Methodenartikel

Galleria mellonella als antimicrobieel screeningsmodel

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67210

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee, 2Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een gestandaardiseerd kader voor het optimaliseren van G. mellonella-infectiemodellen voor gebruik in preklinische antimicrobiële beoordeling. De toepassing van een G. mellonella-model als onderdeel van een preklinische pijplijn voor de ontwikkeling van antimicrobiële stoffen zou het aantal ineffectieve verbindingen dat doorgaat naar klinische proeven kunnen verminderen.

Samenvatting

Om het toenemende wereldwijde probleem van antibioticaresistentie tegen te gaan, is de versnelde ontwikkeling van nieuwe antibiotica essentieel. De huidige preklinische ontwikkeling van antimicrobiële stoffen levert een aanzienlijk aantal leads op die voorafgaand aan of tijdens klinische proeven ongeschikt blijken te zijn. Om de efficiëntie van preklinische ontwikkeling te vergroten, moeten relevante, gestandaardiseerde, toegankelijke en kosteneffectieve modellen worden ontwikkeld. Galleria mellonella (grotere wasmot) larven worden veel gebruikt als infectiemodel om microbiële virulentie te beoordelen, toxiciteitstests voor geneesmiddelen uit te voeren en te dienen als een voorlopig middel om de in vivo werkzaamheid van nieuwe antimicrobiële verbindingen te evalueren. Deze infectiemodellen hebben een grotere biologische relevantie dan veel in-vitroschermen met een vergelijkbare doorvoer en verminderen de afhankelijkheid van zoogdiermodellen wanneer ze worden gebruikt als pre-screening voor antimicrobiële tests. Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methodologie voor de optimalisatie van G. mellonella-infectiemodellen , die kunnen worden toegepast op bacteriesoorten en antimicrobiële therapieën naar keuze. Aan de hand van de WHO-prioriteitsziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa als voorbeeld, schetsen we stappen die kunnen worden ondernomen om een reproduceerbaar model van infectie en therapeutisch testen te ontwikkelen. Dit omvat aanbevelingen over experimentele opzet, monstervoorbereiding en infectie- en behandelingsprotocollen. Integratie van dit model in preklinische pijplijnen voor de ontwikkeling van antimicrobiële stoffen zou de afhankelijkheid van zoogdiermodellen verminderen, het aantal ineffectieve verbindingen dat klinische proeven bereikt verminderen en uiteindelijk de efficiëntie van de preklinische antimicrobiële ontwikkeling verhogen.

Inleiding

De larven van Galleria mellonella (de grote wasmot) worden op grote schaal gebruikt in de biologische wetenschappen als infectiemodellen voor microbiële soorten en voor toxiciteitstests van nieuwe geneesmiddelverbindingen 1,2. Ze hebben het potentieel om aanzienlijk bruikbaar te zijn in een preklinische antimicrobiële testpijplijn, aangezien ze een hoge doorvoer hebben, integrale in vivo kenmerken van menselijke infectie repliceren en de afhankelijkheid van zoogdiermodellen verminderen, in overeenstemming met de principes van vermindering, verfijning en vervanging die gelden voor ethisch gebruik van zoogdiersoorten in onderzoek.

De ontwikkeling van nieuwe antibiotica vereist uitgebreide preklinische tests in vitro en in vivo modellen voorafgaand aan klinische validatie3. Slechts een paar nieuwe middelen met veelbelovende preklinische gegevenspakketten worden ooit doorgestuurd naar de kliniek, en een van de oorzaken van dit hoge verloop is het falen van preklinische screenings om de complexiteit van infectieomgevingen vast te leggen4. Deze problemen dragen niet alleen bij aan een lage translatiesnelheid van antimicrobiële middelen naar de kliniek, maar ook aan een verhoogd gebruik van experimentele gewervelde dieren tijdens preklinische screening in een laat stadium. Om de preklinische beoordeling van nieuwe antimicrobiële stoffen te verbeteren en om het gebruik van dure, tijdrovende, complexe en ethisch problematische muizen in vivo modellen te verminderen, zijn betere instrumenten voor het screenen van geneesmiddelen in een vroeg stadium nodig die het aantal niet-veelbelovende verbindingen verminderen dat doorgaat met testen in gewervelde systemen.

G. mellonella heeft een korte levenscyclus van 8 weken, bestaande uit vier levensfasen: ei, larven, poppen en volwassenen, waarvan de larvale vorm in dit protocolwordt gebruikt 1. G. mellonella zijn gemakkelijk te onderhouden tijdens een experiment zonder dat er speciale apparatuur of een speciale faciliteit voor dierproeven nodig is. Er is geen vereiste om ethische goedkeuring te zoeken voor het gebruik ervan, en onderzoekers kunnen het organisme in eigen huis kweken om de experimentele kwaliteitte verbeteren 2,5,6,7. Het immuunsysteem van G. mellonella lijkt sterk op dat van het aangeboren immuunsysteem van zoogdieren, met het vermogen om te reageren op 'zelf' en 'niet-eigen' prikkels8. Hemocyten zijn verantwoordelijk voor pathogeen-geassocieerde moleculaire patroonherkenning en daaropvolgende fagocytose, en spelen een rol die functioneel analoog is aan die van neutrofielen bij mensen9. G. mellonella codeert voor drie soorten toll-like receptoren die zijn geïdentificeerd door sequentiehomologie met mensen, en produceren complementachtige eiwitten, die niet-eigen materiaal herkennen en gelokaliseerde melanisatiecomplexen vormen na de activering en polymerisatie van fenoloxidase tot melanine10. Dit kan dienen als een visuele uitlezing van de gezondheid van larven tijdens infectie-experimenten, omdat de cuticula donkerder wordt door melanisatie. Er moet echter worden opgemerkt dat de melanisatie-as bij insecten, waarbij fenoloxidase betrokken is, aanzienlijk verschilt van de tyrosinase-melanine-as bij zoogdieren11,12. Bovendien produceert G. mellonella 18 induceerbare antimicrobiële peptiden, waaronder lysozym- en defensine-homologen13. Deze gelijkenis, evenals de eenvoudige onderhoudsprocedures voor larven en de hoge doorvoer van het model, hebben G. mellonella tot een veelgebruikt organisme gemaakt bij de beoordeling van nieuwe geneesmiddelen. Bij de preklinische ontwikkeling van antibiotica heeft G. mellonella een grotere bruikbaarheid in vergelijking met in vitro-modellen, omdat ze de interacties tussen gastheer-pathogeen-geneesmiddelen nauwkeuriger kunnen modelleren in een complexe omgeving met actieve immuniteit.

Op dit moment is er geen gestandaardiseerde leverancier van onderzoekskwaliteit van G. mellonella in Europa. Onderzoekers moeten in plaats daarvan G. mellonella-larven kopen bij aaswinkels of hun eigen kolonie onderhouden. Hoewel er methoden zijn beschreven voor het in stand houden van een interne G. mellonella-kolonie en die de experimentele consistentie kunnen verhogen 5,6,7, is deze optie waarschijnlijk alleen aantrekkelijk voor degenen die de larven vaak gebruiken. Als zodanig richt dit protocol zich op de experimentele opzet na de aankoop van larven van een leverancier van levend aas. Hoewel deze methode toegankelijker is, verhoogt ze de experimentele complexiteit en kan ze extra variabiliteit in tests introduceren als gevolg van inconsistenties in de gezondheid van de larven op het moment dat ze van leveranciers worden ontvangen. Voor academici, de industrie en regelgevers om G. mellonella-testen te accepteren en toe te passen als onderdeel van een preklinische antimicrobiële ontwikkelingspijplijn, is een gestandaardiseerd systeem voor optimalisatie en beoordeling van de antimicrobiële werkzaamheid noodzakelijk.

Deze studie optimaliseert het experimentele ontwerp van een G. mellonella-infectiemodel voor de ontwikkeling van antibiotica. Hoewel er modellen voor G. mellonella-infectie zijn beschreven14,15, documenteert de huidige methodologie aanvullende stappen om de extra complexiteit te verminderen die wordt veroorzaakt door de inconsistentie van het aanbod en biedt het een kader voor de beoordeling van nieuwe antimicrobiële stoffen. Als testcase werd G. mellonella geïnfecteerd met de WHO-prioriteit één ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa en werd de behandeling met een aminoglycosidemiddel (tobramycine) geoptimaliseerd. Dit kader, geïllustreerd in figuur 1, biedt een basis voor toekomstige preklinische antimicrobiële screeningsstudies met nieuwe middelen.

Protocol

In deze studie werden de larven van Galleria mellonella (grote wasmot) geselecteerd als model voor antibioticagevoeligheidstesten en acute toxiciteitsonderzoeken. Er is geen ethische goedkeuring vereist voor het experimentele gebruik van Galleria mellonella. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Experimenteel ontwerp

  1. Bepaal de juiste groepsgroottes van Galleria mellonella-larven op basis van de proportionele verandering in larvale overleving die de studie wil vastleggen. Tabel 1 geeft de groepsgroottes weer die nodig zijn om specifieke procentuele veranderingen in overleving te detecteren met behulp van een Pseudomonas aeruginosa stam PAO1-infectiemodel.
    OPMERKING: Wanneer u een nieuwe ziekteverwekker gebruikt, bepaal dan eerst de variabiliteit tussen de analyses in de proportionele overleving van geïnfecteerde maar onbehandelde larven, aangezien dit de bepaling van de steekproefomvang zal beïnvloeden.
    1. Neem twee groepen PBS-controles op: een die vóór de rest van de infecties wordt geïnjecteerd om ervoor te zorgen dat de spuit scherp en geschikt voor gebruik is, en een andere die tijdens of na bacteriële infecties wordt geïnjecteerd om een goede sterilisatie tussen infectiegroepen te garanderen. Als u optimaliseert met een nieuwe ziekteverwekker, neem dan een warmtebehandelde controle op om ervoor te zorgen dat de dood niet het gevolg is van een immuunrespons op vreemde deeltjes.
      OPMERKING: Insulinespuiten kunnen worden gebruikt voor injecties, waardoor het risico op afstomping en besmetting wordt verminderd. Experimenten kunnen echter routinematig honderden G. mellonella gebruiken, waardoor het gebruik van insulinespuiten kostbaar en verspillend wordt.
    2. Voor studies die de antibacteriële behandeling optimaliseren, moeten twee extra controles worden opgenomen: een groep die geïnfecteerd is met bacteriën en vervolgens wordt geïnjecteerd met een 'schijnbehandeling', en een groep die tweemaal met het medium wordt geïnjecteerd, één keer op het moment van infectie voor de andere aandoeningen en één keer op het moment van behandeling.
      OPMERKING: De eerste is een onbehandelde controlegroep, terwijl de laatste controleert op eventueel trauma veroorzaakt door de injecties. Een dergelijk trauma is waarschijnlijker wanneer botte naalden worden gebruikt.
  2. Bestel G. mellonella bij een leverancier van levend aas, of onderhoud een kolonie G. mellonella zoals eerder beschreven 5,6,7. Bestel voor de leverancier die in de materiaaltabel wordt vermeld 1,8 keer het geplande aantal larven, aangezien ongeveer 33% wordt uitgesloten op basis van grootte en nog eens 10% kan sterven na sterilisatie van de nagelriem.
    1. Bepaal de gewichtsvariabiliteit van G. mellonella voorafgaand aan experimenteel gebruik en zorg ervoor dat het gewichtsbereik niet groter is dan één standaarddeviatie van het gemiddelde.
      OPMERKING: Voor leveranciers die niet in de materiaaltabel worden vermeld, regelt u dat de leverancier nieuwe voorraad verstrekt.
  3. Bewaar G. mellonella bij ontvangst bij kamertemperatuur om de kans op cocooning, die optreedt na incubatie bij 37 °C, te beperken.
    OPMERKING: Niet alle larven van commerciële leveranciers vormen cocons, die eerder zijn gebruikt als indicator voor de gezondheid van de larven16.
  4. Gebruik larven binnen 1 week na ontvangst, in dat geval hebben ze geen voeding nodig.
    OPMERKING: Hoewel de levensfase van de larven per batch zal verschillen, worden de meeste larven tijdens de laatste instar voor het verpoppen geleverd. In dit stadium neemt de voeding op natuurlijke wijze af in vergelijking met eerdere stadia17.

2. Sterilisatie en selectie van G. mellonella-larven

  1. Weeg de larven van Galleria mellonella en gooi de larven weg die buiten het bereik van 224 mg ± 49,2 mg vallen, wat het gemiddelde gewicht van de larven is plus of min één standaarddeviatie. Dit zal resulteren in de uitsluiting van ongeveer 33% van de larven.
    OPMERKING: Gewichtsvariatie kan verschillen tussen leveranciers. Bereken voor leveranciers die niet in dit protocol worden vermeld een geschikt gewichtsbereik.
  2. Voer de volgende stappen uit onder aseptische omstandigheden.
  3. Spuit 70% ethanol in een petrischaal en zorg ervoor dat er genoeg is om de bodem van de schaal te bedekken.
  4. Steriliseer het oppervlak van G. mellonella in batches van 10-20 larven.
    1. Plaats elke batch afzonderlijk in de schaal en besproei de larven twee keer met 70% ethanol.
    2. Gebruik een pincet om de larven te rollen en zorg voor volledige dekking.
    3. Haal de larven uit de ethanol en leg ze in een steriel petrischaaltje. Laat de schaal onafgedekt om de larven te laten drogen.
      LET OP: Als u G. mellonella langer dan 15 s in ethanol laat staan, leidt dit tot hoge sterfte.
  5. Zodra ongeveer 90% van de larven na 2 uur weer actief is, verdeelt u de teruggevonden larven in groepen van een grootte die voldoende detectie van overlevingsveranderingen mogelijk maken volgens de vermogensberekeningen die in tabel 1 worden beschreven.
  6. Gebruik G. mellonella binnen 6 uur na sterilisatie.

3. Optimalisatie van de dichtheid van bacterieel inoculum

  1. Bereid een bacteriële infectievoorraad voor van een bekende CFU/ml voorafgaand aan de infectie. Methoden voor het genereren van voorraden verschillen per organisme. Hier werd Pseudomonas aeruginosa gekweekt tot halverwege de logfase in voedingsbouillon, gealiquoteerd en ingevroren met een dichtheid van 6 x 107 kve/ml.
  2. Pelleteer de infectievoorraad door 5 minuten bij 10.000 x g bij kamertemperatuur te centrifugeren en opnieuw te suspenderen in PBS. Verdun de bacterievoorraad serieel tienvoudig om een reeks inoculumdoses van 101-10 7 kve per larve te genereren, waarbij wordt aangenomen dat elke larve wordt geïnjecteerd met 10 μl inoculum.
    OPMERKING: Het specifieke dosisbereik van inoculum zal verschillen afhankelijk van de bacteriële virulentie, maar het voorgestelde bereik hier zou geschikt moeten zijn voor de meeste pathogene soorten. Bepaling van de groeisnelheid in vitro kan helpen bij de selectie van een geschikt dosisbereik, aangezien stamspecifieke groeisnelheid in vloeibare cultuur gecorreleerd is met larvale sterfte.
  3. Voordat u met infecties begint, somt u het inoculum op met een seriële verdunning van Miles en Misra om de inoculumdichtheid18 nauwkeurig te bepalen.
  4. Bereid drie microfuge-buisjes van 1 ml voor met steriele dH2O, 70% ethanol of steriele PBS. Deze zullen continu worden gebruikt om de spuit te steriliseren die wordt gebruikt om de larven te injecteren.
  5. Inspecteer een steriele Hamilton-spuit van 100 μl en zorg ervoor dat de naaldpunt scherp is en geen haak heeft ontwikkeld, wat aanzienlijk trauma aan de infectieplaats zal veroorzaken.
    LET OP: De punt van de naald van een Hamilton-spuit begint te kromtrekken na ongeveer 300 infecties. Als de punt van de naald kromgetrokken is, moet deze worden vervangen.
  6. Was de spuit achtereenvolgens met dH2O, ethanol en PBS voorafgaand aan infecties, waarbij u de maximale capaciteit van de spuit opzuigt en weggooit.
  7. Draai het geresuspendeerde infectie-inoculum en zuig maximaal 100 μL op in de Hamilton-spuit, voldoende om 10 μL per larve te injecteren.
  8. Injecteer elke larve met 10 μL inoculum in het rechter achterpoot. Zorg ervoor dat de naald ongeveer 2 mm in het lichaam doordringt.
    OPMERKING: Er kunnen verschillende infectiemethoden worden gebruikt. Deze omvatten het houden van de larve boven een pipetpunt om de prolegs bloot te leggen, het statisch vastzetten van de spuit en het positioneren van de G. mellonella met de hand, of het injecteren uit de vrije hand.
  9. Steriliseer de spuit tussen elke reeks infecties zoals beschreven in stap 2.5 om besmetting door resterende huidcommensalen te voorkomen.
  10. Incubeer de geïnfecteerde larven bij een temperatuur die voldoende is voor microbiële groei, tussen 20 °C en 42 °C, wat een geschikt bereik is voor de overleving van G. mellonella 5.
  11. Bewaak de overleving van G. mellonella met regelmatige tussenpozen vanaf het moment waarop de sterfte gewoonlijk voor het eerst wordt waargenomen om het tijdstip van overlijden nauwkeurig te meten. Dit moet in een eerste screening worden beoordeeld. Verwijder eventuele dode larven en noteer hun tijdstip van overlijden.
  12. Selecteer de optimale infectiedosis voor een therapeutisch testonderzoek op basis van de dosis die 50% mortaliteit oplevert na 18 uur en meer dan 80% na 72 uur. Dit maakt de ontwikkeling van een snelle eendaagse screening mogelijk, terwijl voldoende virulentie en een geschikt therapeutisch venster worden gegarandeerd.

4. Toxiciteitsonderzoek van nieuwe antimicrobiële middelen in niet-geïnfecteerde larven

  1. Beoordeel de toxiciteit van nieuwe antimicrobiële stoffen en gekozen vehicula in Galleria mellonella voorafgaand aan hun gebruik met experimenteel geïnfecteerde larven. Bereid een breed scala aan doses voor die het verwachte therapeutische bereik van het antimicrobiële middel overschrijden, op basis van in vitro (bijv. cellijn) toxiciteitsgegevens, indien beschikbaar.
    1. Bedenk dat de larven worden geïnjecteerd met 10 μL van het geneesmiddel. Bereid controles voor die alleen voor het medium zijn in concentraties die overeenkomen met die waarin het geneesmiddel wordt toegediend.
  2. Injecteer gezonde, steriele G. mellonella in de juiste groepsgroottes met de verschillende antimicrobiële en PBS-vehiculumconcentraties, zoals beschreven in stap 3.2-3.10. In de huidige studie was tobramycine het gebruikte antimicrobiële middel.
    OPMERKING: Voor een middel dat DMSO als oplosmiddel vereist, injecteert u met een naald van 26 s in plaats van de standaard naald van 22 gauge, aangezien trauma van grotere naalden de mortaliteit verhoogt bij gebruik van DMSO.
  3. Definieer een veilige dosis als een dosis die geen significant verschil in mortaliteit oplevert in vergelijking met larven die alleen met PBS zijn geïnjecteerd.

5. Optimalisering van de behandeling van een bacteriële infectie met G. mellonella met een antimicrobieel middel

  1. Bereid een reeks doses van het antimicrobiële middel voor, aangezien geïnfecteerde larven worden behandeld met een dosis van 10 μL. Gebruik een reeks doses met minimale toxiciteit, zoals beoordeeld in stap 4.
  2. Volg stap 1 en 2 van dit protocol om Galleria mellonella in de juiste groepen te bereiden en te infecteren met de eerder geoptimaliseerde infectiedosis.
  3. Behandel de larven 2 uur na de infectie met het bereide antimicrobiële middel of de mediumbestrijdingsoplossing. Volg de stappen 3.2-3.8 en injecteer in het tegenovergestelde proleg van het been dat tijdens de infectie is geïnjecteerd. Steriliseer de naald tussen de groepen.
    OPMERKING: Voor deze optimalisatie werd een behandeling na 2 uur geselecteerd om sterke dosis-responsgegevens te verkrijgen, op basis waarvan de daaropvolgende optimalisatie van de behandelingstiming werd bepaald19.
  4. Bewaak de overleving van G. mellonella met tussenpozen van 30 minuten of vaker vanaf het tijdstip waarop de sterfte gewoonlijk voor het eerst wordt waargenomen. Verwijder eventuele dode larven en noteer hun tijdstip van overlijden.
  5. Bereken de verandering in overlevingsverhoudingen tussen de behandelingsgroepen. Gebruik de Kaplan-Meier-overlevingsanalyse om te bepalen of de behandeling leidt tot een significant veranderde larvale sterfte. Neem de juiste post-hoccorrectie voor paarsgewijze multipliciteit op in analyses met meerdere groepen.

6. Optimalisering van de behandelingstiming van geïnfecteerde G. mellonella

  1. Volg stap 1 en 2 om Galleria mellonella in de juiste groepen te bereiden met de eerder geoptimaliseerde infectiedosis.
  2. Bereid het antimicrobiële middel voor in de dosis die eerder in stap 4 is geoptimaliseerd.
  3. Behandel de geïnfecteerde larven 2 uur, 4 uur, 6 uur, 9 uur of 12 uur na infectie volgens stap 3.2-3.8 om te vergelijken hoe de timing van de behandeling de mortaliteit beïnvloedt.
  4. Bewaak de overleving van G. mellonella met tussenpozen van 30 minuten of vaker vanaf het tijdstip waarop de sterfte gewoonlijk voor het eerst wordt waargenomen. Verwijder eventuele dode larven en noteer hun tijdstip van overlijden. De optimale timing is die welke de waargenomen overleving handhaaft na de initiële optimalisatie van de behandelingsdosis.
    OPMERKING: Bij het testen van de antimicrobiële werkzaamheid bij G. mellonella, optimaliseert u zowel de behandelingsdosis als de timing afzonderlijk, waarbij u de eerste gebruikt om de behandelingsdosis in de laatste te bepalen.

Resultaten

Beoordeling van batchvariatie in het gewicht van G. mellonella
Een mogelijke bron van ongewenste variatie in infectie-experimenten komt voort uit verschillen in grootte tussen individuele experimentele eenheden (d.w.z. larven) en tussen batches. De effecten van deze variatie kunnen worden verzacht door de behandelings- of infectiedoses aan te passen op basis van het gewicht, of door alleen die larven binnen een bepaald gewichtsbereik te selecteren voor gebruik in experimenten. De laatste aanpassing is pragmatischer en is niet onderhevig aan menselijke fouten die zich kunnen voordoen tijdens de dosisvoorbereiding. Een bijkomend voordeel van het wegen van de larven is dat het mogelijk is om de behandelingsdoses om te zetten van de doses die aan larven worden toegediend naar hun mg/kg menselijke equivalenten. Om de variatie binnen en tussen partijen te kwantificeren, werden drie partijen van 50 larven, die op verschillende tijdstippen waren besteld, gewogen. Het gemiddelde gewicht in elke groep was 225,5 mg, 230,54 mg en 215,86 mg, met standaarddeviaties van respectievelijk 49,1 mg, 53,7 mg en 44,3 mg (figuur 2A). Tussen de batches was er geen significant verschil in gewicht. Over batches varieerde het gewicht van 107,5 mg tot 341,0 mg, met een gemiddelde van 224,0 mg ± 49,2 mg.

Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, werden larven voorafgaand aan het experiment gewogen en geselecteerd als hun gewicht 224 mg ± 49,2 mg was, waardoor het gewichtsbereik werd teruggebracht van 233,5 mg tot 98,4 mg en 33% van de larven werd verwijderd. Dit is in lijn met eerder werk dat significante variatie identificeerde in overleving van larven geïnfecteerd met MRSA met gewichtsbanden groter dan 100 mg14,20. We vergeleken ook het gewicht van G. mellonella op het moment van levering met dat een week na de bevalling, omdat elke significante gewichtsverandering de experimentele resultaten kan beïnvloeden wanneer larven niet onmiddellijk bij aankomst worden gebruikt. Het gemiddelde gewicht van G. mellonella was 230,54 mg ± 53,7 mg. Een week na de bevalling bedroeg het gemiddelde gewicht 221,8 mg ± standaarddeviatie van 45,7 mg (figuur 2B). Er was geen significant verschil tussen het gewicht bij aankomst en het gewicht na een week, waaruit we concluderen dat larven op elk moment in de eerste week na levering voor experimentele doeleinden kunnen worden gebruikt. Het is belangrijk op te merken dat deze resultaten alleen representatief zijn voor G. mellonella gekocht bij één leverancier, en het gewicht kan aanzienlijk verschillen tussen leveranciers of wanneer larven op verschillende tijdstippen worden besteld.

Optimalisatie van de inoculumdichtheid van P. aeruginosa PAO1
De virulentie van vijf P. aeruginosa-isolaten bij vier inoculumdichtheden werd beoordeeld, waaronder drie veelgebruikte laboratoriumstammen, PAO1, PA14 en PAK, en twee klinische isolaten van chronische luchtweginfecties, LESB58 en IST27-M. Deze werden gebruikt als onderdeel van een CF-relevant stampanel ontwikkeld door Mahenthiralingam et al.21 en zijn representatief voor de wereldwijde fylogenie van de soort. Voorlopige groeigegevens in voedingsbouillon toonden een lagere groeisnelheid voor de isolaten van chronische infectie (Figuur 3). Gezien dit werd G. mellonella geïnfecteerd in groepen van 10 larven met doses van 101, 102, 103 of 104 kve/larve in 10 μl PBS voor PAO1, PA14 en PAK, en doses van 102, 103, 104 of 105 kve/larve voor LESB58 en IST27-M. Twee groepen van 10 larven werden ook geïnjecteerd met alleen PBS, één groep voor en één groep na de infecties. PBS-injecties vóór infectiecontrole op besmette PBS of besmetting van naalden met microbiële soorten uit de nagelriem van de Galleria, terwijl PBS-injecties na infectiecontrole op elke besmetting van naalden met bacteriën die in het infectieproces worden gebruikt. Optimale doses voor PAO1, PA14 en PAK waren 10 kve/larve, aangezien grotere dichtheden resulteerden in > 50% dood na 18 uur (Figuur 4). 10 KVE was de laagste dosis die betrouwbaar en reproduceerbaar kon worden bereid voor infectie. Hogere doses LESB58 en IST27-M waren nodig om de gewenste overlevingskinetiek te bereiken, wat de langzamere groei en lagere draagkracht van deze isolaten onder in vitro omstandigheden weerspiegelt (Figuur 4). De optimale dosis voor beide was 104 kve/larven. LESB58 en IST27-M zijn klinische isolaten van personen met chronische infecties, en LESB58 heeft eerder een lagere virulentie aangetoond in knaagdiermodellen dan PAO122.

Toxiciteitsonderzoek van tobramycine en colistine in Galleria mellonella
Alvorens de werkzaamheid van nieuwe antimicrobiële verbindingen te beoordelen, moet hun toxiciteit worden beoordeeld door een breed scala aan klinisch relevante doses te injecteren. Hierdoor kunnen verbindingen met een hoge toxiciteit vroeg in de preklinische pijplijn uit de tests worden verwijderd. Tobramycine en colistine werden beoordeeld tegen niet-geïnfecteerde G. mellonella-larven, omdat ze vaak worden toegediend voor de behandeling van P. aeruginosa-infectie bij mensen met cystische fibrose (pwCF)23. Klinisch gebruik van tobramycine varieert van 3 mg/kg per dag voor ernstig zieke personen zonder cystische fibrose tot 11 mg/kg elke 24 uur voor personen met cystische fibrose24,25. Deze waarden werden gebruikt als richtlijn voor de dosering in Galleria mellonella, waarbij 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg tobramycine werd geselecteerd voor toxiciteitstests. Er werd geen dood waargenomen bij enige concentratie. Gezien het gebrek aan toxiciteit van tobramycine bij hoge concentraties, werd de toxiciteit van colistine beoordeeld omdat het eerder in verband is gebracht met nefro- of neurotoxiciteit bij 29,8% van de pwCF, met een oplaaddosis van 2,9 (±1,5) mg/kg en de totale dagelijkse dosis van 4,1 (±1,1) mg/kg26. Dit maakte het een waardevolle kandidaat voor toxiciteitstests, hoewel de orgaanspecifieke effecten bij mensen suggereerden dat de toxiciteit zich mogelijk niet vertaalt naar G. mellonella. Inderdaad, wanneer doses van 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg en 250 mg/kg colistine werden toegediend, werd er geen dood van larven waargenomen gedurende 72 uur. Als zodanig werd colistine uiteindelijk toegediend in zijn hoogste oplosbaarheid in H2O, bij 2000 mg/kg. De dood van alle larven werd binnen 12 uur waargenomen, wat bevestigt dat de toxiciteit van het geneesmiddel bij G. mellonella kan worden beoordeeld, maar dat voorzichtigheid geboden is bij het voorspellen van de toxiciteit voor de mens.

Optimalisatie van de behandelingsdosering van tobramycine tegen P. aeruginosa PAO1-infectie
Een reeks klinisch relevante doses tobramycine werd toegediend aan met P. aeruginosa geïnfecteerde larven om de behandelingsdosering te optimaliseren. Voor nieuwe antimicrobiële stoffen kan de dosering in eerste instantie worden geselecteerd op basis van het klinische gebruik van vergelijkbare bestaande antibiotica of op basis van preklinische gegevens voor het nieuwe middel, zoals minimale remmende concentraties in bouillon. Om de werkzaamheid van tobramycine tegen P. aeruginosa PAO1 te beoordelen, werden G. mellonella-larven geïnfecteerd met 10 CFU van P. aeruginosa PAO1, zoals eerder geoptimaliseerd, en geïnjecteerd met 1 mg/kg, 2,5 mg/kg of 5 mg/kg tobramycine 2 uur na infectie. Deze doses zijn gekozen op basis van eerder werk van G. mellonella met tobramycine en zijn in lijn met de huidige klinische doses tobramycine bij personen zonder cystische fibrose 24,27,28.

De drempel voor aanvankelijk succes was een toename van 50% in de overleving van G. mellonella in vergelijking met de onbehandelde controles. Behandeling met PAO1 met 1 mg/kg tobramycine had weinig invloed op de sterfte aan G. mellonella , met 90% sterfte 28 uur na infectie (figuur 5). Behandeling met 2,5 mg/kg tobramycine vertraagde de mortaliteit, maar leverde in totaal 80% mortaliteit op met 5 mg/kg tobramycine, wat resulteerde in een optimale overleving van 90%. De effectieve dosis voor PA14 was 5 mg/kg, maar voor PAK was 2,5 mg/kg. De effectieve dosis voor IST27-M was hoger bij 10 mg/kg, terwijl geen enkele geteste tobramycineconcentratie voldoende was om de larven te redden van een LESB58-infectie. Deze trend correleerde met minimale remmende concentratie (MIC)-waarden voor tobramycine in kation-gecorrigeerde Mueller Hinton-bouillon, waarin 1 μg/ml voldoende was om 90% van de groei te remmen in alle stammen behalve LESB58, die een MIC van 8 μg/ml had. Als zodanig kunnen initiële MIC-tests worden gebruikt om relatieve resistentie tussen stammen aan te geven, hoewel het niet mag worden gebruikt om dosisbereiken in G. mellonella te bepalen, die afzonderlijk moeten worden geoptimaliseerd.

Optimalisatie van de timing van de behandeling met tobramycine tegen P. aeruginosa PAO1-infectie
Klinische toepassing van antibiotica vindt meestal niet plaats binnen enkele uren na infectie, maar dagen of weken erna. Het op deze manier testen van nieuwe antimicrobiële stoffen is onhaalbaar bij G. mellonella, aangezien een hoge mortaliteit wordt waargenomen binnen 24 uur na infectie met P. aeruginosa PAO1. Om de relevantie van het infectiemodel te vergroten, moeten nieuwe antimicrobiële stoffen zo laat mogelijk tijdens de infectie worden toegediend. Om de timing van de behandeling te optimaliseren, werd 5 mg/kg tobramycine toegediend aan PAO1-geïnfecteerde G. mellonella-larven 2 uur, 4 uur, 6 uur, 9 uur en 12 uur na infectie. Experimenteel succes werd gedefinieerd als de antibioticabehandeling die een toename van >50% in overleving opleverde in vergelijking met infectie met PAO1. Behandeling na 9 uur en 12 uur vertraagde mortaliteit, hoewel het de infectie niet kon oplossen (figuur 6). Behandeling na 2 uur, 4 uur en 6 uur leverde een overleving van meer dan 50% op.

Optimalisatie van de groepsgrootte van G. mellonella
De experimentele groepsgrootte werd berekend op basis van de variatie die werd waargenomen in de overleving van G. mellonella na infectie met 10 CFU / larven van P. aeruginosa PAO1. De groepsgrootte kan verschillen op basis van de verwachte procentuele verandering tussen de onbehandelde controlegroep en de behandelingsgroep in elk onderzoek (tabel 1). De berekeningen volgden die beschreven door Charan et al.29. De gebruikte vergelijking wordt hieronder beschreven.

figure-results-1

Waar:

     figure-results-2= 1,96 bij type 1 fout van 5%.

Zβ = 0,842 is de waarde die 80% statistisch vermogen levert.

p1 = Het aandeel van de gebeurtenissen in de testgroep, berekend als p2 + de verwachte procentuele verandering

p2 = Het percentage voorvallen in de controlegroep (onbehandelde infectie), berekend op basis van de variabiliteit van de overleving van P. aeruginosa PAO1 bij figure-results-3.

P = Gepoolde prevalentie, gedefinieerd als (p1 + p2)/2.

figure-results-4
Figuur 1: Schema van een onderzoek naar G . mellonella-infectie . Het algemene protocol omvat de bereiding van G. mellonella-larven voorafgaand aan de infectie, infectie met 10 μL inoculum, de optionele behandeling een aantal uren na de infectie en continue monitoring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 2: Batch- en tijdsafhankelijke variatie in het gewicht van de Galleria mellonella-larven . (A) Gewicht van drie partijen van 50 larven van Galleria mellonella , onmiddellijk bij levering gewogen. Elke batch werd op verschillende tijdstippen besteld. Er was geen significant verschil in gewicht tussen batches, zoals berekend door een eenrichtings-ANOVA (P > 0,05). (B) Gewicht van 50 larven gewogen bij ontvangst vergeleken met dezelfde partij die een week later werd gewogen. Er was geen significant verschil in gewicht zoals berekend door een t-toets van een student (P > 0,05). ns: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 3: Groeicurves van P. aeruginosa stammen PAO1, PA14, PAK, LESB58 en IST27-M. Elke stam werd in LB gekweekt vanaf een initiële OD600 van 0,08-0,13, en OD600 werd vervolgens elke 15 minuten gemeten gedurende 24 uur statische groei bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 4: Optimalisatie van de inoculumdichtheid van Pseudomonas aeruginosa-stammen voor infectie van Galleria mellonella-larven . Overleving van Galleria mellonella-larven na injectie met verschillende dichtheden van kolonievormende eenheden (CFU) per larve. De geteste inoculumdichtheden waren 10, 10², 10³ of 104 kve per larve voor (A) PAO1, (B) PA14 of (C) PAK, en 10², 10³, 104 of 105 kve per larve voor (D) LESB58 en (E) IST27-M. Per groep werden tien larven gebruikt, elk geïnjecteerd met 10 μL inoculum in het rechter achterpoot. De overleving werd vanaf 16 uur na infectie elke 30 minuten gecontroleerd en het tijdstip van overlijden werd geregistreerd. Alle stammen vertoonden dosisafhankelijke virulentie zoals bepaald door de Log-rank (Mantel-Cox) test voor significantie. P < 0,05 voor alle dosisvergelijkingen binnen de stam, behalve voor PAK 101 vs. PAK 102, PAK 103 vs. PAK 104, LESB58 104 vs. LESB58 105 en IST27-M10 3 vs. IST27-M 104, die niet significant waren. Dit cijfer is representatief voor drie biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 5: Overleving van Galleria mellonella-larven na injectie met P. aeruginosa-panelstammen en behandeling met tobramycinesulfaat 2 uur na infectie. 10 G. mellonella-larven per experimentele groep waren geïnfecteerd met ofwel 10 kve van (A) PAO1, (B) PA14 of (C) PAK of 103 kve van (D) LESB58 of (E) IST27-M per larve in 10 μL PBS. Infecties werden toegediend aan het linker achterpoot. 2 uur na infectie werden PAO1, PA14 en PAK geïnjecteerd met 10 μL PBS als controlegroep zonder behandeling, 1 mg/kg, 2,5 mg/kg of 5 mg/kg tobramycine, met LESB58 en IST27-M behandeld met 10 μL PBS, 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg of 40 mg/kg tobramycine, zoals aangegeven in de afbeelding. Tobramycine werd verdund in gedestilleerd water en toegediend in het rechter achterbeen. De overleving werd continu gecontroleerd en het tijdstip van overlijden werd geregistreerd. Log-rank (Mantel-Cox) test voor significantie vs. de PBS-regeling voor elke stam. ns: Niet significant, *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,0005 ****P < 0,0001. Dit cijfer is representatief voor drie biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 6: Overleving van Galleria mellonella-larven na infectie met Pseudomonas aeruginosa PAO1 en daaropvolgende behandeling met tobramycine op verschillende tijdstippen na infectie. 10 larven van G. mellonella per experimentele groep werden geïnfecteerd met 10 CFU PAO1 in 10 μL PBS, geïnjecteerd in het rechter achterpoot. Larven werden vervolgens 2 uur, 4 uur, 6 uur, 9 uur of 12 uur na infectie geïnjecteerd met 5 mg/kg tobramycinesulfaat in 10 μl gedestilleerd water in het linker achterpoot. De overleving werd continu gecontroleerd en het tijdstip van overlijden werd geregistreerd. Log-rank (Mantel-Cox) test voor significantie vs. onbehandelde controle. P < 0,0005, ****P < 0,0001. Dit cijfer is representatief voor drie biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Verwachte verandering in overleving (%)Groepsgrootte
3026
4018
5013
6010
708
806
905
1004

Tabel 1: Groepsgrootte voor overlevingsexperimenten met G. mellonella waarbij G. mellonella-larven worden geïnfecteerd met 10 kve/larven met P. aeruginosa PAO1 en vervolgens een middel worden toegediend.

Discussie

De last van antimicrobiële resistentie (AMR) neemt voortdurend toe. In 2019 werden wereldwijd naar schatting 4,95 miljoen sterfgevallen in verband gebracht met AMR30. Tegen 2050 wordt het sterftecijfer als gevolg van AMR geschat op 10 miljoen31. Om dit risico aan te pakken, moeten nieuwe antimicrobiële stoffen efficiënt en kosteneffectief worden ontwikkeld en getest, waardoor het gebruik van preklinische modellen nodig is die de antimicrobiële werkzaamheid nauwkeurig voorspellen. Het hoge verloop dat wordt waargenomen tijdens de vertaling naar klinische onderzoeken is een belangrijke beperkende factor. Eén studie beschreef 13 kandidaat-antibiotica die faalden in klinische onderzoeken, waarbij 11 er niet in slaagden door te gaan naar fase II32.

De huidige studie biedt een kader voor de optimalisatie van preklinische antimicrobiële screeningstudies van G. mellonella en een methode voor de beoordeling van de antimicrobiële werkzaamheid. G. mellonella-larven hebben een aanzienlijk nut bij het evalueren van geneesmiddeltoxiciteit, MIC-bepaling en virulentietesten, terwijl ze bijdragen aan de vermindering van zoogdieren die worden gebruikt in preklinische ontwikkeling. Galleria mellonella-larven hebben een relatief hoge doorvoer, zijn biologisch relevant en vertalen zich goed in complexere zoogdiermodellen. Ondertussen, terwijl wildtype laboratoriummuizen tussen de £ 8 en £ 30 per stuk kosten met ~ £ 7 wekelijks onderhoud per muis, kost G. mellonella ~ £ 2 voor 50 larven. Het testen van 10 verbindingen in een G. mellonella-model zou daarom ~ £ 60 kosten, vergeleken met meer dan £ 4000 voor dezelfde studie bij muizen. Bovendien hebben eerdere studies de toxiciteit en werkzaamheid van nieuwe verbindingen vergeleken en een correlatie vastgesteld tussen acute toxiciteit bij G. mellonella en muizen 8,19,33. Daarom wordt aanbevolen om een G. mellonella-screening te implementeren om prioriteit te geven aan verbindingen die verder moeten worden getest in muismodellen.

Ondanks het duidelijke nut van het model, zijn er verschillende overwegingen om een succesvolle toepassing te garanderen. Het gebrek aan steriele larven van onderzoekskwaliteit bemoeilijkt hun voorbereiding op experimenteel gebruik, aangezien sterilisatie met ethanol vereist is, of onderzoekers hun eigen G. mellonella-kolonie moeten behouden, wat het risico op besmetting zou verminderen en de algehele experimentele kwaliteit zou verbeteren 5,6. Onjuiste sterilisatie kan aanzienlijke sterfte veroorzaken en het is een uitdaging om het organisme volledig te steriliseren, aangezien een langere blootstellingstijd aan ethanol tot de dood leidt. Alternatieve methoden van sterilisatie zijn onder meer het uitstrijken van het pootje van elke larve met 70% ethanol voorafgaand aan infectie, wat de sterfte tijdens sterilisatie zou verminderen, maar een meer arbeidsintensieve methode is. Andere antiseptica kunnen ook worden gebruikt, hoewel er in deze studie geen alternatieven werden beoordeeld, aangezien sterilisatie met ethanol <10% dood opleverde, eenmaal geoptimaliseerd. Bovendien is het vaak onduidelijk of leveranciers hun G. mellonella behandelen met antibiotica, omdat leveranciers hun larven bij andere leveranciers kunnen betrekken in plaats van zelf kolonies te onderhouden.

De biologie van G. mellonella verschilt aanzienlijk van die van zoogdieren, wat beperkingen oplegt aan hun bruikbaarheid. Hun immuunsysteem mist elke adaptieve immuniteit, hoewel belangrijke oplosbare en cellulaire aspecten van aangeboren immuniteit aanwezig zijn. Hemocyten zijn een belangrijke aangeboren immuunafweer van G. mellonella en vertonen fagocytachtige eigenschappen. Er zijn verschillende subgroepen van deze cellen beschreven, waaronder granulocyten en plasmatocyten, onder andere34. G. mellonella kan ook geen relevante infectieplaatsen recapituleren, zoals die van luchtweg- of blaasinfecties. In een preklinische pijplijn zou G. mellonella echter dienen als een pre-screening voor muizenmodellen, ervoor zorgen dat alleen de meest veelbelovende verbindingen zouden doorgaan naar het complexe zoogdiersysteem dat meer lijkt op menselijke infectieomgevingen. Ten slotte zou het model baat hebben bij verdere genomische karakterisering van G. mellonella om de geschiktheid ervan te bepalen voor het beoordelen van veranderingen in klinisch relevante biomarkers. Dit vereist met name een beter begrip van de immuniteit van G. mellonella.

Over het algemeen is het Galleria mellonella-infectiemodel een waardevol hulpmiddel voor de preklinische beoordeling van nieuwe antimicrobiële verbindingen voorafgaand aan hun evaluatie in zoogdiermodellen. Hoewel het gebruik ervan wordt bemoeilijkt door een gebrek aan standaardisatie van het aanbod, is hun toepassing een hoge doorvoer, eenvoudig en kan deze breed worden toegepast in het hele landschap van antimicrobiële ontwikkeling. In de toekomst zou de integratie van dit model in een gestandaardiseerde preklinische pijplijn de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële verbindingen kunnen versnellen om het percentage kandidaten dat van preklinische evaluatie naar klinische proeven gaat, te vergroten.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

TB, AK, JF en DN ontvingen subsidiesteun voor het Strategic Research Centre (SRC) "An evidence-based preclinical framework for the development of antimicrobial therapeutics in cystic fibrosis" (PIPE-CF; Projectnr. SRC 022) van de UK Cystic Fibrosis Trust en de US Cystic Fibrosis Foundation. LD en JF erkennen financiering van Kidney Research North West (project nr. 49/19).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22s gauge, Small Hub RN Needle, 2 in, point style 2Hamilton7758-03Vervanging voor de Hamilton-spuit.
Bacterial infection stocksBacterieculturen van een bekende dichtheid (CFU/mL) ingevroren tijdens de midden-exponentiële groeifase. 
EthanolFisher Scientific10610813Andere fabrikanten mogen worden gebruikt.
G. mellonella larvaeLivefoods5.06045E+12Voor deze leverancier worden bestellingen gemarkeerd als “Nieuwe voorraad voor laboratoriumgebruik”. Vanaf april 2024 wordt nieuwe voorraad op maandag bij de leverancier afgeleverd. Bestellingen moeten dan worden geplaatst, voor levering op woensdagen.
Microliter spuitHamilton80630De 80630 spuit heeft een capaciteit van 100 µL. Er bestaan andere volumes, zoals de 80430, 80530 of 80730.
PetrischaalFisher Scientific12674785Andere fabrikanten mogen worden gebruikt.

Referenties

  1. Menard, G., Rouillon, A., Cattoir, V., Donnio, P. Y. Galleria mellonella as a suitable model of bacterial infection: Past, present and future. Front Cell Infect Microbiol. 11, 782733(2021).
  2. Piatek, M., Sheehan, G., Kavanagh, K. Galleria mellonella: The versatile host for drug discovery, in vivo toxicity testing and characterizing host-pathogen interactions. Antibiotics. 10 (12), 1545(2021).
  3. Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nat Rev Chem. 5 (10), 726-749 (2021).
  4. Seyhan, A. A. Lost in translation: The valley of death across preclinical and clinical divide - identification of problems and overcoming obstacles. Transl Med Commun. 4 (1), (2019).
  5. Firacative, C., et al. Rearing and maintenance of Galleria mellonella and its application to study fungal virulence. J Fungus. 6 (3), 130(2020).
  6. Pereira, M. F., Rossi, C. C. Overview of rearing and testing conditions and a guide for optimizing Galleria mellonella breeding and use in the laboratory for scientific purposes. APMIS. 128 (12), 607-620 (2020).
  7. Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
  8. Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
  9. Gallorini, M., et al. Immunophenotyping of hemocytes from infected Galleria mellonella larvae as an innovative tool for immune profiling, infection studies and drug screening. Sci Rep. 14, 759(2024).
  10. Smith, F. Q., Casadevall, A. Fungal immunity and pathogenesis in mammals versus the invertebrate model organism Galleria mellonella. Pathog Dis. 79 (3), ftab013(2021).
  11. Sugumaran, M. Comparative biochemistry of eumelanogenesis and the protective roles of phenoloxidase and melanin in insects. Pigment Cell Res. 15 (1), 2-9 (2002).
  12. Sheehan, G., Garvey, A., Croke, M., Kavanagh, K. Innate humoral immune defences in mammals and insects: The same, with differences. Virulence. 9, 1625-1639 (2018).
  13. Wright, C. L., Kavanagh, O. Galleria mellonella as a novel in vivo model to screen natural product-derived modulators of innate immunity. Appl Sci. 12 (13), 6587(2022).
  14. Newton, S. M., et al. Use of the invertebrate Galleria mellonella as an infection model to study the Mycobacterium tuberculosis complex. J Vis Exp. (148), e59703(2019).
  15. Frankel, G., Collins, J. W., Schroeder, G. N., Harding, C. R. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. J Vis Exp. (81), e50964(2013).
  16. Romera, D., et al. The Galleria mellonella infection model as a system to investigate the virulence of Candida auris strains. Pathog Dis. 78 (9), ftaa067(2020).
  17. Kwadha, C. A., Ong'amo, G. O., Ndegwa, P. N., Raina, S. K., Fombong, A. T. The biology and control of the greater wax moth, Galleria mellonella. Insects. 8 (2), 61(2017).
  18. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg. 38, 732-749 (1938).
  19. Ignasiak, K., Maxwell, A. Galleria mellonella (greater wax moth) larvae as a model for antibiotic susceptibility testing and acute toxicity trials. BMC Res Notes. 10 (1), 428(2017).
  20. Hesketh-Best, P. J., Mouritzen, M. V., Shandley-Edwards, K., Billington, R. A., Upton, M. Galleria mellonella larvae exhibit a weight-dependent lethal median dose when infected with methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pathog Dis. 79 (2), ftab003(2021).
  21. Mahenthiralingam, E., Weiser, R., Floto, R. A., Davies, J. C., Fothergill, J. L. Selection of relevant bacterial strains for novel therapeutic testing: a Guidance document for priority cystic fibrosis lung pathogens. Curr Clin MicrobiolRep. 9 (4), 33-45 (2022).
  22. Carter, M. E. K., et al. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J Infect Dis. 202 (6), 935-942 (2010).
  23. Herrmann, G., et al. Colistin-tobramycin combinations are superior to monotherapy concerning the killing of biofilm Pseudomonas aeruginosa. J Infect Dis. 202 (10), 1585-1592 (2010).
  24. Hennig, S., Standing, J. F., Staatz, C. E., Thomson, A. H. Population pharmacokinetics of tobramycin in patients with and without cystic fibrosis. Clin Pharmacokinet. 52 (4), 289-301 (2013).
  25. Reyhanoglu, G., Reddivari, A. K. R. Tobramycin. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK551695/ (2023).
  26. Crass, R. L., Rutter, W. C., Burgess, D. R., Martin, C. A., Burgess, D. S. Nephrotoxicity in patients with or without cystic fibrosis treated with polymyxin b compared to colistin. Antimicrob Agents Chemother. 61 (4), e02329-e02416 (2017).
  27. Deacon, J., et al. Antimicrobial efficacy of tobramycin polymeric nanoparticles for Pseudomonas aeruginosa infections in cystic fibrosis: Formulation, characterization and functionalization with dornase alfa (DNase). J Control Release. 198, 55-61 (2015).
  28. Tamma, P. D., et al. Infectious Diseases Society of America 2022 guidance on the treatment of extended-spectrum β-lactamase producing enterobacterales (ESBL-E), carbapenem-resistant enterobacterales (CRE), and Pseudomonas aeruginosa with difficult-to-treat resistance (DTR-P. aeruginosa). Clin Infect Dis. 75 (2), 187-212 (2022).
  29. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. J PharmacolPharmacother. 4 (4), 303-306 (2022).
  30. Murray, C. J. L., et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  31. de Kraker, M. E. A., Stewardson, A. J., Harbarth, S. Will 10 million people die a year due to antimicrobial resistance by 2050. PLoS Med. 13 (11), e1002184(2016).
  32. Prasad, N. K., Seiple, I. B., Cirz, R. T., Rosenberg, O. S. Leaks in the pipeline: A failure analysis of gram-negative antibiotic development from 2010 to 2020. Antimicrob Agents Chemother. 66 (5), e0005422(2022).
  33. Wang, S., et al. A novel Galleria mellonella experimental model for zoonotic pathogen Brucella. Virulence. 14 (1), 2268496(2023).
  34. Senior, N. J., Titball, R. W. Isolation and primary culture of Galleria mellonella hemocytes for infection studies. F1000Res. 9, 1932(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Galleria Mellonella modelinfectiemodelPseudomonas Aeruginosatesten van drugstoxiciteitpreklinische ontwikkelingbacteri le virulentieinjectie van larvenmonitoring van overlevingantimicrobi le werkzaamheid
Galleria mellonella als antimicrobieel screeningsmodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.