De huidige studie benadrukt de voordelen van het gebruik van de methode die door Jeffrey en Humphrey is ontwikkeld voor het extraheren en kwantificeren van vetoplosbare pigmenten uit microalgen. Deze methode dient als een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van de invloed van groeifactoren op de chlorofylproductie en de cellulaire inhoud in deze organismen.
Methodenartikel
Evaluatie van het effect van groeifactoren op de productie van chlorofyl A en B uit microalgen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microalgen bevatten twee hoofdgroepen pigmenten: chlorofylen en carotenoïden. Chlorofyl is een groen pigment dat lichtenergie absorbeert en omzet in chemische energie om de synthese van organische verbindingen te vergemakkelijken. Dit pigment dient als een waardevolle primaire bron voor biotechnologische inputproducten in de voedings-, farmaceutische en cosmetische industrie vanwege de hoge antioxiderende eigenschappen en kleureigenschappen. Het doel van dit onderzoek was om het effect van groeifactoren (CO2 -concentratie, lichtkleur en lichtintensiteit) te evalueren door middel van een Taguchi L4 experimenteel ontwerp op celgroei en de cellulaire inhoud van chlorofyl a en b in Chlorella sorokiniana, gevolgd door validatie van de methode met behulp van Haematococcus pluvialis Microalgen als aanvullend studiemodel. Celgroei werd gekwantificeerd met behulp van de spectrofotometrische techniek met optische dichtheid bij een golflengte van 550 nm. Voor de kwantificering van chlorofyl werd een celextract verkregen met behulp van een 90% zuivere acetonoplossing, en vervolgens werden de concentraties van chlorofyl a en b gekwantificeerd met behulp van spectrofotometrische technieken op golflengten van 647 nm en 664 nm, volgens de methode beschreven door Jeffrey en Humphrey. De experimentele resultaten gaven aan dat het beheersen van omstandigheden van lage CO2 -toevoeging, paars licht en lage lichtintensiteit zowel de celgroei als de concentratie van chlorofyl a en b in de cellen verhoogt. De implementatie van deze kwantificeringsmethode voor chlorofyl maakt een snelle, eenvoudige en nauwkeurige bepaling van het chlorofylgehalte mogelijk, aangezien de gebruikte golflengten zich op de absorptiepieken van beide soorten chlorofyl bevinden, waardoor deze techniek gemakkelijk reproduceerbaar is voor alle microalgen die worden bestudeerd.
Inleiding
In de afgelopen jaren hebben de toenemende milieuproblemen veroorzaakt door antropogene activiteiten en hun nadelige effecten op de gezondheid en het evenwicht van ecosystemen geleid tot de zoektocht naar efficiëntere en milieuvriendelijkere productiesystemen. Dit heeft de processen in de industrie versneld en de implementatie van bioremediatiebehandelingen en de ontwikkeling van bioverbindingen bevorderd om deze schadelijke effecten te verzachten1.
Deze context heeft geleid tot een aanzienlijke groei in de studie van microalgen, gedreven door de noodzaak om innovatieve oplossingen te vinden voor de huidige ecologische en economische uitdagingen. Microalgen gedijen goed in aquatische omgevingen, waarbij zonlicht en koolstofdioxide worden gebruikt als respectievelijk energiebronnen en koolstof. Deze eigenschap maakt ze tot een duurzaam en veelbelovend alternatief voor het produceren van verschillende waardevolle producten. Onderzoek op dit gebied heeft zich gericht op het begrijpen van de fysiologie en het metabolisme van deze cellen, evenals op het ontwikkelen van efficiënte technologieën voor hun kweek en verwerking2.
Er is een duidelijke behoefte aan het ontwikkelen van toegankelijke en betrouwbare instrumenten voor het bestuderen van microalgen om onderzoeksprocessen te versnellen en het begrip van hun fysiologie, metabolisme en mogelijke toepassingen te verdiepen. Deze instrumenten moeten een snelle analyse mogelijk maken van het effect van milieu- en productiefactoren op belangrijke parameters, zoals de chlorofylconcentratie, die een fundamentele indicator is voor de gezondheid en ontwikkeling van deze organismen. Een afname van het chlorofylgehalte kan duiden op milieustress, voedingstekorten of ziekten.
Deze groene pigmenten spelen een cruciale rol bij de fotosynthese, waarbij ze zonne-energie opvangen om koolstofdioxide en water om te zetten in glucose en zuurstof en vormen tussen 0,5% en 5% van de biomassa van microalgen3. Naast hun essentiële rol bij het in stand houden van levensprocessen, hebben chlorofylen toepassingen gevonden in verschillende industrieën. Chlorofylextracten worden gebruikt in de verwerking van voedsel en dranken als natuurlijke kleurstoffen, die producten levendige groene tinten geven en tegelijkertijd antioxiderende eigenschappen bieden. Bovendien winnen supplementen op basis van chlorofyl aan populariteit in de gezondheids- en welzijnssector vanwege hun vermeende ontgiftende en ontstekingsremmende effecten. Door gebruik te maken van de veelzijdige eigenschappen van chlorofyl kunnen industrieën innovatieve producten ontwikkelen die bijdragen aan zowel de visuele aantrekkingskracht als het welzijn van de consument1.
In dit opzicht is een microalg van groot biotechnologisch belang C. sorokiniana. Dit micro-organisme onderscheidt zich door zijn snelle groeisnelheid, waardoor het zeer efficiënt is in de productie van biomassa. Bovendien vertoont C. sorokiniana een divers gehalte aan zeer voedzame verbindingen, waaronder eiwitten, lipiden en vitamines, waardoor het waardevol is voor verschillende toepassingen in de productie van voedsel, diervoeder en biobrandstoffen. Bovendien is gebleken dat deze microalgensoort extracellulaire enzymen met verschillende functies produceert, wat mogelijkheden opent voor biotechnologische toepassingen zoals afvalwaterzuivering, bioremediatie en farmaceutica. Naast de snelle groei en veelzijdige toepassingen, vertoont C. sorokiniana ook een aanzienlijk potentieel voor de productie van chlorofyl. Als fotosynthetisch micro-organisme beschikt C. sorokiniana over de machinerie die nodig is voor de synthese van chlorofyl, dat tussen 0,5% en 5% van de biomassa van microalgen uitmaakt3. Dit vermogen maakt C. sorokiniana een aantrekkelijke kandidaat voor de productie van chlorofyl op commerciële schaal en belooft een duurzame oplossing te zijn voor dringende milieu- en voedingsuitdagingen5.
Aan de andere kant is een andere microalgensoort van groot belang H. pluvialis. Deze microalg staat bekend om zijn productie van astaxanthine, een krachtig antioxidant pigment met tal van industriële toepassingen. Astaxanthine dient als een beschermend mechanisme voor het fotosysteem van H. pluvialis en beschermt het tegen oxidatieve stress veroorzaakt door omgevingsfactoren. Dit pigment is zeer gewild in de cosmetica-, nutraceuticals- en aquacultuurindustrie, vanwege de antioxiderende eigenschappen en potentiële gezondheidsvoordelen. Met zijn overvloedige vermogen om astaxanthine te produceren, biedt H. pluvialis een veelbelovende weg voor het ontwikkelen van innovatieve producten die voldoen aan verschillende industriële en consumentenbehoeften6.
Recente studies hebben ook het potentieel van H. pluvialis1 voor de productie van chlorofyl benadrukt, waardoor de industriële betekenis ervan verder wordt vergroot. Een studie onderzocht bijvoorbeeld het chlorofylgehalte van H. pluvialis onder wisselende groeiomstandigheden en ontdekte dat H. pluvialis onder optimale kweekparameters opmerkelijke chlorofylproductiesnelheden vertoonde, die die van andere microalgensoorten overtroffen7. Deze bevinding onderstreept het potentieel van H. pluvialis als een duurzame bron van chlorofyl en biedt nieuwe mogelijkheden voor het gebruik ervan in verschillende industriële sectoren.
Protocol
1. Bereiding van kweekmedia en voorbereiding van entmateriaal
- Bereid 1 L 3N-BBM+ V(CCAP) groeimedium voor (Macronutriënten: NaNO3 [0,75 g L-1], CaCl2 [0,019 g L-1], MgSO4 [0,019 g L-1], K2HPO4 [0,057 g L-1], NaCl [0,025 g L-1], KH2PO4 [0,175 g L-1]; micronutriënten: Na2 EDTA [0,0186 g L-1], FeCl3 [0,0024 g L-1], MnCl2 [0,001 g L-1], ZnCl2 [1,25 x 10-4 g L-1], CoCl2 [5 x 10-5 g L-1], Na2MoO4 [9,98 x 10-5 g L-1])8 en steriliseer het gedurende 15 minuten bij 121 °C en 1,5 psi.
- Inoculeer een kolf met 1 l groeimedium in een concentratie van ongeveer 3 x 106 cellen ml-1 voor de microalg C. sorokiniana; of voeg 5% tot 10% (v/v) inoculum toe aan het groeimedium.
OPMERKING: Om steriele omstandigheden te behouden, wordt aanbevolen om een laminaire stroomkap, handschoenen, laboratoriumjas en gezichtsmasker te gebruiken. - Incubeer de geënte kolf onder roodlichtbronnen met een intensiteit van ongeveer 3.600 tot 4.200 lux, bij een temperatuur tussen 22-26 °C, met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur duisternis voor C. sorokiniana en fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur duisternis voor H. pluvialis, en schud elke 24 uur handmatig, ongeveer gedurende 7 dagen voor beide stammen.
OPMERKING: Houd onder groeiomstandigheden minimaal 7-10 dagen (tot het verkrijgen van een intens groene kleur) voor C. sorokiniana en 10-12 dagen voor H. pluvialis. Om het microalgenconcentraat te verkrijgen dat als inoculum in de kinetiek zal dienen, is het noodzakelijk om het bovendrijvende medium uit de geproduceerde algen te verwijderen. - Vul in een steriele omgeving steriele conische centrifugatiebuisjes van 15 ml met ongeveer 10 ml geënt medium en centrifugeer op 3.000 x g gedurende 20 minuten onder 25-30 °C.
- Verwijder onder steriele omstandigheden het supernatans met behulp van een micropipet of door de biomassa in een steriele conische centrifugatiebuis van 50 ml te gieten en te concentreren.
- Herhaal dit proces indien nodig totdat het vereiste volume inoculum voor de kinetiek is verkregen.
- Meet de optische dichtheid (OD550 nm) van het entmateriaal om de celconcentratie van de microalgen te bepalen en bewaar deze bij een temperatuur van 3-4 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
OPMERKING: Directe celtelling werd aanvankelijk uitgevoerd om de celconcentratie te correleren met absorptie. Eenmaal geteld, kan het inoculum niet langer dan 4 dagen in de koelkast worden bewaard.
2. Studie van de groeikinetiek
- Bereid het vereiste volume 3N-BBM+ V (CCAP) voor dat geschikt is voor elk experiment (8 L voor fotobioreactorniveautests voor C. sorokiniana en 0,5 L voor de kolfniveautests voor H. pluvialis) volgens standaard laboratoriumprocedures, en zorg voor een goede sterilisatie.
- Configureer voor zowel de fotobioreactor als de kolven de lichtbron op het gewenste kleurenspectrum (blauw bij 460 nm, paars, mix van 460 nm en 630 nm voor C. sorokiniana en rood bij 630 nm voor H. pluvialis); Dek beide systemen af om interferentie van extern licht te voorkomen.
OPMERKING: Vanwege de variatie in golflengte die door elke lichtgevende diode wordt uitgezonden, werd spectroradiometrie uitgevoerd met behulp van een spectroradiometer op de lichtbronnen om de golflengte en het emissievermogen van elke diode9 te bepalen. Paars licht werd bereikt door rode en blauwe LED's te combineren, wat resulteerde in golflengten van 460 nm met een emissievermogen van 1,65 W nm-1 voor de blauwe LED's en 630 nm met een emissievermogen van 0,6 W nm-1 voor de rode LED's. Deze metingen werden gebruikt voor de tests die uitsluitend onder blauw en rood licht werden uitgevoerd. - Programmeer de timer om af te wisselen tussen 12 uur licht en 12 uur donker voor C. sorokiniana en 16 uur licht en 8 uur donker cycli voor H. pluvialis.
- Sluit het CO2 -beluchtingssysteem aan op het kweekvat van de fotobioreactor om met tussenpozen van 12 uur kooldioxide toe te voeren voor C. sorokiniana.
- Inoculeer het kweekvat met een voldoende volume pre-inoculum om een startceldichtheid van 3 x 105 cellen ml-1 of het equivalent daarvan in optische dichtheid (OD550 nm) = 0,180 te bereiken.
OPMERKING: Zorg voor een aseptische techniek tijdens het inoculeren om besmetting te voorkomen. - Bemonstering van de cultuur met regelmatige tussenpozen van 12 uur voor C. sorokiniana en 8 uur voor H. pluvialis om de celgroei en fysiologische parameters te controleren. Verzamel monsters met behulp van steriele technieken om de integriteit van de cultuur te behouden.
3. Kwantificering van chlorofyl
OPMERKING: Gegevens voor cellulaire kwantificering worden verstrekt in aanvullend bestand 1.
- Plaats 40 ml van het monster in plastic conische centrifugeerbuisjes.
- Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 20 minuten bij 15 °C en gooi het supernatans weg door decantatie of met een pasteurpipet.
- Breng de celpellet over in een glazen buis bedekt met aluminiumfolie en een schroefdop om oxidatie te voorkomen.
- Resuspendeer de celpellet met 3 ml 90% zuivere acetonoplossing met behulp van een vortex.
- Sonicaat het zwevende monster in een ijsbad gedurende twee cycli van elk 5 minuten en laat het 16 uur10 rusten bij 4 °C.
- Na 16 uur opnieuw sonificeren onder dezelfde omstandigheden vermeld in de vorige stap (stap 3.5) en opnieuw centrifugeren onder de eerder beschreven omstandigheden (stap 3.2).
- Scheid het pigmentextract met behulp van een pasteurpipet en breng het over in een andere schone buis die beschermd is tegen licht.
- Plaats het pigmentextract in een kwartscel om af te lezen in een spectrofotometer op golflengten van 630 nm, 647 nm en 664 nm.
NOTITIE: Kalibreer de spectrofotometer vooraf met 90% aceton. - Gebruik de volgende vergelijkingen11 om de chlorofylconcentraties te berekenen:
Chlorofyl A = 11,93 A664 - 1,93 A647
Chlorofyl b = 20,36 A647 - 5,50 A664
OPMERKING: De resultaten worden uitgedrukt in μg ml-1 extract, die worden vermenigvuldigd met het extractvolume en gedeeld door het aantal ml monster om chlorofylconcentraties in μg ml-1 van de cultuur te verkrijgen. - Gebruik de volgende formule om waarden in μg chl cel-1 te verkrijgen:
μg chl cel-1 = μg chl in 1 ml cultuur / [cellen ml-1] celconcentratie in de cultuur.
Resultaten
Om de efficiëntie van de techniek te observeren die variaties in de cellulaire concentratie van chlorofyl detecteert en het effect van groeifactoren in C. sorokiniana te evalueren, werd een experimenteel ontwerp van Taguchi L4 opgesteld, waarbij de toevoeging van CO2 -volume, lichtkleur en lichtintensiteit werden geëvalueerd. Elke factor werd beoordeeld op lage en hoge niveaus, zoals weergegeven in tabel 1, onder de omstandigheden die zijn gedefinieerd door de experimentele opzet in tabel 2.
Nadat het experimentele proces was afgerond, toonden de resultaten aan dat de combinatie van een lage toevoeging van CO2, paars licht en een hoge lichtintensiteit (C1, P, I2) die overeenkomt met behandeling 2, de microbiële groei verhoogde tot 7,83 x 105 cellen ml-1. Aan de andere kant was het chlorofylgehalte hoger in behandeling 4 onder omstandigheden C2, P, I2, en bereikte het een concentratie van 5,92 x 10-7 μg cel-1 na 132 uur (figuur 1), samenvallend met paars licht en hoge lichtintensiteit als de optimale niveaus van de factoren in beide ervaringen.
Tegelijkertijd werd een soortgelijk gedrag waargenomen in de vier geëvalueerde lijnen. Er werd echter een duidelijke voorkeur waargenomen in de tests die onder paars licht werden uitgevoerd. Dit patroon suggereert dat paars licht een positieve invloed kan hebben op de resultaten, waardoor mogelijk optimale omstandigheden voor cellulaire groei of activiteit worden bevorderd. Deze bevindingen onderstrepen het belang van het zorgvuldig overwegen van lichtomstandigheden in biologische experimenten.
Uit de statistische analyse werd de grafiek met de belangrijkste effecten verkregen. In figuur 2 kan worden waargenomen hoe elk niveau van de geëvalueerde factoren de chlorofylproductie in C. sorokiniana beïnvloedt. De beste omstandigheden voor de productie van chlorofyl waren een hoge toevoeging van CO2, paars licht en een hoge lichtintensiteit (C2, P, I2), waarbij kleur en kooldioxideconcentratie zeer nauwe significantiewaarden vertonen, terwijl de lichtintensiteit een lager significant effect vertoont op de geëvalueerde responsvariabelen.
Daarnaast werd een contrastdiagram gegenereerd (figuur 3), dat het gedrag van de cellulaire chlorofylconcentratie laat zien op basis van het effect van CO2 -volumetoevoeging en de lichtkleur waaraan ze werden blootgesteld.
Er werd waargenomen dat paars licht (een mengsel van blauw en rood licht) en een hoge lichtintensiteit de microbiële groei en chlorofylproductie aanzienlijk bevorderen. Ondertussen beïnvloedt een hoge toevoeging van CO2 zowel de parameters positief als negatief, respectievelijk, omdat het de chlorofylcelconcentratie tijdens het experiment tot een maximum verhoogt, maar de microbiële groei belemmert. Het is echter merkbaar dat onder paars licht een CO2 -volumetoevoeging van 20 s pulsen van CO2 elke 12 uur bij een debiet van 8,5 ft³ h-1 een gunstige respons voor beide parameters mogelijk maakt.
Om de methode en de resultaten verkregen van C. sorokiniana, werd een bevestigende kolfniveautest uitgevoerd op H. pluvialis onder rood licht vanwege de natuurlijke eigenschap van het afbreken van chlorofyl om astaxanthine te synthetiseren onder stressomstandigheden, die na 168 uur werden geïnduceerd door het zoutgehalte van het medium te verhogen. Er werd een concentratiegrafiek gegenereerd (figuur 4) waarbij de maximale chlorofylconcentratie om 0 uur werd verkregen met 1,41 x 10-7 μg cel-1. In dit geval werd vanwege het natuurlijke gedrag van microalgen een afname van de chlorofylconcentratie waargenomen, wat wijst op mogelijke fysiologische veranderingen in het onderzochte biologische model. Dit wordt verder geïllustreerd in Figuur 5, die een microfoto van C. sorokiniana (Figuur 5A) en twee microfoto's van H. pluvialis toont: één in de groene fase (Figuur 5B) en één in de fase van verandering en astaxanthineproductie (Figuur 5C). Interessant is dat er ondanks deze achteruitgang geen interferentie optrad door de aanwezigheid van carotenoïde verbindingen, die op hun beurt in vet oplosbare pigmenten zijn; Dit is een sterk bewijs van de selectiviteit en reproduceerbaarheid van de techniek in microalgen met verschillende capaciteiten en gedragingen.
De grafiek toont een afname van de totale chlorofylconcentratie gedurende het experiment. Met name is er een toename van chlorofyl a in vergelijking met chlorofyl b na 50 uur, waar de concentratie van chlorofyl b aanzienlijk afneemt. De meest substantiële daling van de chlorofylconcentratie vindt plaats aan het einde van de exponentiële groeifase. Deze afname wordt toegeschreven aan de productie van carotenoïden in H. pluvialis.
Evenzo werd de analyse van de chlorofyl-a- en b-samenstelling uitgevoerd voor de behandeling met de hoogste productie van C. sorokiniana (C1, P, I2) in figuur 6. In tegenstelling tot H. pluvialis, vertoonde de productie van chlorofyl een consistente toename gedurende de gehele experimenteerperiode, die uitsluitend werd geanalyseerd tijdens de exponentiële fase. Opgemerkt wordt dat, net als bij H. pluvialis, chlorofyl a aanvankelijk in lagere hoeveelheden aanwezig is dan chlorofyl b aan het begin van het experiment; Deze verhoudingen ondergaan echter een opmerkelijke verschuiving na 50 uur, waarbij chlorofyl A daarna een hogere productiesnelheid vertoont dan chlorofyl B.
De analytische techniek die in deze studie is gebruikt, is efficiënt gebleken bij het detecteren van veranderingen binnen een biologisch model en in verschillende biologische modellen. Deze bevindingen onderstrepen de gevoeligheid en precisie van de analytische methode, waardoor een genuanceerd begrip van de chlorofyldynamiek binnen en tussen biologische systemen mogelijk is. Dergelijke inzichten zijn van onschatbare waarde voor het ontrafelen van de ingewikkelde mechanismen die de pigmentsynthese en het metabolisme regelen, en maken de weg vrij voor verdere vooruitgang in biotechnologisch en milieuonderzoek.
Figuur 1: Chlorofyl cellulaire inhoud onder experimentele ontwerpbehandelingen. Chlorofyl cellulaire inhoud gemeten in Chlorella sorokiniana in verschillende experimentele behandelingen. Gegevens gepresenteerd als standaarddeviatie voor n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Grafiek van de belangrijkste effecten voor het cellulaire chlorofylgehalte. Grafiek met de belangrijkste effecten die de impact van verschillende behandelingen op het cellulaire chlorofylgehalte in Chlorella sorokiniana illustreert. Gegevens gepresenteerd als standaarddeviatie voor n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Contourdiagram van de cellulaire chlorofylconcentratie. Contourdiagram met de relatie tussen cellulaire chlorofylconcentratie, CO2-concentratie en lichtkleur. Lichtkleur wordt weergegeven met as 1 als blauw en as 2 als paars, met tussenliggende niveaus die de toevoeging van rood licht aangeven. Gegevens gepresenteerd als standaarddeviatie voor n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Chlorofylconcentratie tijdens de groeikinetiek van H. pluvialis . Chlorofylconcentratie gemeten over de groeikinetiek van Haematococcus pluvialis. Gegevens gepresenteerd als standaarddeviatie voor n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Microfoto's van C. sorokiniana en H. pluvialis. Microfoto's van Chlorella sorokiniana (A) en Haematococcus pluvialis, ter illustratie van een exemplaar in de groene fase (B) en een ander in de vroege rode fase (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Chlorofylconcentratie tijdens de groeikinetiek van C. sorokiniana . Chlorofylconcentratie gemeten over de groeikinetiek van Chlorella sorokiniana. Gegevens gepresenteerd als standaarddeviatie voor n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Factor | Laag niveau | Hoog niveau |
| CO2 -toevoeging (L) | C1 | C2 |
| Lichte kleur | Blauw (B) | Paars (P) |
| Lichtintensiteit (Lux) | Ik1 | Ik2 |
Tabel 1: Kinetische factoren en niveaus. Overzicht van kinetische factoren en hun respectievelijke niveaus: C1 = 0,078 L; C2 = 0,15 l; B = Blauw licht; P = Paars licht; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
| Behandeling | CO2 -toevoeging | Lichte kleur | Lichtintensiteit (Lux) |
| (L) | |||
| 1 | C1 | B | Ik1 |
| 2 | C1 | P | Ik2 |
| 3 | C2 | B | Ik1 |
| 4 | C2 | P | Ik2 |
Tabel 2: Experimentele opzet en behandelingen. Samenvatting van de experimentele opzet en toegepaste behandelingen: C1 = 0,078 L; C2 = 0,15 l; B = Blauw licht; P = Paars licht; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
Aanvullend bestand 1: Mobiele kwantificeringsgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De vergelijkende studie tussen H. pluvialis en C. sorokiniana onthulde significante verschillen in de dynamiek van de chlorofylproductie. Terwijl H. pluvialis gedurende het hele experiment een afname van de chlorofylconcentratie vertoonde, vertoonde C. sorokiniana een gestage toename. Bovendien was er aanvankelijk een lager aandeel chlorofyl a in beide soorten, maar deze verhouding keerde om in bepaalde groeiomstandigheden, wat aanwijzingen kan geven voor een inductie van de productie van genoemde chlorofylen door de selectiviteit of blootstelling van specifieke golflengten. Deze bevindingen suggereren een unieke reactie van elke soort op de experimentele omstandigheden, wat de gevoeligheid benadrukt van de analytische techniek die wordt gebruikt om veranderingen binnen en tussen biologische modellen te detecteren. Het vermogen om subtiele veranderingen in de verhoudingen van chlorofyl a en b te onderscheiden, biedt nieuwe inzichten in de regulatie van pigmentsynthese in microalgen, wat aanzienlijke implicaties kan hebben op gebieden als biotechnologie en milieuonderzoek.
Het detecteren van perioden van verhoogde chlorofylproductie is cruciaal vanwege zijn rol als het primaire pigment in het fotosyntheseproces. Chlorofyl is essentieel voor het opvangen van lichtenergie en het omzetten ervan in chemische energie, die vervolgens wordt gebruikt om de celgroei en het metabolisme te stimuleren. Daarom duidt een toename van de productie van chlorofyl op een verbetering van de fotosynthesecapaciteit van organismen, wat wijst op optimale omstandigheden voor microbiële groei12; dit ondersteunt de observatie in C. sorokiniana dat de tests die een hogere concentratie chlorofyl genereerden, die waren waarin een grotere celgroei werd verkregen, wat waardevolle inzichten opleverde in wanneer de omgevingsomstandigheden het gunstigst zijn voor de ontwikkeling en proliferatie van fotosynthetische micro-organismen.
Met name het begrijpen van de verhoudingen van chlorofyl in H. pluvialis is bijzonder intrigerend, omdat ze belangrijke signalen kunnen geven met betrekking tot de stressstatus van microalgen. Wanneer de omstandigheden ongunstig worden, zoals bij veel licht of gebrek aan voedingsstoffen, kunnen de microalgen de chlorofylproductie verminderen en in plaats daarvan carotenoïde pigmenten zoals astaxanthine synthetiseren11. Deze overgang van groene groeifasen, gekenmerkt door hoge chlorofylconcentraties, naar astaxanthine-rijke, door stress geïnduceerde fasen is gunstig voor het maximaliseren van de astaxanthine-opbrengst. Het onderstreept het belang van het monitoren van chlorofylniveaus als een proxy voor stressrespons en dynamiek van pigmentproductie bij de teelt van H. pluvialis .
Hoewel de beperkingen van de techniek gering zijn vanwege de hoge selectiviteit, zijn voorzorgsmaatregelen zoals het uit de buurt houden van extracten van licht om oxidatie te voorkomen en het zorgvuldig hanteren van gecentrifugeerde monsters om troebelheid van biomassaresiduen te elimineren, essentieel. Een nadeel van de methode is bovendien de vereiste van relatief grote monstervolumes, vooral voor verdunde media of langdurig kinetisch onderzoek op kolfniveau, wat logistieke uitdagingen kan opleveren. Deze overwegingen benadrukken het belang van een zorgvuldig experimenteel ontwerp en monsterbehandeling om de effectiviteit van chlorofylanalysetechnieken in microalgenonderzoek te maximaliseren.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de gedeeltelijke financiering van de TecNM in het kader van de Call for Scientific Research, Technological Development, and Innovation (16898.23-P) voor de Institutos Tecnologicos Federales. Ze waarderen ook de steun van het Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | Acetone 90% |
| 15 mL tube | Biologix | 10-9502 | Testbuis |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Sonicator |
| 5 mL screw cap test tube | Kimax | 45066-13100 | Testbuis |
| 50 mL centrifuge tube | Biologix | 10-9151 | Testbuis |
| Aluminum foil | Reynolds | 611 standard, 12" x 1000 feet | Testbuisdeksel |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | Calciumchloride |
| Centrifuge | Dynamica | 14 R | Gekoelde centrifuge |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | Kobaltdichloride |
| FeCl3 | Merck | 157740 | IJzer(III)chloride |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | Dikaliumfosfaat |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | Monokaliumfosfaat |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | Magnesiumsulfaat |
| Micropipette | LabNet | Model Beta-Pette | Micropipette |
| MnCl2 | Merck | 429449 | Mangaan(II)chloride |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, dinatriumzout dihydraat |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | Natriummolybdaat |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | Natriumchloride |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | Natriumnitraat |
| RGB LED stripe | Steren | GAD-LED2 | Lichtbron |
| Spectrofotometer | PerkinElmer | Model Lambda35 | Spectrofotometer |
| spectroradiometer | Gigahertz-Optik | model BTS256 | |
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | Zinkchloride |
Referenties
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
Herprints en machtigingen
