Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Summary

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Abstract

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) heeft een revolutie teweeggebracht in de structurele biologie door de studie van macromoleculaire structuren in bijna-natuurlijke omstandigheden mogelijk te maken, gesuspendeerd in glasachtig ijs. Deze techniek maakt het mogelijk om eiwitten en andere biomoleculen met hoge resolutie te visualiseren zonder dat kristallisatie nodig is, en biedt belangrijke inzichten in hun functie en mechanisme. Recente ontwikkelingen in de analyse van afzonderlijke deeltjes, in combinatie met verbeterde computationele gegevensverwerking, hebben cryo-EM tot een onmisbaar hulpmiddel gemaakt in de moderne structurele biologie. Ondanks de groeiende acceptatie wordt cryo-EM geconfronteerd met aanhoudende uitdagingen die de effectiviteit ervan kunnen beperken, met name een ongelijke deeltjesverdeling. Dit probleem leidt vaak tot een slechte resolutie en verminderde nauwkeurigheid in gereconstrueerde eiwitstructuren. Dit artikel schetst een eenvoudige, praktische aanpak om deze uitdaging aan te gaan, met het kleine heat-shock-eiwit van Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld. De methode optimaliseert de monstervoorbereiding om preferentiële adsorptie te minimaliseren, wat zorgt voor een homogenere deeltjesverdeling en eiwitcryo-EM-structuren van hogere kwaliteit. Deze techniek biedt waardevolle richtlijnen voor onderzoekers die soortgelijke uitdagingen in structurele studies willen overwinnen.

Introduction

Met recente ontwikkelingen in zowel instrumenthardware ^1,2 als beeldverwerkingssoftware ^3,4,5, is cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) naar voren gekomen als een populair en krachtig hulpmiddel in de moderne structurele biologie. Ondanks deze doorbraken blijven er knelpunten bestaan bij het bereiken van macromoleculaire structuren met hoge resolutie met behulp van cryo-EM. Een van die belangrijke uitdagingen is de ongelijke deeltjesverdeling, inclusief het fenomeen van de oriëntat....

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Eiwitzuivering

1. Induceer expressie van recombinant MjsHSP16.5 in E. coli BL21 (DE3) en zuiver het eiwit met behulp van een nikkelchelaatchromatografiekolom zoals eerder beschreven²⁶. Na zuivering op een grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) kolom²⁶, onderzoekt u de eiwitzuiverheid door 5 μL piekfracties op een 12,5% SDS-PAGE-gel te laden en te visualiseren met standaard Coomassie blauwe....

Results

Om optimale roostercondities voor MjsHSP16.5 te identificeren, werd een eerste cryo-EM-screening uitgevoerd, voornamelijk gericht op het onderzoeken van verschillende eiwitbuffercondities: (1) de uiteindelijke zuiveringsbuffer, die de stabiliteit en homogeniteit van MjsHSP16.5 garandeert en belangrijk is voor de kristallisatie³⁰; (2) buffers aangepast aan de omstandigheden die nodig zijn voor de groei van MjsHSP16.5-kristallen van hoge diffractiekwaliteit

Discussion

Alle eiwitstructuurstudies beginnen met eiwitzuivering, een iteratief proces om een evenwicht te bereiken tussen het isoleren van eiwitdoelen met een hoge zuiverheid en homogeniteit met behoud van hun oorspronkelijke functionaliteit. Hoewel de buffersamenstellingen om eiwitmonsters te zuiveren en te bewaren zorgvuldig worden geselecteerd tijdens het zuiveringsproces, vormen deze buffers vaak een uitdaging tijdens de daaropvolgende cryo-EM-monstervoorbereiding en beeldvorming

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL Round Bottom Tube	SPL Life Sciences	40114
250 µL Gastight Syringe Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Cemented Needle, 22s gauge, 2 in, point style 2
50 µL Dialysis Button	Hampton Research	HR3-326
50-mL Glass Beaker	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagent	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuge Tube 1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR Tubes 0.2 mL, flat cap	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM grid holder block	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Uranyl acetate	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Buffer Screening Kit and Detergents	ThermoFisher Scientific	A49856