a en b in Chlorella sorokiniana, gevolgd door validatie van de methode met behulp van Haematococcus pluvialis Microalgen als aanvullend studiemodel. Celgroei werd gekwantificeerd met behulp van de spectrofotometrische techniek met optische dichtheid bij een golflengte van 550 nm. Voor de kwantificering van chlorofyl werd een celextract verkregen met behulp van een 90% zuivere acetonoplossing, en vervolgens werden de concentraties van chlorofyl a en b gekwantificeerd met behulp van spectrofotometrische technieken op golflengten van 647 nm en 664 nm, volgens de methode beschreven door Jeffrey en Humphrey. De experimentele resultaten gaven aan dat het beheersen van omstandigheden van lage CO₂ -toevoeging, paars licht en lage lichtintensiteit zowel de celgroei als de concentratie van chlorofyl a en b in de cellen verhoogt. De implementatie van deze kwantificeringsmethode voor chlorofyl maakt een snelle, eenvoudige en nauwkeurige bepaling van het chlorofylgehalte mogelijk, aangezien de gebruikte golflengten zich op de absorptiepieken van beide soorten chlorofyl bevinden, waardoor deze techniek gemakkelijk reproduceerbaar is voor alle microalgen die worden bestudeerd.

Inleiding

In de afgelopen jaren hebben de toenemende milieuproblemen veroorzaakt door antropogene activiteiten en hun nadelige effecten op de gezondheid en het evenwicht van ecosystemen geleid tot de zoektocht naar efficiëntere en milieuvriendelijkere productiesystemen. Dit heeft de processen in de industrie versneld en de implementatie van bioremediatiebehandelingen en de ontwikkeling van bioverbindingen bevorderd om deze schadelijke effecten te verzachten¹.

Deze context heeft geleid tot een aanzienlijke groei in de studie van microalgen, gedreven door de noodzaak om innovatieve oplossingen te vinden voor de huidige ecologische en economische uitdagingen. Microalgen gedijen goed in aquatische omgevingen, waarbij zonlicht en koolstofdioxide worden gebruikt als respectievelijk energiebronnen en koolstof. Deze eigenschap maakt ze tot een duurzaam en veelbelovend alternatief voor het produceren van verschillende waardevolle producten. Onderzoek op dit gebied heeft zich gericht op het begrijpen van de fysiologie en het metabolisme van deze cellen, evenals op het ontwikkelen van efficiënte technologieën voor hun kweek en verwerking².

Er is een duidelijke behoefte aan het ontwikkelen van toegankelijke en betrouwbare instrumenten voor het bestuderen van microalgen om onderzoeksprocessen te versnellen en het begrip van hun fysiologie, metabolisme en mogelijke toepassingen te verdiepen. Deze instrumenten moeten een snelle analyse mogelijk maken van het effect van milieu- en productiefactoren op belangrijke parameters, zoals de chlorofylconcentratie, die een fundamentele indicator is voor de gezondheid en ontwikkeling van deze organismen. Een afname van het chlorofylgehalte kan duiden op milieustress, voedingstekorten of ziekten.

Deze groene pigmenten spelen een cruciale rol bij de fotosynthese, waarbij ze zonne-energie opvangen om koolstofdioxide en water om te zetten in glucose en zuurstof en vormen tussen 0,5% en 5% van de biomassa van microalgen³. Naast hun essentiële rol bij het in stand houden van levensprocessen, hebben chlorofylen toepassingen gevonden in verschillende industrieën. Chlorofylextracten worden gebruikt in de verwerking van voedsel en dranken als natuurlijke kleurstoffen, die producten levendige groene tinten geven en tegelijkertijd antioxiderende eigenschappen bieden. Bovendien winnen supplementen op basis van chlorofyl aan populariteit in de gezondheids- en welzijnssector vanwege hun vermeende ontgiftende en ontstekingsremmende effecten. Door gebruik te maken van de veelzijdige eigenschappen van chlorofyl kunnen industrieën innovatieve producten ontwikkelen die bijdragen aan zowel de visuele aantrekkingskracht als het welzijn van de consument¹.

In dit opzicht is een microalg van groot biotechnologisch belang C. sorokiniana. Dit micro-organisme onderscheidt zich door zijn snelle groeisnelheid, waardoor het zeer efficiënt is in de productie van biomassa. Bovendien vertoont C. sorokiniana een divers gehalte aan zeer voedzame verbindingen, waaronder eiwitten, lipiden en vitamines, waardoor het waardevol is voor verschillende toepassingen in de productie van voedsel, diervoeder en biobrandstoffen^. Bovendien is gebleken dat deze microalgensoort extracellulaire enzymen met verschillende functies produceert, wat mogelijkheden opent voor biotechnologische toepassingen zoals afvalwaterzuivering, bioremediatie en farmaceutica^. Naast de snelle groei en veelzijdige toepassingen, vertoont C. sorokiniana ook een aanzienlijk potentieel voor de productie van chlorofyl. Als fotosynthetisch micro-organisme beschikt C. sorokiniana over de machinerie die nodig is voor de synthese van chlorofyl, dat tussen 0,5% en 5% van de biomassa van microalgen uitmaakt³. Dit vermogen maakt C. sorokiniana een aantrekkelijke kandidaat voor de productie van chlorofyl op commerciële schaal en belooft een duurzame oplossing te zijn voor dringende milieu- en voedingsuitdagingen⁵.

Aan de andere kant is een andere microalgensoort van groot belang H. pluvialis. Deze microalg staat bekend om zijn productie van astaxanthine, een krachtig antioxidant pigment met tal van industriële toepassingen. Astaxanthine dient als een beschermend mechanisme voor het fotosysteem van H. pluvialis en beschermt het tegen oxidatieve stress veroorzaakt door omgevingsfactoren. Dit pigment is zeer gewild in de cosmetica-, nutraceuticals- en aquacultuurindustrie, vanwege de antioxiderende eigenschappen en potentiële gezondheidsvoordelen. Met zijn overvloedige vermogen om astaxanthine te produceren, biedt H. pluvialis een veelbelovende weg voor het ontwikkelen van innovatieve producten die voldoen aan verschillende industriële en consumentenbehoeften⁶.

Recente studies hebben ook het potentieel van H. pluvialis¹ voor de productie van chlorofyl benadrukt, waardoor de industriële betekenis ervan verder wordt vergroot. Een studie onderzocht bijvoorbeeld het chlorofylgehalte van H. pluvialis onder wisselende groeiomstandigheden en ontdekte dat H. pluvialis onder optimale kweekparameters opmerkelijke chlorofylproductiesnelheden vertoonde, die die van andere microalgensoorten overtroffen⁷. Deze bevinding onderstreept het potentieel van H. pluvialis als een duurzame bron van chlorofyl en biedt nieuwe mogelijkheden voor het gebruik ervan in verschillende industriële sectoren.

Protocol

1. Bereiding van kweekmedia en voorbereiding van entmateriaal

1. Bereid 1 L 3N-BBM+ V(CCAP) groeimedium voor (Macronutriënten: NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1]; micronutriënten: Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ en steriliseer het gedurende 15 minuten bij 121 °C en 1,5 psi.
2. Inoculeer een kolf met 1 l groeimedium in een concentratie van ongeveer 3 x 10⁶ cellen ^ml-1 voor de microalg C. sorokiniana; of voeg 5% tot 10% (v/v) inoculum toe aan het groeimedium.
   OPMERKING: Om steriele omstandigheden te behouden, wordt aanbevolen om een laminaire stroomkap, handschoenen, laboratoriumjas en gezichtsmasker te gebruiken.
3. Incubeer de geënte kolf onder roodlichtbronnen met een intensiteit van ongeveer 3.600 tot 4.200 lux, bij een temperatuur tussen 22-26 °C, met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur duisternis voor C. sorokiniana en fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur duisternis voor H. pluvialis, en schud elke 24 uur handmatig, ongeveer gedurende 7 dagen voor beide stammen.
   OPMERKING: Houd onder groeiomstandigheden minimaal 7-10 dagen (tot het verkrijgen van een intens groene kleur) voor C. sorokiniana en 10-12 dagen voor H. pluvialis. Om het microalgenconcentraat te verkrijgen dat als inoculum in de kinetiek zal dienen, is het noodzakelijk om het bovendrijvende medium uit de geproduceerde algen te verwijderen.
4. Vul in een steriele omgeving steriele conische centrifugatiebuisjes van 15 ml met ongeveer 10 ml geënt medium en centrifugeer op 3.000 x g gedurende 20 minuten onder 25-30 °C.
5. Verwijder onder steriele omstandigheden het supernatans met behulp van een micropipet of door de biomassa in een steriele conische centrifugatiebuis van 50 ml te gieten en te concentreren.
6. Herhaal dit proces indien nodig totdat het vereiste volume inoculum voor de kinetiek is verkregen.
7. Meet de optische dichtheid (OD₅₅₀ nm) van het entmateriaal om de celconcentratie van de microalgen te bepalen en bewaar deze bij een temperatuur van 3-4 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
   OPMERKING: Directe celtelling werd aanvankelijk uitgevoerd om de celconcentratie te correleren met absorptie. Eenmaal geteld, kan het inoculum niet langer dan 4 dagen in de koelkast worden bewaard.

2. Studie van de groeikinetiek

1. Bereid het vereiste volume 3N-BBM+ V (CCAP) voor dat geschikt is voor elk experiment (8 L voor fotobioreactorniveautests voor C. sorokiniana en 0,5 L voor de kolfniveautests voor H. pluvialis) volgens standaard laboratoriumprocedures, en zorg voor een goede sterilisatie.
2. Configureer voor zowel de fotobioreactor als de kolven de lichtbron op het gewenste kleurenspectrum (blauw bij 460 nm, paars, mix van 460 nm en 630 nm voor C. sorokiniana en rood bij 630 nm voor H. pluvialis); Dek beide systemen af om interferentie van extern licht te voorkomen.
   OPMERKING: Vanwege de variatie in golflengte die door elke lichtgevende diode wordt uitgezonden, werd spectroradiometrie uitgevoerd met behulp van een spectroradiometer op de lichtbronnen om de golflengte en het emissievermogen van elke diode⁹ te bepalen. Paars licht werd bereikt door rode en blauwe LED's te combineren, wat resulteerde in golflengten van 460 nm met een emissievermogen van 1,65 W ^nm-1 voor de blauwe LED's en 630 nm met een emissievermogen van 0,6 W ^nm-1 voor de rode LED's. Deze metingen werden gebruikt voor de tests die uitsluitend onder blauw en rood licht werden uitgevoerd.
3. Programmeer de timer om af te wisselen tussen 12 uur licht en 12 uur donker voor C. sorokiniana en 16 uur licht en 8 uur donker cycli voor H. pluvialis.
4. Sluit het CO₂ -beluchtingssysteem aan op het kweekvat van de fotobioreactor om met tussenpozen van 12 uur kooldioxide toe te voeren voor C. sorokiniana.
5. Inoculeer het kweekvat met een voldoende volume pre-inoculum om een startceldichtheid van 3 x 10⁵ cellen ^ml-1 of het equivalent daarvan in optische dichtheid (OD₅₅₀ nm) = 0,180 te bereiken.
   OPMERKING: Zorg voor een aseptische techniek tijdens het inoculeren om besmetting te voorkomen.
6. Bemonstering van de cultuur met regelmatige tussenpozen van 12 uur voor C. sorokiniana en 8 uur voor H. pluvialis om de celgroei en fysiologische parameters te controleren. Verzamel monsters met behulp van steriele technieken om de integriteit van de cultuur te behouden.

3. Kwantificering van chlorofyl

OPMERKING: Gegevens voor cellulaire kwantificering worden verstrekt in aanvullend bestand 1.

1. Plaats 40 ml van het monster in plastic conische centrifugeerbuisjes.
2. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 20 minuten bij 15 °C en gooi het supernatans weg door decantatie of met een pasteurpipet.
3. Breng de celpellet over in een glazen buis bedekt met aluminiumfolie en een schroefdop om oxidatie te voorkomen.
4. Resuspendeer de celpellet met 3 ml 90% zuivere acetonoplossing met behulp van een vortex.
5. Sonicaat het zwevende monster in een ijsbad gedurende twee cycli van elk 5 minuten en laat het 16 uur¹⁰ rusten bij 4 °C.
6. Na 16 uur opnieuw sonificeren onder dezelfde omstandigheden vermeld in de vorige stap (stap 3.5) en opnieuw centrifugeren onder de eerder beschreven omstandigheden (stap 3.2).
7. Scheid het pigmentextract met behulp van een pasteurpipet en breng het over in een andere schone buis die beschermd is tegen licht.
8. Plaats het pigmentextract in een kwartscel om af te lezen in een spectrofotometer op golflengten van 630 nm, 647 nm en 664 nm.
   NOTITIE: Kalibreer de spectrofotometer vooraf met 90% aceton.
9. Gebruik de volgende vergelijkingen¹¹ om de chlorofylconcentraties te berekenen:
   Chlorofyl A = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Chlorofyl b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   OPMERKING: De resultaten worden uitgedrukt in μg ^ml-1 extract, die worden vermenigvuldigd met het extractvolume en gedeeld door het aantal ml monster om chlorofylconcentraties in μg ^ml-1 van de cultuur te verkrijgen.
10. Gebruik de volgende formule om waarden in μg chl ^cel-1 te verkrijgen:
    μg chl ^cel-1 = μg chl in 1 ml cultuur / [cellen ^ml-1] celconcentratie in de cultuur.

Resultaten

Om de efficiëntie van de techniek te observeren die variaties in de cellulaire concentratie van chlorofyl detecteert en het effect van groeifactoren in C. sorokiniana te evalueren, werd een experimenteel ontwerp van Taguchi L₄ opgesteld, waarbij de toevoeging van CO₂ -volume, lichtkleur en lichtintensiteit werden geëvalueerd. Elke factor werd beoordeeld op lage en hoge niveaus, zoals weergegeven in tabel 1, onder de omstandigheden die zijn ...

Discussie

De vergelijkende studie tussen H. pluvialis en C. sorokiniana onthulde significante verschillen in de dynamiek van de chlorofylproductie. Terwijl H. pluvialis gedurende het hele experiment een afname van de chlorofylconcentratie vertoonde, vertoonde C. sorokiniana een gestage toename. Bovendien was er aanvankelijk een lager aandeel chlorofyl a in beide soorten, maar deze verhouding keerde om in bepaalde groeiomstandigheden, wat aanwijzingen ka...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetone 90%
15 mL tube	Biologix	10-9502	Testbuis
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicator
5 mL screw cap test tube	Kimax	45066-13100	Testbuis
50 mL centrifuge tube	Biologix	10-9151	Testbuis
Aluminum foil	Reynolds	611 standard, 12" x 1000 feet	Testbuisdeksel
CaCl2	Meyer	0925-250	Calciumchloride
Centrifuge	Dynamica	14 R	Gekoelde centrifuge
CoCl2	Merck	1057-100	Kobaltdichloride
FeCl3	Merck	157740	IJzer(III)chloride
K2HPO4	Meyer	2051-250	Dikaliumfosfaat
KH2PO4	Meyer	2055-250	Monokaliumfosfaat
MgSO4	Meyer	1605-250	Magnesiumsulfaat
Micropipette	LabNet	Model Beta-Pette	Micropipette
MnCl2	Merck	429449	Mangaan(II)chloride
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, dinatriumzout dihydraat
Na2MoO4	Merck	243655	Natriummolybdaat
NaCl	Meyer	2365-500	Natriumchloride
NaNO3	Meyer	2465-250	Natriumnitraat
RGB LED stripe	Steren	GAD-LED2	Lichtbron
Spectrofotometer	PerkinElmer	Model Lambda35	Spectrofotometer
spectroradiometer	Gigahertz-Optik	model BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Zinkchloride