Methodenartikel

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/67237

⸱

11 april 2025

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) heeft een revolutie teweeggebracht in de structurele biologie door de studie van macromoleculaire structuren in bijna-natuurlijke omstandigheden mogelijk te maken, gesuspendeerd in glasachtig ijs. Deze techniek maakt het mogelijk om eiwitten en andere biomoleculen met hoge resolutie te visualiseren zonder dat kristallisatie nodig is, en biedt belangrijke inzichten in hun functie en mechanisme. Recente ontwikkelingen in de analyse van afzonderlijke deeltjes, in combinatie met verbeterde computationele gegevensverwerking, hebben cryo-EM tot een onmisbaar hulpmiddel gemaakt in de moderne structurele biologie. Ondanks de groeiende acceptatie wordt cryo-EM geconfronteerd met aanhoudende uitdagingen die de effectiviteit ervan kunnen beperken, met name een ongelijke deeltjesverdeling. Dit probleem leidt vaak tot een slechte resolutie en verminderde nauwkeurigheid in gereconstrueerde eiwitstructuren. Dit artikel schetst een eenvoudige, praktische aanpak om deze uitdaging aan te gaan, met het kleine heat-shock-eiwit van Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld. De methode optimaliseert de monstervoorbereiding om preferentiële adsorptie te minimaliseren, wat zorgt voor een homogenere deeltjesverdeling en eiwitcryo-EM-structuren van hogere kwaliteit. Deze techniek biedt waardevolle richtlijnen voor onderzoekers die soortgelijke uitdagingen in structurele studies willen overwinnen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met recente ontwikkelingen in zowel instrumenthardware 1,2 als beeldverwerkingssoftware 3,4,5, is cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) naar voren gekomen als een populair en krachtig hulpmiddel in de moderne structurele biologie. Ondanks deze doorbraken blijven er knelpunten bestaan bij het bereiken van macromoleculaire structuren met hoge resolutie met behulp van cryo-EM. Een van die belangrijke uitdagingen is de ongelijke deeltjesverdeling, inclusief het fenomeen van de oriëntatievoorkeur, dat voornamelijk wordt waargenomen op het grensvlak tussen luchten water 6,7,8,9.

Tijdens de vitrificatie van het monster vertonen sommige moleculen de neiging om zich langs specifieke assen op het raster uit te lijnen. Dit leidt tot een ongelijke verdeling van deeltjesweergaven in de uiteindelijke dataset. Bepaalde oriëntaties kunnen oververtegenwoordigd zijn, terwijl andere ondervertegenwoordigd of volledig afwezig zijn, wat resulteert in onvolledige bemonstering van de totale eiwitarchitectuur. Gebieden van het eiwit die bij voorkeur op de elektronenbundel zijn gericht, zullen prominenter verschijnen in de dichtheidskaart, terwijl gebieden die van de bundel af zijn gericht, slecht kunnen zijn opgelost of volledig ontbreken10,11. Bijgevolg introduceert een ongelijke deeltjesverdeling potentiële vertekeningen en artefacten in de uiteindelijke gereconstrueerde driedimensionale (3D) structuur. Met name belangrijke structurele elementen zoals alfa-helices en bètavellen kunnen scheef raken, aminozuur- of nucleotideketens kunnen gefragmenteerd lijken en dichtheden van specifieke eiwit- of nucleïnezuursegmenten kunnen vervorming vertonen12. Uiteindelijk vormen deze verkeerde voorstellingen een grote uitdaging om de structuur en functie van biologische moleculen nauwkeurig te ontrafelen.

Er worden momenteel verschillende experimentele benaderingen gebruikt om dergelijke uitdagingen te overwinnen, waaronder optimalisatie van de monstervoorbereiding 13,14,15, rasterbehandeling 16,17,18,19,20,21,22 en strategie voor gegevensverzameling23. Het wordt met name geadviseerd om de uitdaging waar mogelijk in de monstervoorbereidingsfase aan te gaan7. Veelvoorkomende optimalisaties bij de monstervoorbereiding zijn onder meer het wijzigen van de buffersamenstelling, het introduceren van kleinmoleculaire of macromoleculaire bindingspartners, het genereren van intramoleculaire crosslinks en het variëren van wasmiddelen. Dit geldt ook voor membraaneiwitten24,25, hoewel wasmiddelen specifiek moeten worden gebruikt voor zuiverings- en stabilisatiedoeleinden. De aanpasbaarheid, kosteneffectiviteit en wijdverbreide toegankelijkheid van eiwitbufferoptimalisatie maken het tot een voorkeursstrategie in de meeste laboratoria. Deze aanpak maakt nauwkeurige en onmiddellijke aanpassingen van de verschillende parameters mogelijk om te voldoen aan de specifieke vereisten van elk eiwitmonster. Door iteratieve verfijning kunnen onderzoekers systematisch diverse buffercondities testen en verschillende parameters aanpassen die gericht zijn op het minimaliseren van voorkeursoriëntaties en het verbeteren van de algehele kwaliteit van cryo-EM-gegevens. Het simpelweg variëren van eiwitbuffercomponenten en het aanpassen van hun concentraties heeft aangetoond dat ze effectief zijn bij het beïnvloeden van de eiwitstabiliteit door de oppervlaktelading te moduleren, waardoor het eiwitgedrag in glasachtig ijs wordt beïnvloed25. Daarom wordt het optimaliseren van de samenstelling van eiwitbuffers beschouwd als een van de handigste en meest ongecompliceerde benaderingen voor het aanpakken van veelvoorkomende uitdagingen in cryo-EM.

Hier wordt een protocol voorgesteld voor het aanpakken van een veelvoorkomend obstakel in cryo-EM: het overwinnen van een ongelijke deeltjesverdeling. In dit protocol worden de belangrijkste procedures voor eiwitbereiding en bufferscreening, aangevuld met roostervoorbereiding, geschetst met behulp van een klein heat shock-eiwit van Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)26 als casestudy (Figuur 1). Deze sHSP is van nature stabiel, heeft een molecuulmassa van 16,5 kDa per monomeer en assembleert zich tot een 24-mer octaëdrische kooi26,27, waardoor het een aantrekkelijke kandidaat is voor structurele analyse door cryo-EM. De waarneming van een ongelijke deeltjesverdeling tijdens het verzamelen van cryo-EM-gegevens werd echter niet verwacht en kwam tijdens de experimenten naar voren als een belangrijke uitdaging. Verder worden mogelijke benaderingen besproken die gunstig zijn voor onderzoekers die soortgelijke uitdagingen aanpakken, waardoor de efficiënte opheldering van macromoleculaire structuren met behulp van cryo-EM wordt vergemakkelijkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Eiwitzuivering

  1. Induceer expressie van recombinant MjsHSP16.5 in E. coli BL21 (DE3) en zuiver het eiwit met behulp van een nikkelchelaatchromatografiekolom zoals eerder beschreven26. Na zuivering op een grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) kolom26, onderzoekt u de eiwitzuiverheid door 5 μL piekfracties op een 12,5% SDS-PAGE-gel te laden en te visualiseren met standaard Coomassie blauwe kleuring28 (Figuur 2).
  2. Concentreer de poolfracties met MjsHSP16.5 bij 4 °C tot ongeveer 65 mg/ml met behulp van centrifugaalfilters met een grenswaarde van 50 kDa voor het moleculair gewicht, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Piket tijdens het centrifugeren elke 5 minuten voorzichtig de eiwitoplossing om eiwitaggregatie te voorkomen.
  3. Centrifugeer het monster na concentratie bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om aggregaten te verwijderen, verdeel het bovenstaande in volumes van 50 μl in dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml, vries de buisjes snel in vloeibare stikstof in en bewaar de monsters bij -80 °C tot verder gebruik.

2. Eiwitpreparaat voor beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

  1. Ontdooi twee bevroren eiwitbuisjes op ijs. Eenmaal ontdooid, mengt u de oplossing voorzichtig door de buis meerdere keren aan te tikken om homogeniteit te garanderen en centrifugeert u de eiwitoplossing gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 16.000 × g om aggregaten te verwijderen.
  2. Injecteer het bovenstaande op een SEC-kolom en verzamel 0,5 ml elutiefracties.
  3. Verzamel de elutiefracties die overeenkomen met de piek met de hoogste UV-absorptie bij 280 nm en meet de eiwitconcentratie in deze fracties met behulp van de Bradford-test29.
    OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat er voldoende eiwitconcentratie is in een enkele piekfractie voor de downstream-toepassingen, is het noodzakelijk om een grote hoeveelheid eiwitmonster op de SEC-kolom te laden terwijl het binnen de aanbevolen capaciteit van de kolom blijft.

3. Buffer uitwisseling

  1. Bereid de gewenste bufferoplossing (9 mM MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM NaCl en 0,1 mM EDTA), verdeel de buffers in bekers van 50 ml en houd de bufferbekers op 4 °C.
    OPMERKING: Bereid op basis van voorkennis van de biochemie van het doeleiwit een verscheidenheid aan bufferoplossingen met verschillende samenstellingen (buffertypes, pH en ionsterkte), zoals 20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl en 0-5 mM DTT, om de omstandigheden te identificeren die een optimale oplosbaarheid, homogeniteit en stabiliteit van eiwitten bevorderen bij de voorbereiding van het stroomafwaartse rooster.
  2. Bereid het dialysemembraan voor volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  3. Knip het dialysemembraan met een schaar in stukken van 30 mm x 30 mm. Breng deze membranen in evenwicht door ze te incuberen in gedestilleerd water of bufferoplossingen (Figuur 3A).
  4. Voeg 55 μl van de eiwitoplossing (ongeveer 2,5 mg/ml) toe aan de kamer met 50-μl microdialyseknoppen (figuur 3B).
  5. Houd het dialysemembraan verticaal met een tang en raak een rand van het membraan voorzichtig aan tegen tissuepapier om overtollig vocht af te tappen (Figuur 3C). Bedek de microdialyseknop voorzichtig met het membraan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de microdialysekamer worden gebracht (Figuur 3D). Plaats de O-ring bovenop het dialysemembraan. Rol de O-ring voorzichtig in de groef aan de rand van de knop.
  6. Alternatieve methode: Plaats de O-ring langs de as van een golftee en plaats de golftee ondersteboven op het membraan (Figuur 3E). Schuif de O-ring voorzichtig langs de golftee naar beneden totdat deze op de rand van de knop glijdt (Afbeelding 3F). Leid de O-ring voorzichtig in de groef aan de rand van de knop (Figuur 3G).
  7. Dompel elke dialyseknop onder in een afzonderlijk bekerglas met de bestemmingsbuffer met de membraanzijde naar boven (figuur 3H).
  8. Houd de bekers tijdens het dialyseproces op 4 °C. Vervang de dialysebuffer na 2 uur en ga 's nachts door met dialyse.
  9. Gebruik een spuit met een fijne naald (bijv. Hamilton-spuit of insulinespuit) om het membraan voorzichtig te ponsen en de eiwitoplossing uit de microdialysekamer te halen (Figuur 3I). Bewaar het eiwitmonster in een microcentrifugebuisje op ijs tot verder gebruik. Meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test29.

4. Voorbereiding van het rooster

  1. Kies het juiste rastertype.
    OPMERKING: Amorfe holle koolstoffilm op een koperen drager wordt vaak gebruikt. De dikte van de koolstoffilm, de grootte van de gaten en het aantal mazen moeten worden gekozen op basis van de gewenste ijsdikte. Holey carbon-gecoate roosters werden gebruikt voor de monstervoorbereiding van MjsHSP16.5.
  2. Pak de roosters voorzichtig aan de randen vast met een pincet om beschadiging van de roostergaten te voorkomen. Plaats de roosters op een roosterhouder met de carbonkant naar boven. Plaats de roosterhouder in de kamer van het gloeiontladingssysteem.
  3. Voer gloeiontlading uit gedurende 60 s bij 15 mA om het rooster hydrofiel te maken. Het wordt aanbevolen om tijdens dit proces een negatieve lading toe te passen.
    OPMERKING: De aanbevolen parameters dienen als uitgangspunt voor het gloeiontladingssysteem dat in dit onderzoek wordt gebruikt. Optimalisatie kan nodig zijn, afhankelijk van het type gloeiontladingsinstrument en om het gewenste niveau van hydrofiliciteit voor specifieke roostermaterialen te bereiken. Overweeg voor plasmareiniging om alternatieve gassen of gasmengsels zoals waterstof of argon-zuurstofmengsels te testen.
  4. Optionele stap: introduceer extra chemische oplossingen, zoals 99% amylamine in een open glazen fles, in een kamer naast de roosterhouder om specifiek een netto positieve lading op het rooster te produceren.
  5. Gebruik de geloosde roosters binnen 0,5-1 uur om optimale prestaties te garanderen.

5. Voorbereiding van het negatieve vlekkenrooster

  1. Laad 5 μL van het monster (50-300 nM of 20-120 ng/ml) op het gloeiontladen. Laat het monster 1 minuut ongestoord op het roosteroppervlak rusten om de bezinking van eiwitten te vergemakkelijken.
  2. Bereid drie waterdruppels van elk 50 μL op een vel paraffinefilm. Was het monster voorzichtig op het rooster door het roosteroppervlak tegen het oppervlak van de eerste waterdruppel te wrijven. Herhaal de wasstap met de resterende twee waterdruppels.
    OPMERKING: De wastijden kunnen worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke vereisten van elk experiment.
  3. Laad 5 μL van de gefilterde 1% (m/v) uranylacetaatoplossing op het rooster en pipetteer de uranylacetaatoplossing onmiddellijk weg.
  4. Laad nog eens 5 μL van de 1% (m/v) uranylacetaatoplossing op het rooster. Laat het rooster 90 s incuberen in de uranylacetaatoplossing om te kleuren.
    OPMERKING: De kleuringstijd kan worden aangepast en geoptimaliseerd op basis van specifieke monsters.
  5. Raak de pincetzijde van het rooster voorzichtig aan met filterpapier om overtollige vlekkenoplossing te verwijderen. Laat het rooster volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Bewaar het gedroogde rooster in een roosterbak bij kamertemperatuur tot observatie.

6. Voorbeeld vitrificatie

  1. Verdun het eiwitmonster tot de gewenste concentratie.
    OPMERKING: De eiwitconcentratie moet hoog genoeg zijn om het aantal deeltjes in elk gat te maximaliseren, maar laag genoeg om de verdeling van afzonderlijke deeltjes te garanderen. Cryo-EM-eiwitconcentraties variëren doorgaans van 0,5 tot 2 mg/ml. Bepaalde eiwitten kunnen echter, afhankelijk van hun molecuulgewicht en specifieke omstandigheden voor de voorbereiding van monsters, concentraties buiten dit bereik vereisen.
  2. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C om eventuele aggregaten te verwijderen.
  3. Zet het invalbevriezingsinstrument aan. Vul het reservoir van de luchtbevochtiger met gedestilleerd water. Monteer filterpapier met ringen op blot pads. Stel de parameters voor vitrificatie in (temperatuur: 4 °C, vochtigheid: 100%, vlektijd: 6 s, vlekkracht: 5 eenheden, wachttijd: 10 s).
    OPMERKING: Vlektijd en kracht zijn belangrijke parameters voor de optimalisatie van het vitrificatieapparaat, aangezien waterverwijdering uit het rooster en blootstelling van deeltjes aan de lucht-waterinterface dissociatie of oriëntatiebias kunnen veroorzaken.
  4. Monteer de componenten van de cryogene container, inclusief de messing beker, de roosterhouder, de spineenheid en de anti-besmettingsring, in de basislade. Koel de container af door de bak te vullen met vloeibare stikstof. Vul de messing beker met cryogeen (vloeibaar ethaan). Verwijder de spineenheid zodra het cryogeen de smelttemperatuur heeft bereikt.
  5. Monteer het pincet en het rooster op het instrument, laad het monster (meestal 4 μL) op de koolstofzijde van het rooster en start het dompelbevriezingsproces.
  6. Koppel het pincet voorzichtig los van het instrument, plaats het rooster op een opbergdoos en sluit de doos af met het deksel. Bewaar de roosterdoos met de verglaasde monsters in vloeibare stikstof.

7. Laden van de roosters naar TEM

  1. Zet het autogrid-assemblagestation in elkaar en koel het af met vloeibare stikstof.
  2. Plaats de roosterdoos met verglaasde roosters en schroef het deksel voorzichtig los om toegang te krijgen tot de roosters. Plaats een lege autogrid-opslagdoos in de buurt voor gemakkelijke overdracht van gemonteerde roosters.
  3. Plaats de autogrid-ring in de daarvoor bestemde uitsparing voor de ring op het montagestation. Haal het verglaasde rooster voorzichtig uit de rasterdoos en plaats het in de autogrid-ring. Zorg ervoor dat het rooster en de ring zijn uitgelijnd.
  4. Lijn de schijf uit om de cirkelopening bovenop de autogrid-ring en het raster te plaatsen. Om het raster in de autogrid-ring te bevestigen, plaatst u het C-clip-insteekgereedschap bovenop het raster en drukt u het voorzichtig naar beneden om de C-clip erin te klikken.
  5. Draai de schijf terug en verplaats de gemonteerde roosters naar de autogrid-opbergdoos.
  6. Zet het cassettelaadstation in elkaar en koel het laadstation af met vloeibare stikstof.
  7. Plaats de autogrid opbergbox in het laadstation. Verplaats het rooster van de autogrid-opbergdoos naar de cassette en tik zachtjes op het rooster om de juiste plaatsing te garanderen.
  8. Gebruik het handvat om de cassette in de autoloader-capsule te plaatsen. Controleer de pin in de autoloader om te bevestigen dat deze vrij kan bewegen en zorg ervoor dat deze niet vastzit.
  9. Koppel de autoloader-capsule aan de TEM voor rasterobservatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om optimale roostercondities voor MjsHSP16.5 te identificeren, werd een eerste cryo-EM-screening uitgevoerd, voornamelijk gericht op het onderzoeken van verschillende eiwitbuffercondities: (1) de uiteindelijke zuiveringsbuffer, die de stabiliteit en homogeniteit van MjsHSP16.5 garandeert en belangrijk is voor de kristallisatie30; (2) buffers aangepast aan de omstandigheden die nodig zijn voor de groei van MjsHSP16.5-kristallen van hoge diffractiekwaliteit

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle eiwitstructuurstudies beginnen met eiwitzuivering, een iteratief proces om een evenwicht te bereiken tussen het isoleren van eiwitdoelen met een hoge zuiverheid en homogeniteit met behoud van hun oorspronkelijke functionaliteit. Hoewel de buffersamenstellingen om eiwitmonsters te zuiveren en te bewaren zorgvuldig worden geselecteerd tijdens het zuiveringsproces, vormen deze buffers vaak een uitdaging tijdens de daaropvolgende cryo-EM-monstervoorbereiding en beeldvorming

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Cooperative Center for Research Facilities (CCRF) (Sungkyunkwan University, Korea) voor het genereus verlenen van toegang tot hun cryo-EM-faciliteit. Dit werk werd ondersteund door de subsidie van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIT) aan K.K.K. (Nr. 2021M3A9I4022936). Het gebruik van cryo-EM-faciliteiten van het NEXUS-consortium werd ondersteund door een subsidie van de National Research Foundation of Korea, RS-2024-00440289.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14-mL Round Bottom TubeSPL Life Sciences40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTNHamilton81100Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis ButtonHampton ResearchHR3-326
50-mL Glass BeakerDIAMONDHA.1010D.50
ÄKTA pure 25 LCytiva29018224FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitMilliporeUFC90502450-KDa NMWL
Bradford ReagentSupelcoB6916
Dumoxel Style N5Dumont0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgCytiva28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mLHD MicroH23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat capAxygenPCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unitTed Pella91000
PELCO TEM grid holder blockTed Pella16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, CuElectron Microscopy SciencesQ2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific086705B3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GLCytiva29091596
Uranyl acetateMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and DetergentsThermoFisher ScientificA49856

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0. Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  4. Punjani, A., Fleet, D. J. 3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em. Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).
  5. Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models. Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).
  6. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and "visual proteomics". Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).
  7. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).
  8. Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. Challenges in making ideal cryo-Em samples. Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).
  9. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis. J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  10. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nat Commun. 8 (1), 629(2017).
  11. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  12. Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning. Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).
  13. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).
  14. Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).
  15. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  16. Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core. Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).
  17. Nguyen, T. H. D., et al. Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution. Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).
  18. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).
  19. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids. J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).
  20. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).
  21. Patel, A. B., et al. Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA. Science. 362 (6421), eaau8872(2018).
  22. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).
  23. Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  25. Xu, Y., Dang, S. Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em. Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).
  26. Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii. Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).
  27. Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).
  28. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J Vis Exp. (16), e758(2008).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Kim, K. K., et al. crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).
  31. Kim, R., et al. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).
  32. Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding. J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).
  33. Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).
  34. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).
  35. Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).
  36. D'arcy, A. Crystallizing proteins - A rational approach. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).
  37. Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).
  38. Zhang, C. Y., et al. A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).
  39. Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).
  40. Michon, B., et al. Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation. Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).
  41. Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM. Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).
  42. Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective. Q Rev Biophys. 49, e13(2016).
  43. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  44. Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR. J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).
  45. Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy. J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).
  46. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  47. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  48. Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. Cryo-EM: Beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van individuele deeltjesvisualisatie van eiwitstructurentransmissie elektronenmicroscopieplunge vriezengrootte uitsluitingschromatografiedialysemembraandeeltjesdistributieglow discharge raster

Gerelateerde artikelen