Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67214

⸱

8 november 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Trauma and Transfusion Medicine Research Center, Department of Surgery, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Samenvatting

Microfluïdica bevat fysiologisch relevante substraten en stromingen die het vaatstelsel nabootsen en zijn daarom een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van aspecten van trombose en hemostase. In omgevingen met hoge afschuiving die arteriële stroming simuleren, vergemakkelijkt een microfluïdische test de studie van de bloedplaatjesfunctie, aangezien bloedplaatjesrijke trombi zich vormen in een gelokaliseerd stenotisch gebied van een stroomkanaal. Het gebruik van apparaten die een klein monstervolume mogelijk maken, kan bovendien helpen bij het evalueren van de bloedplaatjesfunctie onder stroom van volumebeperkte patiëntmonsters of diermodellen. Het bestuderen van monsters van traumapatiënten of monsters na transfusie van bloedplaatjesproducten kan helpen bij het sturen van therapeutische strategieën voor patiëntenpopulaties waarin de bloedplaatjesfunctie van cruciaal belang is. Effecten van bloedplaatjesremming via farmacologische middelen kunnen in dit model ook worden bestudeerd. Het doel van dit protocol is het opzetten van een microfluïdisch platform dat fysiologische stroming, biologische oppervlakken en relevante hemostatische mechanismen omvat om de bloedplaatjesfunctie te beoordelen met implicaties voor de studie van door trauma geïnduceerde coagulopathie en transfusiegeneeskunde.

Inleiding

Trauma is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit. Ernstig letsel wordt vaak gecompliceerd door een unieke, endogene verstoring van hemostase en trombose, trauma-geïnduceerde coagulopathie (TIC) genoemd1. Bloedplaatjes spelen een cruciale rol bij TIC en er is beschreven dat ze zowel adaptieve als onaangepaste functies hebben2. De mechanismen van disfunctie van bloedplaatjes na letsel blijven onduidelijk en er is een kritieke behoefte om de cellulaire respons beter te begrijpen om de ontwikkeling van verbeterde reanimatie en therapie te begeleiden. Een bijkomend vervelend probleem met betrekking tot de bloedplaatjesfunctie na letsel is de onzekerheid over de betrouwbaarheid van de huidige uitlezingen van de bloedplaatjesfunctie bij de traumapatiënt.

Meerdere onderzoeken hebben aangetoond dat zelfs licht gewonde patiënten, zonder bekend klinisch bloedingsfenotype, een abnormale bloedplaatjesfunctie hebben met behulp van conventionele bloedplaatjesfunctietesten zoals aggregometrie 3,4. Beperkingen in aggregometrie om de bloedplaatjesfunctie in een verwondingssetting te beoordelen, zijn onder meer een gebrek aan fysiologisch relevant letseloppervlak, een reductionistische benadering van agoniststimulatie, monsterverdunning met volbloedimpedantieaggregometrie, plasmascheiding met optische lichttransmissie-aggregometrie en stagnerende monsterbeoordeling. Bovendien blijft het onduidelijk of deze gevoeligheid van de bloedplaatjesfunctie echte cellulaire disfunctie vertegenwoordigt of een meetartefact, zoals een verhoogde elektrische impedantie bij de basislijn, in de setting van letsel2. Het bestuderen van relevante bloedplaatjesfuncties in de context van trauma is dus cruciaal voor het begrijpen van TIC, en er is veel ruimte voor innovatie en verbetering op dit gebied.

Platforms die traditioneel worden gebruikt om de bloedplaatjesfunctie te bestuderen, omvatten geen vloeistofdynamica en -stroming, wat van cruciaal belang kan zijn voor het begrijpen van bloedplaatjesdisfunctie met betrekking tot trauma en trauma-geïnduceerde coagulopathie5. Mechanismen van hemostase die afhankelijk zijn van de stroming zijn onder meer von Willebrand-factor (VWF)-rek bij hoge afschuiving, boven een kritische afschuifsnelheid, en het vastleggen van bloedplaatjes via glycoproteïne 1b 6,7,8, die niet worden vastgelegd met behulp van stagnerende bloedplaatjesfunctietesten. Bovendien binden bloedplaatjes bij voorkeur VWF of fibrinogeen, afhankelijk van het stroomregime, en wekken ze differentiële rollen op bij arteriële versus veneuze trombose 9,10. Arteriële trombi bestaan voornamelijk uit bloedplaatjes, terwijl veneuze trombi voornamelijk uit rode bloedcellen bestaan, gedeeltelijk gebaseerd op flowregimes11. Assays die flowregimes bevatten, kunnen helpen bij het ophelderen van disfuncties die betrekking hebben op het spectrum van TIC-fenotypes, van hypocoagulabiliteit en bloedingsfenotypes tot hypercoagulabiliteit en trombotische fenotypes. Ten slotte kunnen beperkingen van bloedvolumebemonstering bij traumapatiëntenpopulaties het traditionele testen van de bloedplaatjesfunctie uitdagend maken. Hoewel tests zoals flowcytometrie in deze omstandigheden kunnen en moeten worden gebruikt, tonen de resultaten vaak een fysieke karakterisering van een monster en geen hemostatische functionele beoordeling.

Hoewel mechanismen van bloedplaatjesdysfunctie bij trauma misschien niet volledig worden begrepen, kan het modelleren van bloedplaatjesdisfunctie in vitro, bijvoorbeeld met P2Y12-antagonisten, ook helpen bij het bestuderen van therapeutische interventies. Hemostatische reanimatie is van cruciaal belang bij traumapatiënten waarbij bloedproducten worden getransfundeerd in een evenwichtige benadering om shock, coagulopathie en endotheelbeschadiging aan te pakken met volbloed of bloedcomponenten (rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjesconcentraten) ineen verhouding van 1:1:1 12,13,14. Bij traumapatiënten wordt vroeg gebruik van bloedproducten in verband gebracht met een betere overleving15,16. Om de houdbaarheid te verlengen, is er steeds meer onderzoek gedaan naar gekoeld bewaarde bloedplaatjesproducten. Onderzoek van koud bewaarde bloedplaatjes toont verhoogde hemostatische activiteit, evenals veiligheid bij transfusie na letsel17,18.

De evolutie van koud opgeslagen bloedplaatjesreanimatie benadrukt de noodzaak van aanvullende tests om inzicht te krijgen in het meest effectieve bloedplaatjesproduct dat beschikbaar is voor trauma. Traditionele testen op de bloedplaatjesfunctie zijn echter vaak te veel of te weinig gepotentieerd om disfunctie te detecteren, wat zowel optreedt bij de traumapatiënt die therapeutische bloedplaatjestransfusie krijgt als bij het getransfundeerde product zelf dat wordt gezien bij laesies voor de opslag van bloedplaatjes. Het bepalen van de oorsprong van disfunctie kan een uitdaging zijn, gezien de beperkingen in de huidige bloedplaatjesfunctietesten, inclusief de statische aard van de meeste van deze tests. Daarom zijn bij het bestuderen van hemostatische reanimatie in vitro het platform en de detectiemethoden voor zowel ontvanger- als productbloedplaatjespopulaties van cruciaal belang bij het bepalen van optimale therapeutische interventies.

Microfluïdisch testen biedt flowprofielen en biofidelische oppervlakken om een fysiologisch relevante test te creëren waarop bloedplaatjes kunnen worden bestudeerd. Microfluïdische apparaten kunnen worden aangepast om bepaalde pathofysiologie of letseltypes te bestuderen, zoals vaatpunctie19 of endotheelschade20. Deze apparaten bestaan over het algemeen uit polydimethylsiloxaan (PDMS) dat is gebonden aan een glazen microscoopglaasje met oppervlaktemodificaties, zoals collageen, om sub-endotheel en weefselbeschadiging na te bootsen. Het gebruik van dit soort op stroom gebaseerde apparaten kan helpen bij het begeleiden van traumagerelateerd onderzoek naar bloedplaatjesdysfunctie en bij het onderzoeken van optimale transfusiegeneeskundebenaderingen om bloedplaatjesdisfunctie te verbeteren. Deze strategieën kunnen helpen om de bestaande verwarring over de relevantie van statische bloedplaatjestesten zoals aggregometrie bij de gewonde patiënt op te helderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Goedkeuring van het Human Research Protection Office van de Universiteit van Pittsburgh werd verkregen en geïnformeerde toestemming van gezonde menselijke vrijwilligers werd verkregen.

1. Voorbereiding van microfluïdische apparaten

  1. Om het PDMS-gedeelte van het apparaat te fabriceren, bereidt u een hoofdmal voor met messing via computernumerieke besturing (CNC) microbewerking.
    OPMERKING: Afhankelijk van de kanaalafmetingen kunnen fotolithografietechnieken worden gebruikt om een mastermal te maken. Het apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, omvat acht parallelle microbewerkte kanalen van ongeveer 480 μm breed, 140 μm hoog bij de inlaat en uitlaat van het apparaat en 40 μm hoog bij de stenose van het apparaat, met een hellingslengte van/naar het stenotische gebied van ongeveer 0.3 mm. De kanaallengtes zijn ongeveer 6 mm.
  2. Giet met een verkregen mastermal de siliconen elastomeerbasis (verkregen uit de elastomeerset) in een weegschaal. Voeg het siliconenuithardingsmiddel toe (verkregen uit de elastomeerset), dat de verknoping van de siliconenpolymeerketens vergemakkelijkt om het vloeibare PDMS om te zetten in een duurzame en flexibele vaste stof, in een verhouding van 10:1 (basismiddel) en roer het mengsel goed.
  3. Plaats de vorm in een petrischaal en giet de niet-uitgeharde PDMS op de vorm. Plaats de petrischaal 30 minuten in een vacuümexsiccator om luchtbellen te verwijderen.
  4. Eindig het uitharden van de PDMS in de mastermal door deze gedurende 90 minuten in een oven op 70 °C te plaatsen.
  5. Snijd na volledige PDMS-uitharding het microfluïdische gips uit met een scheermesje of scalpel. Pons gaten aan de randen van de kanalen (1,5 mm in diameter aan beide zijden).
  6. Reinig met laboratoriumtape het oppervlak van een glasplaatje en de geëtste kant van het microfluïdische gietstuk. Gebruik indien nodig perslucht om achtergebleven vuil te verwijderen.
  7. Plaats de glasplaat en het microfluïdische gietstuk met de geëtste kant naar boven in een plasmareiniger. Start de vacuümpomp, sluit de kamer af en zet de plasmareiniger aan op de hoogste stand. Laat de dia en PDMS 30 s in de plasmareiniger zitten, schakel vervolgens de plasmareiniger uit en verwijder de stofzuiger.
  8. Bind het plasmagereinigde gietstuk en de glasplaatje aan elkaar door de zijkanten die met de bedrukte zijde naar boven in de plasmareiniger lagen, voorzichtig tegen elkaar te drukken. Plaats het microfluïdische apparaat vervolgens gedurende 10 minuten in een oven/kookplaat op 70 °C.
    OPMERKING: Oefen niet te veel druk uit bij het verlijmen van het gietstuk en de glasdia, omdat dit kan leiden tot verlies van de kanaalmorfologie.
  9. Spoel elke kamer met 10-30 μL 70% ethanol om te steriliseren en laat het microfluïdische apparaat drogen op een warmhoudplaat van 70 °C.
    OPMERKING: Apparaten moeten ten minste 24 uur van tevoren worden gemaakt, maar kunnen weken tot maanden van tevoren worden gemaakt. Apparaten moeten worden bewaard in een luchtdichte verpakking of afgedekte petrischaal bij kamertemperatuur.
  10. De dag voordat u met het microfluïdische apparaat gaat experimenteren, spoelt u elke kamer opnieuw met 10-30 μL 70% ethanol om te steriliseren en laat u het microfluïdische apparaat drogen op een kookplaat van 70 °C.
  11. Smeer de kamer in met type 1 equine fibrillair collageenreagens (1 mg/ml), verdund in 0,9% NaCl in een volumetrische verhouding van 1:5 via een aangewezen uitlaat naar de aangewezen inlaat. Zorg ervoor dat de directionaliteit binnen een experiment behouden blijft. Bewaar het apparaat in een warme, vochtige, gesloten container om verdamping van het gecoate collageen in het kanaal te voorkomen.
  12. Spoel na 1 uur af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de collageenoplossing weg te spoelen. Spoel in de tegenovergestelde richting van de coating. Bewaar het apparaat opnieuw in een warme, vochtige, gesloten container wanneer het niet in gebruik is.

2. Voorbereiding van bloedmonsters

  1. Verkrijg een gecitreerd volbloedmonster via venapunctie. Incubeer gecitreerd volbloed met FC-receptorblokkerende oplossing (1:600).
    OPMERKING: Bloedmonsters worden voor en tijdens het experimenteren bij kamertemperatuur bewaard.
  2. Incubeer gecitreerd volbloed met fluorescentiegeconjugeerd (met behulp van een fluorofoor naar keuze) CD41-antilichaam (1:600). Kleur gedurende 30 minuten op een nutating rocker.
  3. Voeg als positieve controle voor bloedplaatjesremming Ticagror toe, een P2Y12-receptorantagonist gereconstitueerd in een oplossing van 30% w/v 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HP-β-CD) in PBS.
    OPMERKING: Ticagrelor-voorraden tot 6,4 mM moeten worden bereid en verdere verdunning van Ticagrelor-voorraden in HP-β-CD-oplossing (30% HP-β-CD opgelost in PBS) kan worden gedaan voorafgaand aan experimenten (1.000x voorraadconcentraties worden aanbevolen).
  4. Incubeer het gecitreerde monster met Ticagrelor (eindconcentratie tot 6,4 μM) gedurende 30 minuten om de remming van bloedplaatjes te observeren.
  5. Als het bloedproduct wordt gemengd met het gecitreerde monster, kleurt u het bloedproduct met FC-receptorblokkerende oplossing (1:600) en fluorescentiegeconjugeerd (met behulp van een afzonderlijke en afzonderlijke fluorofoor voor het gecitreerde monster) CD41-antilichaam (1:600).
    1. Meng een volumetrisch equivalent van de getransfundeerde producteenheden met het gecitreerde monster. Om bijvoorbeeld 2 eenheden bloedplaatjesproducten te simuleren die zijn getransfundeerd in een bloedende persoon (ongeveer 250 ml per product tot een totaal bloedvolume van 5.000 ml), mengt u 100 μl bloedproduct in 1.000 μl gecitreerd bloedmonster.
  6. Filtreer het bloedmonster onmiddellijk voor het experimenteren door een filter van 40 μm in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.

3. Testen van de bloedplaatjesfunctie onder stroom (methode 1)

  1. Zet de microscoop en de bijbehorende software aan.
  2. Stel een opzuigspuitpomp in op het niveau van de tafel van de microscoop. Pas de instellingen op de spuitpomp aan.
    1. Bereken een volumestroomsnelheid (Q) voor een gewenste gemiddelde wandafschuifsnelheid (γ) van 3.500 s-1 in het stenotische gebied van het kanaal met behulp van vergelijkingen (1) en (2)21.
      figure-protocol-1(1)
      figure-protocol-2(2)
      Waarbij A de dwarsdoorsnede van het kanaal is, P de bevochtigde omtrek, λ de vormfactor, b de korte zijde van de rechthoek (hoogte) en a de lange zijde van de rechthoek (breedte).
      OPMERKING: De waarde van 3,500 s-1 is gekozen vanwege VWF-kritische afschuiving en ligt in het arteriële regime 7,22,23.
  3. Plaats het microfluïdische apparaat op de microscooptafel. Plak de randen van het microfluïdische apparaat op de tafel om beweging te voorkomen. Zorg ervoor dat de uitlaat naar de achterkant van de microscoop wijst.
  4. Sluit het ene uiteinde van de 1/16" ID-slang (ongeveer 30 cm lang) aan op een elleboogconnector en het andere uiteinde op een spuit van 10 ml met 1/16" ID-connector.
  5. Vul de spuit met steriel PBS en sluit deze aan op de spuitpomp.
  6. Plaats de elleboogconnector in het stopcontact van het apparaat.
  7. Bereid inlaatleidingen van ongeveer 10 cm lang voor met de elleboogconnector aan het ene uiteinde en de schuine snede aan het andere uiteinde.
  8. Sluit de inlaatelleboogconnector aan op de inlaat van het apparaat.
  9. Plaats de inlaatleiding in een microcentrifugebuis voor afval op een schuine houder.
  10. Gebruik het 10x-objectief voor kanaalafmetingen van ongeveer 500 μm breed en focus op de kanaalranden van het microfluïdische apparaat.
  11. Bereid de leidingen voor met PBS en maak het kanaal vrij van PDMS/vuil door de spuitpomp handmatig vooruit te bewegen. Zorg ervoor dat u in de buurt van de kanaalinlaat en -uitlaat controleert.
  12. Open de instellingen voor het vastleggen van opgeslagen beelden of maak een procedure voor het vastleggen van afbeeldingen voor tijdreeksen die elke 1-2 s worden vastgelegd met een helderveldkanaal en fluorescerende kanalen die overeenkomen met de fluorescerende CD41-antilichamen die in het bloedmonster worden gebruikt.
  13. Verkrijg het gefilterde gecitreerde bloedmonster en meng door vlak voor het experiment op en neer te pipetteren. Plaats het monster op de schuine microcentrifugehouder.
  14. Plaats de inlaatleiding in het monster.
  15. Begin met het opnemen van de afbeelding.
  16. Trek de spuit langzaam terug om het dode volume in de slang te vullen. Zodra het bloed het kanaal bereikt , drukt u onmiddellijk op play op de spuitpomp om de stroom met de gewenste afschuifsnelheid te hervatten.
  17. Pas de focus aan indien nodig.
  18. Voer het experiment uit totdat bloedplaatjes het stenotische gebied van het microfluïdische apparaat volledig hebben afgesloten of tot een experimenteel eindpunt (d.w.z. 10 minuten).
  19. Zorg ervoor dat de inlaatslang voor de duur van het experiment in het bloedmonster is ondergedompeld.
  20. Zodra het experiment is voltooid, stopt u met het vastleggen van afbeeldingen en stopt u de spuitpomp. Sla de opname van de afbeelding op.
  21. Verwijder de inlaatelleboogconnector en leeg de inhoud van de slang in een afvalkegel. Leeg ook de inhoud van de spuit en de uitlaatleidingen in de kegelvormige afvoer.
  22. Vervang de inlaat- en uitlaatconnectoren en slangen indien nodig voor volgende monsters.

4. Testen van de bloedplaatjesfunctie onder stroom met monsters met een laag volume (minder dan 1 ml) (methode 2)

  1. Herhaal stap 1.1 tot en met 1.4 zoals hierboven.
  2. Pons een uitlaat met een diameter van 1,5 mm en een inlaat met een diameter van 3 mm aan de randen van de kanalen.
  3. Herhaal stap 1.6 tot en met 3.6 zoals hierboven.
  4. Gebruik het 10x-objectief voor kanaalafmetingen van ongeveer 500 μm breed en focus op de kanaalranden van het microfluïdische apparaat.
  5. Maak het kanaal vrij van PDMS/vuil door de spuitpomp handmatig naar voren te schuiven en toegangsvloeistof af te voeren met een laboratoriumdoekje. Verwijder al het vuil met laboratoriumtape op de bovenkant van het microfluïdische apparaat.
  6. Beweeg de pomp handmatig vooruit om het inlaatreservoir van 3 mm met PBS te vullen.
  7. Open de instellingen voor het vastleggen van opgeslagen beelden of maak een procedure voor het vastleggen van afbeeldingen voor tijdreeksen die elke 1-2 s worden vastgelegd met een helderveldkanaal en fluorescerende kanalen die overeenkomen met de fluorescerende CD41-antilichamen die in het bloedmonster worden gebruikt.
  8. Begin met het opzuigen van de spuitpomp (handmatig of met de ingestelde snelheid) en zodra PBS in het kanaal komt en de vulleiding in het reservoir naar beneden gaat, pauzeert u de opname op de pomp.
  9. Verwijder overtollig PBS uit het reservoir met een pipet.
  10. Start de opname van de afbeelding.
  11. Pipetteer het bloedmonster in het reservoir (ongeveer 40 μl) en start onmiddellijk de aftapspuit. Zorg ervoor dat de stroom op gang komt.
    OPMERKING: Als de motor van de spuitpomp voor het aftappen niet was voorbereid in stap 4.8, zal de stroom niet onmiddellijk starten en moet het experiment worden herhaald.
  12. Vul het bloedreservoir bij voor de duur van het experiment en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal komen.
  13. Voer het experiment uit totdat de bloedplaatjes het stenotische gebied van het microfluïdische apparaat volledig hebben afgesloten of tot een experimenteel eindpunt (d.w.z. 10 minuten).
  14. Zodra het experiment is voltooid, stopt u met het vastleggen van afbeeldingen en stopt u de spuitpomp. Sla de opname van de afbeelding op.
  15. Verwijder overtollig bloed in het reservoir door te pipetteren. Leeg de inhoud van de afvoerslang in een conische afvalbuis.
  16. Vervang de connectoren en slangen indien nodig voor volgende monsters.

5. Ontsmetting

  1. Maak de inlaat- en uitlaatlijnen van bloed vrij door te spoelen in een bleekoplossing van 10%.
  2. Als alle kanalen op het microfluïdische apparaat zijn gebruikt, gooi het apparaat dan weg in de container voor biologisch gevaarlijk afval van Sharps.
    OPMERKING: Al het biologisch afval moet op de juiste manier worden weggegooid in het biologisch gevaarlijk afval.

6. Beeldanalyse

  1. Exporteer de afbeeldingen van kinetische experimenten met behulp van software door te klikken op Bestand | Exporteren/Importeren | Exporteren.
  2. Selecteer de volgende parameters: bestandstype: Tagged Image File Format (TIFF); compressie: LZW; vink Originele gegevens en Shift Pixel aan; verwijder het vinkje bij Weergavecurve en kanaalkleur toepassen; vink Subset definiëren (Regio, Rechthoekig gebied aan en selecteer het kanaalgebied met een meting van de breedte en hoogte tussen de condities). Exporteer naar de gewenste map en vink Map maken aan.
  3. Let op de onderstaande experimentele waarden op de software: startframe wanneer bloed het kanaal binnenkomt; framesnelheid (Info, Tijdreeks).
  4. Meet de genormaliseerde gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk frame in een experiment met behulp van Matlab-code die wordt geleverd als aanvullend bestand 1, waarbij de volgende invoer voor elk experiment wordt gewijzigd: startframe/eindframe op basis van experimentlengte (zorg ervoor dat de duur van het experiment behouden blijft tussen de omstandigheden); naam van het experiment/map; het bijsnijden van X-, Y-, H- en W-parameters. Voer de code één keer uit voor het fluorescerende kanaal van de ontvangende bloedplaatjes en één keer voor het fluorescerende kanaal van de bloedplaatjes van het product. Rapporteer genormaliseerde MFI (kolom 2) en genormaliseerde AUC-waarden (genormaliseerd naar startframe). Trek de waarde van de experimentlengte af van de genormaliseerde AUC-waarde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Microfluïdische experimenten die het gebruik van deze methode volgen, zouden de vorming van bloedplaatjesrijke trombi moeten aantonen in het gebied van de stenose van het stroomkanaal (Figuur 1). Figuur 1A illustreert representatieve resultaten waarbij functionele bloedplaatjes een trombus vormden in het stenotische gebied van het kanaal om de bloedstroom door het kanaal te blokkeren. Gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI)-c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het bovenstaande protocol bevat enkele cruciale stappen om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van experimenten te waarborgen. Ten eerste moeten fluorescerende antilichamen zorgvuldig worden overwogen. De antilichamen die worden gebruikt om bloedplaatjes in het monster te detecteren, mogen de functie van de glycoproteïne Ib (GPIb) bloedplaatjesreceptor niet blokkeren. Het matchen van partijen, waar mogelijk tussen experimenten, is ook van cruciaal belang om de reproduceerbaarheid v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen en bedanken alle bloeddonoren die hebben deelgenomen, evenals de flebotomisten van het Trauma and Transfusion Medicine Research Lab en het UPMC Montefiore Clinical and Translational Research Center voor hun hulp bij het verzamelen. SMS wordt ondersteund door K25HL161401. MDN wordt ondersteund door 1R01HL166944-01A1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipments
Axio ObserverZeiss491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum DesiccatorsFisher Scientific08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate StirrerFisher ScientificFB30786161
Nutating MixerFischer Scientific88-861-043
OHAUS Scout Balance ScaleUlineH-5852
OvenFisher Scientific15-103-0520
Plasma cleanerHarrickPDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)Harvard Apparatus883015
Zen 3.4ZeissBlue editionSoftware
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow ConnectorsQosina11691
10 mL syringeFischer Scientific14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrinCayman Chemicals1616930% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filtersFischer ScientificNC1469671
CD41 antibodyNovus Biologicals NB100-26141:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen ReagentChrono Log Corporation3851:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mmFisher ScientificNC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal BleachFischer Scientific50371500
EthanolFisher Scientific07-678-00570%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed GasSupra1381978
Human TruStainBiolegend4223021:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene SpatulaFisher Scientific18-001-017
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-A3
Phosphate buffered salineGibco10010-023
Safety ScalpelFisher Scientific22-079-718
SalineMillipore5674420.90%
Sartorius Polystyrene Weighing BoatsFisher Scientific13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5Fisher Scientific12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitFisher ScientificNC9285739Polydimethylsiloxane (PDMS)
TicagrelorCayman Chemicals15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft lengthMcMaster-Carr6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass BarMcMaster-Carr8954K721For master mold fabrication
VacutainersBD363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mmFisher ScientificNC1215626

Referenties

  1. Moore, E. E., et al. Trauma-induced coagulopathy. Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).
  2. Vulliamy, P., et al. Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive. Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).
  3. Starr, N. E., et al. Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping. J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).
  4. Kutcher, M. E., et al. Characterization of platelet dysfunction after trauma. J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).
  5. Yakusheva, A. A., et al. Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions. Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).
  6. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  7. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).
  8. Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow. Cell. 94 (5), 657-666 (1998).
  9. Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84 (2), 289-297 (1996).
  10. Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).
  11. Chernysh, I. N., et al. The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli. Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).
  12. Holcomb, J. B., et al. Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial. JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).
  13. Shea, S. M., et al. Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage. J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).
  14. Cardenas, J. C., et al. Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial. Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).
  15. Sperry, J. L., et al. Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock. N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).
  16. Meyer, D. E., et al. Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality. J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).
  17. Shea, S. M., et al. Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism. J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).
  18. Sperry, J. L., et al. Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial. Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).
  19. Schoeman, R. M., et al. A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation. Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).
  20. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  21. Miller, C. Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section. Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).
  22. Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. Occlusive thrombosis in arteries. APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).
  23. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  24. Sorrells, M. G., Neeves, K. B. Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays. Micromachines. 11 (1), 62(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Microfluidische assayfysiologische stromingtrombose hemostaseplaatjesaggregatiemonsters van traumapatiëntenplaatjesinhibitiecollageencoatingfluorescentiemicroscopiespuitenpomp
Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.