Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Summary

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Abstract

Microfluïdica bevat fysiologisch relevante substraten en stromingen die het vaatstelsel nabootsen en zijn daarom een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van aspecten van trombose en hemostase. In omgevingen met hoge afschuiving die arteriële stroming simuleren, vergemakkelijkt een microfluïdische test de studie van de bloedplaatjesfunctie, aangezien bloedplaatjesrijke trombi zich vormen in een gelokaliseerd stenotisch gebied van een stroomkanaal. Het gebruik van apparaten die een klein monstervolume mogelijk maken, kan bovendien helpen bij het evalueren van de bloedplaatjesfunctie onder stroom van volumebeperkte patiëntmonsters of diermodellen. Het bestuderen van monsters van traumapatiënten of monsters na transfusie van bloedplaatjesproducten kan helpen bij het sturen van therapeutische strategieën voor patiëntenpopulaties waarin de bloedplaatjesfunctie van cruciaal belang is. Effecten van bloedplaatjesremming via farmacologische middelen kunnen in dit model ook worden bestudeerd. Het doel van dit protocol is het opzetten van een microfluïdisch platform dat fysiologische stroming, biologische oppervlakken en relevante hemostatische mechanismen omvat om de bloedplaatjesfunctie te beoordelen met implicaties voor de studie van door trauma geïnduceerde coagulopathie en transfusiegeneeskunde.

Introduction

Trauma is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit. Ernstig letsel wordt vaak gecompliceerd door een unieke, endogene verstoring van hemostase en trombose, trauma-geïnduceerde coagulopathie (TIC) ^genoemd1. Bloedplaatjes spelen een cruciale rol bij TIC en er is beschreven dat ze zowel adaptieve als onaangepaste functies hebben². De mechanismen van disfunctie van bloedplaatjes na letsel blijven onduidelijk en er is een kritieke behoefte om de cellulaire respons beter te begrijpen om de ontwikkeling van verbeterde reanimatie en therapie te begeleiden. Een bijkomend vervelend probleem met betrekking tot de bloedplaatjesfunctie na letsel is de onzekerheid over de betrouwbaarheid van de huidige uitlezingen van de bloedplaatjesfunctie bij de traumapatiënt.

Meerdere onderzoeken hebben aangetoond dat zelfs licht gewonde patiënten, zonder bekend klinisch bloedingsfenotype, een abnormale bloedplaatjesfunctie hebben met behulp van conventionele bloedplaatjesfunctietesten zoals aggregometrie ^3,4. Beperkingen in aggregometrie om de bloedplaatjesfunctie in een verwondingssetting te beoordelen, zijn onder meer een gebrek aan fysiologisch relevant letseloppervlak, een reductionistische benadering van agoniststimulatie, monsterverdunning met volbloedimpedantieaggregometrie, plasmascheiding met optische lichttransmissie-aggregometrie en stagnerende monsterbeoordeling. Bovendien blijft het onduidelijk of deze gevoeligheid van de bloedplaatjesfunctie echte cellulaire disfunctie vertegenwoordigt of een meetartefact, zoals een verhoogde elektrische impedantie bij de basislijn, in de setting van letsel². Het bestuderen van relevante bloedplaatjesfuncties in de context van trauma is dus cruciaal voor het begrijpen van TIC, en er is veel ruimte voor innovatie en verbetering op dit gebied.

Platforms die traditioneel worden gebruikt om de bloedplaatjesfunctie te bestuderen, omvatten geen vloeistofdynamica en -stroming, wat van cruciaal belang kan zijn voor het begrijpen van bloedplaatjesdisfunctie met betrekking tot trauma en trauma-geïnduceerde coagulopathie⁵. Mechanismen van hemostase die afhankelijk zijn van de stroming zijn onder meer von Willebrand-factor (VWF)-rek bij hoge afschuiving, boven een kritische afschuifsnelheid, en het vastleggen van bloedplaatjes via glycoproteïne 1b ^6,7,8, die niet worden vastgelegd met behulp van stagnerende bloedplaatjesfunctietesten. Bovendien binden bloedplaatjes bij voorkeur VWF of fibrinogeen, afhankelijk van het stroomregime, en wekken ze differentiële rollen op bij arteriële versus veneuze trombose ^9,10. Arteriële trombi bestaan voornamelijk uit bloedplaatjes, terwijl veneuze trombi voornamelijk uit rode bloedcellen bestaan, gedeeltelijk gebaseerd op flowregimes¹¹. Assays die flowregimes bevatten, kunnen helpen bij het ophelderen van disfuncties die betrekking hebben op het spectrum van TIC-fenotypes, van hypocoagulabiliteit en bloedingsfenotypes tot hypercoagulabiliteit en trombotische fenotypes. Ten slotte kunnen beperkingen van bloedvolumebemonstering bij traumapatiëntenpopulaties het traditionele testen van de bloedplaatjesfunctie uitdagend maken. Hoewel tests zoals flowcytometrie in deze omstandigheden kunnen en moeten worden gebruikt, tonen de resultaten vaak een fysieke karakterisering van een monster en geen hemostatische functionele beoordeling.

Hoewel mechanismen van bloedplaatjesdysfunctie bij trauma misschien niet volledig worden begrepen, kan het modelleren van bloedplaatjesdisfunctie in vitro, bijvoorbeeld met P2Y12-antagonisten, ook helpen bij het bestuderen van therapeutische interventies. Hemostatische reanimatie is van cruciaal belang bij traumapatiënten waarbij bloedproducten worden getransfundeerd in een evenwichtige benadering om shock, coagulopathie en endotheelbeschadiging aan te pakken met volbloed of bloedcomponenten (rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjesconcentraten) in^{een verhouding van} 1:1:1 12,13,14. Bij traumapatiënten wordt vroeg gebruik van bloedproducten in verband gebracht met een betere overleving^15,16. Om de houdbaarheid te verlengen, is er steeds meer onderzoek gedaan naar gekoeld bewaarde bloedplaatjesproducten. Onderzoek van koud bewaarde bloedplaatjes toont verhoogde hemostatische activiteit, evenals veiligheid bij transfusie na letsel^17,18.

De evolutie van koud opgeslagen bloedplaatjesreanimatie benadrukt de noodzaak van aanvullende tests om inzicht te krijgen in het meest effectieve bloedplaatjesproduct dat beschikbaar is voor trauma. Traditionele testen op de bloedplaatjesfunctie zijn echter vaak te veel of te weinig gepotentieerd om disfunctie te detecteren, wat zowel optreedt bij de traumapatiënt die therapeutische bloedplaatjestransfusie krijgt als bij het getransfundeerde product zelf dat wordt gezien bij laesies voor de opslag van bloedplaatjes. Het bepalen van de oorsprong van disfunctie kan een uitdaging zijn, gezien de beperkingen in de huidige bloedplaatjesfunctietesten, inclusief de statische aard van de meeste van deze tests. Daarom zijn bij het bestuderen van hemostatische reanimatie in vitro het platform en de detectiemethoden voor zowel ontvanger- als productbloedplaatjespopulaties van cruciaal belang bij het bepalen van optimale therapeutische interventies.

Microfluïdisch testen biedt flowprofielen en biofidelische oppervlakken om een fysiologisch relevante test te creëren waarop bloedplaatjes kunnen worden bestudeerd. Microfluïdische apparaten kunnen worden aangepast om bepaalde pathofysiologie of letseltypes te bestuderen, zoals vaatpunctie¹⁹ of endotheelschade²⁰. Deze apparaten bestaan over het algemeen uit polydimethylsiloxaan (PDMS) dat is gebonden aan een glazen microscoopglaasje met oppervlaktemodificaties, zoals collageen, om sub-endotheel en weefselbeschadiging na te bootsen. Het gebruik van dit soort op stroom gebaseerde apparaten kan helpen bij het begeleiden van traumagerelateerd onderzoek naar bloedplaatjesdysfunctie en bij het onderzoeken van optimale transfusiegeneeskundebenaderingen om bloedplaatjesdisfunctie te verbeteren. Deze strategieën kunnen helpen om de bestaande verwarring over de relevantie van statische bloedplaatjestesten zoals aggregometrie bij de gewonde patiënt op te helderen.

Protocol

Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Goedkeuring van het Human Research Protection Office van de Universiteit van Pittsburgh werd verkregen en geïnformeerde toestemming van gezonde menselijke vrijwilligers werd verkregen.

1. Voorbereiding van microfluïdische apparaten

1. Om het PDMS-gedeelte van het apparaat te fabriceren, bereidt u een hoofdmal voor met messing via computernumerieke besturing (CNC) microbewerking.
   OPMERKING: Afhankelijk van de kanaalafmetingen kunnen fotolithografietechnieken worden gebruikt om een mastermal te maken. Het apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, omvat acht parallelle microbewerkte kanalen van ongeveer 480 μm breed, 140 μm hoog bij de inlaat en uitlaat van het apparaat en 40 μm hoog bij de stenose van het apparaat, met een hellingslengte van/naar het stenotische gebied van ongeveer 0.3 mm. De kanaallengtes zijn ongeveer 6 mm.
2. Giet met een verkregen mastermal de siliconen elastomeerbasis (verkregen uit de elastomeerset) in een weegschaal. Voeg het siliconenuithardingsmiddel toe (verkregen uit de elastomeerset), dat de verknoping van de siliconenpolymeerketens vergemakkelijkt om het vloeibare PDMS om te zetten in een duurzame en flexibele vaste stof, in een verhouding van 10:1 (basismiddel) en roer het mengsel goed.
3. Plaats de vorm in een petrischaal en giet de niet-uitgeharde PDMS op de vorm. Plaats de petrischaal 30 minuten in een vacuümexsiccator om luchtbellen te verwijderen.
4. Eindig het uitharden van de PDMS in de mastermal door deze gedurende 90 minuten in een oven op 70 °C te plaatsen.
5. Snijd na volledige PDMS-uitharding het microfluïdische gips uit met een scheermesje of scalpel. Pons gaten aan de randen van de kanalen (1,5 mm in diameter aan beide zijden).
6. Reinig met laboratoriumtape het oppervlak van een glasplaatje en de geëtste kant van het microfluïdische gietstuk. Gebruik indien nodig perslucht om achtergebleven vuil te verwijderen.
7. Plaats de glasplaat en het microfluïdische gietstuk met de geëtste kant naar boven in een plasmareiniger. Start de vacuümpomp, sluit de kamer af en zet de plasmareiniger aan op de hoogste stand. Laat de dia en PDMS 30 s in de plasmareiniger zitten, schakel vervolgens de plasmareiniger uit en verwijder de stofzuiger.
8. Bind het plasmagereinigde gietstuk en de glasplaatje aan elkaar door de zijkanten die met de bedrukte zijde naar boven in de plasmareiniger lagen, voorzichtig tegen elkaar te drukken. Plaats het microfluïdische apparaat vervolgens gedurende 10 minuten in een oven/kookplaat op 70 °C.
   OPMERKING: Oefen niet te veel druk uit bij het verlijmen van het gietstuk en de glasdia, omdat dit kan leiden tot verlies van de kanaalmorfologie.
9. Spoel elke kamer met 10-30 μL 70% ethanol om te steriliseren en laat het microfluïdische apparaat drogen op een warmhoudplaat van 70 °C.
   OPMERKING: Apparaten moeten ten minste 24 uur van tevoren worden gemaakt, maar kunnen weken tot maanden van tevoren worden gemaakt. Apparaten moeten worden bewaard in een luchtdichte verpakking of afgedekte petrischaal bij kamertemperatuur.
10. De dag voordat u met het microfluïdische apparaat gaat experimenteren, spoelt u elke kamer opnieuw met 10-30 μL 70% ethanol om te steriliseren en laat u het microfluïdische apparaat drogen op een kookplaat van 70 °C.
11. Smeer de kamer in met type 1 equine fibrillair collageenreagens (1 mg/ml), verdund in 0,9% NaCl in een volumetrische verhouding van 1:5 via een aangewezen uitlaat naar de aangewezen inlaat. Zorg ervoor dat de directionaliteit binnen een experiment behouden blijft. Bewaar het apparaat in een warme, vochtige, gesloten container om verdamping van het gecoate collageen in het kanaal te voorkomen.
12. Spoel na 1 uur af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de collageenoplossing weg te spoelen. Spoel in de tegenovergestelde richting van de coating. Bewaar het apparaat opnieuw in een warme, vochtige, gesloten container wanneer het niet in gebruik is.

2. Voorbereiding van bloedmonsters

1. Verkrijg een gecitreerd volbloedmonster via venapunctie. Incubeer gecitreerd volbloed met FC-receptorblokkerende oplossing (1:600).
   OPMERKING: Bloedmonsters worden voor en tijdens het experimenteren bij kamertemperatuur bewaard.
2. Incubeer gecitreerd volbloed met fluorescentiegeconjugeerd (met behulp van een fluorofoor naar keuze) CD41-antilichaam (1:600). Kleur gedurende 30 minuten op een nutating rocker.
3. Voeg als positieve controle voor bloedplaatjesremming Ticagror toe, een P2Y12-receptorantagonist gereconstitueerd in een oplossing van 30% w/v 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HP-β-CD) in PBS.
   OPMERKING: Ticagrelor-voorraden tot 6,4 mM moeten worden bereid en verdere verdunning van Ticagrelor-voorraden in HP-β-CD-oplossing (30% HP-β-CD opgelost in PBS) kan worden gedaan voorafgaand aan experimenten (1.000x voorraadconcentraties worden aanbevolen).
4. Incubeer het gecitreerde monster met Ticagrelor (eindconcentratie tot 6,4 μM) gedurende 30 minuten om de remming van bloedplaatjes te observeren.
5. Als het bloedproduct wordt gemengd met het gecitreerde monster, kleurt u het bloedproduct met FC-receptorblokkerende oplossing (1:600) en fluorescentiegeconjugeerd (met behulp van een afzonderlijke en afzonderlijke fluorofoor voor het gecitreerde monster) CD41-antilichaam (1:600).
   1. Meng een volumetrisch equivalent van de getransfundeerde producteenheden met het gecitreerde monster. Om bijvoorbeeld 2 eenheden bloedplaatjesproducten te simuleren die zijn getransfundeerd in een bloedende persoon (ongeveer 250 ml per product tot een totaal bloedvolume van 5.000 ml), mengt u 100 μl bloedproduct in 1.000 μl gecitreerd bloedmonster.
6. Filtreer het bloedmonster onmiddellijk voor het experimenteren door een filter van 40 μm in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.

3. Testen van de bloedplaatjesfunctie onder stroom (methode 1)

1. Zet de microscoop en de bijbehorende software aan.
2. Stel een opzuigspuitpomp in op het niveau van de tafel van de microscoop. Pas de instellingen op de spuitpomp aan.
   1. Bereken een volumestroomsnelheid (Q) voor een gewenste gemiddelde wandafschuifsnelheid (γ) van 3.500 ^s-1 in het stenotische gebied van het kanaal met behulp van vergelijkingen (1) en (2)²¹.
      (1)
      (2)
      Waarbij A de dwarsdoorsnede van het kanaal is, P de bevochtigde omtrek, λ de vormfactor, b de korte zijde van de rechthoek (hoogte) en a de lange zijde van de rechthoek (breedte).
      OPMERKING: De waarde van 3,500 ^s-1 is gekozen vanwege VWF-kritische afschuiving en ligt in het arteriële regime ^7,22,23.
3. Plaats het microfluïdische apparaat op de microscooptafel. Plak de randen van het microfluïdische apparaat op de tafel om beweging te voorkomen. Zorg ervoor dat de uitlaat naar de achterkant van de microscoop wijst.
4. Sluit het ene uiteinde van de 1/16" ID-slang (ongeveer 30 cm lang) aan op een elleboogconnector en het andere uiteinde op een spuit van 10 ml met 1/16" ID-connector.
5. Vul de spuit met steriel PBS en sluit deze aan op de spuitpomp.
6. Plaats de elleboogconnector in het stopcontact van het apparaat.
7. Bereid inlaatleidingen van ongeveer 10 cm lang voor met de elleboogconnector aan het ene uiteinde en de schuine snede aan het andere uiteinde.
8. Sluit de inlaatelleboogconnector aan op de inlaat van het apparaat.
9. Plaats de inlaatleiding in een microcentrifugebuis voor afval op een schuine houder.
10. Gebruik het 10x-objectief voor kanaalafmetingen van ongeveer 500 μm breed en focus op de kanaalranden van het microfluïdische apparaat.
11. Bereid de leidingen voor met PBS en maak het kanaal vrij van PDMS/vuil door de spuitpomp handmatig vooruit te bewegen. Zorg ervoor dat u in de buurt van de kanaalinlaat en -uitlaat controleert.
12. Open de instellingen voor het vastleggen van opgeslagen beelden of maak een procedure voor het vastleggen van afbeeldingen voor tijdreeksen die elke 1-2 s worden vastgelegd met een helderveldkanaal en fluorescerende kanalen die overeenkomen met de fluorescerende CD41-antilichamen die in het bloedmonster worden gebruikt.
13. Verkrijg het gefilterde gecitreerde bloedmonster en meng door vlak voor het experiment op en neer te pipetteren. Plaats het monster op de schuine microcentrifugehouder.
14. Plaats de inlaatleiding in het monster.
15. Begin met het opnemen van de afbeelding.
16. Trek de spuit langzaam terug om het dode volume in de slang te vullen. Zodra het bloed het kanaal bereikt , drukt u onmiddellijk op play op de spuitpomp om de stroom met de gewenste afschuifsnelheid te hervatten.
17. Pas de focus aan indien nodig.
18. Voer het experiment uit totdat bloedplaatjes het stenotische gebied van het microfluïdische apparaat volledig hebben afgesloten of tot een experimenteel eindpunt (d.w.z. 10 minuten).
19. Zorg ervoor dat de inlaatslang voor de duur van het experiment in het bloedmonster is ondergedompeld.
20. Zodra het experiment is voltooid, stopt u met het vastleggen van afbeeldingen en stopt u de spuitpomp. Sla de opname van de afbeelding op.
21. Verwijder de inlaatelleboogconnector en leeg de inhoud van de slang in een afvalkegel. Leeg ook de inhoud van de spuit en de uitlaatleidingen in de kegelvormige afvoer.
22. Vervang de inlaat- en uitlaatconnectoren en slangen indien nodig voor volgende monsters.

4. Testen van de bloedplaatjesfunctie onder stroom met monsters met een laag volume (minder dan 1 ml) (methode 2)

1. Herhaal stap 1.1 tot en met 1.4 zoals hierboven.
2. Pons een uitlaat met een diameter van 1,5 mm en een inlaat met een diameter van 3 mm aan de randen van de kanalen.
3. Herhaal stap 1.6 tot en met 3.6 zoals hierboven.
4. Gebruik het 10x-objectief voor kanaalafmetingen van ongeveer 500 μm breed en focus op de kanaalranden van het microfluïdische apparaat.
5. Maak het kanaal vrij van PDMS/vuil door de spuitpomp handmatig naar voren te schuiven en toegangsvloeistof af te voeren met een laboratoriumdoekje. Verwijder al het vuil met laboratoriumtape op de bovenkant van het microfluïdische apparaat.
6. Beweeg de pomp handmatig vooruit om het inlaatreservoir van 3 mm met PBS te vullen.
7. Open de instellingen voor het vastleggen van opgeslagen beelden of maak een procedure voor het vastleggen van afbeeldingen voor tijdreeksen die elke 1-2 s worden vastgelegd met een helderveldkanaal en fluorescerende kanalen die overeenkomen met de fluorescerende CD41-antilichamen die in het bloedmonster worden gebruikt.
8. Begin met het opzuigen van de spuitpomp (handmatig of met de ingestelde snelheid) en zodra PBS in het kanaal komt en de vulleiding in het reservoir naar beneden gaat, pauzeert u de opname op de pomp.
9. Verwijder overtollig PBS uit het reservoir met een pipet.
10. Start de opname van de afbeelding.
11. Pipetteer het bloedmonster in het reservoir (ongeveer 40 μl) en start onmiddellijk de aftapspuit. Zorg ervoor dat de stroom op gang komt.
    OPMERKING: Als de motor van de spuitpomp voor het aftappen niet was voorbereid in stap 4.8, zal de stroom niet onmiddellijk starten en moet het experiment worden herhaald.
12. Vul het bloedreservoir bij voor de duur van het experiment en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het kanaal komen.
13. Voer het experiment uit totdat de bloedplaatjes het stenotische gebied van het microfluïdische apparaat volledig hebben afgesloten of tot een experimenteel eindpunt (d.w.z. 10 minuten).
14. Zodra het experiment is voltooid, stopt u met het vastleggen van afbeeldingen en stopt u de spuitpomp. Sla de opname van de afbeelding op.
15. Verwijder overtollig bloed in het reservoir door te pipetteren. Leeg de inhoud van de afvoerslang in een conische afvalbuis.
16. Vervang de connectoren en slangen indien nodig voor volgende monsters.

5. Ontsmetting

1. Maak de inlaat- en uitlaatlijnen van bloed vrij door te spoelen in een bleekoplossing van 10%.
2. Als alle kanalen op het microfluïdische apparaat zijn gebruikt, gooi het apparaat dan weg in de container voor biologisch gevaarlijk afval van Sharps.
   OPMERKING: Al het biologisch afval moet op de juiste manier worden weggegooid in het biologisch gevaarlijk afval.

6. Beeldanalyse

1. Exporteer de afbeeldingen van kinetische experimenten met behulp van software door te klikken op Bestand | Exporteren/Importeren | Exporteren.
2. Selecteer de volgende parameters: bestandstype: Tagged Image File Format (TIFF); compressie: LZW; vink Originele gegevens en Shift Pixel aan; verwijder het vinkje bij Weergavecurve en kanaalkleur toepassen; vink Subset definiëren (Regio, Rechthoekig gebied aan en selecteer het kanaalgebied met een meting van de breedte en hoogte tussen de condities). Exporteer naar de gewenste map en vink Map maken aan.
3. Let op de onderstaande experimentele waarden op de software: startframe wanneer bloed het kanaal binnenkomt; framesnelheid (Info, Tijdreeks).
4. Meet de genormaliseerde gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk frame in een experiment met behulp van Matlab-code die wordt geleverd als aanvullend bestand 1, waarbij de volgende invoer voor elk experiment wordt gewijzigd: startframe/eindframe op basis van experimentlengte (zorg ervoor dat de duur van het experiment behouden blijft tussen de omstandigheden); naam van het experiment/map; het bijsnijden van X-, Y-, H- en W-parameters. Voer de code één keer uit voor het fluorescerende kanaal van de ontvangende bloedplaatjes en één keer voor het fluorescerende kanaal van de bloedplaatjes van het product. Rapporteer genormaliseerde MFI (kolom 2) en genormaliseerde AUC-waarden (genormaliseerd naar startframe). Trek de waarde van de experimentlengte af van de genormaliseerde AUC-waarde.

Results

Microfluïdische experimenten die het gebruik van deze methode volgen, zouden de vorming van bloedplaatjesrijke trombi moeten aantonen in het gebied van de stenose van het stroomkanaal (Figuur 1). Figuur 1A illustreert representatieve resultaten waarbij functionele bloedplaatjes een trombus vormden in het stenotische gebied van het kanaal om de bloedstroom door het kanaal te blokkeren. Gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI)-curven van kinetische beelden die voor de duur van het experiment zijn gemaakt, illustreren een vertragings-, groei- en plateaufase van de opname van bloedplaatjes in de groeiende trombus (Figuur 2A,C). Toenemende concentraties van een P2Y12-antagonist, Ticagrelor, verlagen de MFI van bloedplaatjes en het berekende gebied onder de curve (AUC) van MFI-curven (Figuur 2B,D). Langere incubatietijden zijn nodig (30 minuten vergeleken met 5 minuten) om uitgesproken bloedplaatjesdisfunctie waar te nemen, in overeenstemming met een meer uitgesproken dosis-responsrelatie waarbij gebruik wordt gemaakt van volbloedimpedantieaggregometrie na een incubatie van 30 minuten met Ticagrelor in vergelijking met een incubatie van 5 minuten (aanvullende figuur S1). Onder verschillende voertuigomstandigheden werden vergelijkbare tijdsafhankelijke effecten van P2Y12-remming waargenomen in het microfluïdische model (aanvullende figuur S2).

Visualisatie van twee bloedplaatjespopulaties in de gesimuleerde hemostatische reanimatiemethode illustreert de opname van beide bloedplaatjespopulaties in de trombus (Figuur 3A). De opname van beide bloedplaatjespopulaties in hun overeenkomstige fluorescerende signaal kan kinetisch worden gekwantificeerd over de duur van het experiment via MFI-metingen (Figuur 3B). Steilere hellingen in de groeifase en verhoogde MFI-metingen van het eindpunt tonen een verhoogde bloedplaatjesfunctionaliteit en hemostatisch potentieel aan, wat te zien is in de kwantificering van ontvangende bloedplaatjes wanneer het bloedmonster werd geïnduceerd met bloedplaatjesdisfunctie via P2Y12-remming, en vervolgens reanimatie gesimuleerd door vers autoloog volbloed te mengen in een volumetrische verhouding van 1:10 gekleurd met een duidelijke bloedplaatjesfluorofoor. Bij autologe volbloedmenging werden meer bloedplaatjes opgenomen uit het gesimuleerde getransfundeerde product in vergelijking met een aferese-bloedplaatjesproduct op opslagdag 5 bij kamertemperatuur, die minimale productopname in de vormende trombus vertoonde. Het mengen van bloedplaatjesproducten op dag 5 bij kamertemperatuur vertoonde ook een lagere opname van bloedplaatjes in vergelijking met het mengen met vers autoloog volbloed (Figuur 3B).

Figuur 1: Weergave van bloedplaatjesfunctietesten met behulp van microfluïdica. (A) Er wordt een schematische microfluïdische experimentele opstelling getoond voor het testen van de bloedplaatjesfunctie met behulp van bloedmonsters met een laag volume, inclusief een onttrekkingsspuitpomp die bloed door een stenotische stroomkamer trekt, waardoor beelden in realtime kunnen worden vastgelegd. (B) Een zijaanzicht van een stenotische stroomkamer wordt getoond, inclusief een met collageen bedekt oppervlak waarop bloedplaatjes zich hechten, activeren en aggregeren, wat resulteert in een groeiende trombus in het stenotische gebied. (C) Real-time beeldopname van een gecitreerd bloedmonster onder stroom in een stenotisch microfluïdisch kanaal (3.500 ^s-1) en een groeiende trombus gevormd over 300 s. Schaalbalken = 200 μm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verminderde veranderingen in de MFI-vouw van bloedplaatjes en oppervlakte onder de curve na 30 minuten incubatie met P2Y12-antagonist Ticagrelor. (A) Incubatie met P2Y12-antagonist gedurende slechts 5 minuten vertoont iets langere vertragingsfasen van de MFI-curven en (B) lichte afname van de MFI-AUC. (C) Incubatie gedurende 30 minuten met P2Y12-antagonist resulteert in verlengde vertragingsfasen en verminderde MFI-waarden op het eindpunt, evenals (D) robuustere disfunctie aangetoond via MFI-AUC. Individuele gegevenspunten vertegenwoordigen biologische replicaten en het gemiddelde ± standaarddeviatie wordt weergegeven. Afkortingen: MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; AUC = oppervlakte onder de curve; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vermenging van bloedproducten met coagulopathische P2Y12-remming in het ontvangende monster, waarbij de disfunctie van bloedplaatjes van de patiënt wordt gesimuleerd, in de microfluïdische kamer. (A) Aferese-trombocyteneenheid (plasma, bewaardag 7) (CD41 in cyaan) gemengd in een verhouding van 1:10 met citrerend bloed dat gedurende 30 minuten is voorgeïncubeerd met 0,8 μM Ticagrelor (CD41 in rood). (B) Representatieve genormaliseerde gemiddelde fluorescentie-intensiteitscurven van het bloedmonster van de ontvanger dat ofwel aferese, bloedplaatjeseenheid (opslagdag 5) of autoloog vers volbloed (verhouding 1:10) krijgt, samen met de kinetiek van de bloedplaatjes van de ontvanger in de loop van de tijd. Het gecitreerde bloed van de ontvanger werd gedurende 30 minuten voorgeïncubeerd met 0,8 μM Ticagrelor alvorens te mengen met bloedproducten. (C) Representatief z-stack-beeld van een gemodificeerd apparaat dat is gebonden aan een dekglaasje voor confocale microscopie. Aferese, bloedplaatjesproduct werd gemengd met een trombocytopenisch bloedmonster in een volumetrische verhouding van 1:5 (product:bloed) naast een von Willebrand-factorantilichaam (1:600). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Matlab-code voor beeldanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Aggregometrie van volbloedimpedantie-aggregometrie tijdsafhankelijkheid van P2Y12-remming met Ticagrelor. Incubatie gedurende 30 minuten resulteert in een meer uitgesproken dosis-responsrelatie in vergelijking met 5 minuten. Voertuig- en medicijnoplossingen werden gebruikt tegen 0,1% v/v. Individuele gegevenspunten vertegenwoordigen biologische replicaten en het gemiddelde ± standaarddeviatie wordt weergegeven. Afkortingen: AUC = oppervlakte onder de curve; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Tijdsafhankelijke P2Y12-remming met Ticagrelor in een microfluïdisch model van de bloedplaatjesfunctie. Representatieve MFI-curven en oppervlaktewaarden onder de curve voor technische replicaten van een individuele gezonde donor worden weergegeven met ethanolvehiculum (1% v/v) dat wordt gebruikt voor de oplosbaarheid van geneesmiddelen. Afkortingen: MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; AUC = oppervlakte onder de curve. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het bovenstaande protocol bevat enkele cruciale stappen om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van experimenten te waarborgen. Ten eerste moeten fluorescerende antilichamen zorgvuldig worden overwogen. De antilichamen die worden gebruikt om bloedplaatjes in het monster te detecteren, mogen de functie van de glycoproteïne Ib (GPIb) bloedplaatjesreceptor niet blokkeren. Het matchen van partijen, waar mogelijk tussen experimenten, is ook van cruciaal belang om de reproduceerbaarheid van het fluorescerende signaal te garanderen. Een andere cruciale stap in dit protocol is het gebruik van steriele verbruiksartikelen en oplossingen en gefilterde monsters waar mogelijk. Het filteren van bloedmonsters onmiddellijk voorafgaand aan experimenten voorkomt dat puin of bloedplaatjesklonten die groter zijn dan de kanaalafmetingen de stroom blokkeren, wat een andere kritische parameter is om consistent te blijven tussen experimenten. Bovendien moeten bloedmonsters binnen 4 uur na afname worden getest, zoals beschreven in de informatiecirculaire voor het gebruik van menselijk bloed en bloedbestanddelen opgesteld door AABB, het Amerikaanse Rode Kruis, America's Blood Centers en het Armed Services Blood Program, behalve bij het testen van opslaglaesie van bloedproducten.

In dit protocol kunnen aanpassingen worden overwogen, zoals het hechten van het PDMS aan een dekglaasje voor confocale microscopie, geïllustreerd in Figuur 3C. Indien nodig kan voorafgaand aan de beeldvorming een fixeeroplossing door de kanalen worden geperfundeerd en met PBS worden gewassen voor opslag voorafgaand aan de beeldvorming. Bovendien, hoewel reproduceerbare kanaalafmetingen essentieel zijn om geconserveerde afschuifsnelheden tussen omstandigheden te garanderen, kan de hoogte van het stenotische gebied worden gewijzigd, maar zal dit rechtstreeks van invloed zijn op de timing van trombusvorming, zelfs als deze overeenkomt met afschuifsnelheden. Aangezien grotere kanaalafmetingen meer tijd nodig hebben om substantiële trombusvorming te bereiken, is meer monstervolume nodig. Bij het oplossen van problemen met dit protocol moet de coatingstrategie een belangrijke overweging zijn. Specifiek collageentype, timing, verdunning en opslagcondities zijn allemaal factoren die de oppervlaktelaag kunnen beïnvloeden. Hoewel dit protocol is gevalideerd voor dit specifieke collageenreagens (Table of Materials), kunnen collageenalternatieven die zich betrouwbaar aan het oppervlak van het apparaat kunnen hechten en hechting die is gevalideerd via immunofluorescentiekleuring of andere maatregelen, worden overwogen en eerder met succes door andere groepen zijn gebruikt²⁴.

Een mogelijke beperking van dit protocol is een gebrek aan directe endotheliale respons. Er kunnen echter coatingstrategieën en wijzigingen worden aangebracht om bloedplaatjesfunctietesten op te nemen als reactie op endotheelschade. Ontstekingsfactoren die endotheelcellen afscheiden als reactie op letsel kunnen bijvoorbeeld worden gewijzigd in de coatingstrategie van dit protocol of exogeen worden toegevoegd aan het geteste bloedmonster. De toevoeging van deze factoren zonder de complexiteit van cellularisatie zou een gerichte aanpak mogelijk maken om de effecten van endotheliopathie op de bloedplaatjesfunctie te onderzoeken. Op dezelfde manier kan plasma van patiënten uit ziekte of gezonde controletoestanden in het systeem worden geprikt om de impact van in plasma oplosbare mediatoren op de bloedplaatjesfunctie te testen.

De studie van de bloedplaatjesfunctie onder stroom volgens dit protocol kan de studie van trauma-geïnduceerde coagulopathie en transfusiegeneeskundebenaderingen bij trauma vergemakkelijken. Het huidige testen van de bloedplaatjesfunctie is vaak over- of onderversterkt om een disfunctionele respons bij een traumapatiënt te zien. Deze methode zorgt voor flexibiliteit en ontwerpaanpassingen om de bloedplaatjesfunctie in monsters van traumapatiënten te observeren, zelfs met volumebeperkingen, naast simulatie van bloedplaatjesdisfunctie om therapeutische interventies te beoordelen. Naast de traumapatiënt kan deze methode worden overwogen voor patiënten met een postpartumbloeding, patiënten met een hartoperatie of kankerpatiënten om de functionaliteit van bloedplaatjes en mogelijke therapeutische interventies te beoordelen. Belangrijk is dat deze methode de stromingsdynamiek omvat die van cruciaal belang is voor de mechanismen van de vorming van bloedplaatjesproppen en de hemostatische functie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626