Methodenartikel

Equine Enteric Glial Culture en toepassing op de studie van een neuraal inflammatoir mechanisme bij paardenkoliek

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

4 oktober 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

In dit artikel

Samenvatting

Enterische glia worden steeds meer erkend voor hun rol in intestinale homeostase en ziekteprocessen, inclusief postoperatieve complicaties. Paardenpatiënten die herstellen van een verkennende laparotomie in noodgevallen lijden aan een hoog risico op inflammatoire postoperatieve aandoeningen, wat het belang benadrukt van het opzetten van herhaalbare primaire celcultuur van paardendarmglia voor onderzoek.

Samenvatting

Inflammatoire postoperatieve aandoeningen van paardenkoliek (acute buik) dragen niet alleen bij aan hogere klantkosten, ongemak voor de patiënt en ziekenhuisopnametijd, maar blijken in veel gevallen levensbedreigend te zijn. Een unieke populatie darmcellen, enterische glia, wordt steeds meer erkend voor hun rol bij het waarnemen van het gastro-intestinale milieu en de communicatie met omliggende celtypen. Interacties tussen enterische glia en intestinale epitheel kunnen van cruciaal belang zijn bij het vaststellen hoe enterische glia bij paarden de slijmvliesbarrière kan veranderen om ontstekingen in gezondheid en koliek te moduleren.

Om deze interactie te bestuderen, presenteren we een methode om primaire enterische gliaculturen van paarden uit paardenjejunum te creëren en de culturen bloot te stellen aan ontstekingsaandoeningen waarvan bekend is dat ze aanwezig zijn bij koliek. Primaire enterische gliaculturen werden verkregen van volwassen paarden die werden geëuthanaseerd om redenen die geen verband hielden met koliek. Darmvlokken en lamina propria werden micro-ontleed om de submucosa bloot te leggen. De geïsoleerde submucosa onderging gedurende 2-3 uur enzymatische vertering met collagenase, protease en runderserumalbumine. Vervolgens leverde mechanische vergisting met centrifugeren, pipetteren en celzeven (40-100 μm) een pellet op die werd gebruikt voor het plateren op 0,05 mg/ml poly-L-lysine-gecoate putjes met een concentratie van ~400.000 cellen/300 μL media.

Na confluentie en eerste passage werden de enterische gliacellen vervolgens gedurende 24 uur blootgesteld aan equine recombinant IL-1β (0, 10, 25 ng). Om epitheel-gliale interacties op het moment van koliek te modelleren, werd medium geconditioneerd door controle- of behandelde darmglia rechtstreeks toegevoegd aan confluente equine jejunale monolagen terwijl transepitheliale elektrische weerstand (TEER) werd gemeten met behulp van een EndOhm-kamer met dubbele elektrode. Deze gegevens tonen slechts een van de vele potentieel impactvolle toepassingen van enterische gliacultuur bij paarden.

Inleiding

Paardenkoliek is de meest voorkomende medische klacht voor spoedeisende hulp1. Met tot 17% van die paarden die chirurgische correctie nodig hebben, moeten inspanningen om de postoperatieve resultaten te verbeteren voorop staan in medisch onderzoek bij paarden. Momenteel ervaren postoperatieve koliekpatiënten een hoog risico op verschillende levensbedreigende aandoeningen, waaronder sepsis/endotoxemische shock (12,3% van de patiënten) en postoperatieve ileus (13,7% van de patiënten)3. Ondanks de vooruitgang in de behandeling van postoperatieve complicaties, blijft er behoefte aan geavanceerde behandelingen om deze aandoeningen te voorkomen of te behandelen.

Recent onderzoek heeft de lokale en systemische ontstekingsstatus vankoliekpatiënten aan het licht gebracht. Van pro-inflammatoire eiwitten zoals tumornecrosefactor (TNF) alfa, interleukine 1β (IL-1β), interleukine 6 (IL-6) en monocyt-chemoattractant proteïne-1 is bijvoorbeeld aangetoond dat ze allemaal significant verhoogd zijn in expressie in koliek darmslijmvlies versus normaal darmweefsel4. Vanuit systemisch oogpunt is aangetoond dat een verhoogd TNF-alfa in het darmweefsel gecorreleerd is met een verhoogd risico op postoperatieve nasogastrische reflux van meer dan 2 l, een algemene meting van postoperatieve dysmotiliteit4. Het is ook bekend dat de toediening van interleukine IL-1β en TNF-alfa in staat is om klinische tekenen van septische shock te induceren5.

Een mogelijke verklaring voor de inflammatoire status van koliek darmweefsel en het verband met postoperatieve complicaties is de darmepitheelbarrière. In de gezondheidszorg vormen de tight junction-complexen die de enkele laag zuilvormig epitheel verbinden die het darmkanaal bekleedt, een functionele barrière om te voorkomen dat de luminale inhoud en de bacteriële componenten ervan de submucosale ruimte en de bloedbaan bereiken. De uitzetting en schade veroorzaakt door koliek-geassocieerde darmobstructie en darmmanipulatie tijdens de operatie kunnen deze darmbarrièrefunctie echter verstoren.

In termen van de functionele componenten van de darmwand als geheel, is aangetoond dat het submucosale enterische glianetwerk binnen het enterische zenuwstelsel cruciaal is voor de pathofysiologische ontwikkeling van postoperatieve complicaties die verband houden met ontstekingsroutes en een specifiek therapeutisch doelwit kan bieden 6,7,8,9 . Enterische glia zijn niet alleen aanwezig in het hele maagdarmkanaal, maar ze fungeren ook als sensoren van het darmmilieu, beïnvloeden de signalering met tal van celtypen van de darmwand en reguleren direct de darmbarrière6. Het is daarom gerechtvaardigd om aan te nemen dat deze krachtige sensoren van de darm zouden worden geactiveerd door letsel en ontsteking en een acute reactie zouden kunnen veroorzaken, zoals veranderingen in de barrièrepermeabiliteit.

Deze studie is de eerste die de cultuur van enterische glia bij paarden beschrijft en, meer specifiek, de rol van inflammatoire enterische glia bij paarden op de darmbarrièrefunctie. Hier presenteren we methoden voor de primaire kweek van submucosale darmglia bij paarden en hun reactie op blootstelling aan inflammatoire IL-1β, evaluatie van het effect van enterische gliaproducten na blootstelling aan IL-1β op de permeabiliteit van monolagen van enterocyten bij paarden, en mogelijke blokkade door de toepassing van paardenserum.

Protocol

Equine enterische glia primaire culturen werden verkregen van drie paarden die op humane wijze waren geëuthanaseerd met een overdosis van een barbituraat om redenen die geen verband hielden met deze studie. De paarden die voor de kweekstudies werden geselecteerd, waren volwassen paarden zonder actuele voorgeschiedenis van gastro-intestinale aandoeningen.

1. Submucosale equine enterische glia primaire cultuur

  1. Kweek epitheliale monolagen van paarden uit jejunale crypten verkregen van drie afzonderlijke volwassen paardenpaarden.
    1. Smeer 24-wells platen in met coatingoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C of een nacht bij kamertemperatuur, was ze 2x met steriel water en bewaar ze bij kamertemperatuur totdat de cellen klaar zijn om te worden geplateerd.
    2. Verwijder na humane euthanasie binnen 60 minuten een deel van het jejunum en plaats het in koude Ringer's oplossing op ijs.
    3. Verwijder een deel van 10 cm van het jejunum en open het bij de antimesenteriale grens om niet-lymfoïde gebieden in het midden van het weefsel te houden. Snijd het gedeelte bij tot een gedeelte van ongeveer 7 cm x 7 cm. Spoel het weefsel goed af in verse Ringer's oplossing voordat u het verdeelt.
    4. Speld het weefsel op een met siliconenelastomeer beklede petrischaal in een koude Ringer-oplossing of met de PBS-slijmvlieszijde naar boven en rek het weefsel zo veel mogelijk uit (Figuur 1A).
    5. Verwijder de darmvlokken met een gebogen pincet (Figuur 1B) gevolgd door de lamina propria-laag uit het niet-lymfoïde gebied van ongeveer 5 cm x 5 cm (Figuur 1C).
      OPMERKING: Deze lagen komen gemakkelijk los van de submucosa (Figuur 1B).
    6. Verwijder de submucosa in één vel door deze los te maken met een microdissectieschaar in een hoek en observeer de natuurlijke scheiding terwijl u de submucosa lospelt van de binnenste cirkelvormige spierlaag van het jejunum (Figuur 1D).
    7. Hak de verzamelde submucosale laag in stukjes van 2-5 mm en plaats ze in een kegelvormige buis van 50 ml met 5 ml "Organo-FBS" (tabel 1), 0,825 mg collagenase, 5 mg protease en 20 mg runderserumalbumine. Incubeer het weefsel gedurende 2-3 uur bij 37 °C voor enzymatische vertering.
    8. Voeg na incubatie 10 ml "Organo + FBS" op kamertemperatuur toe om de enzymwerking te stoppen. Pipeteer het weefselmengsel ongeveer 15x op en neer met een serologische pipet van 10 ml om cellen van het weefsel te dissociëren en centrifugeer vervolgens bij 3.000 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met 10 ml PBS op kamertemperatuur door ongeveer 15x op en neer te pipetteren met een serologische pipet van 10 ml om de cellen van het weefsel te dissociëren.
    10. Centrifugeer de conische buis bij 3.000 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met 10 ml "Organo + FBS" op kamertemperatuur door ongeveer 15x op en neer te pipetteren met een serologische pipet van 10 ml om cellen van het weefsel te scheiden.
    11. Filtreer de cellen serieel door een celzeef van 100 μm, 70 μm en vervolgens een celzeef van 40 μm ter grootte van een porie.
    12. Centrifugeer de gefilterde cellen en media bij 3.000 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en repareer de pellet in 1 ml "Organo + FBS".
    13. Kleur met trypanblauw om levende cellen te identificeren en tel ze met een hemocytometer.
    14. Zaai ongeveer 400.000 cellen in 300 μL "Organo + FBS" in elk putje van een plaat met 24 putjes en voeg groeifactoren toe aan elk putje: N2 5 μL/putje, G5 5 μL/putje en B27 10 μL/putje. Plaats de plaat met 24 putjes in een incubator van 37 °C met 5% CO2 om de cellen te laten hechten. Verander vierentwintig uur later de media in "glia media" (Tabel 1) met de bovenstaande groeifactoren en verander elke 48 uur (Figuur 2).

2. Immunofluorescerende cytologie

  1. Kweek de enterische gliacellen uit de primaire cultuur (P0) (stap 2.1.14) tot 70-80% samenvloeiing en passeer ze één keer (P1).
  2. Fixeer de primaire cultuur (P0) cellen in de putjes met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten voorafgaand aan de toepassing van 0,1% PBS-azide.
  3. Bereid een verzadigingsoplossing bestaande uit PBS-azide, 4% ezelinnenserum en 0,5% Triton-X. Voeg 300 μL verzadigingsoplossing toe aan de putjes om de cellen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur te permeabiliseren.
  4. Voeg het primaire antilichaam voor de gliamarker, gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), en het primaire antilichaam voor de fibroblastmarker, alfa-gladde spieractine, toe in verdunningen van 1:1.000 in verzadigingsoplossing voor nachtelijke incubatie bij 4 °C.
  5. Was 3x met PBS voordat u secundair antilichaam voor ezel anti-konijn IgG Alexa Fluor 594 en geit anti-muis IgG Alexa Flour 488 toevoegt in een verdunning van 1:500 in verzadigingsoplossing gedurende 2-3 uur.
  6. Kleuring van de kernen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in een verdunning van 1:1,000 in PBS gedurende 5 minuten.
  7. Bewaar de cellen na drie wasbeurten met PBS in 0,1% PBS-azide.

3. Submucosale blootstelling aan enterische glia van de darmglia van de primaire cultuur IL-1β

  1. Wanneer cellen uit de eerste passage (P1) 70-80% samenvloeiing bereiken, voert u het IL-1β-blootstellingsexperiment uit. Stel de putjes gedurende 24 uur bloot aan 0 ng, 10 ng en 25 ng IL-1β. Bewaar na 24 uur de media uit elke put bij -80 °C.

4. Equine organoïde cultuur voor de productie van enterocyt monolagen

OPMERKING: Volgens het protocol van Stewart et al. dat in 2018 werd gepubliceerd, werden de ingewanden en knoppen van paarden die waren gecryobankt, uitgebreid voor 2D-enteroïde studies10.

  1. Gebruik ongeveer 700-1.000 knoppen/cryptefragmenten (40.000-50.000 cellen wanneer gedissocieerd in enkele cellen) per transwell-insert. Smeer de transwell-inzetstukken in met 42 μl 0,05% Matrigel voordat de enterocyten worden toegevoegd. Laat de Matrigel op de insert worden gefixeerd door gedurende 1 uur bij 37 °C. Zuig het extra medium op en laat de transwells 30 minuten onafgedekt drogen. Voeg 200 μL DMEM-F12 medium toe aan elke transwell-insert en bewaar de plaat bij 37 °C tot gebruik.
  2. Was de Matrigel-pasteitjes met de organoïden met PBS en stel ze vervolgens bloot aan 500 μL celherstel terwijl ze op ijs liggen. Pipeteer ze herhaaldelijk om ervoor te zorgen dat de cellen volledig in een buisje van 15 ml zijn verzameld.
  3. Centrifugeer de buis bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C., verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet in het doelvolume van het medium van de intestinale epitheelstamcel (IESC). Bereken het doelvolume door het gewenste aantal monolagen te vermenigvuldigen met 200 μL medium. (Tabel 1).
  4. Smeer een spuit van 1 ml voor op IESC-media en zuig de celsuspensie op via een naald van 16 G. Vervang de naald van 16 G door een naald van 28 G en werp de celsuspensie erdoorheen om de scheiding van de organoïden te bevorderen.
  5. Plaats 200 μl van de resulterende celsuspensie in de apicale zijde van de gecoate transwells en 500 μl IESC en eerder beschreven groeifactoren op de basale zijde van de transwell-insert10. Verander de media en groeifactoren elke 24-48 uur totdat de samenvloeiing is bereikt. Definieer confluentie als de celdichtheid die overeenkomt met een TEER van 1,000 ohmsxcm 2,11. Voor meting, zie stap 5.1.

5. Permeabiliteit van de monolaag van enterocyten bij paarden na blootstelling aan inflammatoire cytokines en enterische gliaproducten bij paarden

  1. Gebruik een TEER-meetkamer met dubbele elektrode om de TEER over de monolagen te kwantificeren en een basismeting vast te stellen over elk transwell permeabel membraan. Zorg ervoor dat de IESC-media en transwell 15 minuten de tijd hebben om op kamertemperatuur te komen voordat ze metingen uitvoeren. Vul de kweekbeker met 1,5 ml IESC-media en zorg ervoor dat er precies 200 μL media aanwezig is in het transwell-inzetstuk, zodat de vloeistofleidingen overeenkomen op het moment van meting.
  2. Stel het basolaterale aspect van de transwell-inserts bloot aan inflammatoire cytokines van 25 ng IL-1β, 10 ng en 25 ng interleukine 6 (IL-6) per putje, of gliaproducten van culturen die zijn blootgesteld aan 10 ng of 25 ng IL-1β. Stel het basolaterale aspect van de controletranswell-inserts bloot aan gliamedia en gliamedia uit culturen die niet zijn blootgesteld aan IL-1β.
  3. Meet de TEER gedurende 45 minuten met tussenpozen van 10-15 minuten door elke transwell in de kweekbeker te plaatsen.

6. Statistieken

  1. Bereken de vouwverandering van de TEER van elke transwell voor de tijdstippen: 0, 10, 20, 30 en 45 min.
  2. Vergelijk met behulp van de software naar keuze (zie Materiaaltabel) de correlaties tussen verminderde TEER en basolaterale blootstelling aan IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng en 100 ng) en gliamedia (blootgesteld aan 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β en 25 ng IL-1β) om media te controleren met behulp van een ongepaarde eenzijdige t-test.

Resultaten

Microdissectie van het jejunum van paarden naar de submucosale laag (figuur 1) met verdere enzymatische en mechanische vergisting, zou levensvatbare celculturen van enterische glia bij paarden kunnen produceren. De cellen vertoonden een pleomorfisme met een dominantie van spoelvormige cellen die consistent waren met de enterische glia van andere soorten (Figuur 2A). De culturen waren positief voor de selectieve gliamarker, gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), met een lage fibroblastbesmetting (alfa SMA, figuur 2B). In sommige gevallen werd de microdissectie van de submucosale lagen niet in voldoende mate gecontroleerd en werden culturen besmet met hoge percentages fibroblasten die werden waargenomen door immunofluorescentie van fibroblastmarker gladde spieractine (figuur 3).

Vervolgens, als voorbeeld van het nut van enterische gliacultuur bij paarden, werd de impact van IL-1β-blootgestelde enterische glia op de intestinale epitheliale barrièrefunctie beoordeeld. Basolaterale blootstelling aan media van equine submucosale enterische gliacultuur blootgesteld aan 10 ng en 25 ng IL-1β gedurende 24 uur verhoogde de permeabiliteit significant (p = 0,05 en 0,04, respectievelijk, gemiddelde van controlemedia = 0,9, gemiddelde van gliale 10 ng IL-1β-groep = 0,8, 95%-betrouwbaarheidsinterval = -0,2 tot 0,02, gemiddelde van gliale 25 ng IL-1β-groep = 0,8, 95% betrouwbaarheidsinterval = -0,1995 tot 0,01060, n = 3-4) (Figuur 4A). Blootstelling van equine epitheliale monolagen aan basolaterale 10-25 ng equine IL-6, een inflammatoir cytokine waarvan is aangetoond dat het zowel wordt geproduceerd door enterische glia blootgesteld aan IL-1β als een verhoogde enterocytpermeabiliteit induceert in knaagdiermodellen12, verhoogde de permeabiliteit van equine enterocyten monolayer echter niet significant (Figuur 4B)

figure-results-1
Figuur 1: Isolatie van enterische glia uit paardenjejunum door microdissectie en enzymatische en mechanische spijsvertering. (A) Het jejunum werd langs de antimesenteriale rand doorgesneden en met de slijmvlieszijde naar boven vastgepind. (B) De darmvlokken werden gevisualiseerd door microscopie en verwijderd met zacht schrapen totdat de piekerige lamina propria werd gevisualiseerd. (C) De lamina propria-laag werd vervolgens verwijderd totdat de gladde spiervezels net zichtbaar waren door de doorschijnende submucosa. (D) De submucosa werd in een tent gezet en afgepeld van de spierlaag, waarbij indien nodig sneden in vezelachtige tags werden gemaakt. Beelden werden verkregen met een 10x dissectiemicroscoop (B,C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Beeldvorming van de submucosale darmgliaculturen van paarden. (A) De stellate (pijlen), fusiforme (open pijlpunt) en ganglionische (gesloten pijlpunt) morfologie van de enterische glia van het paard werd gewaardeerd door middel van fasecontrastmicroscopie. (B) De zuiverheid van culturen werd beoordeeld door kleuring voor GFAP en voor de fibroblastmarker, gladde spieractineschaalbalken = 100 mm (A), 400 mm (B). Afkortingen: GFAP = glial fibrillar zuur eiwit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Beeldvorming van niet-succesvolle submucosale enterische gliaculturen bij paarden. De zuiverheid van culturen werd beoordeeld door kleuring voor GFAP (rood) en voor de fibroblastmarker voor gladde spieractine (groen), wat een groot percentage fibroblastbesmetting aantoont. Gele pijlpunt staat voor GFAP en witte pijlpunt voor gladde spieractine. Schaal staaf = 400 mm. Afkorting: GFAP = glial fibrillar zuur eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Equine epitheliale monolaag TEER na blootstelling aan inflammatoire cytokines en inflammatoire gliaproducten. (A) Basolaterale blootstelling aan media van equine submucosale darmgliacultuur, blootgesteld aan 10 ng en 25 ng IL-1β gedurende 24 uur, significant verhoogde permeabiliteit (*p = respectievelijk 0,05 en 0,04, n = 3-4). (B) Acute blootstelling van equine enterocyten monolayer aan basolaterale 25 ng IL-1β en 10-25 ng equine IL-6 verhoogde de permeabiliteit van equine epitheliale monolaag niet significant (n = 2-4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Reagentia voor isolatie en cultuur. De volgende reagentia werden gebruikt om media te formuleren voor isolatie van enterische glia bij paarden, enterische gliacultuur en intestinale epitheelstamcelcultuur bij paarden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het doel van deze studie was om een herhaalbare methode voor primaire cultuur van submucosale darmglia bij paarden te ontwikkelen en de toepassing ervan aan te tonen om epitheel-gliale interacties te modelleren op het moment van koliek. Enterische glia-isolatie en -cultuur, die nieuw is bij het paard, is nuttig gebleken bij het begrijpen van darmziekteroutes in varkens- en knaagdiermodellen en bij mensen 6,7,13,14. Het bestuderen van deze celpopulatie is potentieel belangrijk vanwege hun rol als subepitheliale sensoren van het darmmilieu, evenals hun vermogen om te interageren met en te communiceren met de omliggende cellen in de darmwand. Met hun scherpe waarnemingsvermogen is het niet moeilijk om je een potentieel kritieke rol van glia voor te stellen bij koliek bij paarden, waarbij darmweefsel wordt belast door uitzetting, ischemie en mogelijk chirurgische manipulatie6.

Eerder werk van Lisowski et al. toonde de verhoogde ontstekingsstatus van paardendarmweefsel aan op het moment van koliekchirurgie. Het belang van het verminderen van deze inflammatoire omgeving wordt benadrukt door darmgliaculturen van knaagdieren waarvan is bewezen dat ze in staat zijn om producten te synthetiseren met het vermogen om de darmbarrièrefunctie te verstoren 7,12. Lekkage van de luminale inhoud van de darm in de darmwand zou niet alleen leiden tot een ontstekingsreactie, maar ook tot mogelijke infiltratie in de bloedsomloop, die vervolgens endotoxemische shock/sepsis zou kunnen veroorzaken. Postoperatieve patiënten met paardenkoliek worden helaas geplaagd door tal van op ontstekingen gebaseerde postoperatieve complicaties, waaronder sepsis en postoperatieve ileus, die niet alleen de overleving en het comfort van de patiënt verminderen, maar ook de kosten voor de cliënt en emotioneel leed verhogen. Het opstellen van een model van epitheel-gliale interacties op het moment van koliek kan een mogelijke route van de permeabiliteit van de darmbarrière van paarden bij koliek en mogelijke preventie ophelderen.

De kweek van submucosale darmglia van paarden omvat aanpassingen en beperkingen als gevolg van de kenmerken van de soort. Het belangrijkste was dat de tijdsduur die nodig was voor een effectieve enzymatische vertering titratie vereiste. De auteurs ontdekten dat incubatie met de enzymen gedurende 2-3 uur bij 37 °C noodzakelijk was voor de succesvolle isolatie van enterische glia bij paarden. Bovendien lijkt het schadelijk voor de levensvatbaarheid van de cultuur om enterische culturen van meer dan 80% samen te laten vloeien voordat ze worden gepasseerd. De belangrijkste beperking van deze methode op dit moment is de steekproefomvang. Deze studie betrof alleen weefsel/cellen die waren verkregen van paarden die koliekchirurgie of euthanasie ondergingen om niet-studiegerelateerde redenen. Voortgezette kweek van enterische glia bij paarden van extra proefpersonen, evenals het ontwikkelen van een protocol voor het invriezen en bewaren van enterische glia bij paarden, zal de kracht van deze studie aanzienlijk vergroten.

Deze studie introduceert het nieuwe nut van submucosale enterische gliacultuur bij paarden en primaire cultuur van enterocyten bij paarden als mogelijke methodologieën om paardenkoliek en gastro-intestinale aandoeningen te helpen begrijpen. Bovendien, hoewel epitheliale monolagen van paarden gekweekt uit geïsoleerde darmcrypten en organoïden in het verleden goed ingeburgerd waren, bleef deze studie niet alleen hun bruikbaarheid als model aantonen, maar moedigde deze studie ook aanvullende studies aan die de interactie met de intestinale enterocyt van paarden en andere celtypen in de darmwand onderzoeken.

Waargenomen interacties tussen deze celtypen bevatten mogelijke toepassingen voor zowel koliek als andere inflammatoire gastro-intestinale aandoeningen zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD) en colitis. Bovendien zal een voortdurende verfijning van kweekmethoden voor enterische glia en enterocyten het mogelijk maken om in de toekomst cocultuurstudies op te zetten. Bovendien, terwijl de huidige studie zich richt op de submucosale enterische gliapopulatie vanwege de nabijheid van de epitheliale monolaag en de focus op de darmbarrièrefunctie, kan aanvullend werk worden uitgevoerd om de functie van de enterische glia van het paard te kweken en te beoordelen op basis van de myenterische plexi van de darmwand, wat kan helpen bij het bepalen van de impact van inflammatoire enterische glia bij paarden op de motiliteit15.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de Morris Animal Foundation bedanken voor hun financiering van dit project.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 M HEPES bufferGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4’6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Alpha smooth muscle actin antibodyAbcam7817
Amphotericin BSigmaAA95294.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Bovine Serum AlbuminSigmaAA3311
BSA 50 mg/mL stock solutionSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
CollagenaseSigma9891
DMEM-F12 mediaThermo Fisher11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamberWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Gentamicin solutionSigmaG1272Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibodyAbcam4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solutionCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaClThermo FisherS271-10Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3Thermo FisherS637-212Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solutionGemini400-109
Poly-L-lysineSigmaP26360.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism softwareGraphPad
ProteaseSigmaP4630
Sodium bicarbonate solutionSigmaS87617.5% stock solution

Referenties

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Equine enterische gliaintestinale barri refunctieisolatie van submucosale cellenenzymatische digestietransepitheliale elektrische weerstandepitheliale gliale interactieinterleukine 1 b taintestinale epitheliale monolaag
Equine Enteric Glial Culture en toepassing op de studie van een neuraal inflammatoir mechanisme bij paardenkoliek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.